神經毒素植入物的制作方法

專利名稱：神經毒素植入物的制作方法
Stephen Donovan和Daniel G.Brady背景本發明涉及到一種受控的藥物釋放遞送系統。特別地，本發明涉及到一種受控的神經毒素釋放遞送系統。
受控的釋放系統可以以預定的速度在一定的時間期限內進行某種藥物的體內遞送。釋放速度一般由該系統的設計而決定并且很大程度上不依賴于環境條件，例如pH。已知一些受控釋放系統可以在數年期間遞送藥物。反之，持續釋放系統在典型的情況下在24小時或者更短時間內遞送藥物，并且一些環境因素可影響該釋放速度。由此，藥物從一種植入的受控釋放系統(一種“植入物”)中的釋放速度為該載體植入材料以及藥物本身的生理化學特征的函數。在典型的情況下，該植入物由一種惰性材料制成，該材料引發很小的宿主反應或者不引發宿主反應。
受控的釋放系統可含有一種具有生理活性的藥物，該藥物被摻入一種載體之中。該載體可以為一種聚合物或者一種生物陶瓷材料。該受控的釋放系統可被注入、插入或者植入患者身體的選定部位并且在該處安置較長時間，在此期間該植入物以某種方式和一定的濃度釋放該藥物，該濃度提供了理想的療效。
聚合材料可出于擴散、化學反應或者溶解活動以及由于磁力、超聲或者溫度變化因素的影響而釋放藥物。擴散可來自一種儲存器或者基質。化學控制可產生于聚合物降解或者藥物從該聚合物上被切除。溶解活動可涉及到該聚合物的膨脹或者某種滲透效應。例見Science249；1527-15331990。
一種膜或者儲存器植入物依賴于某種生物活性物穿過聚合物膜的擴散。基質植入物由一種聚合物基質組成，生物活性物在該基質中均一地分布。膨脹控制下的釋放系統通常基于親水性的玻璃狀聚合物，該聚合物在生物液體或者特定的環境刺激物存在下進行了膨脹。
在優選的情況下，所使用的植入材料基本上無毒、無致癌性并且無免疫原性。適當的植入材料包括聚合物，例如聚(2-羥基甲基丙烯酸乙酯)(p-HEMA)、聚(N-乙烯吡咯烷酮)(p-NVP)+，聚乙烯醇(PVA)、聚丙烯酸(PAA)、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、乙烯-醋酸乙烯酯(EVAc)共聚物、聚乙烯吡咯烷酮/甲基丙烯酸酯共聚物、聚甲基丙烯酸甲酯、聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚酐、聚原酸酯、膠原和纖維素衍生物，該植入材料還包括生物陶瓷，例如羥基磷灰石(HPA)、磷酸鈣(TCP)以及磷酸鈣鋁(ALCAP)。乳酸、羥乙酸和膠原可被用于制造生物降解的植入物。
含有一種聚合物以用于某種治療藥物的長時間遞送的受控的釋放系統已為人所知。例如，一種由非生物可降解的聚合物的皮下貯存器植入物可被用于釋放避孕用的類固醇，例如孕激素，在高達60個月的期間每天釋放25-30mg(即，Norplant植入物)。另外，從植入聚合物中還可釋放葡聚糖(分子量約2百萬)。
植入物材料可以是生物可降解的或者生物可侵蝕的。生物可侵蝕的植入物的優勢在于該植入物無需從患者體內除去。生物可侵蝕植入物可基于生物活性物質從膜或者基質中的釋放。由PLA-PGA制備的生物可降解的微球體已知可用于皮下或者肌內給藥。
可降解植入物在優選的情況下在其受控釋放期間保持了其結構完整性，從而使該植入物在需要去除或者可以去除的情況下能夠被去除。在摻入的藥物降至治療水平以下之后，生物可降解植入物可完全降解而不留任何藥物，該藥物可在進一步的期間內低水平釋放。已知一些由可降解材料制成的用于遞送類固醇等的皮下植入物以及可注射的微球體，所述材料例如乳酸-乙醇酸共聚物、聚已內酯和膽固醇。
蛋白質植入物已知一些用于諸如蛋白質這樣的大分子的受控釋放系統。因此，已經以摻入高分子量蛋白質的生物相容性聚合物微團進行了植入并且顯示該微團在超過100天的時間內進行該蛋白質的連續釋放。多種不穩定的高分子量酶(例如分子量為88kD的堿性磷酸酶和250kD的催化酶)已被摻入具有長期連續釋放特性的生物相容的聚合物植入物。通常該聚合物在制備溶液中濃度的提高可降低蛋白質從該植入物中釋放的初始速度。Nature 263；797-8001976。
另外，還可以從EVAc植入物中釋放白蛋白以及從基于膠原的微球體中釋放聚賴氨酸。Mallapragada S.K.et al.，at page 431 ofchapter 27 in Von Recum，A.F.Handbook of BiomaterialsEvalution，second edition，Taylar & Francis(1999)。另外，對破傷風毒素從微球體中的釋放也進行了研究。同前文獻的432頁。插入皮下的燒結的EVAc共聚物已被證明能夠在100天的期間釋放胰島素。同前文獻的433頁。
進一步，已知可以將一種諸如人類生長因子(hGH)(分子量約26kD)這樣的蛋白包被入一種聚合基質中，該基質被植入時允許該人類生長因子在約一周的期間內進行體內釋放。U.S.專利號no.5,667,808。
一種受控的釋放系統(即，一種“植入物”)可表現出蛋白釋放的高初始爆發，繼之以最小釋放。不幸的是，由于受控釋放基質中的蛋白濃度很高，這些蛋白分子易于聚集并且形成具有免疫原濃度的變性蛋白。
脈沖釋放植入物水凝膠已被用于構建單脈沖或者多脈沖藥物遞送植入物。單脈沖植入物可以是滲透控制或者溶解控制。Doelker E.，CelluloseDeriatives，Adv Polym Sci 107；199-2651993。已知特定物質從植入物中的多脈沖釋放可通過對某種環境變化作出反應而獲得，該變化因素的例子如溫度(Mater Res Soc Symp Proc，331；211-216；1994；J.Contr Rel 15；141-1521991)、pH(Mater Res Soc SympProc，331；199-204；1994)、離子強度(React Polym，25；127-1371995)、磁場(J.biomed Mater Res，21；1367-13731987)或者超聲波。
不幸的是，由非生物可降解聚合物制成的皮下可植入藥團具有需要手術移植和去除的缺陷。使用一種生物降解，生物可侵蝕的植入物可克服非生物可降解植入物的這一明顯的缺陷。生物可降解的植入物可在長時間內釋放某種藥物，并且該聚合物在組織內同步或者隨后降解為組成物，這樣就避免了對該植入物進行去除的需要。例見，DrugDevelopment and Industrial Pharmacy 24(12)；1129-1138；1998。
可降解聚合物可以是一種表面侵蝕聚合物，這與顯得臃腫和均一的聚合物形成對比。表面侵蝕聚合物僅僅從其外表面發生降解，并且藥物釋放由此而正比于該聚合物的侵蝕速度。這樣的一種適宜的聚合物為聚酐。
肉毒桿菌毒素厭氧的革蘭氏陽性細菌肉毒梭狀芽孢桿菌產生一種強效的多肽神經毒素，肉毒桿菌毒素，該毒素導致人類和動物的神經麻痹疾病，稱之為肉毒中毒。肉毒梭狀芽孢桿菌的芽孢在土壤中被發現并且可在日用罐頭廠的經不正確的消毒和密封的食物容器中生長，這是許多肉毒中毒病例的病因。肉毒中毒的影響一般在食用感染有肉毒梭狀芽孢桿菌培養物或者芽孢的食物后18到36小時顯現。肉毒桿菌毒素可不受削弱地明顯穿過腸道并且攻擊外周運動神經元。肉毒桿菌毒素中毒的癥狀可由行動、吞咽和說話困難發展為呼吸肌麻痹直至死亡。
A型肉毒桿菌毒素是已知對人類的致死性最強的天然生物制劑。商業化A型肉毒桿菌毒素(純化的神經毒素復合物)1在小鼠中的LD50值是50皮克(即，1個單位)。一個單位的BOTOX含有約50皮克(約56阿摩爾(attomole))的A型肉毒桿菌毒素復合物。有趣的是，在摩爾量的基礎上，A型肉毒桿菌毒素的致死性約比白喉毒素高18億倍，約比氰化鈉高6億倍，約比眼鏡蛇毒素高3千萬倍，約比霍亂毒素高1千2百萬倍。Singh，Critical Aspect of Bacterial Protein Toxins，page63-84(chapter 4)of Natural Toxin II，edited by B.R.Singhet al.，Plenum Press，New York(1996)(其中所述的0.3ng的A型肉毒桿菌毒素LD50等于一個單位根據約0.05ng的BOTOX等于一個單位這個事實進行了校正)。一個單位(U)的肉毒桿菌毒素被定義為基于對體重為18-20克的雌性Swiss Webster小鼠進行腹膜內注射的LD50。
已經鑒定出了7種免疫學上不同的肉毒桿菌毒素，這些毒素分別為肉毒桿菌毒素血清型A、B、C1、D、E、F和G，這些血清型均可被類型特異性的抗體的中和作用所識別。不同血清型的肉毒桿菌毒素在其所影響的動物種類以及其所引發的麻痹的嚴重程度和持續時間上有所不同。例如，通過對在大鼠中產生的麻痹速度的測量，已經測定A型肉毒桿菌毒素的毒力比B型肉毒桿菌毒素強500倍。另外，已經測定B型肉毒桿菌毒素在480U/kg的劑量下對于靈長類動物是無毒的，該劑量約為A型肉毒桿菌毒素的靈長類LD50的12倍。肉毒桿菌毒素明顯地同膽堿能的運動神經元以高親合性結合，被轉運進入該神經元并且阻斷乙酰膽堿的釋放。
不考慮血清型，毒素中毒的分子機制表現得類似并且涉及到至少3個步驟或者階段。在該過程的第一步，該毒素通過一種特異相互作用結合于該靶神經元的突觸前膜，該相互作用發生于重鏈，即H鏈以及一種細胞表面受體之間；該受體被認為對于各種類型的肉毒桿菌毒素以及破傷風毒素而有所不同。該H鏈的羧基末端片段，Hc，對于該毒素向細胞表面的靶定是重要的。
在第二步，該毒素穿過中毒細胞的細胞膜。該毒素最初被細胞通過受體介導的細胞內吞作用而吞入并且形成了一種含有該毒素的的內含體。該毒素隨后從該內含體中逸出進入細胞的細胞質。這一步被認為受到該H鏈的氨基末端片段HN的介導，該片段引發該毒素針對于約5.5或者更低的pH的構象變化。已知這些內含體具有一種質子泵，該泵降低內含體的pH。該構象變化將該毒素中的疏水殘基暴露于外，這些殘基允許該毒素將其自身包被于內含體膜中。該毒素(或者至少輕鏈)隨后通過內含體膜轉運進細胞質。
肉毒桿菌毒素活性機制的最后一步涉及到連接重鏈，即H鏈和輕鏈，即L鏈的二硫鍵的還原。肉毒桿菌毒素和破傷風毒素的完整毒性被包含于全毒素的輕鏈中；該L鏈為一種鋅(Zn++)內肽酶，該酶選擇性地剪切蛋白，這些蛋白對于含有神經遞質的囊泡被質膜的胞質面的識別和對該表面的泊定以及這些囊泡同質膜的融合十分重要。破傷風神經毒素以及肉毒桿菌毒素B、D、F和G導致了小突觸泡蛋白(又稱為囊泡相關膜蛋白(VAMP))的降解，該蛋白為一種突觸小體膜蛋白。存在于突觸囊泡的胞質面的大多數的VAMP由于這些剪切事件之一而被除去。血清型A和E剪切SNAP-25。原本認為剪切突觸融合蛋白的血清型C1經發現剪切突觸融合蛋白和SNAP-25。各種毒素特異性地剪切不同鍵(除破傷風毒素和B型剪切相同的鍵)。
肉毒桿菌毒素已經應用于治療神經肌肉失調的臨床手段，該失調的特征為骨骼肌過度活躍。A型肉毒桿菌毒素已于1989年被U.S.Foodand Drug Administration批準用于瞼痙攣、斜視以及半側面痙攣。非A型肉毒桿菌毒素血清型同A型肉毒桿菌毒素相比顯得毒力較低并且/或者活性持續時間較短。A型肉毒桿菌毒素在外周肌內的臨床效果通常在注射后一周內顯現。A型肉毒桿菌毒素的單次肌內注射所產生的癥狀減輕的典型持續時間平均約為3個月。
盡管所有的肉毒桿菌毒素血清型可抑制神經遞質乙酰膽堿在神經肌肉連接中的釋放，但是它們是通過影響不同的神經分泌蛋白和/或剪切這些蛋白的不同位點來達到這種效果的。例如，A型和E型肉毒桿菌毒素均剪切25千道爾頓的(kD)的突觸小體相關蛋白(SNAP-25)，但是它們靶向于該蛋白中的不同氨基酸序列。B、D、F和G型肉毒桿菌毒素作用于囊泡相關蛋白(VAMP，亦稱小突觸泡蛋白)，它們各自在不同位點剪切該蛋白。最后，已經證明C1型肉毒桿菌毒素剪切突觸融合蛋白和SNAP-25。在作用機理上的這些差別可能影響不同的肉毒桿菌毒素血清型的相對毒力以及/或者作用持續時間。顯然，肉毒桿菌毒素的底物可在多種不同的細胞類型中發現.例見，Biochem，J 1；339(pt1)159-651999，以及Mov Disord，10(3)3761995(胰島B細胞至少含有SNAP-25以及小突觸泡蛋白)。
對于所有7種已知的肉毒桿菌毒素血清型，肉毒桿菌毒素蛋白質分子的分子量約為150kD。有趣的是，肉毒桿菌毒素由梭菌以復合物形式產生，該復合物含有150kD的肉毒桿菌毒素蛋白分子以及與之結合的非毒素蛋白質。因此，A型肉毒桿菌毒素復合物可由梭菌以900kD、500kD以及300kD形式產生。B和C1型肉毒桿菌毒素僅僅以700kD或者500kD復合物產生。D型肉毒桿菌毒素以300kD和500kD復合物形式產生。最后，E和F型肉毒桿菌毒素僅僅以約300kD復合物的形式產生。這據信些復合物(即，分子量高于約150kD)含有一種非毒素的紅血球凝集素蛋白以及一種非毒素并且無毒的非紅血球凝集素。這兩種非毒素的蛋白質(這些蛋白同肉毒桿菌毒素分子一起構成了相關的神經毒素復合物)可能為肉毒桿菌毒素分子提供穩定性以抵抗變性作用，并且向肉毒桿菌毒素提供保護以防毒素侵染時的消化性酸。另外，較大的(分子量高于約150kD)肉毒桿菌毒素復合物可能導致肉毒桿菌毒素從肉毒桿菌毒素復合物的肌內注射位點以較慢的速度擴散。
體外研究已經表明，肉毒桿菌毒素抑制鉀離子所誘導的乙酰膽堿和去甲腎上腺素從腦干組織的原代細胞培養物中的釋放。另外，已經報道肉毒桿菌毒素毒素抑制甘氨酸和谷氨酸在脊髓神經元的原代培養物中的受激釋放，并且肉毒桿菌毒素在腦突觸小體制劑中抑制神經遞質乙酰膽堿、多巴胺、去甲腎上腺素(Habermann E.，et al.，TetanusToxin and Botulinum A and C Neurotoxins Inhibit NoradrenalineRelease From Cultured Mouse Brain，J Neurochem 51(2)；522-5271988)、CGRP、P物質以及谷氨酸(Sanchez-Prieto，J.，et al.，Botulinum Toxin A Blocks Glutamate Exocytosis From Guinea PigCerebral Cortical Synaptosomes，Eur J.Biochem 165；675-6811987)的釋放。由此，當使用足夠的濃度時，大多數神經遞質受刺激物激發的釋放被肉毒桿菌毒素所阻斷。例見，Pearce，L.B.，Pharmacologic Characterization of Botulium Toxin For BasicScience and Medicine，Toxicon 35(9)；1373-1412 at1393(1997)；Bigalke H.，et al.，Botulinum A NeurotoxinInhibits Non-Cholinergic Synaptic Transmission in MouseSpinal Cord Neurons in Culture，Brain Research 360；318-3241985；Habermann E.，Inhibition by Tetanus and BotulinumA Toxin of the Release of[3H]Noradrenaline and[3H]GABA FromRat Brain Homogenate，Experientia 44；224-2261988；BigalkeH.，et al.，Tetanus Toxin and Botulinum A Toxin Inhibit Releaseand Uptake of Various Transmitters，as Studied withParticulate Preparations From Rat Brain and Spinal Cord，Naunyn-Schmiedeberg′s Arch Pharmacol 316；244-2511981以及Jankovic J.et al.，Therapy With Botulinum Toxin，MarcelDekker，Inc.，(1994)，page 5。
A型肉毒桿菌毒素可通過制備肉毒梭狀芽孢桿菌的培養物并在發酵罐中使其生長并且根據已知的程序純化該發酵混合物來獲得。所有的肉毒桿菌毒素血清型最初均以無活性的單鏈蛋白的形式合成，該單鏈蛋白必須經過蛋白酶的剪切或者切割從而具有神經活性。制造A型和G型肉毒桿菌毒素的菌株具有內源蛋白酶，因此從該細菌培養物中可以提取主要為活性形式的A型和G型肉毒桿菌毒素。與之相對比，C1、D和E型肉毒桿菌毒素主要由非蛋白水解菌株合成，因此在典型情況下它們在從培養物中被回收時為非活性形式。B和F型肉毒桿菌毒素由蛋白水解菌株和非蛋白水解菌株產生，因此可以以活性或者非活性形式回收。但是，即使是產生諸如B型這樣的肉毒桿菌毒素的蛋白水解菌株也僅僅剪切所產生毒素的一部分。被切割和未切割的分子的精確比例依賴于該培養基孵育的時間長度和溫度。因此，諸如B型這樣的肉毒桿菌毒素的制劑中可能有一定百分比是非活性的，這可能導致了已知的B型肉毒桿菌毒素同A型肉毒桿菌毒素相比較的明顯低毒。非活性肉毒桿菌毒素分子在臨床制劑中的存在將被算進該制劑的總體蛋白負載，這同抗原性的增加有關，但對該制劑的臨床效能并無作用。另外，已知B型肉毒桿菌毒素在肌內注射時與同劑量的A型肉毒桿菌毒素相比具有較低的活性持續時間以及較低的效力。
已從肉毒梭狀芽孢桿菌的Hall A菌株中制備出了高質量的結晶A型肉毒桿菌毒素，其特征為≥3×107U/mg，A260/A278低于0.60以及在凝膠電泳中的獨特帶型。可以使用已知的Shantz法，根據Shantz，E.J.，et al.，Properties and Use of Botulinum Toxin and OtherMicrobial Neurotoxins in Medicine，Microbiol Rev.56；80-991992中的闡述，來獲得結晶A型肉毒桿菌毒素。一般來說，A型肉毒桿菌毒素復合物可從無氧發酵物中分離和純化，該發酵物通過在適當的培養基中培養A型肉毒梭狀芽孢桿菌來產生。已知的程序還可用于同非毒素蛋白的分離以獲得純凈的肉毒桿菌毒素，例如具有約150kD分子量并且比效力為1-2×108LD50 U/mg或更高的純化A型肉毒桿菌毒素；具有約156kD分子量并且比效力為1-2×108LD50 U/mg或更高的純化B型肉毒桿菌毒素，以及具有約155kD分子量并且比效力為1-2×107LD50 U/mg或更高的純化F型肉毒桿菌毒素。
肉毒桿菌毒素和/或肉毒桿菌毒素復合物可從List BiologocalLaboratories，Inc.，Campbell，California；the Center forApplied Microbiology and Research，Porton Down，U.K.；Wako(Osaka，Japan)，Metabiologics(Madison，Wisconsin)以及從Sigma Chemicals of St.Louis，Missouri獲得。
純凈的肉毒桿菌毒素非常不穩定以至于它通常不被用于制備藥學組合物。進一步，諸如A型肉毒桿菌毒素這樣的肉毒桿菌毒素復合物還對由表面變性、熱和堿性條件引起的變性作用極端敏感。失活的肉毒桿菌毒素形成可能具有免疫原性的類毒素蛋白。所產生的抗體可使患者不受毒素注射作用影響。
肉毒桿菌毒素(它們是細胞內肽酶)的生物活性一般同酶一樣依賴于，至少部分依賴于它們的三維構象。因此，A型通過加熱、多種化學物的表面拉伸作用(surface stretching)以及表面干燥作用而失去毒性。另外，將從已知的培養、發酵和純化中獲得毒素進行稀釋至用于藥學組合物制劑的非常低的濃度會導致該毒素迅速失去毒性，除非存在一種適當的穩定劑。將毫克量的毒素稀釋至含有納克每毫升的溶液中的過程存在著很大的難度，這是由于特異毒性在這種高稀釋度下會迅速失去。另外，該毒素可在含它的藥學組合物制劑化后數月或者數年使用。很明顯，已知該毒素可在制造和配制期間以及貯藏期間通過穩定劑的使用來進行穩定化，穩定劑的例子如白蛋白和凝膠。
含有肉毒桿菌毒素的商業化藥學組合物以商標BOTOX(可購自Allergan，Inc.，of Irvine，California)進行銷售。BOTOX由一種純化的A型肉毒桿菌毒素復合物、白蛋白以及氯化鈉組成，它們以消毒的真空干燥形式包裝。A型肉毒桿菌毒素從肉毒梭狀芽孢桿菌的Hall菌株培養物中制備，該菌在含有N-Z氨基酸和酵母抽提物的培養基中生長。A型肉毒桿菌毒素通過一系列的酸沉淀而從培養物溶液中純化為一種結晶復合物，該復合物由活性高分子量毒素蛋白以及一種相關的紅血球凝集素蛋白組成。將該結晶復合物重新溶解于含有鹽和白蛋白的溶液中并且在真空干燥之前進行無菌過濾(0.2微米)。經真空干燥的產品在5℃或低于5℃的冷柜中保存。BOTOX可在肌內注射前以無菌的無防腐劑的鹽水進行重構。每藥瓶BOTOX含有無菌的真空干燥形式的約100單位(U)的A型肉毒梭狀芽孢桿菌毒素純化神經復合物、0.5毫克的人類血清白蛋白以及0.9毫克的氯化鈉，不含防腐劑。
為重構真空干燥的BOTOX，通過將適量的稀釋液吸入適當大小的注射器而使用不含防腐劑的無菌普通鹽水(0.9％氯化鈉注射液)。由于BOTOX可能會通過導入氣泡或者類似的劇烈攪拌而變性，因此將該稀釋液輕輕地注射入藥瓶。出于無菌的目的，BOTOX在優選的情況下在藥瓶從冷柜取出并進行重構后4小時內進行給藥。在這四小時期間，重構好的BOTOX可保存于約2℃到8℃的冰箱中。重構的冷藏BOTOX在至少2周內保持活性。Neurology，48249-531997。
已有報道A型肉毒桿菌毒素已被用于臨床，如下(1)每次肌內注射(多個肌肉)約75-125單位的BOTOX以治療子宮肌張力異常；(2)每次(向降眉間肌進行5單位的肌內注射并且向各皺眉肌肉進行10單位的肌內注射)肌內注射5-10單位的BOTOX以治療眉間皺紋(眉溝)；(3)通過以30-80單位BOTOX對恥骨直腸肌進行括約肌內注射以治療便秘。
(4)以每塊肌肉約1-5單位來向上眼瞼的側瞼板前眼輪匝肌以及下眼瞼的側瞼板前眼輪匝肌進行肌內注射BOTOX以治療瞼痙攣；(5)為治療斜視，以1-5單位的BOTOX向眼外肌肉進行肌內注射，所注射的量根據被注射的肌肉的大小以及所需的肌肉麻痹的程度(即，所需的屈光度校正量)而變化；(6)通過向5個不同的上肢屈肌進行BOTOX的肌內注射以治療上肢的卒中后痙攣，如下(a)flexor digitorum profundus7.5U至30U(b)flexor digitorum sublimus7.5U至30U(c)flexor carpi ulnaris10U至40U(d)flexor carpi radialis15U至60U(e)二頭肌50U到200U。所示的五塊肌肉均在同一療程接受注射以使該患者在每一療程通過肌內注射接受60U至360U的上肢屈肌BOTOX(r)。
(7)為治療偏頭痛，以25U的BOTOX進行的顱骨膜注射(對稱注射入眉間、額和顳肌)作為偏頭痛的預防治療較之載體已經顯示出顯著的優點，該效果根據在25U注射后3個月的期間內偏頭痛頻率、最大嚴重度、伴隨的嘔吐和急性藥物使用的減少而測定。
已知A型肉毒桿菌毒素可具有長達12個月的效力(European J.Neurology 6(Supp4)S111-S11501999)，并且在某些情況下長達27個月，(The Laryngoscope 1091344-1346199)。但是，Botox的通常持續時間一般為約3到4個月。
A型肉毒桿菌毒素在治療多種臨床癥狀中的成功已經引起了對其它肉毒桿菌毒素血清型的興趣。已經開展了對兩種商業化的A型肉毒桿菌毒素制劑(BOTOX和Dysport)以及B和F型肉毒桿菌毒素制劑(均獲自Wako Chemicals，Japan)的研究以測定局部肌肉弱化效果、安全性和抗原性潛能。將肉毒桿菌毒素制劑注射入右側腓腸肌頭部(0.5-200.0單位/kg)并且使用小鼠趾外展評測分析(DAS)來測定肌肉弱化。從劑量反應曲線計算ED50值。對另外的小鼠進行肌內注射以測定LD50劑量。根據LD50/ED50來計算治效指數。分組小鼠接受BOTOX(5.0-10.0單位/kg)或者B型肉毒桿菌毒素(5.0-400.0單位/kg)的后肢注射并且進行肌肉弱化以及水消耗增加的測試，后者為口干的一種推測模型。抗原性潛能通過在兔體內的每月肌內注射而測定(對于B型肉毒桿菌毒素為1.5或者6.5ng/kg，對于A型肉毒桿菌毒素為0.15ng/kg)。對于所有的血清型，峰值肌肉弱化和持續時間與劑量相關。DAS ED50值(單位/kg)如下BOTOX6.7，Dysport24.7，B型肉毒桿菌毒素27.0-244.0，F型肉毒桿菌毒素4.3。BOTOX同B型肉毒桿菌毒素和F型肉毒桿菌毒素相比具有更長的活性持續時間。治療指數值如下BOTOX10.5，Dysport6.3，B型肉毒桿菌毒素3.2。經B型肉毒桿菌毒素注射的小鼠體內的水消耗高于BOTOX，盡管B型肉毒桿菌毒素在弱化肌肉上較為低效。注射后4個月，4只兔子中的2只(經1.5ng/kg的處理)以及全部4只兔子(經6.5ng/kg的處理)產生了抗B型肉毒桿菌毒素的抗體。在一個獨立的研究中，9只經BOTOX處理的兔子中無一顯示出抗A型肉毒桿菌毒素的抗體。IAS結果顯示出A型肉毒桿菌毒素的峰值毒力與F型相當，而F型肉毒桿菌毒素的峰值毒力高于B型肉毒桿菌毒素。至于效力持續時間，A型肉毒桿菌毒素高于B型肉毒桿菌毒素，并且B型肉毒桿菌毒素的效力持續時間高于F型肉毒桿菌毒素。根據治療指數值的顯示，兩種商業化的A型肉毒桿菌毒素制劑(BOTOX和Dysport)有所不同。在后肢注射B型肉毒桿菌毒素后所觀察到的水消耗行為的提高顯示臨床上相當可觀數量的該血清型進入了該小鼠的體循環。該結果還顯示，為獲得可與A型肉毒桿菌毒素相當的效果，必須提高其它被測血清型的劑量。提高的劑量可具有安全性。進一步，在兔體內，B型比BOTOX更具有抗原性，這可能是由于為達到有效劑量的B型肉毒桿菌毒素而注射的較高蛋白量。Eur J Neurol 1999Nov；6(suppl 4)S3-S10。
除在外周部位具有藥學活性外，肉毒桿菌毒素還可在中樞神經系統中顯示去神經支配效果。Wiegand et al.，Naunyn-Schmiedeberg′sArch.Pharmacol.1976；292，161-165以及Habermann，Naunyn-Schmiedeberg′s Arch.Pharmacol.1974；281，47-56中報道肉毒桿菌毒素能夠通過逆向運輸上升至脊髓區域。同樣，在外周部位，例如通過肌內進行注射的肉毒桿菌毒素，有可能被逆向運輸至脊髓。
美國專利No.5,989,545披露，一種經修飾的肉毒梭狀芽孢桿菌神經毒素或其片段，在優選的情況下為一種肉毒桿菌毒素，同一種特定的靶定部分進行化學偶聯或者重組融合后可通過以該試劑對脊髓進行給藥而用于治療疼痛。
乙酰膽堿在典型的情況下，哺乳動物神經系統的各種類型的神經元僅僅釋放一種類型的小分子神經遞質。神經遞質乙酰膽堿被諸多腦部區域的神經元所分泌，但具體地為運動皮層的大的錐形細胞、基底節的不同神經元、支配骨骼肌的運動神經元、自主神經系統(交感神經或者副交感神經)的節前神經元、副交感神經系統的節后神經元以及交感神經系統的某些節后神經元所分泌。基本上，因為大部分交感神經系統的節后神經元分泌神經遞質去甲腎上腺素，因此只有汗腺、立毛肌以及少量的血管的節后交感神經纖維是膽堿能的。在多數情況下乙酰膽堿具有激動效果。然而，已知乙酰膽堿在某些外周副交感神經末梢具有抑制效果，例如通過迷走神經對心律的抑制。
自主神經系統的輸出信號通過交感神經系統或者副交感神經系統被傳遞至軀體。交感神經系統的節前神經元由位于脊髓的中間側角的節前交感神經元細胞體延伸而來。延伸自細胞體的節前交感神經纖維同位于脊椎旁的交感神經節或者位于脊椎前的神經節中的節后神經元形成突觸。由于交感和副交感神經系統的節前神經元均為膽堿能，對這些神經節使用乙酰膽堿將激動交感和副交感節后神經元。
乙酰膽堿激活兩種受體，毒蕈堿受體和煙堿受體。毒蕈堿受體見于所有受副交感神經系統的節后神經元以及交感神經系統的節后膽堿能神經元刺激的效應器細胞。煙堿受體見于腎上腺髓質以及自主神經節，該受體位于交感和副交感神經系統的節前和節后神經元之間的突觸中的節后神經元細胞膜表面上。煙堿受體亦可見于多種非自主神經末梢上，例如位于骨骼肌纖維的神經肌肉接頭的細胞膜上。
乙酰膽堿從膽堿能神經元中釋放，此時透明的細胞內小囊泡同突觸前神經元細胞膜融合。諸多的非神經分泌細胞，例如腎上腺髓質(以及PC12細胞系)和胰島細胞，分別從濃核大囊泡中釋放兒茶酚胺和甲狀旁腺素。PC12細胞等為大鼠嗜鉻細胞瘤細胞的一種克隆，該細胞系被廣泛地用作研究交感腎上腺發育的組織培養模型。肉毒桿菌毒素抑制這兩種類型的化合物從這兩種類型的細胞中的釋放，毒素通過體外滲透(例如通過電穿孔)或者直接注射而進入該去神經支配細胞。同樣已知肉毒桿菌毒素可阻斷神經遞質谷氨酸從皮質突觸體細胞培養物中的釋放。
神經肌肉連接在骨骼肌細胞中由軸突與肌肉細胞的靠近形成。通過神經系統傳遞的信號導致了末端軸突中的動作電位，該電位通過離子通道的激活以及所導致的神經遞質乙酰膽堿從神經元內的突觸囊泡中釋放，例如在神經肌肉連接的運動終板釋放而產生。該乙酰膽堿穿過細胞外空間同肌肉終板表面的乙酰膽堿受體蛋白結合。一旦產生了足量的結合，肌肉細胞的動作電位便導致了特異的膜離子通道的變化，這引起了肌肉細胞的收縮。乙酰膽堿隨后從肌肉細胞釋放并且通過細胞外空間內的膽堿酯酶而進行代謝。代謝物經重循環回到末端軸突以便重加工成為新的乙酰膽堿。
因此，存在著對一種生物相容性的，無免疫原性的，非生物可降解的植入物的需求，該植入物允許一種治療有效的神經毒素在人類患者體內的長時間連續釋放。
簡述本發明滿足了這種需求并且提供了一種生物相容性的，無免疫原性的，非生物可降解的植入物，該植入物允許一種神經毒素在人類患者體內的長時間連續釋放。
我們的發明提供了一種神經毒素植入物，用以治療病痛，例如治療一種包括肌肉痙攣在內的運動失調，該植入物克服了已知與一種諸如肉毒桿菌毒素這樣的神經毒素的反復濃注或者皮下注射所伴隨的問題、困難以及缺陷。
本發明的范圍內的一種受控釋放系統含有一種聚合物基質以及位于該聚合物基質中的一定量的神經毒素，其中分部量的該神經毒素可在長時間內從該聚合物基質中釋放。
該神經毒素可從該聚合物基質中以基本上連續的方式或者單相的方式釋放，并且該神經毒素從聚合物基質中釋放的時間可為10天到6年。
該聚合物基質可由一種基本上非生物可降解的物質制造，并且該神經毒素可為一種多肽。另外，該神經毒素可為一種突觸前神經毒素，例如一種梭菌毒素。進一步，該神經毒素可為一種肉毒桿菌毒素，例如選自A、B、C1、D、E、F和G型肉毒桿菌毒素的肉毒桿菌毒素。在優選的情況下，該神經毒素為一種A型肉毒桿菌毒素。
組成該聚合物基質的聚合物選自甲基丙烯酸酯、乙烯基吡咯烷酮、乙烯醇、丙烯酸、硅氧烷、乙酸乙烯酯、乳酸、乙醇酸、膠原和生物陶瓷聚合物及它們的共聚物。
該植入物所容納的神經毒素的量為約1單位至約100,000單位的肉毒桿菌毒素，在優選的情況下為約1單位至約50,000單位的肉毒桿菌毒素。因此，該神經毒素的量可為約10單位至約2,000單位的A型肉毒桿菌毒素，并且該神經毒素的量可為約100單位至約30,000單位的B型肉毒桿菌毒素。
該神經毒素可為一種肉毒桿菌毒素，該毒素從該植入物中以一定量釋放，該量有效地在該植入系統的附近導致某肌肉或者肌肉群的松弛性麻痹。
本發明的一個詳細的實施方案為一種受控的釋放系統，該系統含有一種聚合物基質，并且該聚合物基質中具有10單位至20,000單位的肉毒桿菌毒素，其中分部量的該肉毒桿菌毒素在約2個月至約5年的較長期間內從該聚合物基質中釋放。
一種用于制造本發明的范圍內的受控釋放系統的方法可具有的步驟有(a)將一種聚合物溶解于一種溶劑中以形成一種聚合物溶液；(b)將一種神經毒素混合或者分散于該聚合物溶液中以形成一種聚合物-神經毒素混合物，以及；(c)使該聚合物-神經毒素混合物凝固，從而制成了一種受控的釋放系統。在混合步驟之后還可以有一個使溶劑蒸發的步驟。
另外，一種使用本發明范圍內的連續釋放系統的方法可包括注射或者植入一種受控的釋放系統，以此治療某種運動失調或者膽堿能神經支配所影響的失調，該受控釋放系統可具有一種聚合物基質。
最后，用于形成一種與金屬陽離子復合的神經毒素的方法包括以下步驟(a)形成一種含有一種神經毒素的溶液；(b)在適于將多價金屬陽離子同該神經毒素復合的pH下，將一種多價金屬陽離子成分分散于該神經毒素溶液中，由此而形成了一種與金屬陽離子復合的神經毒素懸浮液，其中的金屬陽離子成分同神經毒素之間的摩爾比為約4∶1至約100∶1；(c)使所述的懸浮液干燥以形成與金屬陽離子復合的神經毒素。
通過一種本發明范圍內的連續釋放系統在一個給定的期間內進行給藥的神經毒素的量，對于A型肉毒桿菌毒素可為約10-3U/kg至約35U/kg，對于其它的肉毒桿菌毒素，例如B型肉毒桿菌毒素，可高達約200U/kg。35U/kg或者200U/kg是一個上限，這是因為它分別接近于A型和B型肉毒桿菌毒素這樣的特定神經毒素的致死劑量。在優選的情況下，用于在一個給定的期間內通過一種連續釋放系統給藥的神經毒素的量為約10-2U/kg至25U/kg。更優選的情況下，該神經毒素以10-1U/kg至15U/kg的量進行給藥。最優選的情況下，該神經毒素以1U/kg至10U/kg的量進行給藥。在許多情況下，神經毒素，諸如A型肉毒桿菌毒素，以約1個單位至約500個單位進行的給藥提供了有效并且長期的治療緩解。更優選的情況下，可以使用約5個單位約300個單位的某種神經毒素，例如A型肉毒桿菌毒素，在最優選的情況下，可以將約10個單位到約200個單位的某種神經毒素，例如A型肉毒桿菌毒素，局部地向一種靶組織進行給藥并獲得有效結果。在本發明的一個特別優選的實施方案中，可用1個單位至100個單位的某種肉毒桿菌毒素，如A型肉毒桿菌毒素對一種靶組織進行局部給藥并獲得有效治療結果。
該神經毒素可由一種梭菌產生，例如肉毒梭狀芽孢桿菌、丁酸梭菌、巴氏梭菌或者破傷風梭菌。另外，該神經毒素可為一種經修飾的毒素，這是一種同天然或者野生的神經毒素相比至少具有一個氨基酸刪除、修飾或者替換的神經毒素。進一步，該神經毒素可為一種重組產生的神經毒素或其衍生物或片段。
該神經毒素可以為一種肉毒桿菌毒素，例如肉毒桿菌毒素血清型A、B、C1、D、E、F或G其中之一。在優選的情況下，該神經毒素為A型肉毒桿菌毒素。
很明顯，該肉毒桿菌毒素可通過以一種肉毒桿菌毒素植入物對該患者進行皮下的植入而進行給藥。該肉毒桿菌毒素可以用于對一名患者的肌肉以約1單位至約10,000單位的量進行給藥。當該肉毒桿菌毒素為A型肉毒桿菌毒素時，該肉毒桿菌毒素可被用于對一名患者的肌肉以約1單位至約100單位的量進行給藥。
值得注意的是，有報道經過肉毒桿菌毒素處理的腺體組織可在該毒素注射后長達27個月的時間內表現出降低的分泌活性。Laryngoscope 1999；1091344-1346，Laryngoscope 1998；108381-384。
我們的發明涉及到一種植入物以及制造和使用該植入物的方法，該植入物用于一種神經毒素的受控釋放。該植入物可具有一種含有神經毒素的聚合物基質。該植入物被設計為在以其進行給藥來治療多種疾病狀況時能夠在較長的時間內以有效水平的神經毒素進行給藥，例如肌內給藥、硬膜外給藥或皮下給藥。
本發明進一步涉及到一種組合物以及制造和使用該組合物的方法，目的在于具有生物活性的穩定的神經毒素的控制。本發明的受控釋放組合物可含有一種生物相容性的聚合物組成的聚合物基質以及該分散于生物相容性聚合物中的具有生物活性的穩定神經毒素。
定義以下定義適用于本文。
“生物相容性”意指使用該植入物時在該植入位點只有不明顯的炎癥反應。
“具有生物活性的化合物”意指一種可在受其給藥的對象體內產生有利變化的化合物。例如，“具有生物活性的化合物”包括神經毒素。
針對該具有生物活性的化合物而使用的“有效量”意指該化合物的量通常足以在該對象體內產生所需的變化。例如，在所需的效果為一種肌肉松弛性麻痹的情況下，該化合物的有效量至少導致了該所需肌肉的充分麻痹，同時并未導致不需麻痹的鄰近肌肉的充分麻痹并且并未導致顯著的全身毒性反應。
針對一種植入物的非活性成分(例如一種用于形成基質或者包被組合物的聚合物)而使用的“有效量”意指該非活性成分足以有利地影響一種具有生物活性的制劑以所需的速度在所需的期間內的釋放的量。例如，在該所需的效果為使用一種單一植入物所引起的肌肉麻痹時，該“有效量”可在60天至6年的期間促進延長該釋放。這種“有效量”可根據本說明書的指導以及本領域的常識而確定。
針對一種植入物的表面積而使用的“有效量”意指該植入物的表面積足以影響該具有生物活性的化合物的流量以產生所需的效果，例如肌肉麻痹。這一必需面積可直接通過測定所得的特定活性化合物的釋放而進行確定和調整。該植入物的表面積或者包褪層為一種膜的量，該量為對該具有生物活性的化合物進行的完整包被所必需。該表面積取決于該植入物的幾何形狀。在優選的情況下，該表面積被盡可能地最小化以降低該植入物的體積。
“植入物”意指一種受控的藥物釋放遞送系統。該植入物由一種生物相容性的聚合物或者生物陶瓷材料組成，它們含有一種載體或者它們可作為該載體發揮作用，該載體用于一種具有生物活性的分子。該植入物可經注射、插入或者移植而進入人體。
“局部給藥”意指以一種具有生物活性的化合物通過非全身途徑進行的對某組織的直接給藥，該化合物的例子如一種治療藥物。局部給藥由此而包括了，皮下、肌內、脊髓內(即，鞘內和硬膜外)、顱內和腺體內給藥。局部給藥不包括全身途徑的給藥，例如口腔或者靜脈內給藥。
“神經毒素”意指一種可干擾跨神經肌肉或者神經腺體連接的神經沖動傳遞、阻斷或者降低某種神經遞質的神經元胞吐作用或者在神經元的鈉通道電勢門處改變動作電位的藥物。神經毒素的例子包括肉毒桿菌毒素、破傷風毒素、蛤蚌毒素以及河豚毒素。
“治療”意指在一種哺乳動物體內對一種疾病的任何治療，并且包括(i)防止該疾病的發生或者(ii)抑制該疾病，即，停止它的發展；(iii)緩解該疾病，即，降低癥狀的發生率或者導致該疾病的回退。
一種用于制造本發明范圍內的用于神經毒素的受控釋放的植入物的方法可包括，將一種生物相容性的聚合物溶解于一種聚合物溶液之中以形成一種聚合物溶劑、將具有生物活性的穩定神經毒素顆粒在該聚合物溶液中進行擴散以及隨即將該聚合物進行固化以形成一種含有該神經毒素顆粒的聚合物基質。
使用本發明范圍內的用于神經毒素的受控釋放的植入物的方法可包括，通過將該植入物移植入患者而在較長時間內在該患者體內提供一種治療有效水平的具有生物活性的神經毒素。
詳述本發明基于一種發現，即，含有一種生物相容性的非生物可降解或者生物可降解性的聚合物的植入物可表現出治療有效量的神經毒素在較長時間內的體內釋放。
本發明的一種植入物可經手術而通過切開插入目的效應位點(即，用于減少肌肉痙攣的位點)，或者，該植入物可使用一種中空的針頭移植槍，例如通過美國專利No.4475,572所披露的類型進行皮下或者肌內給藥。該針頭的直徑可針對所使用的植入物的大小而進行調整。進一步，可以以本發明范圍內的植入物進行顱內植入從而向某種目標腦組織提供一種治療量的神經毒素的長期遞送。當本發明范圍內的非生物降解植入物被用盡時，該植入物的除去并非必要，這是因為該植入物由一種生物相容性的無免疫原性材料組成。
為使神經毒素穩定于能夠同適當的可形成植入物基質的聚合物進行混合的形式(即，經凍干或者冷凍干燥的粉末狀神經毒素)，或者為使神經毒素在存在于或者整合入選定聚合物的基質時穩定，可以使用各種不同的藥用賦形劑。適當的賦形劑可包括淀粉、纖維素、滑石、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、稻米、面粉、碳酸鈣、硅膠、硬脂酸鎂、硬脂酸鈉、甘油單硬脂酸酯、氯化鈉以及脫脂奶粉。
該植入物的厚度可被用于控制本發明的組合物對水的吸收以及由此而控制神經毒素從其中的釋放速度，較厚的植入物釋放多肽的速度慢于較薄的植入物。
在最初階段即爆發期(burst period)，該植入物可能迅速地釋放次最佳量的神經毒素。一般情況下這一爆發期持續不到24小時并且通常在植入后持續約一小時。此后，該植入物所釋放的神經毒素的量迅速降低并且穩定于顯著降低并且相當恒定(即，零級反應動力學)的神經毒素釋放水平。這一較長的神經毒素釋放的第二階段可延續約一年到約5或6年的時間。該第二階段的初始部分可被稱為成形期(makeup period)。
在爆發期和成形期所釋放的加和量的神經毒素在優選的情況下等于治療特定的失調或疾患的最佳量的神經毒素。成形期的時間在一定程度上短于一定的時間范圍，在該時間范圍之后該神經毒素的最佳給藥表現出顯著降低的效力。例如，為治療上肢痙孿，肌內A型肉毒桿菌毒素的最佳量可為注射入肱二頭肌的90個單位。在典型情況下，快速濃注后1-7天內所誘導出的松弛性麻痹在約3個月后基本耗盡。本發明范圍內的神經毒素皮下植入物可經設置而在植入后基本上立即(即，在爆發期間)釋放約60個單位的肉毒桿菌毒素。這一次最佳量的神經毒素提供了迅速的基本病痛解除。在第二階段該植入物連續地釋放約0.4單位/天的神經毒素，例如A型肉毒桿菌毒素，由此而使90個單位的最佳量在約75天后通過該植入物完全釋放入靶組織。
尚未鑒定出肉毒桿菌毒素能表現出高度特異親和性的突觸前神經元受體。同樣沒有已被接受的機制來說明肉毒桿菌毒素的神經元內的長半衰期。雖然如此，已知一種動力學過程發生并且造成了由肉毒桿菌毒素的給藥所產生的麻痹效果的漸進式消損，該動力學可能為該肉毒桿菌毒素受體去阻斷、復現、再合成和/或重激活，或者為新神經萌芽的出現，抑或二者兼備。因此，當在上例中，最佳量(總計90個單位)的肉毒桿菌毒素由該植入物在75天釋放時，由于肉毒桿菌毒素的效果的衰減的動力學特征，由植入物進行的毒素的后續釋放(即超過75天)不導致不需要的或多余的麻痹區域。約為需要去神經支配的組織的最佳直徑的2/3。此后神經毒素在形成期及其后的釋放提供了該組織在最佳或者所需程度上的去神經支配，并且提供了用于在該靶組織中的新近復神經化位點進行重新去神經支配的神經毒素的量。
已知瞼痙攣可通過以5單位(每隔2-4個月重復一次)的A型肉毒桿菌毒素向側面前眼瞼軟骨輪匝肌進行肌內注射來進行治療。很明顯，我們的發明范圍之內的一種單個植入物可被用于瞼痙攣的在諸如一年這樣的期間的治療。對于這種病痛以及通過神經毒素的植入物釋放的治療所選定的1年時間以及所使用聚合物的15％爆發特性，裝載入該植入物的總神經毒素可為20個單位。在爆發期間，約3單位的毒素被釋放(植入后24個小時之內)，繼之以每天約0.0467單位連續釋放(即，每天釋放約2.3皮克的BOTOX)。因此，到第42天，總量約5單位的神經毒素被釋放。在該例中釋放速度(15％爆發釋放，剩余部分在364天內釋放)為0.234％/天。在該例中，在第一天該患者接受了一個20單位的植入物，并且在一年之后將該耗盡的植入物從該患者中取出并且插入另一個20單位的植入物。這樣，將第二植入物在第365天的效果包括在內，在365天期間以25個單位進行了給藥。
由于一摩爾(M)的A型肉毒桿菌毒素復合物含有約9×105克，因此一皮克(pg)的A型肉毒桿菌毒素復合物為約1.1×10-18M。因此，0.234％/天的總摻入神經毒素的所需釋放相當于約2.53×10-18M/天的釋放。對于一年的治療期，20％爆發釋放以及隨后的364天80％的釋放的結果是約0.22％/天或者0.044單位/天或者2.2皮克/天或者2.42×1018M/天的受控釋放。從20單位的植入物的20％爆發釋放在植入后最初的約24小時內提供了4單位的神經毒素。一般情況下，該植入物的表面積相當于每y cm2的植入物表面積為x單位的毒素釋放/天。
用每次注射約5單位至約100單位的肉毒桿菌毒素注射治療不同的狀況。對于在一年時間內需要的最佳藥劑量為25單位A型肉毒桿菌毒素的狀況，對其進行治療的典型植入物可裝載有100單位的A型肉毒桿菌毒素復合物。爆發釋放可為20％，隨后在364天釋放80％，這相當于0.22％/天或者0.22單位/天或者11皮克/天或者約1.21×10-17M/天。
對于20次以25單位進行注射的5年治療期，第一次注射在零時間進行，第20次注射在第57個月進行，總系列注射量為500單位。與之對比，使用我們的發明，用于治療反應于25單位肉毒桿菌毒素，例如反應于25單位的A型肉毒桿菌毒素的狀況的一種5年植入物可以由裝載有500個毒素單位的植入物來制成，該植入物的特征在于20單位的爆發釋放(4％爆發釋放)，繼之以在1736天內進行的480單位的釋放，這相當于該植入物釋放0.267單位/天或者5.56×10-4％/天或者13.35皮克/天。
可通過將一種選定的聚合物溶解于一種適當的溶劑中來制造基質植入物。將所需量的凍干或者冷凍干燥的粉末狀神經毒素(即，用于在該治療期間進行釋放的全部所需神經毒素，例如未經重構的BOTOX)混合入這種制備溶液。這種方法可被用于制造包被的植入物微粒，其改動在于在本發明的一個實施方案中所使用的包衣為一種生物可侵蝕聚合物，該聚合物對于神經毒素是可透過的。因此，該神經毒素在該包衣降解之前并不從該基質擴散入周邊組織。
由于在pH高于7時穩定用的非毒素蛋白從肉毒桿菌毒素解離并由此造成毒性的逐步消失，用于進行肉毒桿菌毒素的混合的制備溶液或者其它溶液的pH被維持于4.2-6.8。在優選的情況下，該pH為約5-6。進一步，該混合物/溶液的溫度不應高于約35攝氏度，這是由于該毒素在高于40攝氏度的溶液/混合物中易于失去毒性。
本發明的范圍之內的，用于一種神經毒素的體內受控釋放的適當的植入物可經制備以使該植入物以連續或者脈沖方式釋放該神經毒素。“連續釋放”意指毒素在初始的爆發期之后以一種基本上是單相的方式進行釋放。連續釋放可具有一個拐點，但不具有平臺期。連續釋放并不需要每單位時間從該植入物中釋放相同量的神經毒素。脈沖釋放植入物可以雙相或者多相方式釋放神經毒素。這樣，脈沖釋放植入物可具有相對短的初始誘導(爆發)期，繼之以釋放少量或者不釋放神經毒素的時期。
具有生物活性的神經毒素的受控釋放是一種可產生治療效果的釋放，該釋放在一定時期內產生血清水平可忽略的生物活性神經毒素，該時期長于由水相神經毒素的直接給藥所獲得的作時期。在優選的情況下，受控釋放為神經毒素在約6個月或者更長時間內的釋放，并且在更優選的情況下為在約一年或者更長時間內的釋放。
本發明的范圍之內的，用于諸如肉毒桿菌毒素這樣的神經毒素的體內受控釋放的適當的植入物可表現出該神經毒素的連續釋放或者脈沖釋放。另外，該植入物可含有一種非生物可降解的或者生物可降解的聚合物材料。很明顯，我們的發明包含了(1)連續釋放的非生物可降解的神經毒素植入物；(2)連續釋放的生物可降解的神經毒素植入物；(3)脈沖釋放的非生物可降解的神經毒素植入物；和(4)脈沖釋放的生物可降解的神經毒素植入物，而且這四種類型的植入物包含內容均可經制劑化成為各種構型，這些構型適用于皮下注射或者植入，例如顆粒、片、微球體、薄膜、桿和管構型，這些構型均具有，例如，包被于貯存器上的一種或者多種包衣。
我們的發明的范圍之內的植入物可被制劑化而成為一種注射用的懸液。這樣的懸液可通過藥學領域中所熟知的工藝進行制造，例如將聚丙交酯/多肽混合物在一種超速離心研磨器中進行研磨并將經研磨和過濾的顆粒懸浮于一種注射用溶劑來，該超速離心研磨器配以一種適宜的網篩，例如120孔的，該注射用溶劑的例子如丙二醇、水、油或者其它已知的適宜注射用液體載體，在水中可根據情況加入一種傳統的粘度提高劑或者懸浮劑。
被包被的神經毒素在體內37攝氏度下較長時間后的變性可通過穩定化該神經毒素而降低，該神經毒素的穩定化通過將其同白蛋白一起凍干、從一種酸性溶液中進行凍干、從一種低含水量的溶液中凍干(對于A型肉毒桿菌毒素，這三個條件可通過使用非重構的Botox來達到)以及使用一種特定的聚合物基質組合物來進行。
在優選的情況下，具有生物活性的神經毒素的體內釋放并不在該神經毒素的釋放期間導致明顯的免疫系統反應。
基質穩定化神經毒素我們已經披露，穩定化的神經毒素可含有具有生物活性的非聚集的神經毒素，該神經毒素復合有至少一種類型的多價金屬陽離子，該離子具有二價或者更高的價態。
適當的多價金屬鹽離子包括生物相容性金屬陽離子成分中所包含的金屬離子。如果金屬陽離子成分在其用量下對于接受者無毒并且不存在對接受者身體的明顯的毒副作用或者不良效果，例如注射位點的免疫反應，則該金屬陽離子成分為生物相容性的。
在優選的情況下，對于以金屬陽離子成分進行穩定化的神經毒素，金屬陽離子成分同神經毒素的摩爾比為約4∶1至100∶1，在更為典型的情況為約4∶1至10∶1。
用于穩定化神經毒素的一種優選的金屬陽離子為Zn++。二價鋅離子之所以較為優選是因為肉毒桿菌毒素已知為一種二價鋅的肽鏈內切酶。在一個更為優選的實施方案中，包括Zn++陽離子在內的金屬陽離子成分同神經毒素的摩爾比為6∶1。
用于對神經毒素進行穩定化的金屬離子的適用性可由本領域的普通技術人員通過實施多種穩定性顯示工藝來測定，該穩定性顯示工藝的例子如聚丙烯酰胺凝膠電泳、等電聚焦、反相色譜、HPLC以及效力檢驗，該效力檢驗針對含有金屬陽離子的神經毒素凍干顆粒進行，以此測定該神經毒素在凍干之后以及從微顆粒中釋放期間的效力。在穩定化的神經毒素中，通過該神經毒素同至少一種類型的金屬陽離子在該神經毒素同聚合物溶液接觸前的復合，降低了神經毒素在體內水合期間在微顆粒中發生聚集和/或由于形成受控釋放組合物的過程或者由于受控釋放組合物的化學性質而失去生物活性或者效力的傾向性。
通過我們的發明，穩定化的神經毒素通過穩定化而防止了其在受控釋放期間顯著的體內聚集。顯著的聚集被定義為一定量的聚集，該量的聚集導致了15％或更多的包被于聚合物中或者摻入聚合物基質中的神經毒素的聚集。在更優選的情況下，聚集被維持低于存在于聚合物中的神經毒素的約2％。
神經毒素受控釋放組合物中的神經毒素還可以同其它賦形劑進行混合，例如增量劑或者額外的穩定化試劑，如用于在凍干期間對該神經毒素進行穩定化的緩沖液。
增量劑一般含有惰性材料。適當的增量劑為本領域的技術人員所知。
適用于本發明的受控釋放組合物的聚合物或者聚合物基質必須具有生物相容性。如果一種聚合物以及該聚合物的任何一種降解產物對于接受者沒有毒性并且對接受者身體并不產生明顯的傷害或者不良作用，例如在注射位點的免疫反應，該聚合物為生物相容性的。
神經毒素受控釋放組合物的聚合物可由生物可降解材料制成。根據本文的定義，生物可降解指的是該組合物將在體內經過降解或者侵蝕而形成化學物質。降解可通過酶、化學和物理過程所導致。
適當的生物相容性的生物可降解聚合物包括，例如，聚丙交酯、聚乙交酯、聚丙交酯共聚乙交酯、聚乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸共聚羥基乙酸、聚己內酰胺、聚碳酸酯、聚酯酰胺、聚酐、聚氨基酸、聚原酸酯、聚氰基丙烯酸酯、聚二噁烷酮、聚草酸烷基酯、生物可降解的聚氨基甲酸乙酯，以及它們的混合物和共聚物。
進一步，該聚合物的末端功能可進行修飾。例如，聚酯可為一種封端、非封端的聚合物或者二者的混合物。根據本領域的經典定義，封端的聚合物特異性地具有封端的羧基末端基團。一般來說，封端基團來自于聚合化的起始物并且在典型的情況下為一種烷基。未封端的聚合物一般具有游離的羧基末端基團。
對于用于本發明的生物可降解的聚合物來說可接受的分子量可通過本領域的普通技術人員考慮一定的因素來確定，這些因素的例子如，所需的聚合物降解速度、諸如機械強度這樣的物理性質、以及聚合物在溶劑中的溶解速度。在典型的情況下，可接受的分子量范圍為約2,000道爾頓至約2,000,000道爾頓。在一個優選的實施方案中，該聚合物為一種生物可降解的聚合物或者共聚物。在一個更為優選的實施方案中，該聚合物為一種聚丙交酯共聚乙交酯(后文稱為“PLGA”)，其丙交酯∶乙交酯之比約為1∶1，并且分子量約為5,000道爾頓至70,000道爾頓。在一個更為優選的實施方案中，用于本發明的PLGA的分子量約為6,000道爾頓至31,000道爾頓。
包含于一劑受控釋放微顆粒或者別的受控釋放系統中的神經毒素的量，包括生物活性的穩定化的神經毒素顆粒在內，為一種治療或者預防處理上有效的量，該量可由本領域中的普通技術人員考慮一些因素進行確定，這樣的因素的例子如，體重、待治療的狀況、所使用的聚合物的類型以及從該聚合物中的釋放速度。
在一個實施方案中，神經毒素受控釋放組合物含有約10-4％(w/w)至1％(w/w)的生物活性的穩定化神經毒素。所使用的神經毒素顆粒的量根據所需的效果、計劃的釋放水平、應當釋放該神經毒素的時間而變。神經毒素顆粒加載量的優選的范圍為約10-4％(w/w)至約0.1％(w/w)的神經毒素顆粒。更為優選的神經毒素加載量范圍為約10-3％(w/w)至約1％(w/w)的神經毒素，最為優選的生物活性穩定化神經毒素顆粒加載量為約10-2％(w/w)。
在另一個實施方案中，神經毒素受控釋放組合物還含有第二種金屬陽離子成分，該成分并不包含于穩定化的神經毒素顆粒中，并且該成分分散于該聚合物中。這第二種金屬陽離子成分在優選的情況下含有與穩定化的神經毒素所含相同的金屬陽離子種類。或者，這第二種金屬陽離子成分可含有一種或者多種不同種類的金屬陽離子。
這第二種金屬陽離子成分作用于調控該神經毒素從聚合物基質中的釋放，例如，通過作為金屬離子的一種貯存器發揮作用以進一步延長神經毒素受金屬陽離子穩定化的時間長度，從而增強該神經毒素在該組合物中的穩定性。
在對釋放進行調控中所使用的金屬陽離子成分在典型的情況下含有至少一種類型的多價金屬陽離子。適于對神經毒素的釋放進行調控的第二種金屬陽離子成分的例子包括或含有，例如，Mg(OH)2、MgCO3(例如4MgCO3Mg(OH)25H2O)、ZnCO3(例如3Zn(OH)22ZnCO3)、CaCO3、Zn3(C6H5O7)2、Mg(OAc)2、MgSO4、Zn(OAc)2、ZnSO4、ZnCl2、MgCl2以及Mg3(C6H5O7)2。第二種金屬陽離子成分同聚合物的適當的比例為重量比約1∶99至約1∶2。這一最佳比例取決于所使用的聚合物和第二種金屬陽離子。
本發明的神經毒素受控釋放組合物可形成多種形狀，例如薄膜、顆粒、柱體、片或者微顆粒。根據本文定義，微顆粒含有一種聚合物成分，該顆粒的直徑低于約1毫米并且在其中散布有穩定化的神經毒素顆粒。微顆粒可具有球形、非球形或者不規則形狀。在優選的情況下微顆粒為一種微球體。典型情況下，該微顆粒的大小應適于注射。微顆粒的優選的大小為直徑約1至約180微米。
本發明的用于形成一種進行生物活性的非聚集神經毒素的受控釋放的組合物的方法中，適量的具有生物活性的穩定化的神經毒素被分散于一種聚合物溶液中。
一種適當的聚合物溶液含有約1％(w/w)至約30％(w/w)的適當的生物相容性聚合物，其中該生物相容性聚合物在典型情況下溶解于一種適當的聚合物溶劑中。在優選的情況下，聚合物溶液含有約2％(w/v)至約20％(w/v)的聚合物。含有約5％(w/v)至約10％(w/n)聚合物的聚合物溶液最為優選。
根據本文定義，適當的聚合物溶劑中該聚合物可以溶解，但在其中穩定化的神經毒素顆粒基本不溶并且無反應性。適當的聚合物溶劑的例子包括極性有機液體，例如二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯和丙酮。
為制備具有生物活性的穩定化的神經毒素，將神經毒素在一種適當的水性溶劑中，同至少一種適當的金屬陽離子成分一起，在適于形成金屬陽離子和神經毒素的復合物的pH條件下進行混合。在典型情況下，復合的神經毒素應為不透明的沉淀物，該沉淀物懸浮于該溶劑中。但是，該復合神經毒素亦可處于溶液之中。在一個甚至更優選的實施方案中，神經毒素同Zn++進行復合。
用于形成一種神經毒素復合物的適當的pH條件在典型的情況下包括約5.0至約6.9之間的pH值。適當的pH條件在典型的情況下通過使用一種含水的緩沖液作為溶劑來獲得，例如碳酸氫鈉。
適當的溶劑是那些可使神經毒素以及金屬陽離子成分在其中至少微量可溶的溶劑，例如水性碳酸氫鈉緩沖液。對于水溶劑，在優選的情況下，所使用的水為去離子水或者注射用水(WFI)。
在同金屬陽離子成分進行接觸之前，該神經毒素可處于固態或者溶解態。另外，在同神經毒素進行接觸之前，該金屬陽離子可處于固態或者溶解態。在一個優選的實施方案中，神經毒素的一種含水的緩沖溶液同該金屬陽離子成分的一種水溶液進行混合。
在典型的情況下，復合的神經毒素應處于渾濁的沉淀物形式下，該沉淀物懸浮于該溶劑之中。但是，該復合的神經毒素也可處于溶液狀態下。在一個優選的實施方案中，該神經毒素同Zn++進行復合。
復合于Zn++的神經毒素可通過諸如凍干這樣的方法進行干燥，從而形成穩定化的神經毒素微粒。懸浮狀態或者溶液之中的復合Zn++的神經毒素可經過大體積的凍干或者被分成較小體積然后凍干。在一個優選的實施方案中，使復合Zn++的神經毒素懸液體積減小，例如通過使用超聲噴嘴，并且隨后進行凍干從而形成穩定化的神經毒素顆粒。用于對復合Zn++的神經毒素混合物進行凍干的方法包括本領域所已知的方法。
在優選的情況下，穩定化的神經毒素顆粒直徑為約1-6微米。該神經毒素顆粒可分開地進行碎片化，或者，該神經毒素顆粒可在被加入至一種聚合物溶液中后進行碎片化，碎片化的方法的例子如通過超聲探頭或者超聲噴嘴的手段。
在另一個實施方案中，第二種金屬陽離子成分也被懸浮于該聚合物溶液中，該成分并不包含于該穩定化的神經毒素顆粒之內。
應當理解，第二種金屬陽離子成分和穩定化的神經毒素可按順序、以相反順序、間歇地、分開地或者通過同時添加而分散入一種聚合物溶液。在替代情況下，一種聚合物、第二種金屬陽離子成分和穩定化的神經毒素可按順序、以相反順序、間歇地、分開地或者通過同時添加來進行混合。
在這種方法中，該聚合物溶液隨后固化以形成一種聚合物基質，該基質含有穩定化的神經毒素顆粒的一種分散物。
用于從一種聚合物溶液形成一種神經毒素受控釋放組合物的適當的方法為溶劑蒸發法，該方法在美國專利No.3,737,337；3,523,906；3,691,090以及4,389,330中有所描述。溶劑蒸發可被用作為形成神經毒素受控釋放微顆粒的方法。
在溶劑蒸發法中，含有一種穩定化的神經毒素顆粒分散物的聚合物溶液被進行混合或者以連續相進行攪拌以形成一種乳劑，在其中該聚合物溶劑是部分可溶混的。該連續相通常為一種水性溶劑。在該連續相中通常包含有乳化劑以穩定該乳劑。該聚合物溶劑隨后進行幾個小時或者更長時間的蒸發，由此而使該聚合物固化以形成一種聚合物基質，該基質中含有穩定化的神經毒素顆粒的分散物。
用于由一種聚合物溶液而形成神經毒素受控釋放微顆粒的優選的方法在美國專利No.5,019,400中有所描述。同其它方法相比，例如同相分離法相比，這種微球體形成方法額外降低了產生具有特定的神經毒素含量的受控釋放組合物所需的神經毒素的量。
在這一方法中，含有穩定化的神經毒素顆粒分散物的該聚合物溶液經加工而產生一些小滴，其中至少相當一部分的小滴含有聚合物溶液和穩定化的神經毒素顆粒。隨后通過適于形成微顆粒的方法進行冷凍。用于加工該聚合物溶液分散物以形成小滴的方法的例子包括將該分散物導向通過一種超聲噴嘴、壓力噴嘴、瑞利噴射器(Rayleighjet)或者通過其它用于由溶液形成小滴的設備。
適用于對小滴進行冷凍以形成微顆粒的設備包括將這些小滴導入或者靠近一種液化氣體，例如液氬和液氮，從而形成冷凍的微顆粒，隨后將這些微顆粒同該液態氣體相分離。冷凍的微液滴隨后被暴露于一種液態非溶劑，例如乙醇或者混合以己烷或者戊烷的乙醇。
冷凍的微液滴中的溶劑以液態和/或固態被抽提進入該非溶劑從而形成了含有微顆粒的穩定化的神經毒素。將乙醇與其它非溶劑進行混合，例如與己烷或者戊烷混合，可提高從特定的聚合物中進行溶劑抽提的速度，該速度高于通過單獨使用乙醇所獲得的速度，該聚合物的例子如聚(丙交酯共乙交酯)聚合物。
通過改變小滴的大小可制造出較大體積范圍的神經毒素受控釋放微顆粒，改變的方法的例子如，改變超聲噴嘴的直徑。如果需要很大的微顆粒，該微顆粒可通過用一個注射器直接注入冰冷液體。提高該聚合物溶液的粘度亦可增加微顆粒的大小。通過這一過程可產生一定大小的微顆粒，例如直徑約1000至約1微米的微顆粒。
另一種用于由聚合物溶液形成神經毒素受控釋放組合物的方法包括薄膜成形，例如在一種模具中進行，從而形成一種薄膜或者一種模型。例如，在將含有穩定化的神經毒素顆粒的分散物的聚合物溶液置入模具后，隨后通過本領域的已知方法除去聚合物溶劑，或者降低該聚合物溶液的溫度，直至獲得具有相符的干重的薄膜或者模型。
對于生物可降解的聚合物植入物，神經毒素的釋放是由于該聚合物的降解。降解的速度可通過改變影響聚合物的水合速度的性質來進行控制。這些性質包括，例如，形成該聚合物的不同的單體的比例，例如丙交酯和乙交酯；一種單體的L-異構體代替外消旋混合物的使用；以及該聚合物的分子量。這些性質可影響親水性和結晶性，這控制了該聚合物水合的速度。諸如鹽、碳水化合物和表面活性劑等疏水賦形劑也可被引入以增強水合作用，并且這些可以改變聚合物的侵蝕速度。
通過改變生物可降解聚合物的性質，可以控制擴散和/或聚合物降解對于神經毒素釋放所產生的貢獻。例如，提高聚(丙交酯共乙交酯)聚合物中乙交酯的含量并且降低該聚合物的分子量可增強該聚合物的水解作用并由此而提供了一種由聚合物侵蝕而產生的較高的神經毒素釋放。另外，聚合物水解的速度在非中性pH下會有所提高。因此，可向用于形成微球體的聚合物溶液中加入一種酸性或者堿性賦形劑以改變該聚合物的侵蝕速度。
我們的發明的組合物可通過非全身該藥途徑，例如通過植入(例如，皮下、肌內、顱內和)對人類或者其它動物進行給藥，從而提供所需劑量的神經毒素，該劑量基于以神經毒素對多種醫學狀況進行治療的已知參數。
適于給藥的具體植入劑量可由本領域的普通技術人員根據上文所討論的因素很容易地確定。該劑量還可能依賴于待治療或者去神經支配的組織大小以及該毒素的商業制劑。另外，對人體內的使用劑量的估計量還可由其它組織的有效去神經支配所需的肉毒桿菌毒素的確定量推導得出。因此，用于注射的A型肉毒桿菌毒素的量正比于待處理的組織的質量和活性水平。一般情況下，該植入物在每單位時間(即，每2-4月一次或者一段時間)內可釋放每千克患者體重約0.01單位至約35單位肉毒桿菌毒素，從而有效地獲得所需的肌肉麻痹。低于約0.01U/kg的肉毒桿菌毒素對于肌肉并不具有明顯的治療效果，而高于約35U/kg的肉毒桿菌毒素接近于神經毒素，例如A型肉毒桿菌毒素的毒性水平。小心地制備并且置放該植入物可防止大量的肉毒桿菌毒素在全身出現。一個更為優選的劑量范圍為約0.01U/kg至約25U/kg的肉毒桿菌毒素，如制劑化為BOTOX的內毒桿菌毒素。用于給藥的以u/kg表示的肉毒桿菌毒素的實際量取決于待治療組織的范圍(質量)和活性水平以及選擇的給藥途徑。A型肉毒桿菌毒素是用于本發明的方法中的優選肉毒桿菌毒素。
用于實施本發明范圍內的方法的神經毒素為肉毒桿菌毒素，如血清型A，B，C，D，E，F或G肉毒桿菌毒素之一。所使用的肉毒桿菌毒素優選為A型肉毒桿菌毒素，這是因為其在人類中的高效力、容易獲得以及通過肌內注射對其進行局部給藥用于治療骨骼肌和平滑肌失調時的有效用途。
本發明在其范圍內包括了任意一種神經毒素的使用，該毒素在被用于治療一種運動失調或者由膽堿能的神經支配所影響的病痛時具有一種長期的治療效果。例如，由產毒素梭菌，如，肉毒梭狀芽孢桿菌、丁酸梭菌和巴氏梭菌，可被用于或者改造用于本發明的方法。另外，肉毒桿菌毒素血清型A、B、C、D、E、F或G均可被有利地用于本發明的實施，盡管根據上文的解釋A型是最為優選的血清型。本發明的實施可提供從一個月至約5或6年的有效病痛緩解。
本發明在其范圍內包括(a)通過細菌培養、毒素抽提、濃縮、保存、冷凍干燥和/或重構而獲得或者加工的神經毒素復合物以及純凈的神經毒素；以及(b)經修飾或者重組的神經毒素，該神經毒素有一個或者多個氨基酸被有目的地刪除、通過已知的化學/生化氨基酸修飾程序或者通過使用已知的宿主細胞/重組載體重組技術進行修飾或者替換，還包括通過這樣的方法制造的神經毒素的衍生物或者片段，并且包括一些神經毒素，這些神經毒素具有一個或者多個同其相連的靶定部分，該部分針對一種存在于某種細胞上的細胞表面受體。
用于本發明的肉毒桿菌毒素可以凍干或者真空干燥的形式在容器中真空貯藏。在凍干之前，該肉毒桿菌毒素可同藥學可接受的賦形劑、穩定劑和/或者載體，例如白蛋白，進行結合。凍干或者真空干燥的材料可以以鹽水或者水進行重構。
我們的發明還在其范圍內包括了一種植入的受控釋放神經毒素復合物的應用，該應用是為了提供一種慢性失調的治療緩解，該失調的例子如運動失調。因此，該神經毒素可被一種適當的聚合物基質所包埋、吸收或者攜帶，該基質可被植入或者包被入皮下從而向所需的靶組織提供一年或者更長時間的該神經毒素的受控釋放。允許多肽藥物的受控釋放的可植入的聚合物是已知的，并且可被用于制備一種適于插入或者皮下粘附的肉毒桿菌毒素植入物。例見，Pain 1999；82(1)49-55；Biomaterails 1994；15(5)383-9；Brain Res 1990；515(1-2)309-11以及美國專利號6,022,554；6,011,011；6,007,843；5,667,808和5,980,945。
用于確定給藥的適宜路線和劑量的方法一般由參治醫師根據病例決定。對于本領域的技術人員這樣的判定是常規行為(例見，Harrison′s Principles of Internal Medicine(1998)，edited byAnthony Fauci et al.，14thedition，published by McGraw Hill)。
實施例以下的實施例闡述了本發明包含的具體的組合物以及方法并且并非意圖限制我們的發明的范圍。
實施例1Zn++穩定化的神經毒素的形成一百個單位的某種神經毒素，如未經重構的Botox，被溶解于碳酸氫鈉緩沖液(pH6.0)以形成一種神經毒素溶液。由去離子水和二水合乙酸鋅形成一種Zn++溶液并且隨后將其輕輕攪拌加入神經毒素溶液中以形成一種Zn++神經毒素復合物。隨后通過加入1％的乙酸而將該Zn++神經毒素復合物的pH調節至6.5到6.9。由此形成了一種含有不溶的Zn++穩定化的神經毒素的混濁懸浮沉淀物。由此制成了一種神經毒素(例如A型肉毒桿菌毒素)復合物，該毒素經穩定化而在隨后摻入聚合物植入物基質時不產生嚴重的聚集。
實施例2神經毒素受控釋放顆粒適于摻入一種聚合物或者可聚合溶液的神經毒素可為A型肉毒桿菌毒素(例如Botox)，該毒素可以以一種冷凍干燥粉末的形式購得。另外，可將多種聚合物和共聚物進行混合并且以一種干燥狀態進行貯藏，該貯藏過程對最終的植入物的效果并無影響。例如，一種使用UV固化引發劑的丙烯酸酯共聚物。該神經毒素可如上文實施例1所描述的那樣同Zn++進行復合。Zn++穩定化的神經毒素復合物隨后同未固化的丙烯酸酯共聚物、UV引發劑和某種酸(pH介于5.5和6.8)進行混合。將該混合物置入一種玻璃或者透明的塑料顆粒模具，該模具可允許UV光線透過。將該模具置入一種20℃下的溫控水浴之中。以紫外光使顆粒固化的50秒，將顆粒包裝并進行滅菌。UV固化過程的時間和強度應使低量的神經毒素被破壞或者變性。
該顆粒的大小以及顆粒中的神經毒素的含量由所需的應用所限定。當顆粒被植入時，該顆粒在體內進行水合，該過程稍微延遲了在該神經毒素從植入物中的初始爆發。以濃度為初始爆發所需的一部分神經毒素包被于該顆粒之外可抵消這種延遲。在本實施例中，該顆粒的效果應約為4到6個月。
實施例3神經毒素受控釋放制劑為提高該顆粒有效遞送神經毒素的時間可使用多層的材料。這樣，內層材料可由聚乙烯吡咯烷酮/甲基丙烯酸甲酯共聚物制成。這種材料可維持高濃度的神經毒素復合物。將適量的神經毒素可如上文實施例1所描述的那樣同Zn++進行復合并且該復合物隨后同未凝固的共聚物、低溫引發劑和某種酸(pH介于5.5和6.8)進行混合。將該混合物置于一種玻璃或者塑料顆粒模具之中。將該模具置入一種約35℃下的溫控水浴之中約6到8小時。這形成了長期受控釋放所需的神經毒素的貯存器。
為延長該神經毒素的釋放，隨后將第二種材料固化于該初始顆粒之周圍。該材料經過高分子密度和生物相容性的選擇。聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)是具有這樣的特征的材料的例子。將該顆粒(上述的)同未固化的PMMA/低溫引發劑一起置于一種模具(插入成型)之中。未固化PMMA的二次包被對于確保該顆粒的均一包被可能是必需的。在優選的情況下，該PMMA的厚度為0.5mm。在成型之后，以所需的初始爆發濃度的神經毒素對該顆粒的外部進行包被。該PMMA層應厚得足以產生貯存器中的神經毒素的延遲(高達3個月)。當該神經毒素達到該植入物的表面時可獲得神經毒素的第二次較大爆發。這種二次爆發將繼以長約3個月的該神經毒素的緩慢減速釋放。在該實施例中，該顆粒效力約為7到9個月。
實施例4多層神經毒素受控釋放植入物通過使用多層——高密度聚合物/低密度聚合物w/神經毒素——可以增加神經毒素受控釋放的時間范圍，但該植入物的大小也可能提高了。隨著該植入物的大小的增加，該神經毒素在體內擴散到更大的區域，這可能會降低該植入物的效力。為避免這種情況，將該植入物被包入一種非透性的材料，例如鈦。保持一個小的開口用于該神經毒素從包被的顆粒中的精確定點釋放。這在一般情況下可有效地使該植入物具有顯著不同的釋放特征。這樣做基本上還可以允許神經毒素可通透的較厚的聚合物切片，這有效地提高了該神經毒素釋放的持續時間。
內層材料可由諸如聚乙烯吡咯烷酮/甲基丙烯酸甲酯共聚物這樣的物質制成。這種物質可維持高濃度的神經毒素復合物。該神經毒素被復合以Zn++。隨后將該復合物同未固化的共聚物、低溫引發劑和某種酸(pH介于5.5和6.8)進行混合。將該混合物置于一種玻璃或者塑料顆粒模具之中。將該模具置入一種35℃下的溫控水浴之中約6到8小時。這形成了長期受控釋放所需的神經毒素的貯存器。
為延長該神經毒素的釋放，隨后將第二種材料固化于該初始顆粒之周圍。將該顆粒(上述的)同未固化的PMMA/低溫引發劑一起置于一種模具(插入成型)之中。未固化PMMA的二次包被對于確保該顆粒的均一包被可能是必需的。在理想的情況下，該PMMA的厚度為0.5mm。為形成多層，根據上文所述應用了相同的插入成型工藝。
當完成了最后一層的高密度聚合物，使用一種鈦顆粒作為模具。將該顆粒同未固化的PMMA一同置于該鈦顆粒之中。封閉該顆粒的蓋子并將之置入35℃下的強制通風爐中約6到8小時。該顆粒的蓋子上具有一個22號開口用于該神經毒素的釋放。在本實施例中，該顆粒的效力約為10個月到24個月。
實施例5具有分層柱的神經毒素植入物為在較長的時間范圍內維持釋放，一種替代性的方法是將一種高密度聚合物/低密度聚合物w/神經毒素的層結構置入上述的鈦顆粒之中。對于應用的每一層，固化過程可在35℃下的強制通風爐中進行約6到8小時。該顆粒的直徑應是所用的神經毒素的量的關鍵性決定因素。層的數量可決定該植入物將維持效力的時間。對于各層，PMMA層的厚度可為約0.5mm并且該低密度聚合物w/神經毒素可為約0.3mm。每加一層可獲得約3個月的效力提高。具有2年壽命的植入物可通過將該植入物的長度提高至約6.4mm，加上約1mm的鈦殼橫斷面總計約7.4mm。
在此披露的本發明的組合物和方法具有眾多優勢，包括以下部分1.一種單一植入物可被用于提供治療效果，該治療效果為一種神經毒素在一年或者更長的時間內的連續或者脈沖式給藥。
2.該神經毒素被遞送入一種局部組織區域而并無顯著量的神經毒素出現在全身。
3.對患者的后期護理的需求降低。
4.對神經毒素的周期性注射以治療某種狀況的需求降低，該癥狀的例子如神經肌肉失調。
5.由于所需注射數的減少而帶來的患者舒適度的提高。
6.患者依從性的提高。
我們的神經毒素受控釋放制劑的一個優勢包括了在靶組織產生長期的穩定的治療水平的神經毒素。這些優勢還包括通過降低需要的注射數量而提高患者依從性以及接受程度。
在此引及的所有參考文獻、文章、出版物和專利應用均全文引為參考。
盡管本發明已經通過具體的優選方法進行了詳細描述，本發明范圍內的其它的實施方案、版本以及修正是可能存在的。例如，多種神經毒素可被有效地應用于本發明的方法中。另外，本發明包括了局部(即，肌內、腺體內、皮下和顱內)給藥方法，其中，通過植入物，兩種或者多種神經毒素，如兩種或者多種肉毒桿菌毒素，被同時給藥或者先后給藥。例如，A型肉毒桿菌毒素可通過植入物進行給藥直至失去臨床反應或者產生中和抗體，隨后通過植入物以B型或者E型肉毒桿菌毒素進行給藥，或者，可以以肉毒桿菌毒素血清型A-G中的任意兩種或者多種的組合進行局部給藥以控制所需治療結果的發生和持續時間。進一步，可通過植入物在神經毒素的給藥之前、同時或者之后以非神經毒素化合物進行給藥，從而在該神經毒素，如肉毒桿菌毒素開始產生其治療效果之前提供一種輔助效果，如去神經支配的增強或者更快的發生。
我們的發明在其范圍內還包括了一種諸如肉毒桿菌毒素這樣的神經毒素在制備用于治療一種運動失調和/或由膽堿能神經支配所影響的失調的藥物中的應用，該藥物的例子如一種受控釋放植入物，該治療通過經該神經毒素植入物進行的局部給藥而進行。
因此，以下權利要求的精神和范圍應不受限于上文所進行的優選
權利要求
1.一種受控釋放系統，該系統含有(a)一種聚合物基質，以及；(b)一定量的神經毒素，該毒素位于該聚合物基質內，其中分部量的該神經毒素可在較長的時間范圍內從該聚合物基質中釋放，同時不產生明顯的免疫系統反應。
2.權利要求1的受控釋放系統，其中的神經毒素從該聚合物基質中以一種基本上連續或者單相的方式進行釋放。
3.權利要求1的受控釋放系統，其中神經毒素從聚合物基質中釋放的時間范圍為約10天至約6年。
4.權利要求1的受控釋放系統，其中該聚合物基質由一種基本為非生物可降解的物質組成。
5.權利要求1的受控釋放系統，其中該神經毒素包括一種多肽。
6.權利要求1的受控釋放系統，其中該神經毒素包括一種突觸前神經毒素。
7.權利要求1的受控釋放系統，其中該神經毒素為一種梭菌神經毒素。
8.權利要求1的受控釋放系統，其中該神經毒素為一種肉毒桿菌毒素。
9.權利要求1的受控釋放系統，其中該神經毒素為一種肉毒桿菌毒素，該毒素選自A、B、C、D、E、F和G型肉毒桿菌毒素。
10.權利要求1的受控釋放系統，其中該神經毒素為A型肉毒桿菌毒素。
11.權利要求1的受控釋放系統，其中組成該聚合物基質的聚合物選自甲基丙烯酸酯、乙烯基吡咯烷酮、乙烯醇、丙烯酸、聚甲基丙烯酸甲酯、硅氧烷、乙酸乙烯酯、乳酸、乙醇酸、膠原和生物陶瓷聚合物及它們的共聚物。
12.權利要求1的受控釋放系統，其中一定量的神經毒素為約1個單位至約50,000個單位的一種肉毒桿菌毒素。
13.權利要求1的受控釋放系統，其中一定量的神經毒素為約10個單位至約2,000個單位的A型肉毒桿菌毒素。
14.權利要求1的受控釋放系統，其中一定量的神經毒素為約100個單位至約30,000個單位的B型肉毒桿菌毒素。
15.權利要求1的受控釋放系統，其中該神經毒素為一種肉毒桿菌毒素，該毒素以一定量進行釋放，該釋放量在植入系統附近有效地導致一塊肌肉或者肌肉群的松弛性肌肉麻痹。
16.一種受控釋放系統，該系統含有a)一種聚合物基質，以及；b)位于該聚合物基質中的約10個單位至約20,000個單位的肉毒桿菌毒素，其中分部量的該肉毒桿菌毒素可在約2個月至約5年的較長時間范圍內從該聚合物基質中釋放，同時不產生明顯的免疫系統反應。
17.一種用于制造受控釋放系統的方法，該方法包括以下步驟(a)將一種聚合物物溶于一種溶劑以形成一種聚合物溶液；(b)將一種神經毒素混合或分散于該聚合物溶液中以形成一種聚合物-神經毒素混合物，以及；(c)使該聚合物-神經毒素混合物凝固或者固化，由此制成了一種受控釋放系統。
18.權利要求17的方法，該方法在混合步驟之后進一步包括了蒸發溶劑的步驟。
19.一種用于使用一種連續釋放系統的方法，該方法包括對一種受控釋放系統進行注射或者植入，以此對某種運動失調或者由膽堿能神經支配所影響的失調進行治療，該受控釋放系統含有一種聚合物基質和一種神經毒素。
20.一種用于制造與金屬陽離子復合的神經毒素的方法，該方法以下包括步驟(a)形成一種含有神經毒素的溶液；(b)將一種多價金屬陽離子成分同該神經毒素溶液進行混合從而將該多價金屬陽離子同該神經毒素復合，由此而形成了一種與金屬陽離子復合的神經毒素懸液，以及；(c)干燥所述的懸液以形成所述與金屬陽離子復合的神經毒素。
全文摘要
一種生物相容性植入物，該植入物用于在一個月至5年的一段治療期內進行某種神經毒素的連續體內釋放。該植入物可由一種聚合物和神經毒素的溶液凝固而成，該聚合物的例子如乙酸乙基乙烯酯共聚物。該神經毒素可為一種肉毒桿菌毒素。
文檔編號A61K38/48GK1446081SQ01813759
公開日2003年10月1日 申請日期2001年5月25日 優先權日2000年6月2日
發明者S·多諾萬, D·G·布拉迪 申請人:阿勒根公司