促生長素抑制素類似物的制作方法

專利名稱：促生長素抑制素類似物的制作方法
技術領域：
本發明涉及促生長素抑制素肽模擬物、其生產方法以及含有它們的藥物制劑。
更具體地講，本發明提供了下式的化合物 也稱為環[{4-(NH2-C2H4-NH-CO-O-)Pro}-Phg-DTrp-Lys-Tyr(4-Bzl)-Phe]，在本文中稱為化合物A，其非對映異構體及其混合物，其游離的形式、鹽或絡合物的形式或保護的形式。Phg表示-HN-CH(C6H5)-CO-，Bzl表示芐基。
化合物A的保護形式與上面的分子相對應，其中至少有一個氨基被保護起來，通過脫保護可以得到化合物A，優選生理學可除去的形式。適宜的氨基保護基是例如在“Protective Groups in Organic Synthesis”，T.W.Greene，J.Wiley & Sons NY(1981)，219-287中所公開的基團，其內容在此引入作為參考。該類氨基保護基的實例是乙酰基。
當化合物A以絡合物形式存在時，其一般是在Pro的側鏈氨基上帶有螯合基團并且與可檢測的元素或放射性治療的元素絡合的化合物A。帶有螯合基團的化合物A在這里被稱為偶聯的化合物A。
螯合基團的實例包括例如那些從多氨基多羧酸或酸酐衍生的基團，例如那些從非環狀配體例如二亞乙基三胺五乙酸(DTPA)、乙二醇-O，O′-二(2-氨基乙基)-N，N，N′，N′-四乙酸(EGTA)、N，N′-二(羥基芐基)乙二胺-N，N′-二乙酸(HBED)和三亞乙基四胺六乙酸(TTHA)衍生的基團、那些從取代的DTPA例如對-異硫氰酸根合-芐基-DTPA衍生的基團、那些從大環配體例如1，4，7，10-四氮雜環十二烷-N，N′，N″，N-四乙酸(DOTA)和1，4，8，11-四氮雜環十四烷-N，N′，N″，N-四乙酸(TETA)或1，4，7，10-四氮雜環十三烷-N，N ′，N″，N-四乙酸(TITRA)衍生的基團。
螯合基團可以直接連接在Pro的側鏈氨基上，或者可以通過一個間隔基連接在其上。適宜的間隔基包括本領域已知的那些，例如在GB-A-2,225,579中所公開的那些，例如氨基羧酸的二價殘基，例如β-Ala或從6-氨基-己酸衍生的二價殘基。
優選的螯合基團是從DTPA、DOTA或TETA衍生的基團。首選從DTPA或DOTA衍生的螯合基團。
可檢測的元素指的是在體內診斷技術中能表現出可檢測的性質的任何元素，優選金屬離子，例如能發出可檢測的放射線的金屬離子或能影響NMR馳豫特性的金屬離子。放射性治療的元素指的是可以發出對所治療的病癥具有有益作用的放射線的任何元素。
適宜的元素的包括例如重元素或稀土離子，例如用于CAT掃描(計算機控制軸向X線斷層照相術)中的離子、順磁離子，例如Gd3+、Fe3+、Mn2+和Cr2+、熒光金屬離子，例如Eu3+、以及放射性核素例如放射性鑭系元素，特別是發射γ-射線的放射性核素、發射β謝線的放射性核素、發射α-射線的放射性核素、發射Auger-e-的放射性核素或發射正電子的放射性核素，例如68Ga、18F或86Y。
適宜的發射γ-射線的放射性核素包括診斷技術中所用的那些。該發射γ-射線的放射性核素有利的具有1小時至40天、優選5小時至4天、更優選12小時至3天的半衰期。其實例有放射性同位素鎵、銦、锝、鐿、錸、鋱、镥、鉈和釤，例如67Ga、111In、99mTc、161Tb、169Yb、186Re或177Lu。
適宜的發射β-射線的放射性核素包括放射性治療中所用的那些，例如90Y、67Cu、186Re、188Re、169Er、121Sn、127Te、177Lu、143Pr、198Au、109Pd、165Dy、142Pr或153Sm。
適宜的發射α-射線的放射性核素是治療用的那些，例如211At、212Bi或201Tl。
化合物A可以以例如游離形式或鹽的形式存在。鹽包括酸加成鹽，例如與無機酸、高分子酸或有機酸形成的鹽，例如與鹽酸、乙酸、乳酸、天冬氨酸、苯甲酸、琥珀酸或雙羥萘酸成的鹽。酸加成鹽可以以單價或二價鹽的形式存在，這取決于向游離堿形式的化合物A中加入的是1當量還是2當量的酸。優選的鹽是乳酸鹽、天冬氨酸鹽、苯甲酸鹽、琥珀酸鹽和雙羥萘酸鹽，包括其單鹽或二鹽，更優選天冬氨酸二鹽和雙羥萘酸單鹽。
當螯合基團中存在羧酸基團時，偶聯的化合物A還可以以例如堿金屬鹽如鈉或鉀鹽或取代或未取代的銨鹽的形式存在。
本發明還包括一種生產化合物A的方法。其可以用類似于已知方法的方法來生產，例如a)將保護了的、與聚合物結合的或未保護形式的直鏈的肽以能夠得到化合物A的方式進行環合，然后任選地除去保護基，b)為了生產偶聯的化合物A，將螯合基團與保護了的或未保護形式的化合物A連接在一起，然后任選地除去保護基，然后回收所形成的游離形式、鹽形式或任選地與可檢測的元素或放射性治療的元素相絡合的化合物A或偶聯的化合物A。
一般而言，選擇哪種氨基酸在C末端位置上作為肽鏈的開始并不是關鍵，因為直鏈的肽將被環合，只要直鏈肽中的氨基酸序列與化合物A中的相對應即可。但可能會有一些其它的因素導致一種起始氨基酸比另一種更優選。當化合物A是通過固相合成進行制備時，優選通過適宜的連接基將第一個氨基酸連接到樹脂、例如可購買到的以聚苯乙烯為基礎的樹脂上，其中所說的連接基是例如可在溫和條件下裂解以使側鏈保持完整的連接基，例如SASRIN或取代或未取代的基于三苯甲基的連接基，例如4-(羥基-二苯基-甲基)-苯甲酸，其中的一個苯基可任選地被取代，例如被Cl所取代。所需肽鏈的建立可以通過常規的方法來完成，例如，可以使用其中的末端氨基被Fmoc-保護了的氨基酸單元，所存在的側鏈氨基用不同的氨基保護基例如Boc或CBO進行保護。優選將直鏈的肽以能夠在Tyr(4-Bzl)-OH和Phe之間形成鍵的方式進行環合，例如Phe-{4-(NHR1-C2H4-NH-CO-O-)Pro}-Phg-DTrp(R2)-Lys(ε-NHR3)-Tyr(4-Bzl)-OH或其官能衍生物，其中R1、R2和R3分別是氨基保護基。環合步驟a)可方便的用已知方法來完成，例如經由疊氮化合物、活潑酯、混合酸酐或碳二亞胺來完成。然后除去保護基，例如通過用三氟乙酸裂解或通過氫化作用除去。
肽的環化也可以直接在固體載體上進行，第一個氨基酸是Nα-和C-末端保護的形式，并通過一個側鏈(例如Lys的ε-氨基官能團)或通過骨架固定連接到其上。然后，可以按照標準的固相合成(SPPS)過程來合成直鏈的序列。在將C-末端保護基裂解后，將肽按照例如以上的描述環合。然后，將環狀的肽從樹脂上裂解下來并脫保護。
如果需要的話，存在于Pro上的側鏈可在肽環合步驟a)之前或之后引入到該氨基酸上。因此，作為起始氨基酸或起始的直鏈肽或環肽的Pro(其中，在各種情況中的Pro均在環上被OH取代)可以分別轉化成其中Pro被NHR1-C2H4-NH-CO-O-取代的化合物A或所需的Pro單元或相應的直鏈肽。
偶聯的化合物A的絡合作用可以通過將偶聯的化合物A與相應的可以產生可檢測的元素或放射性治療的元素的化合物、例如金屬鹽、優選水溶性的鹽反應來進行。該反應可以按照與已知方法類似的方法來完成，例如在Perrin，Organic Ligand，Chemical Data Series 22.NY Pergamon Press(1982)中所公開的方法；在Krejcarit和Tucker，Biophys.Biochem.Res.Com.77581(1977)以及Wagner和Welch，J.Nucl.Med.20428(1979)中所公開的方法。
用下面的實施例來說明本發明。所有的溫度都是℃。
縮寫AcOH＝乙酸Boc ＝叔丁氧基羰基Bzl ＝芐基CBO ＝芐氧羰基DIPCI ＝N，N’-二異丙基碳二亞胺DIPEA ＝二異丙基乙基胺DMF ＝二甲基甲酰胺DPPA＝二苯基磷酰基疊氮化物Fmoc＝芴基甲氧羰基HOBT＝1-羥基苯并三唑Osu ＝N-羥基琥珀酰亞胺TFA ＝三氟乙酸THF ＝四氫呋喃為了進行脫保護，將殘余物在0℃下溶解于95∶5的TFA/H2O(約50mM)中，并在冷卻下攪拌30分鐘。然后將該產物用含有約10當量HCl的乙醚進行沉淀，過濾，用乙醚洗滌并干燥。為了使剩余的吲哚-N-氨基carbaminicacid完全分解，將該產物溶于5％的AcOH中并在15小時后在約5℃下冷凍干燥。在C-18 10μm STAGROMA柱(5-25cm)上進行制備型RP-HPLC，用0.5％TFA至0.5％TFA的70％乙腈溶液進行梯度洗脫。合并含有純的標題化合物的級分，用水稀釋然后將其冷凍干燥。將該冷凍干燥物溶于水中，然后用10％的Na2CO3水溶液進行沉淀。濾出固體游離堿，用水洗滌并在真空中在室溫下進行干燥。將所得的白色粉末直接用于形成不同的鹽。
二-天冬氨酸鹽還可以通過將實施例1的化合物溶解于4∶1的水/乙腈中，過濾，將其上樣到離子交換樹脂例如BioRad AG4X4柱上然后用4∶1的水/乙腈洗脫來進行。將洗脫液濃縮，冷凍并將其凍干。[α]D20＝-47.5°，在甲醇中，c＝2.5mg/ml。c.苯甲酸鹽轉化成苯甲酸鹽可以通過將實施例1的化合物和2當量的苯甲酸一起溶解于1∶2的乙腈/水混合物中來完成。將所得混合物冷凍并將其凍干。d.雙羥萘酸鹽將1當量實施例1的化合物和1當量雙羥萘酸一起溶解于2∶2∶1的乙腈/THF/水的混合物中。將所得的混合物冷凍并將其凍干。實施例3環[{4-(DOTA-NH-C2H4-NH-CO-O-)Pro}-Phg-DTrp-Lys-Tyr(4-Bzl)-Phea)環[-Pro(4-OCO-NH-CH2-CH2-NH2)-Phg-DTrp-Lys(Cbo)-Tyr(Bzl)-Phe-]，三氟乙酸鹽該化合物按照與合成[-Pro(4-OCO-NH-CH2-CH2-NH2)-Phg-DTrp-Lys(Cbo)-Tyr(Bzl)-Phe-]，三氟乙酸鹽的方法相同的方法合成，只是用Fmoc-Lys(Cbo)-OH替代其中的Fmoc-Lys(Boc)-OH。b)將400mg可購買到的DOTA x 2H2O(SYMAFEX-法國)溶于20ml水中。在向其中加入20ml DMF后，將170mg環[-Pro(4-OCO-NH-CH2-CH2-NH2)-Phg-DTrp-Lys(CBO)-Tyr(BzD-Phe-]和190mg DCCI以及60mg N-羥基琥珀酰亞胺一起加入其中。將所得的混懸液在室溫下保持72小時。過濾后，減壓蒸除溶劑并將剩余的粗品在硅膠上進行純化(用DCM/MeOH/HOAc50％8/2/0.25→7/3/1作為流動相)。c)為了進行脫保護，將上述DOTA-偶聯物用5ml三氟乙酸/茴香硫醚(9/1)在室溫下處理2小時。將該溶液倒入到100ml乙醚+5ml 3N HCl/乙醚的混合物中，然后將形成的沉淀通過過濾分離出來。用DCM/MeOH/HOAc50％7/4/2→7/5/4作為流動相在硅膠上進行純化。用0.1％TFA至0.1％TFA的90％CH3CN溶液的梯度在RP18-HPLC柱(Spherisorb 250×4.6mm)上完成脫鹽步驟后，得到分析純的終產物。MH+1434.7。
游離形式的化合物A或可藥用鹽和絡合物形式的化合物A在體外和體內試驗中表現出有價值的藥理學性質，因此表明可用于治療。
更具體地講，化合物A對于人促生長素抑制素受體(hsst)、特別是hsst1、hsst2、hsst3和hsst5表現出值得注意的結合特性。已經對5種促生長素抑制素受體亞型(sst1、sst2、sst3、sst4和sst5)進行了克隆和鑒定。Y.Yamada等人在Proc.Nat.Acad.Sci.，89，251-255(1992)中公開了hsst1、hsst2和hsst3以及它們的序列。L.Rohrer等人在Proc.Acad.Sci.，90，4196-4200(1993)中公開了hsst4及其序列。R.Panetta等人在Mol.Pharmacol.45，417-427，1993中公開了hsst5及其序列。
結合試驗可以用如下所公開的方法，用得自選擇性和穩定表達hsst1、hsst2、hsst3、hsst4或hsst5的細胞系例如CHO或COS細胞的膜來進行。
膜是根據已知的方法制備的，例如C.Bruns等人在Biochem.J.，1990，65，第39-44頁中所公開的方法。將用穩定表達hsst1或hsst2或hsst3或hsst4或hsst5的hsst選擇性細胞系、例如CHO或COS細胞所制備的膜在22℃下，用濃度遞增的[125I-Tyr11]-SRIF-14在含有0.5％BSA的10mmol/lHepes緩沖液(pH7.6)中以300μl的總體積一式三份的進行培養。通過快速過濾來終止培養，將過濾器在計數器中進行計數。特異性結合等于總結合減去在存在1μmol/l促生長素抑制素-14的情況下的非特異性結合。該實驗是一式三份的進行的。親和性常數(KD)和結合位點的數目是用適宜的統計學和作圖程序來計算的。
化合物A在上述結合試驗中對hsst1、hsst2、hsst3和/或hsst5的IC50值在納摩爾的范圍內，優選0.1至10nM的IC50值(IC50＝在用[125I-Tyr11]-SRIF-14作為hsst1-5特異性放射性配體的競爭性結合試驗中產生半數最大抑制作用時的濃度)。
IC50
化合物A還能與促生長激素分泌激素受體相結合。G.Muccioli等人，J.Endocrinol.1998，157，99-106，H.Ong等人，Endocrinology 1998，139，432-435和R.G.Smith等人，Horm.Res.，1999，3，1-8公開了這些受體。對于這些受體的結合試驗可以按照在J.Endocrinol.Invest.24RC1-RC3，2001中所公開的方法來進行。在該試驗中，化合物A可以置換125I-Tyr-Ala-海沙瑞林(hexarelin)。因此，化合物A可用于調節促生長激素分泌激素受體的活性，例如表現出可能在體重增加或代謝調節方面有作用。
此外，化合物A還表現出GH-釋放抑制活性，這可以通過在體外試驗中所表現出的抑制GH從所培養的腦垂體細胞中的釋放來證實。例如，將成年雄性大鼠的前部腦垂體腺切成小片并用20mM HEPES緩沖液中的0.1％胰蛋白酶將其分散。將分散了的細胞在補充了5％胎牛血清、5％馬血清、1mM NaHCO3、2.5nM地塞米松、2.5mg/ml胰島素和20U/ml青霉素/鏈霉素的MEM(Gibco)中培養四天。在進行試驗的當天將所粘附的細胞用經20mM HEPES緩沖并用補充了5mM葡萄糖和0.2％BSA的Krebs-Ringer培養液洗滌兩次。隨后，將該細胞在存在3×10-10M生長激素釋放因子的條件下與化合物A一起培養3小時。通過RIA來測定釋放到培養基中的生長激素的量。在該試驗中，化合物A具有0.4nM的IC50值。
化合物能抑制大鼠體內生長激素(GH)的釋放。將化合物A皮下給藥于麻醉的大鼠。在將該化合物給藥后1小時斷頭并收集血樣。根據給藥后6小時對基礎GH分泌的抑制作用來估測作用的持續時間。在給藥后1小時和6小時用RIA來測定激素水平。通過作圖(log-probit)來測定各實驗對激素分泌的抑制作用的ID50值用并將所得的值進行對數平均。在該體內模型中，化合物A能顯著抑制生長激素的釋放并具有長期的持續作用(平均基準ID50＝5.5μg/kg皮下給藥6h)。在測定對胰島素的作用的類似試驗中，化合物A能抑制胰島素分泌。
對GH具有強而有效的抑制作用還可以在猴子的研究中得到證實。此外，用糖尿病猴進行的代謝研究證明了化合物A具有有效的抗糖尿病/胰島素-敏化作用。
此外，正如在用雄性大鼠所進行的標準試驗中所表現出的那樣，化合物A抑制了體內的IGF-1血漿水平。簡要的說，將化合物A通過皮下植入的滲透泵對Lewis品種的雄性大鼠進行給藥。用例如異氟烷進行短期麻醉，通過從眼球后血管取血來收集血樣。在該試驗中，化合物A能顯著降低IGF-1的血漿水平并具有長期持續的作用例如，在用10μg/kg/h的化合物A治療14天后可觀察到高于60％的抑制作用。更具體地講，接受了主動脈或腎同種移植的大鼠在進行了用化合物A以10μg/kg/h的劑量連續輸注長達126天的連續治療后未觀察到任何脫逸現象，這種治療能顯著并且持續地降低IGF-1的血漿水平。
因此，化合物A能用于預防或治療其病因包括或與GH過度分泌和/或IGF-1過高有關的疾病，例如可用于治療肢端肥大癥以及I型或II型糖尿病，尤其是其并發癥，例如血管病、糖尿病增生性視網膜病、糖尿病斑性水腫、腎病、神經病和黎明現象、以及其它與胰島素或高血糖素釋放有關的代謝障礙，例如肥胖，例如病態肥胖或下丘腦或胰島素過多性肥胖。化合物A還可用于治療腸皮膚瘺和胰管皮膚瘺、過敏性腸綜合征、炎性疾病，例如Grave病、炎性腸病、牛皮癬或類風濕性關節炎、多囊腎病、傾倒綜合征、水瀉綜合征、與AIDS有關的腹瀉、化療引起的腹瀉、急性或慢性胰腺炎和分泌胃腸激素的腫瘤(例如GEP腫瘤，例如胰腺瘤、高血糖素瘤、胰島瘤、良性腫瘤等)、淋巴細胞惡性腫瘤，例如淋巴瘤或白血病、肝細胞癌和胃腸道出血，例如靜脈曲張性食管出血。
化合物A還可用于治療促生長素抑制素受體呈陽性的腫瘤，例如帶有hsst1、hsst2、hsst3和/或hsst5的腫瘤，這可以在用帶有該類促生長素抑制素受體的各種癌細胞系進行的增殖試驗中證實。
AR42J大鼠的胰腺腫瘤細胞系是得自重氮絲氨酸誘導的外分泌胰腺腫瘤(Jessop和Hay，1980)。使不含支原體屬細胞的培養物在補充了10％胎牛血清(FCS)的DMEM中，在5％CO2的條件下進行繁殖。細胞在不含抗生素或殺真菌劑的條件下進行生長。將亞融合的AR42J細胞用胰蛋白酶進行處理，用DMEM+2.5％FCS進行稀釋并將其接種于未覆蓋的96-孔平板中。在48小時的培養期后(0天)，通過用庫而特計數器進行細胞計數和通過SRB比色測定來測定各對照平板中的細胞數目。然后使該細胞與各種濃度的化合物A接觸2至5天，然后進行計數。在這些條件下，在10-12至10-6M的濃度范圍內化合物A可以抑制腫瘤細胞的繁殖。體內腫瘤生長研究將重19-22g的雌性裸鼠按每組5只動物進行分組并使之自由進水和進食不含病原體的嚙齒動物食物。皮下腫瘤是用所培養的AR42J細胞來進行誘導的。在進行腫瘤細胞接種2-4天后開始進行治療，將化合物A以連續輸注的形式進行給藥，例如以10至50μg/kg/hr的速度進行給藥。用卡鉗來測定腫瘤的大小。統計學計算采用學生氏t檢驗。在該試驗中，與生理鹽水對照組相比，化合物A在第11天時對腫瘤生長的抑制作用為51％。
因此，化合物A可用于治療惡性細胞增殖性疾病，例如癌，特別是帶有促生長素抑制素受體型的腫瘤，化合物A對該類受體具有結合親和力，例如在下文中關于絡合物形式的偶聯的化合物A所描述的。
正如在標準試驗，例如在裸鼠試驗中所表現出來的那樣，化合物A還具有抑制血管生成的作用。簡要地說，將腫瘤細胞(1ml中0.1至10×106個)(SiHa細胞和MDA MB-231細胞，其是按照Angiogenesis(R.Steiner，P.B.Weisz和R.Langer編，1992，瑞士)中所公開的方法制備的)皮內接種。通常在每只小鼠兩處中腹部的位置上進行注射，該位置遠離主要的腹部皮膚血管以使背景血管計數較低。將對照組給予0.1ml在PBS中的0.02％的臺盼藍。在注射后10天，通過吸入CO2來處死進行了麻醉的小鼠。將皮膚固定在一個塑料環上(直徑40mm)，用倒置顯微鏡(Zeiss IM)以12.5和25倍的放大率進行評估。為了對血管生成進行測定，對血管進行照相，對直接與腫瘤相連的那些血管進行計數。在對照動物中，對那些在注射部位周圍與所定義的區域相連的血管進行計數。該區域相當于皮膚腫瘤的平均面積。后者是通過使用卡鉗，根據公式3.14×r2來進行測定的。在腫瘤接種的當天或在3天后將化合物A皮下給藥。將對照動物用賦形劑進行處理。在這一試驗中，當以例如0.01至1000μg/kg的劑量皮下給藥時，化合物A抑制了血管生成。
因此，化合物A可用于預防或治療血管生成、如上面所述的炎性病癥，包括炎性眼病、斑性水腫，例如囊樣斑性水腫、自發性囊樣斑性水腫、與年齡有關的滲出性黃斑變性、與脈絡膜新血管生成有關的病癥以及增生性視網膜病。
正如下面的試驗所表現出的那樣，化合物A還具有抑制平滑肌細胞增殖和遷移的作用。慢性同種移植物排斥反應將雄性DA(RT1a)大鼠的腎正位移植到雄性Lewis(RT11)接受者體內。總共有24只動物接受了移植。從移植當天開始，將所有的動物以7.5mg/kg/天的劑量口服環孢菌素A來處理14天，以防止急性的細胞排斥反應。不進行對側的腎切除術。用不同劑量的化合物A或安慰劑對各實驗組進行處理，每組包含六只動物。從移植后的第14天開始，通過輸注化合物A或接受安慰劑對接受移植的動物進行治療達112天。在移植后的第14天，用MRI對器官灌注進行測定。在移植后第53-64天和實驗結束時重復進行這一操作。然后對這些動物進行尸體解剖。在該大鼠腎同種移植模型中，以10μg/kg/h的劑量給予化合物A可改善器官灌注并能減少與慢性排斥反應有關的血管重構和移植物浸潤(細胞排斥反應)。還觀察到了顯著和持續下降的IGF-1水平。這些結果已經在用異種的小鼠心異體移植模型所進行的第二組實驗中得到了證實，證明了其對血管重構以及在移植物浸潤中的有益作用。
還在用B10.A(2R)(H-2h2)小鼠作為供體和用B10.BR(H-2k)小鼠作為接受者的頸動脈環路移植模型中對化合物A進行了試驗。簡要地說，通過末端-旁側吻合術將供體的頸動脈作為一個環路對位移植到接受者的頸動脈中。在移植后立即皮下放置一臺微型泵，用該泵以50μg/kg/h的速率輸送化合物A。在移植后30天采集頸動脈移植物以分析血管的重構，例如通過Verhoeff彈性蛋白染色的石蠟切片的形態學分析，用計算機輔助系統來進行分析。在該模型中，與形成了大量新內膜的未進行處理的動物相比，化合物A抑制了新內膜的形成。血管成形術對血管成型術的研究是通過用氣囊導管損傷的大鼠模型來進行的。氣囊導管插入術是在第0天進行的，基本上用Powell等人(1989)所描述的方法來進行。在用異氟醚進行麻醉的情況下，將Fogarty 2F導管引入到左側的普通頸動脈中以獲得均勻的去內皮化。然后將該導管取出，在動脈外部周圍進行結扎以防止出血，使動物恢復。用兩組12只的RoRo大鼠(400g，約24周大)進行研究一組為對照組，一組為接受化合物A的組，將大鼠隨機進行分組。從進行氣囊損傷前2天(-3天)開始直至研究結束時(氣囊損傷后14天)，用微型泵以10μg/kg/h的速率將化合物A通過連續輸注進行給藥。然后將大鼠用異氟醚進行麻醉，并用0.1M磷酸鹽緩沖的生理鹽水溶液(PBS，pH7.4)進行灌注，然后再用2.5％的在磷酸鹽緩沖液(pH7.4)中的戊二醛灌注15分鐘。然后將頸動脈進行切除，將其與周圍的組織進行分離，然后將其浸入到含有7％蔗糖的0.1M二甲胂酸鹽緩沖液(pH7.4)中，在4℃下培養過夜。第二天，根據制造商的建議，將該動脈植入到Technovit 7100中。通過圖像分析系統(MCID，Toronto，Canada)對血管中層、新內膜和腔的橫截面積進行形態學評估。在該試驗中，化合物A顯著抑制了新內膜增厚。
因此，化合物A還能用于防止或對抗移植血管的疾病，例如同種異體-或異種異體移植的血管病變，例如移植血管的動脈粥樣硬化，例如在移植器官例如心、肺、合并的心-肺、肝、腎或胰腺移植物中所出現的動脈粥樣硬化，或用于預防或治療靜脈移植物狹窄、血管損傷后的再狹窄和/或血管閉塞，例如由于插入導管的操作或由于血管刮擦操作如經皮經腔血管成形術、激光治療或其它的破壞血管內膜或內皮完整性的侵入性操作而造成的血管損傷。
化合物A具有有利的血漿半衰期。其具有15至30小時的清除半衰期。
對于所有上述適應癥，所需劑量當然應隨著例如主體、給藥方式和所治療病癥的嚴重程度而變化。但是，一般而言，以1μg至0.7mg/kg/天的劑量將化合物A進行給藥就能獲得令人滿意的結果。用于患者的指示性的日劑量為約2μg至約50mg、優選約0.01至約40mg、例如約0.01至約3mg的化合物皮下給藥，該劑量可以方便的以單元劑量的形式以多至一天3次的分割劑量進行給藥，其中所說的單元劑量包含例如約0.5μg至約25mg、例如約2μg至20mg、例如約2μg至1.5mg的化合物A。
化合物A可以以游離形式或以可藥用鹽或絡合物的形式進行給藥。所述鹽和絡合物可以用一般方法進行制備并表現出與游離化合物相同等級的活性。本發明還提供了一種包含游離堿形式或可藥用鹽形式或絡合物形式的化合物A和一種或多種可藥用稀釋劑或載體的藥物組合物。該組合物可以用常規的方法進行制備。化合物A還可以以緩釋的形式進行給藥，例如以包含例如可生物降解的聚合物或共聚物的植入物、微囊、微球或納米球的形式給藥、以脂質體制劑的形式給藥、或以自凝膠化的形式(例如在與患者的體液相互作用后能形成凝膠的固體或半固體組合物)進行給藥。
化合物A或其可藥用鹽或絡合物可以以任何常規的途徑進行給藥，例如以可注射的溶液或混懸液的形式(包括例如如上所述的緩釋形式)胃腸外給藥、用常規的吸收促進劑口服給藥、經鼻給藥或以栓劑的形式給藥、或以例如眼用液體、凝膠、軟膏或混懸制劑例如脂質體、微球或納米球制劑的形式局部給藥，例如用于滴注或結膜下或眼內或眼周注射。
根據前面所述的內容，本發明還提供了1.用作藥物的化合物A或其可藥用的鹽或絡合物；2.在需要治療的個體中預防或治療如上所述的疾病或病癥的方法，該方法包括向所述患者施用有效量的化合物A或其可藥用的鹽或絡合物；或3.化合物A或其可藥用的鹽或絡合物用于制備用于如上面2中所定義的方法的藥物組合物。
因此，正如通過標準試驗所證實的那樣，當與可檢測的元素，例如發射γ-或正電子的核素、熒光金屬離子或順磁離子例如111In、161Tb、177Lu、86Y、68Ga、Eu3+、Gd3+、Fe3+、Mn2+或Cr2+絡合時，偶聯的化合物A或其可藥用的鹽可用作顯影劑，例如用于促生長素抑制素受體呈陽性的組織和細胞如促生長素抑制素受體呈陽性的腫瘤和轉移瘤、顯示促生長素抑制素受體的炎癥或自身免疫病癥、結核或移植后的器官排斥反應的顯影，當與發射α-或β-射線的核素或發射Auger-e-的核素，例如90Y、161Tb、177Lu、211At、213Bi或201Tl絡合時，其可用作用于在體內治療促生長素抑制素受體呈陽性的腫瘤和轉移瘤、類風濕性關節炎和嚴重的炎癥狀況的放射性藥物。
具體地講，觀察到偶聯的化合物A可以與促生長素抑制素受體以約8至10的pKi值進行結合。與例如111In、88Y、90Y或177Lu絡合的實施例3的化合物在nM范圍內與各sst亞型按照化合物A的結合曲線進行結合。
偶聯的化合物A及其絡合物與促生長素抑制素受體的親和力還可以根據標準試驗方法，通過體內試驗來證實，例如用GB-A-2,225,579中所公開的方法。例如在對帶有表達hsst2受體的外分泌胰腺腫瘤的小鼠或大鼠注射后4小時，與例如111In、88Y、90Y或177Lu絡合的實施例3的化合物表現出明顯的腫瘤聚集。
在以1至5μg/kg的劑量給予用0.1至5mCi、優選0.1至2mCi的放射性核素進行標記的絡合物形式的偶聯的化合物A后，例如給予與111In、177Lu、86Y或161Tb絡合的化合物A后，腫瘤部位變得可檢測。
當用發射α-或β-射線的放射性核素或發射Auger-e-的核素進行放射性標記時，偶聯的化合物A對促生長素抑制素受體呈陽性的腫瘤細胞表現出抗增殖和/或細胞毒性作用，例如在裸鼠試驗中所表現出來的那樣。
將裸鼠如上所述用AR42J大鼠胰腺腫瘤細胞或NCI-H69人小細胞肺癌細胞進行接種。當腫瘤達到1至2cm3的體積時，將動物隨機分成對照組和治療組。通過腹膜內注射或靜脈內注射將絡合物形式的偶聯的化合物A進行給藥。每只小鼠的給藥劑量最高為40mCi/kg。如上所述用卡鉗對腫瘤的大小進行測量。統計學計算采用學生氏t檢驗。在該試驗中，在單次給藥與90Y絡合的實施例3的化合物后，在一星期后可觀察到短暫的腫瘤縮小，其可達到最初體積的50％，并且腫瘤的生長被延遲了兩個星期。與之相反，對照組表現出連續的腫瘤生長，其體積加倍的時間約為七天。
因此，在一系列特定的或供選擇的實施方案中，本發明還提供了4.與可檢測的元素相絡合的偶聯的化合物A用于在個體體內檢測促生長素抑制素受體呈陽性的細胞和組織、例如促生長素抑制素受體呈陽性的腫瘤和轉移瘤并記錄所述絡合物靶向的受體的位置的應用；5.用于在個體中體內檢測促生長素抑制素受體呈陽性的組織和細胞、例如促生長素抑制素受體呈陽性的腫瘤和轉移瘤的方法，該方法包括給所述個體施用與可檢測的元素絡合的偶聯的化合物A或其可藥用的鹽，并記錄所述絡合物靶向的受體的位置。
用作顯影劑的絡合物形式的偶聯的化合物A可以被例如靜脈內給藥，例如以可注射溶液或混懸液的形式給藥，優選以單次注射的形式給藥。優選在臨向個體給藥前進行放射性標記。
對于動物而言，指示的劑量范圍可以為0.01至1μg/kg與0.02至0.5mCi發射γ-射線的放射性核素絡合的偶聯的化合物A。對于較大的動物例如人而言，劑量范圍可以為1至100μg/m2與例如1至100mCi/m2可檢測元素例如111In、86Y或177Lu絡合的偶聯的化合物A。
6.與發射α-或β-射線的核素或發射Auger-e-的核素絡合的偶聯的化合物A用于在體內治療促生長素抑制素受體呈陽性的腫瘤和轉移瘤的應用。
7.用于在需要治療的個體中體內治療促生長素抑制素受體呈陽性的腫瘤和轉移瘤、例如治療所述腫瘤的侵入或與該類腫瘤的生長有關的癥狀的方法，該方法包括向所述個體施用治療有效量的與發射α-或β-射線的核素或發射Auger-e-的核素絡合的偶聯的化合物A。
8.偶聯的化合物A或其可藥用的鹽在制造顯影劑或放射性藥物組合物中的應用。
在進行本發明的放射性治療應用時所用的劑量當然可以隨著例如所治療的具體病癥例如已知的對表達促生長素抑制素受體的正常器官的放射毒性、腫瘤的體積和所需治療而變化。一般而言，該劑量是根據用健康器官所獲得的藥物動力學和放射活性分布數據而計算出來的，并以所觀察到的靶吸收為基礎。發生β-射線的偶聯的化合物A的絡合物可以被重復進行給藥，例如在1至3個月的時期內重復給藥。
對于動物而言，劑量范圍可以為20至100μg/kg與15至70mCi發射α-或β-射線的核素或發射Auger-e-的核素例如90Y、177Lu或161Tb相絡合的偶聯的化合物A。對于較大的動物例如人而言，劑量范圍可以為1至100μg/m2與例如100mCi/m2發射α-或β-射線的核素或發射Auger-e-的核素例如90Y、177Lu或161Tb相絡合的偶聯的化合物A。
用作放射性治療物質的絡合物形式的偶聯的化合物A可以通過任何常規的給藥途徑來進行給藥，例如靜脈內給藥，例如以可注射的溶液的形式進行靜脈內給藥。還可以有利的通過輸注的形式來進行給藥，例如在15至60分鐘內進行輸注。取決于腫瘤所處的部位，還可以盡可能的靠近該腫瘤部位來進行給藥，例如通過導管來進行給藥。本發明還提供了一種包含游離堿形式或可藥用鹽的形式或與可檢測的或放射性治療劑相絡合的偶聯的化合物A以及一種或多種可藥用的稀釋劑或載體的藥物組合物。
化合物A或絡合物形式的偶聯的化合物A可用于成像或治療表達或聚集促生長素抑制素受體的腫瘤如腦垂體腫瘤、胃-腸胰腺腫瘤、良性腫瘤、中樞神經系統腫瘤、乳腺腫瘤、前列腺腫瘤(包括老年的激素性頑固前列腺癌)、卵巢腫瘤或結腸腫瘤、小細胞肺癌、惡性腸梗阻、副神經節瘤、腎癌、皮膚癌、成神經細胞瘤、嗜鉻細胞瘤、髓質甲狀腺癌、骨髓瘤、淋巴瘤、何杰金氏和非何杰金氏淋巴瘤、骨腫瘤及其轉移瘤、以及自身免疫和炎性病癥，例如類風濕性關節炎、Graves病或其它的眼部炎性疾病。
本發明的另一方面還提供了一種包含偶聯的化合物A或其絡合物以及一種或多種可藥用的載體或稀釋劑的藥物組合物。這種藥物組合物可以用常規的方法進行制備，并可以以試劑盒的形式提供以用于成像，所述試劑盒含有兩種獨立的試劑，一種是放射性核素，另一種是偶聯的化合物A，并且含有用于說明將其混合的指導說明。對于放射性治療而言，該絡合物形式的偶聯的化合物A優選是熱的液體制劑的形式。
化合物A或絡合物形式的偶聯的化合物A可以作為唯一的活性成分進行給藥，或例如作為輔藥和其它藥物聯合給藥。例如，化合物A可以與如下物質聯合給藥免疫抑制劑，例如鈣神經素抑制劑，例如環孢菌素A或FK 506；具有免疫抑制性質的大環內酯，例如雷怕霉素或40-O-(2-羥基乙基)-雷怕霉素(RAD)；具有免疫抑制性質的子囊霉素，例如ABT-281、ASM981等等；皮質類固醇；環磷酰胺；硫唑嘌呤；甲氨蝶呤；來氟米特；咪唑立賓；霉酚酸或其鹽，例如MyforticR；霉酚酸莫非替克(mycophenolatemofetil)；15-脫氧精胍菌素或免疫抑制同系物、類似物或其衍生物；加速淋巴細胞回流的物質，例如FTY720；免疫抑制的單克隆抗體，例如白細胞受體的單科隆抗體，例如MHC、CD2、CD3、CD4、CD7、CD8、CD25、CD28、CD40、CD45、CD58、CD80、CD86或其配體的單科隆抗體；其它的免疫調節化合物，例如具有至少一部分CTLA4的細胞外區域的重組結合分子或其突變體，例如與非-CTLA4蛋白序列連接的至少CTLA4的細胞外部分及其突變體，例如CTLA4Ig(例如被稱為ATCC 68629)或其突變體，例如LEA29Y；粘連分子抑制劑，例如LFA-1拮抗劑、ICAM-1或-3拮抗劑、VCAM-4拮抗劑或VLA-4拮抗劑。化合物A還可以與下列物質合用抗炎劑、GH促分泌素受體調節劑，例如ghrelin或海沙瑞林、GH受體拮抗劑，例如pegvisomant、胰島素促分泌劑或胰島素分泌增強劑，例如磺酰脲，例如甲苯磺丁脲、氯磺丙脲、妥拉磺脲、醋磺環己脲、4-氯-N-[(1-吡咯烷基氨基)羰基]-苯磺胺(glycopyramide)、格列本脲(優降糖)、格列齊特、1-丁基-3-間氨基苯磺酰脲、氨磺丁脲、格列波脲、格列吡嗪、格列喹酮、格列派特、格列噻唑、格列丁唑、格列己脲、格列嘧啶、格列平脲、苯磺丁脲或tolylcyclamide、短效的非磺酰脲、口服的促胰島素劑衍生物，例如短效的胰島素增強劑，例如氯茴苯酸、瑞格列奈、苯基乙酸衍生物，例如nateglinide、DPP IV抑制劑，例如1-{2-[(5-氰基吡啶-2-基)氨基]乙基氨基}乙酰基-(2S)-氰基-吡咯烷二鹽酸鹽、LAF237、GLP-1或GLP-1激動劑模擬物、胰島素敏化劑，例如過氧物酶體增殖因子激活的受體γ激動劑(PPARγ)，例如格列酮類，例如(S)-((3，4-二氫-2-(苯基-甲基)-2H-1-苯并吡喃-6-基)甲基-噻唑烷-2，4-二酮(恩格列酮)、5-{[4-(3-(5-甲基-2-苯基-4-噁唑基)-1-氧代丙基)-苯基]-甲基}-噻唑烷-2，4-二酮(達格列酮)、5-{[4-(1-甲基-環己基)甲氧基]-苯基}甲基)-噻唑烷-2，4-二酮(環格列酮)、5-{[4-(2-(1-吲哚基)乙氧基)苯基]甲基}-噻唑烷-2，4-二酮(DRF2189)、5-{4-[2-(5-甲基-2-苯基-4-噁唑基)-乙氧基]}芐基)-噻唑烷-2，4-二酮(BM-13.1246)、5-(2-萘基磺酰基)-噻唑烷-2，4-二酮(AY-31637)、二{4-[(2，4-二氧代-5-噻唑烷基)-甲基]苯基}甲烷(YM268)、5-{4-[2-(5-甲基-2-苯基-4-噁唑基)-2-羥基乙氧基]芐基}-噻唑烷-2，4-二酮(AD-5075)、5-[4-(1-苯基-1-環丙烷-羰基氨基)-芐基]-噻唑烷-2，4-二酮(DN-108)、5-{[4-(2-(2，3-二氫吲哚-1-基)乙氧基)苯基]甲基}-噻唑烷-2，4-二酮、5-[3-(4-氯-苯基)]-2-丙炔基]-5-苯基磺酰基)噻唑烷-2，4-二酮、5-[3-(4-氯苯基)]-2-丙炔基]-5-(4-氟苯基-磺酰基)噻唑烷-2，4-二酮、5-{[4-(2-(甲基-2-吡啶基-氨基)-乙氧基)苯基]甲基}-噻唑烷-2，4-二酮(rosiglitazone)、5-{[4-(2-(5-乙基-2-吡啶基)乙氧基)苯基]-甲基}噻唑烷-2，4-二酮(吡格列酮)、5-{[4-((3，4-二氫-6-羥基-2，5，7，8-四甲基-2H-1-苯并吡喃-2-基)甲氧基)-苯基]-甲基}-噻唑烷-2，4-二酮(曲格列酮)、5-[6-(2-氟-芐氧基)萘-2-基甲基]-噻唑烷-2，4-二酮(MCC555)、5-{[2-(2-萘基)-苯并噁唑-5-基]-甲基}噻唑烷-2，4-二酮(T-174)或5-(2，4-二氧代噻唑烷-5-基甲基)-2-甲氧基-N-(4-三氟甲基-芐基)苯甲酰胺(KRP297)、非格列酮型如N-(2-苯甲酰基苯基)-L-酪氨酸類似物，例如GI-262570、或oxolidinedione，例如JTT501、雙重PPARγ/PPARα激動劑，例如DRF-554158、NC-2100或NN-622、視黃醛X受體激動劑或rexinoid，例如2-[1-(3，5，5，8，8-五甲基-5，6，7，8-四氫-2-萘基)-環丙基]-吡啶-5-甲酸、4-[(3，5，5，8，8-五甲基-5，6，7，8-四氫-2-萘基)-2-羰基]-苯甲酸、9-順式視黃酸或其類似物、衍生物或可藥用鹽、蛋白質酪氨酸磷酸酯酶激酶1B、糖原合酶激酶-3抑制劑、非肽類小分子胰島素模擬化合物，例如L-783,281或CLX-901，或低劑量的胰島素、谷酰胺果糖-6-磷酸酯酰氨基轉移酶抑制劑、葡萄糖-6-磷酸酯酶抑制劑、雙胍類，例如甲福明、果糖-1，6-二磷酸酯酶抑制劑、糖原磷酸化酶抑制劑，例如CP-91149、高血糖素受體拮抗劑，例如CP-99711、NNC 92-1687、L-168,049或BAY27-9955、磷酸烯醇丙酮酸酯羧基激酶、丙酮酸酯脫氫酶激酶抑制劑、α-葡萄糖甙酶抑制劑，例如4”，6”-二脫氧-4”-[(1S)-(1，4，6/5)-4，5，6-三羥基-3-羥基甲基-2-環-己烯基氨基]麥芽三糖或O-4，6-二脫氧-4-{[1S，4R，5S，6S]-4，5，6-三羥基-3-(羥基甲基)-2-環己烯-1-基}-氨基}-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-O-α-D-吡喃葡萄糖基(1→4)-D-吡喃葡萄糖(阿卡波糖)、N-(1，3-二羥基-2-丙基)纈胺醇(伏格列波糖)或米格列醇、或胃排空抑制劑，例如GLP-1、CCK-8和糊精(例如Pramlintide)、具有抗血管生成作用的物質，例如苯并卟啉，例如verteporfin、midostaurin或4-吡啶基甲基-酞嗪。
化合物A或絡合物形式的偶聯的化合物A還可以與抗增殖的物質合用，例如化療藥物，例如紫杉醇、吉西他濱、順鉑、阿霉素、5-氟尿嘧啶或紫杉酚合用，與激素類物質或拮抗劑，例如抗雄激素或米托蒽醌(尤其是在前列腺癌的情況中)、或抗雌激素如來曲唑(尤其是在乳腺癌的情況中)、抗代謝物、植物生物堿、生物響應改性劑，優選淋巴因子或干擾素、蛋白質酪氨酸激酶抑制劑和/或絲氨酸/蘇氨酸激酶抑制劑或具有其它或未知的作用機理的物質，例如各種epothilone或epothilone衍生物，或大環內酯，例如雷怕霉素、RAD或CCI779合用。
當化合物A或絡合物形式的偶聯的化合物A與其它藥物聯合給藥時，共同給藥的藥物的劑量當然應該隨著所用的共同給藥的藥物的類型、所使用的具體藥物、所治療的病癥等而變化。“共同給藥”或“聯合給藥”或這里所用的類似術語指的是將所選擇的治療劑向單一的病人進行給藥，并且包括其中的藥物不一定以相同的給藥途徑或在相同的時間進行給藥的治療方案。
根據前面所述，本發明還包括另一個方面9.一種藥物聯合形式，其包含a)第一種物質，其是化合物A或絡合物形式的偶聯的化合物A和b)共同給藥的物質，例如如上所定義的物質。
10.如上所定義的方法，該方法包括將治療有效量的化合物A或絡合物形式的偶聯的化合物A和第二種藥物聯合給藥，例如同時或依次給藥，其中所說的第二種藥物是例如如上所定義的物質。
本發明具體的聯合形式的選擇取決于所預防或治療的疾病或病癥；例如與免疫抑制劑聯合用于例如預防或治療慢性的移植物排斥反應，與胰島素促分泌劑、胰島素分泌增強劑、胰島素敏化劑或低劑量的胰島素聯合用于治療糖尿病或其并發癥，與抗炎劑聯合用于預防或治療炎性疾病或病癥，與具有抗血管生成作用的物質聯合用于預防或治療例如斑性水腫和黃斑變性，或與化療劑聯合用于癌癥。
權利要求
1.下式所示的化合物或其鹽或絡合物 其中的一個氨基可以是保護的形式或是未保護的形式。
2.權利要求1所述的化合物，其是未保護的鹽的形式。
3.權利要求2所述的化合物，為單鹽或二鹽的形式。
4.權利要求3所述的化合物，為醋酸鹽、苯甲酸鹽、天冬氨酸鹽或雙羥萘酸鹽的形式。
5.生產權利要求1所述化合物的方法，該方法包括，將保護了的、與聚合物結合的或未保護形式的直鏈的肽以能夠得到所需化合物的方式進行環合，然后任選地除去保護基并回收所生成的游離或鹽形式的所需化合物。
6.權利要求1所述的化合物，其中Pro的側鏈氨基與螯合劑偶聯，任選地與可檢測的元素或放射性治療的元素絡合。
7.一種藥物組合物，該組合物含有權利要求1所述的化合物或其可藥用鹽以及一種或多種可藥用的稀釋劑或載體。
8.權利要求7所述的藥物組合物，為緩釋形式或局部應用的形式。
9.權利要求7所述的藥物組合物，該藥物組合物用于和免疫抑制劑、抗炎劑、GH促分泌素受體調節劑、GH受體拮抗劑、胰島素促分泌劑、胰島素分泌增強劑、胰島素敏化劑、低劑量的胰島素、具有抗血管生成作用的物質或化療劑聯合應用。
10.在個體中預防或治療疾病的方法，其中所述的疾病是其病因包括或與GH過度分泌和/或IGF-1過高有關的疾病，以及與胰島素或高血糖素釋放有關的其它代謝障礙、腸皮膚瘺和胰管皮膚瘺、過敏性腸綜合征、炎性病癥和疾病、多囊腎病、傾倒綜合征、水瀉綜合征、與AIDS有關的腹瀉、化療引起的腹瀉、急性或慢性胰腺炎、胃腸出血、腫瘤和惡性腫瘤、血管生成、斑性水腫、與脈絡膜新血管生成有關的病癥、增生性視網膜病、移植血管疾病、靜脈移植物狹窄、血管損傷后的再狹窄和/或血管閉塞，該方法包括給需要所述治療的個體施用有效量的權利要求1所述的化合物或其可藥用鹽或絡合物。
全文摘要
本發明提供了環[{4－(NH
文檔編號A61P31/00GK1446229SQ01813686
公開日2003年10月1日 申請日期2001年7月30日 優先權日2000年8月1日
發明者R·阿爾貝特, W·鮑爾, D·博德默爾, C·布倫斯, I·費爾納, H·赫爾斯特恩, I·劉易斯, M·邁森巴赫, G·韋克貝克, B·維特費爾特 申請人:諾瓦提斯公司