預防鼻病毒感染的新型免疫粘附素的制作方法

專利名稱：預防鼻病毒感染的新型免疫粘附素的制作方法
技術領域：
本發明涉及融合人類鼻病毒受體蛋白和免疫球蛋白的免疫粘附素及其在植物內的表達。該免疫粘附素也計劃用于人類鼻病毒感染的預防和治療。
背景技術：
普通感冒一般是相對輕微的疾病，但感冒也可以導致嚴重的并發癥，例如中耳炎、鼻竇炎和哮喘加重。人類鼻病毒(HRV)引起成人感冒的50％和兒童感冒的25％(Bella和Rossmann，J Struct Biol.12869-74，1999，和Sperber和Hayden，Antimicrob Agents Chemother.32409-19，1988)。社會花費為此達到每年數十億美元。這些微小并且裸露的RNA病毒代表小核糖核酸病毒的一種亞組(Rueckert，Virology，pp.507-548，eds.，Fields等，Raven Press，Ltd.New York，1990)。鼻病毒的X光晶體圖識別到直徑300的二十面體對稱的衣殼(1＝0.1nm)，該衣殼由60拷貝的每種病毒外被蛋白VP1，VP2和VP3構成(Rossmann，Nature 317145-153，1985)。HRV表面凹陷或“峽谷”提示受體結合位點(Colonno等，Proc Natl Acad Sci USA.855449-5453，1985；Rossmann等，Nature 317145-153，1985)。HRV的102種血清型中，91種(稱作主要組)共享一種細胞表面糖蛋白為它們的受體，該細胞表面糖蛋白稱為細胞間粘附分子-1(ICAM-1)(Greve等，Cell 56839-847，1989；Staunton等，Cell 56849-853，1989)；該結合位點位于N-末端結構域1中(Greve等，J Virol.656015-6023，1991；Staunton等，Cell 61243-254，1990)。
ICAM-1是一種含有五個細胞外結構域、一個疏水跨膜結構域和一個短胞質結構域的膜蛋白。ICAM-1在許多免疫和炎癥反應的重要細胞上表達，并在其它細胞表面誘導表達(Casasnovas等，Proc Natl Acad SciUSA.954134-9，1998)。ICAM-1的功能為白細胞整聯蛋白LFA-1和Mac-1的配體(Springer，Cell.7630114，1994；Staunton等，Cell 61243-254，1990)。由于跨膜結構域的相互作用，ICAM-1在細胞表面主要以二聚體形式存在(Miller等，J Exp Med.1821234-41，1995；Reilly等，J Immunol.155529-32，1995)。
由五個細胞外結構域組成的重組可溶性ICAM-1(sICAM-1)在體外被證實可以有效的阻斷鼻病毒感染人類細胞(Greve等，J Virol.656015-6023，1991；Marlin等，Nature.34470-2，1990)。sICAM-1對抗實驗室菌株和野生分離菌株譜的活性分析證實，HRV的所有主要菌株都對sICAM-1敏感。不以ICAM為受體的少量菌株并不受sICAM-1影響(Crump等，Antiviral Chem Chemother.4323-327，1993；Ohlin等，Antimicrob Agents Chemother.381413-5，1994)。
可溶性ICAM-1的體外抗病毒活性似乎通過不止一種機制介導。這些機制包括與細胞表面ICAM-1競爭結合位點、干擾病毒進入或及通過使未成熟病毒RNA釋放形成空衣殼而直接使病毒失活(Arruda等，AntimicrobAgents Chemother.361186-1191，1992；Greve等，J Virol.656015-6023，1991；Marlin等，Nature.34470-2，1990；Martin等，J Virol.673561-8，1993)。
HRV的宿主范圍僅限于靈長類動物。一項新的研究證實，可溶性ICAM-1可以預防黑猩猩的鼻病毒感染(Huguenel等，Am J Respir CritCare Med.1551206-10，1997)。雖然黑猩猩并不出現臨床癥狀，通過檢測血清轉化和病毒釋放證實了感染的存在。在給藥時或給藥后10分鐘后給予HRV時，單劑量10mg可溶性ICAM-1的鼻內噴霧可以有效地預防HRV-16感染。
人類臨床實驗證實，可溶性ICAM-1降低實驗HRV感冒的嚴重性(Turner等，JAMA 2811797-804，1999)。該實驗共有196位受試者接受不同制劑的可溶性ICAM-1或安慰劑的治療。一些受試者在接種HRV39前7小時給予可溶性ICAM-1或安慰劑，其他受試者在病毒接種十二小時后給藥。藥物以鼻內溶液或粉末形式給藥，每日6次持續7天(每天用量4.4mg)。該項研究通過病毒分離或血清轉化證實可溶性ICAM-1不預防感染(安慰劑治療組92％感染率，可溶性ICAM-1治療組85％感染率)。但是可溶性ICAM-1對于所有的疾病檢測值確實有影響。總體癥狀評分降低45％，患有臨床感冒的受試者比例降低23％，并且鼻粘液重量降低56％。在使用粉末和溶液制劑組間或接種前和接種后兩組間沒有明顯區別。使用可溶性ICAM-1治療不會導致任何副作用或鼻粘膜吸收。并且使用可溶性ICAM-1治療并不抑制抗HRV型特異性抗體的產生。
如上述討論，ICAM-1以二聚體的形式存在于細胞表面。Martin等，在J Virol.673561-8，(1993)中第一次提出，多聚可溶性ICAM-1多價結合HRV可能導致更高的有效親和性，其稱為親和力，使病毒易于脫外被。他們構建的多價ICAM-1/免疫球蛋白分子假定較單價可溶性ICAM-1在中和HRV上更為有效，因此可以提高治療效率。這些ICAM-1/免疫球蛋白分子包括與IgA1(IC1-2D/IgA)、IgM(IC1-2D/IgM)和IgG1(IC1-2D/IgG)鉸鏈區和重鏈恒定區融合的ICAM-1氨基末端結構域1和2。而且，五個細胞外結構域融合于IgA1(IC1-5D/IgA)。在HRV結合、感染性和構象分析中，比較了這些ICAM-1/免疫球蛋白分子和含有兩個(sIC1-2D)和五個(sICl-5D)結構域的可溶性ICAM-1。ICAM-1/IgA免疫球蛋白分子(IC1-5D/IgA)是可溶性ICAM-1效率的200倍，ICAM-1/IgM免疫球蛋白分子(IC1-2D/IgM)和ICAM-1/IgG免疫球蛋白分子(IC1-2D/IgG)分別是可溶性ICAM-1效率的25和10倍。這些分子在抑制鼻病毒結合細胞和破壞病毒衣殼構象上有較高的效率。ICAM-1/IgA免疫球蛋白分子在納摩爾濃度范圍有效。對比IC1-2D/IgA和IC1-2D/IgG證實，使用的恒定區Ig種類對效率有很大影響。
隨后的研究對比了可溶性ICAM-1和IC1-5D/IgA對九種主要HRV血清型和適當耐受可溶性ICAM-1的HRV-39變異體的抑制活性(Crump等，Antimicrob Agents Chemother.381425-7，1993)。IC1-5D/IgA較單體可溶性ICAM-1對于標準血清型的抑制在重量基礎上的有效性是50至143倍，摩爾基礎上的有效性是60至170倍。HRV-39變異體對可溶性ICAM-1的耐受性是野生型的38倍多，而對IC1-5D/IgA的耐受性只有野生型的5倍。這一結論與病毒逃脫多價分子抑制的頻率低于病毒逃脫單價可溶性受體的假設一致(Martin等，J Virol.673561-8，1993)。設計檢測病毒失活的分析證實，可溶性ICAM-1不能直接使HRV-39和HRV-13明顯失活(感染性降低＜0.5log10)。然而，與IC1-5D/IgA共孵育導致這些相同病毒的感染性降低約1.0log10(Crump等，Antimicrob AgentsChemother.381425-7，1994)。Martin等(J Virol.673561-8，1993)的結果提示，價越多，分子的效應越強。通過蔗糖梯度沉淀可以分離IC1-2/IgM的二聚體和十聚體形式。十聚體對阻斷HRV與Hela細胞結合的效應是二聚體的五倍。
所描述的ICAM-1/免疫球蛋白分子有一些局限性，包括繁雜的生產技術和這種生產方法的高花費。而且，以上描述的ICAM-1/免疫球蛋白分子作為多聚體，在必須使鼻病毒失活的苛刻環境里僅有局限的穩定性。
本發明免疫粘附素較本領域已知的那些有明顯的優勢。本發明中植物表達的免疫粘附素可以為四聚體而并不僅為二聚體。有多個結合位點的免疫粘附素對病毒有較高的親和力，從而提高免疫粘附素的效率。而且，把分泌成分和免疫球蛋白J鏈與本發明免疫粘附素結合，提高免疫粘附素在粘膜環境內的穩定性(Corthesy，Biochem Soc Trans.25471-475，1997)。與分泌結合的分泌型IgA是正常存在于乳汁和初乳等粘膜分泌液內的抗體同種型。不同于其它的抗體同種型，SIgA能在沒有蛋白水解降解的條件下通過腸道。SIgA在室溫條件下的粗植物制備物中也非常穩定。分泌成分的功能可能是在粘膜的苛刻條件下保護抗體(Paul，Fundamental Immunology，Raven Press，NY，Third Edition，pp.303-304，1993)。而且，在植物內生產本發明免疫粘附素較動物細胞培養更為經濟，由于植物并不攜帶任何動物病毒，植物產品對于人類使用更為安全。
發明概述本發明涉及免疫粘附素包含含有與免疫球蛋白重鏈至少一部分連接的鼻病毒受體蛋白的一種嵌合ICAM-1分子，其中J鏈和分泌成分與該嵌合ICAM-1分子結合。
在優選實施方案中，本發明的免疫粘附素由鼻病毒受體蛋白細胞外結構域1，2，3，4和5任意的組合形成的一種鼻病毒受體蛋白和連接于免疫球蛋白重鏈的ICAM-1組成。本發明也涉及免疫粘附素，其中免疫球蛋白為IgA，IgA1，IgA2，IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgM，IgD，IgE或由不同免疫球蛋白同種型的結構域或片段構成的嵌合免疫球蛋白重鏈。
本發明其它的優選實施方案中，免疫粘附素包含多種與J鏈和分泌結分組合的嵌合ICAM-1分子。價數提高使之與鼻病毒的有效親和力升高，因此提高免疫粘附素的效率。
在本發明的一個優選實施方案中，所有用于生產本發明免疫粘附素的蛋白都為人類蛋白。除了在植物和植物細胞中生產，本發明考慮一種表達于哺乳動物細胞、毛根培養物、組織培養的植物細胞和植物、脊椎動物或非脊椎動物來源的異源細胞內的免疫粘附素。
在本發明的優選實施方案中，免疫粘附素在占植物基因組一部分的單子葉植物和雙子葉植物內表達。植物表達相對于培養細胞表達可以使生產免疫粘附素的花費明顯減少。
本發明考慮的免疫粘附素具有植物特異的糖基化作用。其氨基酸序列內具有糖基化信號天冬氨酸-X-絲氨酸/蘇氨酸的多肽的編碼基因在植物細胞表達時，通過與該的序列天冬氨酸殘基連接的寡糖而糖基化，其中X可以為任意氨基酸殘基。見Marshall，Ann.Rev.Biochem.，41673(1992)和Marshall，Biochem.Soc.Symp.，4017(1974)對起糖基化信號功能的多肽序列的概括性綜述。這些信號在哺乳動物和植物細胞內都可被識別。在蛋白的成熟末期，植物或植物細胞表達的蛋白較在其它類型細胞，包括哺乳動物細胞和昆蟲細胞表達的蛋白具有不同形式的糖基化作用。已有具體的研究鑒定植物特異糖基化作用，并與其它類型細胞的糖基化作用進行對比，例如，Cabanes-Macheteau等，Glycobiology 9(4)365-372(1999)和Altmann，GlycoconjugateJ.14643-646(1997)描述的研究。這些研究組和其它研究組已經證實，植物特異的糖基化作用產生木糖與甘露糖β(1，2)連接的多糖，但哺乳動物和昆蟲細胞中的糖基化作用并不導致木糖β(1，2)連接于甘露糖。植物特異的糖基化作用使巖藻糖α(1，3)連接于毗鄰的GlcNAc，而哺乳動物細胞中的糖基化作用使巖藻糖α(1，3)連接于毗鄰的GlcNAc。而且，植物特異的糖基化作用不能導致唾液酸添加至蛋白多糖的末端，而哺乳動物的糖基化作用可以添加唾液酸。
在其它實施方案中，本發明的免疫粘附素是一種組合物的一部分，該組合物包含植物材料和結合J鏈和分泌成分的免疫粘附素。所述的植物材料可以是植物細胞壁、植物細胞器、植物細胞質、完整的植物細胞、存活的植物等。可能存在的特殊植物材料或植物大分子包括二磷酸核酮糖羧化酶、光采集復合物、色素、二級代謝物或葉綠素。本發明組合物中的免疫粘附素的質量濃度為0.001％～99.9％(排除水)。在其它實施方案中，免疫粘附素質量濃度為0.01％～99％(排除水)。在其它實施方案中，本發明組合物的植物材料或植物大分子的質量濃度為0.01％～99％(排除水)。
本發明也考慮治療和預防人類鼻病毒感染受試者的方法，包括減少人類鼻病毒對病毒易感宿主細胞的感染性，或通過使用本發明免疫粘附素接觸該病毒的方法減少由人類鼻病毒引發或傳播的普通感冒，其中免疫粘附素結合人類鼻病毒并降低其傳染性。該免疫粘附素介導感染的途徑，包括與細胞表面ICAM-1競爭結合位點，干擾病毒進入或脫外被，和/或通過釋放未成熟病毒RNA形成病毒空衣殼而直接使病毒失活(Arrude等，Antimicrob Agents Chemother.361186-1191，1992；Greve等，JVirol.656015-6023，1991；Martin等，Nature.34470-2，1990；Martin等，J Virol.673561-8，1993)。在其它的實施方案中，通過一種方法治療受試者人類鼻病毒的感染，包括向受試者鼻內給予有效量的本發明的免疫粘附素，其中該免疫粘附素降低人類鼻病毒的傳染性。
附圖簡述

圖1說明了pSSPHuA2，在該載體中，編碼含有人類ICAM-1前5個結構域的嵌合ICAM-1分子和人類IgA2m(2)Fc區的DNA進行融合。該載體包含驅動信號肽和人類IgA2m(2)重鏈恒定區表達的SuperMas啟動子。通過PCR擴增編碼ICAM1-5結構域的序列，使之含有方便的酶切位點(5’SpeI和3’SpeI)，以方便信號肽和Cα1結構域之間的插入。為了提高構建體的表達水平，在重鏈的3’末端添加編碼ER保留信號(RSEKDEL)的DNA。
圖2說明了一種嵌合ICAM分子。2A說明了嵌合ICAM-1分子產生的DNA表達盒。2B說明在信號肽剪接后，成熟融合蛋白的氨基酸序列。克隆引入使用的氨基酸以下劃線標注，并且標記ICAM-1的5個細胞外結構域和IgA2m(2)重鏈Cα1-Cα3結構域間的連接。黑體N說明十五個潛在的糖基化位點。
圖3說明該免疫粘附素在獨立轉化的煙草愈傷組織中的表達。3A說明非還原SDS-聚丙烯酰胺凝膠免疫印跡，其上使用包含不同轉化煙草愈傷組織(C)和液體提取物(Aq)的樣品，并探測人類ICAM的存在。圖中給出分子量標記，其參考標準(R)是人類ICAM(～75kD)和人類SIgA(＞＞250kD)(每種約75ng)的混合物。3B說明含有從愈傷組織Rhi107-11中部分純化的免疫粘附素多種級分的非還原SDS-聚丙烯酰胺凝膠免疫印跡。分析的純化組分是汁液(J)，G-100級分(G)，無菌過濾的G-100級分(SG)和人類SIgA(75ng)與人類ICAM-1(75ng)(RS)的參考標準混合物。
使用抗人ICAM(～ICAM)、人IgA重鏈(～α)，人分泌成分(～SC)和人J鏈(～J)抗體探測印跡。其次，必須使用酶偶聯的抗體標記帶有堿性磷酸酶的免疫陽性條帶。
圖4說明酶聯免疫吸附測定(ELISA)的結果，其說明植物提取物和可溶性ICAM-1在與抗ICAM mAb結合時的競爭。此測定中的96孔板用0.25μg的可溶性ICAM-1/ml包被。正方形代表sICAM濃度的升高，圓圈代表愈傷組織提取物數量升高(無菌過濾的G-100級分)，它用于與恒定量的一種鼠(抗人ICAM)抗體競爭粘附的ICAM。
圖5說明一種免疫粘附素抑制人類鼻病毒殺傷HeLa細胞能力的分析結果(細胞病變效應或CPE分析)。5A說明在包括ICAM-Fc融合體(IC1-5D/IgA)中的免疫粘附素或抗阿霉素抗體的部分純化提取物存在下，人類鼻病毒對HeLa細胞CPE的對比分析結果。(右側向上和向下的三角代表來源于Rhi107-11并包含免疫粘附素的兩種提取物。)5B說明在可溶性人類ICAM-1或ICAM-Fc融合體(IC1-5D/IgA)的免疫粘附素提取物存在下，人類鼻病毒對HeLa細胞CPE的對比分析結果。插圖說明可溶性ICAM(1.35μg/ml)和IC1-5D/IgA(0.12μg/ml；少11.3倍)的IC50值范圍的放大。
圖6說明制造1克最終的免疫粘附素所必須的產量評估。該圖說明了在20％的產率下和預期的表達水平和植物重量下生產1g免疫粘附素所需的植物數量。對于不同水平的免疫粘附素表達(mg/kg鮮重)和總體收率(設定為20％)，可以在合理可能性窗口內(虛線方框)判斷用于具體生產目的(1g/收獲物)每種植物的重量和植物的總數。所需的植物量降低，與特殊生長和再生長周期相反。期望得到的生物量，作為時間和生長狀況的函數影響收獲的時間和收獲的間隔時間。可以通過交錯種植和收獲期調整這些生長周期，使之適應純化方案的實際需要。
圖7說明表2列出的每種免疫球蛋白基因的蛋白的編碼序列和氨基酸序列。
圖8說明實施例2中描述的用于轉化植物的質粒序列，該質粒用于研究本發明免疫粘附素的表達。
圖8A說明質粒PSSpICAMHuA2的核苷酸和蛋白序列。
圖8B說明豆球蛋白信號肽的核苷酸和蛋白序列。
圖8C說明pSHuJ蛋白編碼區的核苷酸和氨基酸序列。
圖8D說明pSHuSc蛋白編碼區的核苷酸和氨基酸序列。
圖8E說明質粒pBMSP-1的核苷酸序列。
圖8F說明質粒pBMSP-1spJSC的核苷酸序列。
圖9包括ICAM-1、人類IgA2的核苷酸和蛋白序列SEQ ID NO1；SEQ IDNO2；SEQ ID NO3；SEQ ID NO4；SEQ ID NO5；SEQ ID NO6；SEQID NO7；SEQ ID NO8和其它核苷酸序列。
發明詳述A.定義在此使用的以下縮寫和術語包括但并不限于以下定義。
本發明的實施將使用，除非另外指明，本領域技術人員已知的免疫學、分子生物學、微生物學、細胞生物學和重組DNA常規技術。見例如，Sambork等，Molecular CloningA Laboratory Manual，第二版(1989)；Current Protocols In Molecular Biology(F.M.Ausubel等des.，(1987))；the series Methods In Enzymology(Academic Press，Inc.)；M.J.Macpherson等，eds.，Pcr 2A Practical Approach(1995)；Harlow和Lane，eds，AntibodiesA Laboratory Manual(1988)，和H.Jones，，Methods In Molecular Biology vol.49“PlantGene Transfer And Expression Protocols”(1995)。
免疫球蛋白分子或抗體。包含共價偶聯的免疫球蛋白重鏈免疫和免疫球蛋白輕鏈活性部分的多肽或多聚體蛋白，并能與抗原特異性結合。所述免疫球蛋白或抗體分子是一種大家族的分子，它們包括多種類型的分子，例如IgD、IgG、IgA、分泌型IgA(SIgA)、IgM和IgE。
構建體或載體。轉移到目的植物組織或細胞的一種人工組裝的DNA片段。代表性的構建體包含有特殊目的基因、標記基因和適當的控制序列。術語“質粒”指一種自主的，自我復制的染色體外DNA分子。在一個優選實施方案中，本發明的質粒構建體包含抗體重鏈和輕鏈的編碼序列。質粒構建體包含適當的調節元件，也稱為“表達盒”。在一個優選實施方案中，質粒構建體還可以包含一種篩選或可選擇標記，例如一種抗生素抗性基因。
可選擇標記。編碼的產物可以使轉基因組織在一種選擇性培養基中生長的基因。選擇性標記的非限制性實例包括編碼抗生素，例如氨芐青霉素、卡那霉素等抗性的基因。其它的可選擇標記為本領域技術人員熟知。
轉基因植物。基因工程植物或基因工程植物的后代。轉基因植物通常至少包含一種非相關生物體來源的物質，例如病毒、其它的植物或動物。
嵌合ICAM-1分子ICAM-1細胞外結構域1、2、3、4和5的任意組合與免疫球蛋白重鏈蛋白的至少一部分的融合，它是通過把ICAM-1序列連接于免疫球蛋白重鏈基因序列的上游，并從構建體表達編碼蛋白而形成的。
嵌合免疫球蛋白重鏈免疫球蛋白重鏈至少包含一部分來源于不同同種型或亞型的免疫球蛋白重鏈或其它肽、多肽或蛋白的氨基酸序列。一種代表性的嵌合免疫球蛋白重鏈含有至少來源于兩種不同同種型或亞型免疫球蛋白重鏈的氨基酸殘基序列。
雙子葉植物(dicots)胚具有為兩瓣種子或子葉的開花植物。雙子葉植物的實例為煙草、番茄、紫花苜蓿等豆類、橡樹、楓樹、玫瑰、薄荷、南瓜、雛菊、胡桃、仙人掌、紫羅蘭和毛茛。
有效量有效量的本發明的免疫粘附素足夠可檢測地抑制鼻病毒傳染性、細胞毒性或復制性；或減少鼻病毒傳染的嚴重性或持續時間。
人類鼻病毒(HRV)一種無被膜的RNA病毒，代表一種細小核糖核酸病毒亞組，是人類感冒的主要病因。鼻病毒也被稱為鼻病毒、呼腸孤病毒和細小病毒，見pp.1057-1059，Zinsser Microbiology，Joklik等，eds.Appleton和Lange(1992)。
免疫粘附素包含嵌合ICAM-1分子的復合物，任選包含分泌成分和J鏈。
免疫球蛋白重鏈包含免疫球蛋白抗原結合域的至少一部分和免疫球蛋白重鏈可變區的至少一部分或免疫球蛋白重鏈恒定區的至少一部分的多肽。因此，免疫球蛋白來源的重鏈與免疫球蛋白基因超家族成員有明顯的氨基酸序列同源區。例如，Fab片段的重鏈是一種免疫球蛋白來源的重鏈。
免疫球蛋白輕鏈包含免疫球蛋白抗原結合域的至少一部分和免疫球蛋白輕鏈可變區或恒定區的至少一部分的多肽。因此，免疫球蛋白來源的輕鏈與免疫球蛋白基因超家族成員有明顯的氨基酸同源區。
免疫球蛋白分子包含共價偶聯的免疫球蛋白重鏈免疫和免疫球蛋白輕鏈活性部分，并能與抗原特異性結合的蛋白。
ICAM-1分子細胞間粘附分子-1。ICAM-1作為人類鼻病毒的受體起作用。
J鏈一種參與免疫球蛋白多聚化和運送多聚化免疫球蛋白通過上皮細胞的多肽。見The Immunoglobulin HelperThe J Chain inImmunoglobulin Genes，第345頁，Academic Press(1989)。J鏈見于IgM五聚體和IgA二聚體，一般通過二硫鍵連接。J鏈在鼠和人類中都有研究。
單子葉植物(monocots)胚芽具有一個子葉或種子葉的開花植物。單子葉植物的實例為百合花、大麻、玉米、燕麥等谷物、小麥、大麥、蘭花、鳶尾、洋蔥和棕櫚。
糖基化作用通過寡糖修飾蛋白。見Marshall，Ann.Rev.Biochem.，41673(1972)和Marshall，Biochem.Soc.Symp.，4017(1974)對起糖基化信號功能的多肽序列的總體綜述。哺乳動物和植物細胞都可識別這些信號。
植物特異的糖基化作用在植物表達的蛋白內發現的糖基化作用模式不同于哺乳動物或昆蟲細胞中蛋白的糖基化作用。植物或植物細胞表達的蛋白較其它類型的細胞，包括哺乳動物細胞和昆蟲細胞有不同的糖基化作用模式。鑒定植物特異的糖基化作用并與其它細胞類型的糖基化作用相對比的詳細研究見Cabanes-Macheteau等，Glycobiology 9(4)365-372(1999)，Lerouge等，Plant Molecular Biology3831-48(1998)和Altmann，Glycocon jugate J.14643-646(1997)。植物特異的糖基化作用產生的多糖中的木糖β(1，2)連接于甘露糖。哺乳動物和昆蟲細胞的糖基化作用都不能使木糖β(1，2)連接于甘露糖的多糖。植物不能使唾液酸連接于多糖的末端，而哺乳動物細胞可以達到。而且，植物特異的糖基化作用使巖藻糖α(1，3)連接于毗鄰GlcNAc，而哺乳動物細胞的糖基化作用使巖藻糖α(1，6)連接于毗鄰GlcNAc。
分泌成分(SC)分泌性免疫球蛋白的一種成分，它幫助免疫球蛋白對抗滅活試劑，從而提高分泌型免疫球蛋白的生物效應。該分泌成分可以來源于任何哺乳類或嚙齒類動物，包括鼠或人類。
sICAM一種天然存在的可溶性ICAM-1剪切形式，缺少疏水性跨膜結構域和ICAM的羰基末端細胞質結構域。
本文件引入的文章、專利和專利申請在此全文引入作為參考。
B.含有嵌合ICAM分子的免疫粘附素本發明提供生產含有嵌合ICAM分子的免疫粘附素分子的新方法。本發明的免疫粘附素含有與J鏈和分泌成分結合的由連接于免疫球蛋白重鏈分子一部分的鼻病毒受體蛋白組成的嵌合ICAM-1分子。本發明的嵌合ICAM-1分子含有不同來源的兩種分子鼻病毒受體蛋白部分和免疫球蛋白鏈部分。本發明的鼻病毒受體蛋白來源于細胞間粘附分子-1(ICAM-1)。人類鼻病毒受體ICAM-1核苷酸序列已由Staunton等，Cell 52925-933(1988)；Greve等，Cell 56839-847(1989)；Greve等，J.Virology 656015-6023(1991)；Staunton等，Cell 61243-254(1990)測定并鑒定，描述于SEQ ID No.3和Genbank注冊號No.M24283。
ICAM-1分子是一種膜蛋白(SEQ ID NOS1和2)，具有五個細胞外結構域，一個疏水性跨膜結構域和一個短的細質結構域。這些特征已由Casasnovas等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，954134-4139(1998)和Staunton等，Cell 52925-933(1988)描述。本發明特別使用ICAM-1分子結構域，該結構域負責定位于N-末端結構域1和2的人類鼻病毒的結合(Greve等，J.Virol.，656015-6023(1991)，以及Staunton等，Cell 61243-254(1990))。本發明也考慮包含ICAM-1分子細胞外結構域1、2、3、4和5任意組合的鼻病毒受體蛋白部分。在特別優選實施方案中，鼻病毒受體蛋白部分包含ICAM-1分子的結構域1和2，在其它優選實施方案中，也包含ICAM-1分子結構域1、2、3、4和5。
本領域熟知五個細胞外結構域的界限，并見Staunton等，Cell 52925-933(1988)的描述。近似結構域界限見下表1。
表1ICAM-1結構域氨基酸1 1-882 89-1053 106-2844 285-3855 386-453本發明使用的ICAM-1結構域1約在1-88位殘基；結構域2約在89-105位殘基；結構域3約在106-284位殘基；結構域4約在285-385位殘基；結構域5約在386-453位殘基。本領域技術人員應理解這些結構域的精確界限可以改變。
本發明的嵌合ICAM-1分子優選至少包含IgM或IgA重鏈的一部分，該部分使免疫球蛋白重鏈結合于免疫球蛋白J鏈，并因此結合于分泌成分。來源于本發明免疫球蛋白重鏈的嵌合ICAM-1部分可以由選自IgA重鏈或IgM重鏈或其它重鏈同種型的各個結構域組成。來源于IgA或IgM之外的免疫球蛋白重鏈或免疫球蛋白輕鏈的免疫球蛋白結構域也考慮通過分子工程結合于免疫球蛋白J鏈，因而可以用于產生本發明的免疫球蛋白。
本領域技術人員應理解免疫球蛋白由約100-110個氨基酸殘基的結構域組成。這些不同的結構域已為本領域所熟知并具有已知界限。使用現代分子生物學技術可以成功地去除單個結構域并用其它抗體分子的結構域替換。這些結構域是以鏈內二硫鍵穩定的球狀結構的。這賦予分散的形狀，使結構域之成為自制單位，可以被其它形狀相似的結構域替換或與其交換。免疫球蛋白重鏈恒定區結構域賦予多種特性，稱作包含該結構域的特定分子上的抗體效應子功能。效應子功能的實例包括固定補體、胎盤轉移、結合葡萄球菌蛋白、結合鏈球菌蛋白G、結合單核細胞、中性粒細胞或肥大細胞和嗜堿性粒細胞。特定結構域和特定免疫球蛋白同種型與這些效應子功能的相互作用已被熟知，例如描述于免疫學，Roitt等，Mosby St.Louis，Mo.(1993 3rdEd.)。
本領域技術人員能夠識別免疫球蛋白重鏈恒定區序列。例如，通過Genbank方便的得到多種免疫球蛋白DNA和蛋白序列。表2說明免疫球蛋白重鏈基因和該基因編碼蛋白的Genbank注冊號。表2中列出的序列在圖7中說明。
表2
除了嵌合ICAM-1分子，本發明的免疫粘附素還可以包含免疫球蛋白輕鏈分子或結合于免疫球蛋白來源的重鏈的免疫球蛋白J鏈。在優選實施方案中，本發明的免疫粘附素包含兩個或四個嵌合ICAM-1分子和結合于至少一個嵌合ICAM-1分子的免疫球蛋白J鏈。J鏈如本領域描述并被熟知。見例如，M.Koshland，The Immunoglobulin HelperThe J Chain，in Immunoglobulin Genes，Academic Press，London，pg.345，(1989)和Matsuuchi等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，83456-460(1986)。免疫球蛋白J鏈序列可以從美國多種數據庫方便地得到。
本發明的免疫粘附素可以具有結合于嵌合ICAM-1分子的一種分泌成分。這種結合可以通過氫鍵、二硫鍵、共價鍵、離子交換或這些鍵的組合產生。一般地，嵌合ICAM-1分子通過分子間二硫鍵相互連接。嵌合ICAM-1分子間的相互作用可以是非共價的或通過二硫鍵。本發明考慮使用多種不同物種，包括人、大鼠、兔、牛等的分泌成分。這些分子的核苷酸序列為本領域熟知。例如，美國專利6,046,037包括多種序列，該專利在此引入作為參考。
本發明的免疫粘附素包含分泌成分、嵌合ICAM-1分子和J鏈，一般通過以下化學鍵連接氫鍵、二硫鍵、共價鍵、離子相互作用或這些鍵的組合。
本發明也考慮含有一種以上嵌合ICAM-1分子的免疫粘附素。免疫粘附素可以包含單體單位的，不以二硫鍵與其它嵌合ICAM-1分子結合的嵌合ICAM-1分子。在優選實施方案中，免疫粘附素也包含與其它嵌合ICAM-1分子結合形成二聚體和其它多價分子的嵌合ICAM-1分子。因為嵌合分子內免疫球蛋白部分的結合，嵌合ICAM-1分子一般是二聚體形式。嵌合ICAM-1分子的免疫球蛋白部分允許兩個嵌合ICAM-1分子結合形成具有由鼻病毒受體蛋白組成的兩個活性結合部分的二聚體分子。在優選實施方案中，通過正常存在于免疫球蛋白結構域之間作為天然存在的免疫球蛋白分子和天然免疫球蛋白的一部分的二硫鍵區發生二聚化。本領域技術人員應理解，這些天然免疫球蛋白分子內正常存在的二硫鍵可以被修飾、移動和去除，但依舊保持形成嵌合ICAM-1分子二聚體的能力。
在其它優選實施方案中，由于J鏈和嵌合ICAM-1分子免疫球蛋白部分的結合，免疫粘附素包括多聚體形式的嵌合ICAM-1分子。J鏈和兩個嵌合ICAM-1分子的二聚體的結合允許形成四聚體形式的免疫粘附素。在一種優選實施方案中，嵌合ICAM-1分子的免疫球蛋白部分來源于IgA分子，J鏈的添加允許形成包含四個嵌合ICAM-1分子和四個結合位點的四聚體復合物。在其它優選實施方案中，嵌合ICAM-1分子使用嵌合免疫球蛋白重鏈，嵌合ICAM-1分子可以通過負責結合J鏈的來自于IgA或IgM的結構域，形成二聚體或其它更高級的多價復合物。在其它嵌合免疫球蛋白分子內，負責兩個免疫球蛋白重鏈的二硫鍵結合和/或一個免疫球蛋白輕鏈和一個重鏈間的二硫鍵結合的免疫球蛋白部分可以置于嵌合免疫球蛋白分子內，以便形成二聚體或其它高級的多價復合物。
本發明考慮的免疫粘附素包含嵌合ICAM-1分子，其中包含重鏈的免疫球蛋白結構域來源于重鏈或輕鏈免疫球蛋白的不同同種型。本領域技術人員應理解，使用分子技術可以用相似的結構域替代這些結構域，因此產生兩種不同免疫球蛋白分子間雜交的免疫球蛋白分子。這些嵌合免疫球蛋白允許對含有分泌成分的免疫粘附素進行構建，使其含有通過不同免疫球蛋白結構域賦予的多種不同的和需要的特性。
本發明也考慮了嵌合ICAM-1分子，其中來源于免疫球蛋白、重或輕J鏈的嵌合分子可以含有少于源于不同免疫球蛋白分子的一個完整結構域。同樣的分子技術亦可用于產生這些嵌合ICAM-1分子。
在優選實施方案中，本發明的嵌合ICAM-1分子至少包含鼠或人IgA1、IgA2和IgM的CH1、CH2和CH3結構域。本發明的其它優選實施方案中的免疫球蛋白結構域至少包括IgM的Cμl、Cμ2、Cμ3或Cμ4結構域。
優選的嵌合ICAM-1分子包含源于人免疫球蛋白的兩種不同同種型的結構域。優選的嵌合ICAM-1分子包含的免疫球蛋白至少包含人IgG、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgE或IgD的CHl、CH2或CH3結構域。其它作為嵌合ICAM-1分子的一部分使用的優選免疫球蛋白包括至少含有源于IgE或IgM的CH1、CH2、CH3或CH4的結構域的免疫球蛋白。本發明還考慮了含有至少來源于兩種不同哺乳動物免疫球蛋白同種型的免疫球蛋白結構域的嵌合ICAM-1分子。概括的說，任意哺乳動物免疫球蛋白都可用于優選實施方案，例如以下同種型任意IgG同種型、任意IgA、IgE、IgD或IgM同種型。本發明也考慮了人類、鼠或其它哺乳動物物種來源的嵌合ICAM-1分子。在優選實施方案中，嵌合ICAM-1分子包含負責J鏈與IgA或IgM結合的IgA或IgM的部分。因此，通過在嵌合ICAM-1分子內使用一種嵌合免疫球蛋白，J鏈可以與主要為不能結合J鏈或分泌成分的同種型的嵌合免疫球蛋白分子結合。
本發明也考慮了嵌合ICAM-1分子，其包含的免疫球蛋白結構域來源于兩種不同同種型的嚙齒動物或靈長類動物的免疫球蛋白。本領域技術人員熟知嚙齒動物或靈長類動物免疫球蛋白的同種型。本發明的嵌合ICAM-1分子可以包含免疫球蛋白來源的重鏈，其包括至少一種以下的免疫球蛋白結構域小鼠IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgA、IgE或IgD的CH1、CH2或CH3結構域；小鼠IgE或IgM的CH1、CH2、CH3或CH4結構域；人IgG、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2或IgD的CH1結構域；人IgE或IgM的CH1、CH2、CH3或CH4結構域；哺乳動物IgG同種型、IgA、IgE或IgD同種型的CH1、CH2、CH3或CH4結構域；哺乳動物IgE或IgM的CH1、CH2、CH3或CH4結構域；嚙齒動物IgG、IgA、IgE或IgD同種型的CH1、CH2或CH3結構域；嚙齒動物IgE或IgM的CH1、CH2、CH3或CH4結構域；動物IgG同種型、IgA、IgE或IgD同種型的CH1、CH2或CH3結構域；和動物IgE或IgM的CH1、CH2、CH3或CH4結構域。本發明也考慮在嵌合ICAM-1分子內替代或添加來源于免疫球蛋白超家族成員分子的蛋白結構域。免疫球蛋白超家族分子的氨基酸序列和核苷酸序列與免疫球蛋白同源。免疫球蛋白超家族的部分分子可以通過氨基酸或核苷酸序列同源性識別。見例如，Immunoglobulin Genes，第361頁，Academic Press(1989)。
在本發明的優選實施方案中，免疫粘附素的表達是通過產生具有植物特異的糖基化作用的免疫粘附素的方法得到。本領域熟知，糖基化作用是植物細胞內蛋白的一種主要修飾(Lerouge等，Plant MolecularBiology 3831-48，1998)。其它類型的細胞中也發生蛋白的糖基化作用，包括哺乳動物和昆蟲細胞。糖基化過程始于內質網，通過共翻譯轉移寡糖前體至新生多肽鏈的特定殘基。這些寡糖被加工為不同類型的多糖，其不同點在于存在殘基的類型和殘基間連接的特性，該加工存在于糖蛋白從內質網移動至其最終目的地的分泌通路上。本領域技術人員應理解，在成熟后期，植物或植物細胞表達的蛋白較其它類型細胞，包括哺乳動物細胞和昆蟲細胞表達的蛋白有不同的糖基化作用模式。已有具體的研究鑒定植物特異的糖基化，并與其它類型細胞的糖基化進行對比，例如，Cabanes-Macheteau等，Glycobiology 9(4)365-372(1999)和Altmann，Glycoconjugate J.14643-646(1997)描述的研究。這些研究組和其它研究組已經證實植物特異的糖基化作用產生的多糖中的木糖β(1，2)連接于甘露糖。哺乳動物和昆蟲細胞的糖基化作用都不能使木糖β(1，2)連接于甘露糖的多糖。植物特異的糖基化作用使巖藻糖α(1，3)連接于毗鄰GlcNAc，而哺乳動物細胞的糖基化作用使巖藻糖α(1，6)連接于毗鄰GlcNAc。而且，植物特異的糖基化作用不能使唾液酸添加至蛋白多糖的末端，而哺乳動物中的糖基化作用可以添加唾液酸。
以植物特異的方式糖基化的本發明的免疫粘附素可以包含一種嵌合ICAM-1分子，其包含ICAM-1分子細胞外結構域1、2、3、4和5的任意組合。圖2B說明本發明的嵌合ICAM-1/IgA2分子(SEQ ID N08)的氨基酸序列，其包含ICAM-1的所有五種結構域。黑體N代表天冬酰胺殘基，其在植物細胞、哺乳動物和昆蟲細胞的糖基化作用中與寡糖部分連接。本領域技術人員應理解，糖基化位點是三肽Asn-X-Ser/Thr，其中X可以是除了脯氨酸和天冬氨酸以外的任意氨基酸殘基(Kornfeld和Kornfeld，Annu Rev Biochem 54631-664，1985)。因此，本領域技術人員應理解，蛋白的哪一個氨基酸具有植物特異的糖基化作用將取決于存在ICAM-1的哪一個結構域。因為ICAM-1的序列和結構域界限已知(見Staunton等，Cell 52925-933，1988)，本領域技術人員可以明確如何測定任何5種ICAM-1結構域潛在組合上的植物特異的糖基化位點。
在本發明的其它優選實施方案中，免疫粘附素含有植物特異的糖基化作用，并包含具有ICAM-1細胞外結構域1、2、3、4和5的任何組合的嵌合ICAM-1分子，它進一步包含與所述嵌合ICAM-1分子結合的J鏈和分泌成分。同嵌合ICAM-1分子一樣，本領域技術人員可以識別J鏈和分泌成分序列內的植物特異的糖基化作用位點。
本發明考慮了具有植物特異的糖基化作用的免疫粘附素，其中包含嵌合ICAM-1分子，其中免疫球蛋白重鏈選自IgA(SEQ ID NOS15-18)，IgA1(SEQ ID NOS15-16)，IgA2(SEQ ID NOS17)，IgG1(SEQ IDNOS19-20)，IgG2(SEQ ID NOS21-22)，IgG3(SEQ ID NOS23-24)，IgG4(SEQ ID NOS25-26)，IgM(SEQ ID NOS46-47)，IgD(SEQ IDNOS27-32和36-41-43)，IgE(SEQ ID NOS44-45)和嵌合免疫球蛋白重鏈。本領域技術人員應理解，哪些免疫球蛋白重鏈序列或哪些免疫球蛋白重鏈序列組合被組合于嵌合免疫球蛋白重鏈，才能對免疫粘附素嵌合ICAM-1分子的糖基化數量和位點有影響。正如嵌合ICAM-1分子，本領域技術人員可以識別免疫球蛋白重鏈序列，包括可被構建的多種嵌合免疫球蛋白重鏈序列中的植物特異的糖基化作用位點。
同時在此提供免疫粘附素的功能衍生物。“功能衍生物”意味著本發明多肽或核酸的一種“化學衍生物”、“片段”或“突變體”，其保持至少一部分的蛋白功能，例如與蛋白特異抗體的反應性、酶活性或結合活性，這些功能保證該衍生物在本發明中的用途。本領域熟知，由于遺傳密碼子的簡并性，多種不同的核苷酸序列可以編碼同樣的氨基酸序列。本領域也熟知，氨基酸的保守性取代可以使蛋白或多肽保持原始的功能。在兩種情況下，本公開內容的意圖包括所有的改變。
該衍生物也可通過常規方法工程化，使其包含一種親和純化標簽，從而可以生產大量和/或相對純化或分離量的免疫粘附素。存在多種不同形式的標簽，它們可被摻入免疫粘附素的一種或多種成分，優選地不破壞無標簽的免疫粘附素的所需結合活性。這些標簽可被工程化為與編碼本發明免疫粘附素的核苷酸序列融合的可表達核酸序列。可以進一步使該標簽工程化，使其可以通過例如商品化的酶被去除。
可以進一步去除密碼子或用非簡并性密碼子取代一個或多個密碼子，產生一種結構上修飾的多肽，其基本上與未修飾的核苷酸分子產生的多肽有相似的有效性。如本領域所認知的，兩種多肽可以是功能上等價的，正如產生它們的兩種核酸分子，盡管兩種核酸分子間的差異不與遺傳密碼子相關。
該方法的操作以及生產后的化學衍生可以用于，例如增加穩定性、可溶性、吸收性、生物學或治療效應、和/或生物半衰期。能介導這些效應的部分已被公開，例如，Remington’s Pharmaceutical Science，18thed.，Mack Publishing Co.，Easton，PA(1990)。本發明范圍內的一種功能衍生物是一種“突變體”多肽，它相對于天然多肽缺少一個或多個氨基酸或包含添加的或取代的氨基酸。通過適當修飾蛋白的DNA編碼序列，突變體即可來源于一種天然得到的復合物組分，包括在天然序列的C-末端、N-末端和/或內部的一個或多個位點上添加、去除、和/或修飾一種或多種氨基酸的密碼子。眾所周知，上述的突變體含有添加、取代和/或其它的氨基酸，它保持天然蛋白的一種或多種特征性部分。
使用本領域普通技術人員熟知的標準技術可以制備去除、插入和/或取代了氨基酸殘基的蛋白的功能性衍生物。例如，使用定點突變技術得到功能衍生物的修飾成分(實例見Adelman等，1983，DNA 2183)，其中使用例如以上描述的技術修飾DNA編碼序列中的核苷酸得到修飾的編碼序列，接著在原核或真核宿主細胞內表達該重組DNA。還可以使用本領域熟知的方法，通過直接化學合成，方便地制備氨基酸去除、插入和/或取代的蛋白。蛋白的功能衍生物一般具有與天然蛋白同樣的定量生物活性。
而且，本發明的免疫粘附素并不僅為修飾的ICAM-1/Ig免疫粘附素，還包括其它的天然ICAM家族成員、同種型、和/或其它同源氨基酸序列，例如人類、靈長類動物、嚙齒類動物、犬科動物、貓科的動物、牛、鳥類等。免疫粘附素使用的Ig類型也可進一步改變，例如可以假定在給定物種的范圍內或外的不同的Ig家族成員特性。ICAM和Ig是多種多樣的，具有已知的序列，本領域技術人員可以使用它們創造不同的具有或多或少不同功效的免疫粘附素，并在給定生物體內實施治療。下表說明，但非完全性地列舉了具有ICAM-1同源性，可用于產生其它免疫粘附素分子的實例。
表3
同樣地，已知人類和其它物種的不同Ig分子的許多重鏈恒定區可以用在此描述的嵌合體的特定Ig區取代。
C.含有免疫粘附素的載體、細胞和植物本發明也考慮了含有本發明的免疫粘附素的表達和克隆載體、細胞和植物。分離免疫粘附素各種部分的編碼基因的技術為本領域技術人員熟知，運用這些技術可以把多種所需片段插入表達載體和克隆載體，例如那些能夠導入細胞和轉基因植物的載體。
本發明考慮了組裝免疫粘附素的方法，該方法包括以下步驟把編碼嵌合分子和免疫球蛋白J鏈的DNA片段導入一種生物體，再把編碼分泌成分的DNA導入同一生物體。優選的分泌成分至少包含人類多免疫球蛋白受體(pIgR)氨基酸殘基序列或其它物種的類似氨基酸殘基的1至約606位的一個氨基酸殘基片段(Mostov，Ann Dev.Immu.1263-841994)。
本發明所考慮的真核細胞包括植物細胞，其中含有本發明的免疫粘附素。本發明也考慮植物細胞，其包含本發明的免疫粘附素各種成分的編碼核苷酸序列。本領域技術人員應理解，編碼分泌成分保護蛋白、嵌合ICAM-1分子和J鏈的核苷酸序列一般將與啟動子可操作性連接，并以表達載體或表達盒的一部分存在。典型地，如果使用的真核細胞是一種植物細胞，那么應使用能在植物細胞內操作的啟動子。在嵌合ICAM-1基因之后，分泌成分基因和J鏈基因得到分離，它們一般被操作性連接于一種表達載體內的轉錄啟動子。本發明也考慮表達載體，其包含操作性連接于表達的調節序列的編碼嵌合ICAM-1分子的核苷酸序列。這些表達載體將待表達的核苷酸序列置于一種特定的細胞啟動子序列3’端，使該核苷酸序列轉錄和表達。該表達載體也包含改進轉錄效率的各種增強子序列。而且，也可以包括終止子、聚腺苷酸化(poly A)位點和其它的3’末端加工信號，以增加在特定細胞內轉錄的核苷酸序列的量。
選定生物體內各成分的表達可以來源于一種獨立復制的質粒、或來源于染色質的永久成分、或來源于瞬時產生編碼這些成分的轉錄物的任意DNA片段。適于轉化的生物體可以是原核或真核生物。復合物各成分的導入可以通過直接DNA轉化、biolistic遞送入生物體或通過另一種生物體介導，例如通過重組土壤桿菌在植物細胞上的作用二介導。在轉基因生物體內表達蛋白通常需要共導入一種合適的啟動子元件和聚腺苷酸化信號。在本發明的一項實施方案中，啟動子元件潛在性導致組分在植物所有細胞內的組成型表達。在大多數或所有細胞內的組成型表達可以確保前體占據同一個細胞內膜系統，這可能是組裝所必需的。
表達載體可被宿主細胞相容，優選使用植物細胞相容的載體表達本發明的基因。用于在植物內表達基因的代表性表達載體為本領域所熟知，包括Rogers等在Meth.in Enzymol.，153253-277(1987)中描述的來源于腫瘤誘導的(Ti)根癌土壤桿菌質粒的載體。然而，眾所周知，一些其它的表達載體系統在植物內也有一定功能。見例如，Verma等，PCT出版號WO87/00551及Cooking和Davey，Science，2361259-1262(1987)。
以上描述的表達載體包含表達控制元件，包括啟動子。待表達的基因被操作性連接于表達載體，允許啟動子序列指導RNA聚合酶結合并合成所需的多肽編碼基因。用于基因表達的啟動子為可誘導的、病毒的、合成的、組成型和可調控型。本領域技術人員熟知，所使用表達載體的選擇和最終把編碼本發明部分免疫粘附素的核苷酸序列操作性連接于哪些啟動子，直接依賴于所需的功能特性，例如表達蛋白的位置和時間及待轉化的宿主細胞，這些是本領域構建重組DNA分子所固有的限制性。然而，在本發明的實施中使用的表達載體至少能夠指導復制，并優選能夠指導使操作性連接于其上的包括于DNA片段中的多肽編碼基因的表達。
在優選實施方案中，用于表達基因的表達載體包括一種植物細胞內有效的選擇標記，優選為藥物抗性選擇標記。優選的藥物抗性標記是表達產生卡那霉素抗性的基因，即一種包含胭脂堿合成酶啟動子、Tn5新霉素磷酸轉移酶II和胭脂堿合成酶合成酶3’非翻譯區的嵌合基因，見Rogers等在Methods For Plant Molecular Biology，a Weissbach andH.Weissbach，eds.，Academic Press Inc.，San Diego，Calif.(1988)的描述。一種有用的植物表達載體可以從Pharmacia，Piscataway，N.J.購得。在植物中表達外源蛋白的表達載體和啟動子描述于美國專利5,188,642；5,349,124；5,352,605和5,034,322，在此引入作為參考。
通過互補粘性末端將DNA操作性連接至載體的多種方法已得到開發。例如，可以將互補的均聚合物軌跡添加至DNA片段，以便插入載體DNA。載體和DNA片段即可通過互補均聚合物尾部之間的氫鍵連接，形成重組DNA分子。作為選擇，包含一個或多個限制性位點的合成接頭可用于連接DNA片段至表達載體。
通過鈍端DNA片段與過量合成接頭分子在酶存在下共孵育，該合成接頭即可連接于鈍端DNA片段，其中酶能夠催化鈍端DNA分子的連接，例如噬菌體T4 DNA連接酶。因此，該反應的產物為末端帶有合成接頭序列的DNA片段。這些DNA片段再用適當的限制性內切酶剪切并連接入表達載體，載體事先用可以產生與合成接頭末端相容的末端的酶消化。包括多種限制性內切酶位點的合成接頭可以通過許多商業化來源方便的得到，包括New England BioLabs，Beverly，Mass。
編碼本發明的分泌成分、J鏈和嵌合ICAM-1分子的核苷酸序列被直接導入同一植物細胞或把這些成分的每一種分別導入植物細胞并再生植物，雜交各種成分，得到包含所有所需成分的最終植物細胞。
可以使用任何方法把編碼本發明免疫粘附素各成分的核苷酸序列導入真核細胞。例如，把基因導入植物的方法包括土壤桿菌介導的植物轉化、原生質體轉化、基因轉移至花粉、注入生殖器官和未成熟胚胎。每種方法都有自身的利和弊。因此，把基因導入一種具體真核細胞或植物物種的具體方法不一定是對另一種真核細胞或植物物種最有效的方法。
根癌土壤桿菌介導的轉化是把基因導入植物細胞常用的系統，因為DNA能被導入整個植物組織，而避免從原生質體再生完整植物的需要。使用土壤桿菌介導的表達載體把DNA導入植物細胞為本領域所熟知。見例如，Fraley等，Biotechnology，3629(1985)和Rogers等，Methodsin Enzymology，153253-277(1987)描述的方法。進一步，Ti-DNA的整合是相對精確的過程，幾乎不導致基因的重排。待轉化的DNA區域通過邊界序列決定，間插DNA通常被插入植物基因組，如Spielmann等，Mol.Gen.Genet.，20534(1986)和Jorgensen等，Mol.Gen.Genet.，207471(1987)的描述。現代土壤桿菌轉化載體也能夠在大腸桿菌內復制，使操作更加方便，如Klee等在Plant DNA Infectious Agents，T.Hohn and J.Schell，eds.，Springer-Verlag，New York，pp.179-203(1985)中的描述。現代科技進一步優化了土壤桿菌介導的基因轉移的載體，改變了載體的基因排列和限制性內酶切位點以方便構建能表達不同多肽編碼的基因。Rogers等在Methods in Enzymology，153253-277(1987)中描述的載體具有方便的多接頭區，其側翼為指導插入的多肽編碼基因表達的啟動子和聚腺苷酸化位點，適用于本發明的目的。
對于土壤桿菌介導轉化有效的植物物種，應選用這種基因轉移方便和特性明確的方法。土壤桿菌介導的葉盤和其它組織的轉化不限于根癌土壤桿菌天然感染的植物物種。因此，土壤桿菌介導轉化對雙子葉植物最有效。
雖然使用土壤桿菌載體可以在蘆筍產生轉基因植物，幾乎沒有單子葉植物是土壤桿菌的天然宿主，如Bytebier等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，8453-45(1987)。因此，商業上重要的谷物，例如水稻、玉米和小麥必須使用其它的轉化方法。植物原生質體轉化可以用以下方法達到，包括磷酸鈣沉淀、聚乙二醇處理、電穿孔和這些處理的組合。見例如，Potrykus等，Mol.Gen.Genet.，199183(1985)；Lorz等，Mol.Gen.Genet.，199178(1985)；Fromm等，Nature，319791(1986)；Uchimiya等，Mol.Gen.Genet.，204204(1986)；Callis等，Genes and Development，11183(1987)和Marcotte等，Nature，335454(1988)。
這些方法在不同植物物種中的應用依賴于具體植物物種從原生質體再生的能力。從原生質體再生谷類的說明方法見Fujimura等，PlantTissue Culture Letters，274(1985)；Toriyama等，TheorAppl.Genet.，7316(1986)；Yamada等，Plant Cell Rep.，485(1986)；Abdullah等，Biotechnology，41087(1986)。
對于不能從原生質體成功再生的植物物種，可以使用其它方法把DNA導入完整的細胞或組織。例如，從未成熟胚胎或外植體再生谷類見Vasil，Biotechnology，6397(1988)的描述。而且，“粒子槍”或高速微粒技術也可使用。使用這些技術，DNA在微小(0.525μm)金屬粒子表面以1至幾百米每秒的速度穿透細胞壁進入細胞質，如Klein等，Nature，32770(1987)；Klein等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，858502(1988)和McCabe等，Biotechnology，6923(1988)的描述。該金屬粒子穿透數層細胞，從而允許組織外植體內細胞的轉化。金屬粒子已經成功地應用于轉化玉米細胞，得到可育性穩定轉化的煙草和大豆植株。組織外植體的轉化不需要通過原生質體階段，因此加速了轉基因植物的產生。
也可以通過直接把DNA轉化入花粉而導入植物，如Zhou等，Methodsin Enzymology，101433(1983)；D.Hess，Intern Rev.Cytol.，107367(1987)；Luo等，Plant Mol.Biol.Report，6165(1988)描述。多肽編碼基因的表達可以通過把DNA注入植物生殖器官得到，如Pena等，Nature，325274(1987)描述。DNA可以被直接注入未成熟胚胎細胞并使脫水的胚胎再水合，如Neuhaus等，Theor.Appl.Genet.，7530(1987)和Benbrook等，在Proceeding Bio Expo 1986，Butterworth，Stoneham，Mass.，pp27-54(1986)描述。
從單植株原生質體或多種外植體再生植株為本領域所熟知。見例如，Methods for Plant Molecular Biology，A.Weissbach and H.Weissbach，eds.，Academic Press，Inc.，San Diego，Calif.(1988)。這種再生和生長過程包括選擇轉化細胞和莖、轉化莖生根和幼苗在土壤內生長。
通過根癌土壤桿菌從葉外植體導入外源基因的植物再生可以如Horsch等，Science，2271229-1231(1985)描述。在這個過程中，轉化體在存在一種選擇性試劑的培養基和誘導被轉化植物物種莖發芽的培養基中生長，如Fraley等，Proc.natl.Acad.Sci.U.S.A.，804803(1983)描述。該過程一般在2-4周的時間內長出莖，這些轉化莖再被轉移至含有選擇性試劑和抗生素的適當生根誘導培養基，其中的抗生素用來預防細菌生長。在選擇性試劑存在下生根形成幼苗的轉化莖被轉移至土壤中允許根的生長。這些過程應根據所使用的具體植物物種而變化，該變化為本領域所熟知。
本發明的免疫粘附素可以由任意植物細胞生產，包括來源于雙子葉植物或單子葉植物、茄科植物、苜蓿、豆類或煙草的植物細胞。
本發明轉基因植物可以從所有可進行有性雜交的植物物種產生，該植物可以使用本領域技術人員已知的方法轉化。可使用的植物物種是雙子葉植物，包括煙草、番茄、豆類、苜蓿、橡樹和楓樹；單子葉植物，包括草類、玉米、谷類、燕麥、小麥和大麥；和低等植物，包括裸子植物、松樹、問荊、石松、苔類、金魚藻、苔蘚、海藻、配子體、孢子體和蕨類植物。
本發明也考慮在哺乳動物細胞等真核細胞內表達免疫粘附素。本領域技術人員應理解，存在多種系統用于在哺乳動物細胞內表達免疫粘附素，并可以在這些細胞內簡便地修飾這些系統以表達本發明的免疫粘附素和嵌合ICAM-1分子。在優選實施方案中，本發明的嵌合ICAM-1、J鏈和分泌成分分子被置于載體pCDM8內，該載體已由Aruffo等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，848573-8577(1987)描述。使用的pCDM8并不是唯一的，還有多種其它的系統不利用cog細胞表達系統。例如，以下美國專利描述了可用于嵌合ICAM-1分子和其它免疫粘附素分子的真核表達系統。
D.包含免疫粘附素的組合物本發明也考慮了包含本發明免疫粘附素和植物大分子或材料的一種免疫粘附素。代表性的植物大分子或植物材料來源于可用于本發明的所有植物。植物大分子與本發明免疫粘附素共同存在于，例如，植物細胞內、植物細胞提取物中或植物內。組合物中與本發明免疫粘附素結合的典型植物大分子是二磷酸核酮糖羧化酶、光采集復合物色素(LHCP)、二級代謝物或葉綠素。本發明組合物中的植物材料或植物大分子的濃度為干重的0.01％～99％(排除水)。其它組合物中的本發明免疫粘附素的質量濃度為1％～99％(排除水)。其它組合物中的本發明免疫粘附素的質量濃度為50％～90％(排除水)。
本發明的組合物可以含有質量濃度為0.1％～5％的植物大分子(排除水)。組合物內存在的質量一般由植物大分子和本發明免疫粘附素組成。當本發明的免疫粘附素以較高或較低濃度存在時，組合物中植物大分子的濃度將向相反方向變動。在其它實施方案中，組合物內的植物大分子以質量濃度0.12％～1％(排除水)存在。
本發明考慮一種組合物，包含嵌合ICAM-1分子、J鏈或分泌成分。如前面的描述，這些成分構成一種復合物并結合。該組合物一般包括植物來源的分子。該組合物也可在產生功能性免疫粘附素和植物來源分子的提取過程后得到。
該提取方法包括對含有該復合物的植物施加一種力，從而使該植物的質外體小室破裂，釋放所述復合物。該力包括如釋放質外體液體的主要方法中使用的剪切力。
完整植物或植物提取物包含免疫粘附素和多種其它植物大分子的混合物。二磷酸核酮糖羧化酶(RuBisCo)或RuBisCo片段為混合物中含有的大分子。另一種大分子是LHCP。另一種分子是葉綠素。
其它制備含有嵌合ICAM-1分子免疫粘附素組合物的有效方法包括使用多種溶劑提取并對植物材料采用真空處理。本發明組合物可以包括質量濃度為0.1％～5％(排除水)的植物大分子。
本發明也考慮了可用于治療病人或動物的治療組合物。可以在從植物或其它轉基因生物體提取前或后給予該治療組合物。免疫粘附素一旦被提取，即應通過大小排阻、離子交換或親和層析等常規技術進一步純化。植物分子可以與該復合物共同給藥。
本發明也考慮了植物來源分子和動物來源分子間的相對比例可以變動。具體植物蛋白，例如RuBisCo或葉綠素的量可以是提取物質量的低至0.01％或高至99.9％(排除水)。
本發明也考慮了不進一步純化具體治療成分，直接使用含免疫粘附素的治療性植物提取物。可以通過局部施用、口服、鼻噴霧或任何其它適于遞送抗體至粘膜靶病原體的方法給藥。
E.藥物組合物、制劑和給藥途徑。
在此描述的免疫粘附素可以給藥于病人，優選以適當藥物組合物的形式給藥。這種組合物可包含，但不限于以上描述的成分。該組合物在給藥時，優選地表現治療和/或預防特性中的一種或兩種。可以根據本領域常規方法制備該組合物，并制成多種不同的形式，例如溶液、懸浮液或乳狀液，和在服用前適于溶解于液體的固體形式。多肽和蛋白的制劑和給藥技術可見于Remington’s Pharmaceutical Sciences，MackPubishing Co.，Easton，PA，最新版。使用這些程序，普通技術人員即可利用本發明免疫粘附素達到成功，而無需過多的實驗。
1.給藥途徑本發明的適當給藥途徑包括，例如口、鼻、吸入、眼內、咽喉、支氣管、經粘膜或腸內給藥。還可以選擇在局部給藥，例如通過注射或其它方法在優選的作用位點給藥。
2.制劑本發明藥物組合物也可以其自身熟知的方式加工，例如常規混合、溶解、粒化、糖衣化、研末、乳化、裝入膠囊、封閉或凍干。一種或多種生理可接受的載體包括賦形劑和/或其它輔助劑，其促進活性復合物添加入藥物制劑。適當的制劑依賴于所選擇的具體給藥途徑。
對于注射給藥，本發明的試劑應在水溶液，優選生理可接受的緩沖液，例如漢克氏液、林格氏液或生理鹽水中配制。對于經粘膜給藥，制劑中應使用適于穿透障礙的滲透劑。這些滲透劑通常為本領域所熟知。
對于口服給藥，通過結合活性復合物和本領域熟知的藥物可接受載體，可以容易對復合物進行制劑化。這些載體使本發明的復合物被制成片劑、藥丸、錠劑、膠囊、液體、凝膠體、糖漿、膏劑、懸浮液等，以適用于口服治療的病人。適當的載體包括賦形劑，例如填料，如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇和/或山梨醇；纖維素制劑，例如玉米淀粉、小麥淀粉、大米淀粉、番茄淀粉、明膠、黃蓍膠、甲基纖維素、羥基丙基甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果需要，也可以添加崩解劑，例如交聯聚乙烯吡咯烷酮、瓊脂、褐藻酸或其鹽，如褐藻酸鈉。
錠劑的核心被適當包衣。為此目的，可以使用濃縮的糖溶液，其可任選的包括阿拉伯樹膠、滑石粉、聚乙烯吡咯烷酮、卡波泊爾膠、聚乙二醇、和/或二氧化鈦、漆溶液、和適當的有機溶劑或溶劑混合物。可添加染料或色素于片劑或錠劑包衣，用于識別或鑒定活性復合物劑量的不同組合。
可以口服的藥物制劑包括明膠制成的適推型膠囊，及明膠和增塑劑，例如甘油或山梨醇制成的軟而密封的膠囊。適推型膠囊包括活性成分和與之混合的填料，例如乳糖、淀粉等粘合劑，和/或滑石粉或硬脂酸鎂等滑潤劑、和任選的穩定劑。在軟膠囊內，活性復合物可在適當液體內溶解或懸浮，例如脂肪、液體石蠟或液體聚乙二醇。而且可以添加穩定劑。所有口服給藥的制劑應以適于這種給藥方式的劑量給藥。
對于經頰給藥，組合物應采用片劑或錠劑的常規形式給藥。
對于吸入給藥，用于的本發明復合物可以方便地以氣溶膠噴霧的形式遞送，該氣溶膠噴霧是從加壓包噴霧器推進的，同時使用了適當的推進劑，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它適當的氣體。在加壓氣溶膠的情況下，可以通過活瓣計量確定劑量單位。可以將用于吸入器或吹入器的膠囊和明膠等彈射劑配制為包含復合物和適當粉劑基質，例如乳糖或淀粉的粉末混合物。
作為選擇，活性成分也可在使用前以粉劑形式用一種適當的載體例如無致熱原無菌水重建。
而且，該復合物也可被制成貯存制劑。這種長效制劑可以通過植入(例如皮下或肌肉內)或肌肉內注射給藥。因此，例如，該復合物可以用適當的聚合物或疏水材料(例如以可接受的油存在的乳狀液)或離子交換樹脂，或配制為微溶衍生物，例如微溶的鹽。
而且，該復合物可以通過緩釋系統遞送，例如包含治療試劑的固體疏水聚合物的半通透基質。多種緩釋材料都已被確定，并為本領域技術人員所熟知。根據化學特性，緩釋膠囊可以在幾周至高達100天內釋放該復合物。根據治療試劑的化學特性和生物穩定性，可以使用其它蛋白穩定方案。
藥物組合物也可以包含適當的固體或凝膠相載體或賦形劑。這些載體或賦形劑的實例包括但并不僅限于，碳酸鈣、磷酸鈣、多種糖、淀粉、纖維素衍生物、明膠和聚乙二醇等聚合物。
藥物兼容的鹽可以與多種酸，包括但并不僅限于，鹽酸、硫酸、醋酸、乳酸、酒石酸、蘋果酸、琥珀酸、檸檬酸等形成。鹽更易于溶解在相對無堿形式的水或其它質子溶劑中。調節溶液的pH值也常規用于最優化所需的特性。
3.確定有效劑量和劑量方案適于本發明使用的藥物組合物包括含有的活性成分的量可達到所需目的，如治療和/或預防的組合物。藥物有效量是指可以有效預防、減輕或改善疾病癥狀或延長被治療者存活期的復合物量。本領域技術人員能夠確定一種藥物有效量，一般將該量確定為0.5μg/kg/日～500g/kg/日，各個劑量一般包括約1ng至幾ng的免疫粘附素。
對于本發明方法使用的任何復合物，最初可以通過細胞培養分析來估計治療有效量。例如，對不同動物或細胞培養物可以給予多種劑量，并對比其效應。通過這種方法可以鑒定所需的濃度范圍，并由此制備和給藥。最優化的方法是本領域普通技術人員熟知的。
技術人員不僅應考慮藥物有效性，也要考慮標準制藥過程在細胞培養或實驗動物內的毒性，例如測定LD50(人群50％致死劑量)和ED50(人群50％治療有效劑量)。毒性和療效的劑量比是治療指數，它可通過LD50和ED50的比值表示。優選治療指數值較高的復合物。從這些細胞培養分析和動物研究獲得的數據可以用作人類制劑的劑量范圍。優選的該復合物劑量濃度范圍包括幾乎沒有或無毒的ED50。根據使用的劑劑型和給藥途徑，使用的劑量可在該濃度范圍內變動。醫生可以根據病人的情況選擇使用精確的制劑、給藥途徑和劑量。(見例如，Fingl等，1975，in“The Pharmacological Basis of Therapeutics，”ch.1 p.1)。
可以調整給藥的劑量和頻率，使免疫粘附素在粘膜水平充分保持或達到藥效，如治療和/或預防效果。最小有效濃度(MEC)應根據每種免疫粘附素和免疫粘附素制劑變化，但可通過體外和/或體內數據估計。達到MEC的必需劑量應根據個體特性和給藥途徑決定。然而，此處的分析可用于確定粘膜濃度，其可在劑量和精確配制上被進一步優化。
可以使用MEC值決定劑量間隔。復合物可以通過一種方式給藥，其保持粘膜水平高于MEC的時間為10-90％，30-90％，最優選50-90％。
如果需要，該組合物也可在包或撒布器內存在，其中可以含有包含活性成分的一種或多種單位劑形。該包可以包含例如金屬或塑料箔，例如起泡包(blister pack)。該包或撒布器也可以帶有給藥的說明。該包或撒布器也可以帶有與注釋，說明容器使用調控藥品制造、使用或銷售的政府機構所規定的形式，該注釋反應了該機構批準了該形式的免疫粘附素用于人類或獸醫給藥。這種注釋可以作為，例如美國食品和藥品監督局批準的處方藥標簽或批準的產品插頁。可制備包含配制于相容的藥物載體中的本發明復合物的組合物，將其置于一個適當的容器中，并標記用于治療適應癥，例如治療或預防由宿主生物體/患者ICAM分子介導的疾病。
F.治療和預防ICAM-1介導疾病的方法對于需要治療和/或預防性使用本發明免疫粘附素嵌合體，例如對于抗鼻病毒感染和/或伴隨感冒的癥狀的患者，應給于其藥物有效量的所需免疫粘附素，優選作為根據以上描述確定、生產和給藥的藥物組合物的一部分。這些制劑和遞送形式可以廣泛的變化。以下描述即是用于推斷有效量和毒性的預備程序，也可方便的用于確定人類和其它動物的治療和預防參數和方案。這些程序僅為說明，并不意味限制本發明。而且，這些是本領域普通技術人員常規使用的程序。
1.免疫粘附素降低鼻病毒在人類中的感染性的能力劑量遞增耐受研究可以使用例如隨機對照試驗檢測本發明的免疫粘附素，例如該免疫粘附素在鼻內給藥對感染的效果。可以使用其它給藥途徑。存在多種可用于監控效果的測定，例如分析評估疾病癥狀，如鼻病毒感染引起的感冒癥狀的IL-8反應分析。這些研究能夠評估在受試患者使用后，免疫粘附素對于鼻病毒感染的治療和預防的程度。例如，對健康和不健康受試者給予該免疫粘附素，并在一段時間中評估，例如隨鼻病毒接種和/或疾病的進展而評估。使用的臨床方案應基于先前用于評估重組可溶性ICAM-1分子抵抗鼻病毒感染的有效性的方法，或其改進方案(Turner等，JAMA 2811797-804，1999)。
所有物種、年齡、健康或疾病狀態的雄性或雌性受試者都可用于評估。受試者在研究前可能表現出血清中和抗體滴度，所述滴度可能反應于感染和免疫粘附素給藥而波動。
本發明的免疫粘附素可被制成內含各種量的免疫粘附素的一種緩沖鹽，并以不同的時間間隔向患者給藥。單升高劑量和多升高劑量研究可用于評估免疫粘附素的安全性。在每種情況下，每種劑量水平上都有一個或多個受試者參與評估，其中一些接受免疫粘附素治療，任選一個或多個接受安慰劑治療。在任一研究中，都可評估多個劑量水平。劑量水平可以變動，一般在ng至g范圍內。
在毒性和/或藥效評估時，可以間隔秒、分鐘、小時、周和月給藥。
可以評定藥物安全性和毒性，例如通過視覺檢查鼻粘膜的刺激或炎癥癥狀。也可根據常規方法進行血液安全性評估，并使用敏感分析，例如ELISA測定多種血液成分，包括循環免疫粘附素和鼻病毒數量。鼻灌洗檢測也可通過類似常規方法進行操作。
常規統計分析和計算可被用于測定對單個患者和/或受試者群體有效性和預測隨時間的毒性。
本領域熟知的侵襲研究也可用于證實其對臨床感冒的治療保護和/或降低病毒侵襲后的感冒癥狀，其使用商購的起始材料，例如病毒、細胞和動物。見例如，Gwaltney等，Prog.Med.Virol.39256-263，1992。
以下實施例說明本發明的公開內容。這些實施例不應限制本發明專利申請范圍。
實施例1.免疫粘附素表達盒的構建通過PCR克隆制備編碼ICAM-1細胞外結構域D1至D5的表達盒。具體的說，包含ICAM-1細胞外所有五個Ig樣結構域的片段是使用以下寡核苷酸引物從質粒pCDIC1-5D/IgA(參考Martin等的文獻)中擴增得到5’-TCTGTTCCCAGGAACTAGTTTGGCACAGACATCTGTGTCCCCCTCAAAAGTC-3’
(SEQ ID NO6)5’-CATACCGGGGACTAGTCACATTCACGGTCACCTCGCGG-3’(SEQ ID NO7)這兩條引物設計為在PCR片段的5’和3’端引入SpeI位點(加下劃線的核苷酸)。PCR過程使用Pfu聚合酶(Stratagene)減少錯誤的聚集。將該PCR片段克隆入PCRScript載體(Stratagene)，并在測序后融合至人類IgA2表達盒(羰基末端含或不含SEKDEL)。
開發了在植物內表達的人類J鏈和分泌成分構建體，以及人類IgA2重鏈構建體。制成一種重鏈表達盒載體，稱為pSSpHuA2(見圖1)。它包括編碼豆球蛋白信號肽的序列(Baumlein等，Nucleic Acids Res.14(6)，2707-2720，1986)。豆球蛋白序列由GenBank注冊號No.X03677提供，豆球蛋白信號肽序列為SEQ ID NO10(也見圖8)，在驅動信號肽表達的SuperMas啟動子和IgA2m(2)重鏈恒定區之間為含SpeI和SacI位點的IgA2m(2)恒定區。
擴增的編碼人類ICAM-1前五個結構域和人類IgA2m(2)Fc區的DNA被融合入植物表達盒，產生嵌合ICAM-1分子表達構建體，如圖2A所示。這是通過把編碼ICAM-1的五個細胞外結構域的片段克隆入pSSpHuA2載體，產生pSSPICAMHuA2而完成的。方便的限制性位點(5’SpeI和3’SpeI)允許擴增片段被插入信號肽和Cα1結構域之間。在得到的構建體內，嵌合ICAM-1分子的表達受組成型啟動子“SuperMas”(Ni等1995)和nos 3’終止子區控制。
得到的嵌合ICAM-1分子構建體不含可變區。在mRNA翻譯時，預計信號肽的剪切將ICAM-1重鏈融合定位于植物細胞內質網(ER)。編碼ER保留信號(RSEKDEL，SEQ ID NO5)的DNA被附著于重鏈3’末端，以提高構建體的表達水平。RSEKDEL(SEQ ID NO4)氨基酸序列是將蛋白保留在植物細胞內質網的共有信號序列。該序列已被證實提高植物體內抗體聚集水平(Schouten等，Plant Molecular Biology30781-793，1996)。嵌合ICAM-1分子構建體的氨基酸序列如圖2B所示。該構建體的DNA序列和翻譯框架在用作粒子轟擊前應核實無誤。
目前證實，J鏈與IgA的組裝發生于高爾基體(Yoo等，J.Biol.Chem.27433771-33777，1999)，無RSEKDEL的重鏈也在高爾基體內構建。ICAM-1片段被克隆入無RSEKDEL的含IgA2m(2)恒定區表達盒。
2.在植物內表達組裝的免疫粘附素A.免疫粘附素表達載體pSSPICAMHuA2(SEQ ID NO9和圖8)質粒全長6313bp。49-1165位核苷酸代表Super啟動子(Ni等，Plant Journal 7661-9-676，1995)。1166-3662位核苷酸包括編碼與接頭序列雜交的人類ICAM-1/人類IgA2m(2)恒定區的序列。包括了共有Kozak序列(Kozak，Cell 44(2)283-92，1986)(nt 1186-1192)和蠶豆豆球蛋白信號肽(nt1189-1257；Bumlein等，Nucleic Acids Reg.14(6)2707-2720(1986))以增強轉錄起始。先前已公布了人類IgA2m(2)恒定區(nt3663-3633)序列(Chintalacharuvu等，J.Imm.1525299-5304，1994)。將編碼內質網保留信號SEKDEL的序列附著于重鏈末端(nt3634-3654)。3663-3933位核苷酸來源于胭脂堿合成酶3’末端(轉錄終止和聚腺苷酸化信號；Depicker等，1982)。質粒的剩余部分來源于pSP72載體(Promega)。
PSHuJ(SEQ ID NO11和圖8)質粒全長4283bp。14-1136位核苷酸代表Super啟動子(Ni等，Plant Journal 7661-9-676，1995)，圖8所示的1137-1648位核苷酸包含編碼包括天然信號肽(Krajci等，Biochem.And Biophys.Res.Comm158783，1994)和接頭序列的人類J鏈的序列。包括了共有Kozak序列(Kozak，Cell 44(2)283-92，1986)(nt 1151-1157)以增強轉錄起始。1649-1902位核苷酸來源于胭脂堿合成酶3’末端(轉錄終止和聚腺苷酸化信號；Depicker等，J Mol Appl Genet 1(6)561-73(1982)。質粒的剩余部分來源于pSP72載體(Promega)。
pSHuSC(SEQ ID NO12和圖8)質粒全長5650bp。13-1136位核苷酸來源于Super啟動子(Ni等，Plant Journal 7661-9-676，1995)，1137-2981位核苷酸包含編碼包括天然信號肽(Krajci等，Biochem.AndBiophys.Res.Comm1 58783，1994)和接頭序列的人類分泌成分的序列。共有Kozak序列(Kozak，Cell 44(2)283-92，1986)(nt 1151-1157)增強轉錄起始。2982-3236位核苷酸來源于胭脂堿合成酶3’末端，提供轉錄終止和聚腺苷酸化信號；見Depicker等，J Mol Appl Genet1(6)561-73(1982)。質粒的剩余部分來源于pSP72載體(Promega)。
pBMSP-1質粒(SEQ ID NO13和圖8)來源于pGPTV-KAN。Becker等在Plant Molecular Biology 20，1195-1197，(1992)中描述的新的植物二元載體，其可選擇標記鄰近左側T-DNA邊界，以及在左側和右側邊界之外的序列。pBMSP-1的18-187位核苷酸代表右側T-DNA邊界，1811-775位核苷酸代表superMAS啟動子。2393-2663位核苷酸代表NOS啟動子(Depicker等，J Mol Appl Genet 1(6)561-73，1982)，2698-3492位核苷酸編碼NPT II基因(使其具有卡那霉素抗性)，3511-3733位核苷酸是來源于根癌土壤桿菌基因7的聚腺苷酸化信號(Gielen等，Embo J3835-46，1984)。1768-976位核苷酸編碼NPTII基因，4317-4464位核苷酸代表左側T-DNA邊界。
pBMSP-1spJSC質粒(SEQ ID NO14和圖8)來源于pBMSP質粒，含有super啟動子控制的J和SC。該質粒1-149位核苷酸代表左側T-DNA邊界。955-733位核苷酸是來源于根癌土壤桿菌基因的聚腺苷酸化信號，1768-976位核苷酸編碼NPT II基因(使其具有卡那霉素抗性)，2073-1803位核苷酸代表NOS啟動子。2635-3768位核苷酸代表superMAS啟動子，3774-5595位核苷酸編碼人類分泌成分，5603-5857位核苷酸代表NOS聚腺苷酸化信號。5880-6991位核苷酸代表superMAS啟動子，7007-7490位核苷酸編碼人類連接鏈，7504-7757位核苷酸代表NOS聚腺苷酸化信號。7886-8057位核苷酸代表右側T-DNA邊界。
pGPTV-HPT質粒編碼賦予潮霉素抗性的酶，可以從Max-Planck-Institut für Züichtungsforschung(Germany)購得。見Becker在PlantMolecular Biology 20，1195-1197(1992)中的描述。
B.植物轉化和植物內免疫粘附素的表達以上描述的表達盒被用于在植物內生產組裝的免疫粘附素。把pSSPICAMHuA2、pSHuJ、pSHuSC和pBMSP-1質粒共轟擊入煙草葉組織(N.tabacum cultivar Xanthi)，轉化的微愈傷組織在卡那霉素存在的營養瓊脂上篩選。各個微愈傷組織指示獨立的轉化事件，其被從母體組織中解剖并在具有卡那霉素的營養瓊脂上繁殖。
對愈傷組織進行轉基因表達的篩選。通過免疫印跡及PCR證實#7132愈傷組織表達嵌合ICAM-1免疫粘附素和J鏈(未給出數據)。該愈傷組織不具有編碼SC的DNA。培養的愈傷組織生長良好，能夠積聚充足的質量，再次對#7132愈傷組織進行轟擊，該次轟擊使用以上描述的兩種質粒，其中PBMSP-1SpJSC包含J鏈和SC的表達盒，pGPTV-HPT包含賦予潮霉素抗性的hpt I基因表達盒。在營養瓊脂選擇和生長后，通過免疫印跡可鑒定一些表達以一些組裝狀態存在的嵌合ICAM-1分子、J鏈和SC的獨立轉化體。
圖3說明嵌合ICAM-1分子在獨立轉化煙草愈傷組織內的表達。圖3A說明非還原SDS-聚丙烯酰胺凝膠免疫印跡，其上使用包含不同轉化的煙草愈傷組織(C)和水提取物(Aq)的樣品并探測人類ICAM的存在。免疫粘附素的溶解性使我們確信提取物可以方便地制備，相似的信號使我們相信表達的可重復性。圖3B說明含有從愈傷組織Rhi107-11中部分純化的免疫粘附素的多種級分的非還原SDS-聚丙烯酰胺凝膠的免疫印跡。該印跡通過抗人ICAM(～ICAM)、人IgA重鏈(～α)、人分泌成分(～SC)和人J鏈(～J)抗體探測。其次，必須使用酶偶聯的抗體和堿性磷酸酶標記免疫陽性條帶。通過在未表達愈傷組織提取物內檢測不到免疫陽性條帶，進一步確證免疫印跡的特異性(未給出數據)。沒有糖基化的嵌合ICAM-1分子二聚體的估計MW是173，318；這種形式很可能出現在條帶中的250kD標記下，因為它對于ICAM-1和重鏈為免疫陽性。該條帶對SC(總體估計MW～248kD)也為免疫陽性，但對J鏈則不是，這是有些出乎意料的，因為SIgA組裝的途徑是規范的，它涉及兩種細胞類型(在哺乳動物中)，并要求SC組裝前存在J鏈。一種包括單分子J鏈和單分子SC的免疫粘附素四聚體在糖基化前的估計MW約為440kD。一些物種的分子量超過200kD，可見對所有四種標記均為免疫陽性。
使用DNA包被的微粒轟擊，在植物和動物中得到穩定的轉化體(見Sanford等，Meth.Enz.217483-509，1993的綜述)。粒子介導的用編碼本發明免疫粘附素載體進行的轉化使用Bio-Rad制造的PDS-1000/He粒子加速設備。PDS-1000/He粒子加速設備系統使用氦氣壓向靶細胞加速DNA包被的微粒。該技術的物理特性使其用途廣泛并方便操作。我們已經成功的使用分泌型IgA的所有四種組分轉化煙草。
基本的biolistic過程如以下操作通過在1ml無水乙醇內混合60mg粒子制備一種微粒的原懸浮液。該懸浮液經渦旋后，移出25-50μl至另一無菌微量離心管內。離心30秒后棄除乙醇，用1ml無菌水重懸沉淀并離心5分鐘。棄除水分，并用25-50μl的DNA溶液重懸沉淀，該溶液含有并不總是等摩爾量的質粒DNA的混合物。每種制備物內加入的質粒量為0.5ng～1μg。依次加入以下物質220μl無菌水，250μl 2.5MCaCl2和50μl 0.1M亞精胺。該混合物至少渦旋10分鐘后，離心5分鐘。棄除上清液，用600μl無水乙醇沉淀DNA/微粒，混合并離心1分鐘。棄除乙醇并用36μl的乙醇重懸沉淀。在Kapton(DuPont)制造的巨載體片中心，盡量均勻的加入10μl懸浮液，乙醇自動揮發。該巨載體片和破裂盤被放置在單元內。包含表面消毒煙草葉的培養皿被放置在終止屏下。腔室被排空至28-29mmHg時，目標被轟擊一次。該方案最優化于煙草使用，也可通過改變參數優化使其適用于其它植物，例如He壓力、包被粒子的數量、巨載體和終止屏間的距離和終止屏至組織的飛行距離。
嵌合ICAM-1分子表達盒也在二元載體中組裝，以便用于土壤桿菌介導的轉化。一種設計用于表達人類J鏈和分泌成分，及卡那霉素抗性的土壤桿菌二元載體被導入根癌土壤桿菌LBA4404株。在另一種二元載體內的嵌合ICAM/IgA分子也用于轉化LBA4404。根據標準步驟，兩種菌株的過夜培養物被用作與煙草葉片同時“共培養”(Horsch等，Science2271229-1231，1985)。
使用標準步驟再生被轟擊和土壤桿菌轉化的煙草葉盤(Horsch等，Science 2271229-1231，1985)。因為從轟擊組織再生的轉化植物在成熟時經常產生基因沉默，通過土壤桿菌介導的轉化制備轉基因煙草植物，可以在成熟植物內達到更高的表達率。
3.組裝的免疫粘附素的純化純化根據實施例3表達的免疫粘附素。大量培養愈傷組織用于促進提取過程的開發。一種部分純化方案提供了穩定濃度，適于多種緩沖條件下，用于研究免疫粘附素進一步純化的后續色譜技術(見圖3)。在榨汁機內提取愈傷組織，所述榨汁機在兩個不銹鋼齒輪間碾碎組織，組織浸洗在含檸檬酸鈉(0.6M，pH7.4)和尿素(終濃度2M)的緩沖液內。汁液(～1ml/g鮮重)在通過粗棉布粗濾后，用0.67倍體積的飽和硫酸氨沉淀。可以在離心和在Dounce勻漿器內用小量體積的50mM檸檬酸鈉(pH6.6)徹底提取后收集得到一種綠色沉淀物勻漿。再次離心收集得到一種清亮棕色的上清液，通過Sephadex G-100柱在去鹽模式緩沖液交換下部分純化。該去鹽/緩沖液交換步驟允許在所需緩沖液條件下制備部分純化的濃度(～0.2ml/g鮮重愈傷組織)；再用0.25X磷酸緩沖鹽溶液洗脫G-100柱。該洗脫液可在2-8℃的條件下至少穩定存放10天。
4.免疫粘附素抑制人類鼻病毒的感染性根據實施例3制備的免疫粘附素已被證實可以抑制人類鼻病毒對細胞的感染性。根據實施例3制備的愈傷組織提取物與可溶性ICAM-1成功地競爭同抗ICAM單克隆抗體的結合。圖4說明從酶聯免疫吸附測定(ELISA)得到的數據。此測定用0.25μg可溶性ICAM-1/ml包被96孔板。方塊代表sICAM濃度的提高，圓圈代表用于與粘附的ICAM競爭定量小鼠(抗人ICAM)抗體的愈傷組織提取物(從G-100得到的無菌過濾級分)用量的提高。在沖洗孔之后，用偶聯于辣根過氧化物酶的抗小鼠抗體檢測粘附的小鼠抗體。以鄰苯二胺為底物，在490nm檢測粘附的酶活性。通過公式OD490＝y＝y0+a/[1+e^-{(x-x0)/b}]可以很好的描述數據(正方形，sICAM；圓圈，提取物)，其中a＝ymax，y0＝ymin，b＝曲線快速變化部分的斜率及x0＝50％反應水平的x值。相對于可溶性ICAM-1，在此檢測的免疫粘附素提取物包含～250μg ICAM/ml的等價物；由于受ICAM-1重鏈融合物的二聚體和四聚體組裝的預計親和力效應的影響，這是一個過高的估計。因此，該ELISA證實免疫粘附素與可溶性ICAM-1競爭結合抗ICAM單克隆抗體。
該競爭性ELISA通過對比達到50％反應時所需要的各種級分的標化量，允許活性恢復的定量評估。在純化時，免疫粘附素制劑的滴度可以表達為倒數稀釋液，或為達到50％反應時需要將1毫克免疫粘附素稀釋到的毫升數。該ELISA將促進免疫粘附素純化過程的開發。
一種細胞病變效應分析(CPE)證實部分純化的免疫粘附素抑制人類鼻病毒對人類細胞感染性的特異能力(圖5)。在每種混合物與HeLa S3細胞在33℃鋪板前，用人類ICAM-1、ICAM/IgA融合體(Dr.Tim Springer惠贈)、或表達我們的ICAM/IgA免疫粘附素或另一種不同抗體的愈傷組織提取物預孵育HRV-39血清型鼻病毒。三天后固定存活細胞，并用結晶紫的甲醇溶液染色；570nm處的光密度提供細胞活力的一種成比例檢測方法。
來源于Rhi107-11的兩種提取物包含免疫粘附素，它們明顯抑制病毒感染和殺傷HeLa S3細胞的能力(圖5A，右側向上和向下的三角)。因為該提取物僅為部分純化，我們也分析一種相似制備的提取物，其包括直接對抗化療藥物阿霉素的人類IgA2m(2)。該提取物包含一種相似的具有不相關的結合特異性的免疫球蛋白，不能抑制鼻病毒的感染性，它證實ICAM-1重鏈融合體的表達賦予了抑制的特異性。CPE分析證實，如所期望的，可溶性ICAM-1和IC1-5/IgA(Martin等，1993)對表達活性抑制的不同能力(圖5B)。圖5B的插圖是可溶性ICAM-1(1.35μg/ml)和IC1-5/IgA(0.12μg/ml；低11.3倍)IC50范圍的按比例放大。
5.用于臨床和毒理學研究的免疫粘附素的生產和純化通過制備轉基因煙草植物生產足夠量的用于臨床和毒理學研究需要的免疫粘附素。該表達免疫粘附素的轉基因植物(無ER保留信號)通過土壤桿菌介導的轉化得到。期望缺少ER保留信號，從而提高組裝，因為新生SIgA通過包括反式高爾基體的完整高爾基體產生，其中SC與dIgA共價連接，如脈沖實驗所示(Chintalacharuvu和Morrison，Immunotechnology 4165-174，1999)。因為土壤桿菌介導的轉化更可能產生具有一致的轉基因表達水平的植物，這些植物的后代可被用作生產臨床級的免疫粘附素。
為了最大化表達水平并創建一個純種系，需要建立純合植物。在采集種子前，最高產的植物(T0代)能夠在溫室內自我受精。四分之一的T1代植物預期為純合體。它們在溫室內生長，使多種植物的種子樣品在含卡那霉素的培養基內開始發芽。所有來源于純合陽性植物的后裔(T2)預期為綠色。一些雜合植物的后代預期為白色或黃色。通過回交野生型植物和后裔提取物的免疫印跡證實純合性。
收獲和加工可在生產競爭中連續篩選，特別是由于可以從單個植株中得到大量的收獲物，即一次收獲將植物切至土壤水平，重新生長進行下一次收獲。在建立免疫粘附素生產等級時，必須確定所需最終的免疫粘附素的量，解釋表達水平(mg制備的免疫粘附素/kg煙草鮮重)、知道植物的生長速率和平均的植物預期重量、和純化方案的總體產率(設定20％)。設定生產3g最終的免疫粘附素總體需要4次收獲，每次預期生產1g最終的免疫粘附素。
已知這些目標和參數，可以確定必需的植物數和植物生長所需的空間。圖6說明生產1克最終的免疫粘附素的必需生產量評估。該圖說明在預期的表達水平和植物重量下，以20％產率生產1g免疫粘附素所需的植物數。在免疫粘附素的不同表達水平(mg/kg鮮重)和總體回收率(設定為20％)、以及每個植物的重量，因此可以確定合理可能性窗中(虛線方框)指定產品目標(1g/收獲)的植物總數。所需植物數量降低，與指定生長和再生長周期數相反。預期的生物量產生是時間和生長條件的函數，它影響收獲的時間和收獲之間的時間。這些生長周期可以通過交錯種植和收獲期而適應純化方案的實際。根據我們的經驗，需要x個植物。例如，在合理表達水平，即100mg免疫粘附素/kg下，從植物制備1g最終的免疫粘附素，需要250個植物，收獲時的重量為200g/植物(發芽后約80天)。以這種規模，這些植物需要約10m2的生長空間并在150天內收獲兩次。
一次加工50kg以上的生物量需要多種適度的大規模操作，其在食物加工工業內都有相對部分。這些操作包括大批材料處理、減小體積、榨汁和過濾。用一種Vincent Press和Durco過濾系統有效地加工這些量。榨汁步驟使用已被證實的，簡單的檸檬酸鈉和尿素緩沖液。這些成分對提取物起緩沖作用，幫助防止酚醛酸的氧化和其與蛋白的結合(Gegenheimer，Methods in Enzymology 182174-193，1990；Loomis，Methods in Enzymology，31528-544，1974；Van Sumere等，TheChemistry and Biochemistry of Plant Proteins，1975.)并保證免疫粘附素在后續酸沉淀中的可溶性。
過濾不溶于酸的脂和蛋白(總量的約90％)，接著通過切線流動超濾濃縮免疫粘附素，并去除其中小的蛋白，特別是酚醛酸。雙重過濾提高小分子的去除率并交換制備用于短期儲存和后續層析的緩沖液。SP-瓊脂糖凝膠(在pH5.0或以下結合)或Q-瓊脂糖凝膠(在pH5.5或以上結合)是一種可用于過濾免疫粘附素的離子交換層析。它們容易得到、具有刻度、穩固及具有高能力。特別是，它們可用于膨脹床形式，這種形式減少了過濾前步驟的嚴格性。陽離子交換層析最先使用，其較陰離子交換層析更具選擇性。免疫粘附素從蛋白潛在存在的一些物種中純化得到，其中至少95％的蛋白以ICAM-1/IgA、ICAM-1/dIgA或ICAM-1/SIgA的形式存在，二價和四價ICAM-1結構域的存在對有效抗病毒活性是關鍵的。接著檢測純化免疫粘附素中內毒素的可接受水平、尼古丁等生物堿和生物負載。而且，監測了有效性水平(通過ELISA和CPE分析確定)、蛋白濃度、pH和外觀。隨后確定臨床用免疫粘附素的穩定性，確保患者接受完全強效的免疫粘附素。甚至部分純化的提取物在冷凍條件下也能保持10天的穩定。臨床配制的免疫粘附素(在磷酸緩沖液中)在-20℃、2-8℃和37℃存放3-6個月后的滴度和效力也進行了檢驗。
6.免疫粘附素具有植物特異的糖基化作用對生產的免疫粘附素進行分析，確定其中存在的糖基化作用模式。Cabanes-Macheteau等，Glycobiology9(4)365-372(1999)，證實在一種植物表達的抗體構建體上存在一些植物特異的糖基化部分。使用他們的方法證實，根據實施例1、2和3生產的免疫粘附素具有一種植物特異的糖基化模式。我們預期這種多樣性也是免疫粘附素可變性的一種來源。粗提物已在體外被證實具有抗病毒活性(未顯示數據)，所以糖基化作用并不表現影響有效性。N-連接糖基化作用(圖2說明嵌合ICAM-1分子僅存在15個潛在的位點)可能是使免疫印跡條帶多樣的因素。用N糖苷酶A在印跡前消化免疫粘附素制劑，表現出條帶模式的多樣性瓦解成較少的離散的條帶。這樣，最初通過還原和非還原聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定糖基化形式。而且，通過CPE分析和競爭ELISA檢測消化和偽消化片段，證實N-連接糖基化對體外效力和滴度的影響。
7.免疫粘附素滅活人類鼻病毒分析根據實施例1、2和3制備的免疫粘附素通過結合病毒、阻止病毒進入和誘導形成病毒空衣殼滅活HRV的能力。為了檢測免疫粘附素與HRV的結合，免疫粘附素與[3H]亮氨酸標記的HRV-39孵育30分鐘后，加入HeLa細胞1小時。在沖洗后，細胞和結合的病毒用Triton X-100分離，并在閃爍計數器上檢測[3H]水平。
對比用免疫粘附素孵育時HRV-39的滅活和sICAM-1對HRV的滅活。在與sICAM-1單體孵育時，HRV-39并沒有明顯的直接滅活(感染性降低＜0.5log10)，而與IC1-5D/IgA孵育時，感染性降低約1.0log10(Arruda等，Antimicrob.Agents Chemother.363686-1191，1992；Crump等，Antimicrob.Agents Chemother.381425-7，1994)。為了檢測免疫粘附素滅活HRV-39的能力，10650％組織培養感染劑量的HRV-39在搖板平臺上的培養基內33℃孵育1小時，培養基包含濃度是每種分子對于病毒IC50的10倍的sICAM-1或免疫粘附素或為普通培養基。每種病毒-免疫粘附素或病毒-培養基混合物再以10倍稀釋度進行系列稀釋，在96孔板中HeLa細胞上測定滴度。
免疫粘附素對HRV粘附宿主細胞的作用通過在存在或缺少免疫粘附素時，MOI為0.3條件下孵育HRV-39與HeLa細胞而檢測。4℃1小時吸光過程后，沖洗細胞，用加上或減去免疫粘附素的培養基替換培養基。細胞在33℃孵育10小時(允許復制一輪)，通過凍/融細胞收獲病毒。在HeLa細胞上測定病毒滴度。
ICAM-IgA(IC1-5D/IgA)較sICAM-1在誘導HRV構象改變上更為有效，使之形成無感染性的病毒空顆粒(Martin等，J.Virol.673561-8，1993)。為了檢測根據實施例1、2和3生產的免疫粘附素誘導HRV構象改變和引起病毒RNA釋放的能力，純化的免疫粘附素與[3H]亮氨酸標記的HRV-39孵育30分鐘，再把病毒覆蓋于5-30％蔗糖梯度。40,000rpm離心90分鐘后，收集各級分，檢測[3H]水平，并檢測各級分的感染性。(完整HRV沉積于蔗糖梯度上的149s，而缺少RNA的空衣殼沉積于75s(Martin等，J.Virol.673561-8，1993))。由于ICAM/SigA的價增加，我們預期ICAM/SIgA免疫粘附素較ICAM-IgA在誘導非感染性顆粒形成中更為有效。
使用CPE分析檢測純化免疫粘附素對一組主要和次要(不使用ICAM-1作為受體)HRV血清型的抑制作用。ICAM-1對HRV感染性的抑制能力在病毒各分離物中各不相同。已被證實，在使用HeLa細胞分析檢測一組HRV主要受體血清型時，sICAM-1的EC50值為0.6μg/ml-＞32μg/ml(Crump等，Antimicrob.Agents Chemother.381425-7，1994)。我們的研究包括9種主要血清型(HRV-3，-13，-14，-16，-23，-39，-68，-73和-80)和次要受體血清型HRV-1A。
8.臨床研究證實免疫粘附素對降低在人類中的感染性的能力劑量遞增耐受研究在兩個隨機對照實驗中檢測本發明的免疫粘附素，用于確定鼻內給予免疫粘附素對感染、IL-8反應和實驗鼻病毒感冒的影響。這兩個研究評估了在鼻病毒接種前或后，給予受試者免疫粘附素的作用。在此使用的臨床方案基于先前評估重組可溶性ICAM-1分子對抗鼻病毒感染有效性使用的方案(Turner等，JAMA 2811797-804，1999)。
A.受試者受試者從Charlottesville的Virginia大學社區募集。受試者需要具有良好的健康狀態、不吸煙、年齡在18～60歲。有變態反應疾病或非變態反應性鼻炎、異常鼻解剖結構或粘膜、或前兩周有呼吸道感染病史的受試者應排除在外。妊娠或哺乳婦女或沒有采用醫學許可生育控制的婦女也排除在外。在病毒侵襲研究實驗中(I/II期，見下文)，受試者必須對實驗病毒易感，這是通過在實驗開始90天內測定對病毒的血清中和抗體滴度為1∶4或低于1∶4而證實的。
B.研究藥物本發明的免疫粘附素被制成含2.6mg/ml的磷酸緩沖液(PBS)噴霧溶液。安慰劑由PBS組成，與活性制劑有相同的外觀。該溶液通過使用一種配備計量鼻噴霧泵的藥瓶給藥。該泵每次遞送70μl溶液，其中每次噴霧包含183μg免疫粘附素。該藥物的給藥量是每日6次(間隔3小時)，每次每個鼻孔噴霧兩次，全天總量4.4mg。該劑量與tremacamra研究感染時所使用的mg蛋白/日表示的可溶性ICAM-1的劑量相同(Turner等，JAMA 2811797-804，1999)。1摩爾免疫粘附素的質量約為1摩爾sICAM-1質量的兩倍。然而，由于sICAM-1和ICAM-IgA融合體間體外活性不同，免疫粘附素在摩爾基礎上較sICAM-1有效數倍。因此，該量是必需量的保守計算值。除非在劑量遞增研究中發現該劑量的問題，一般均使用該量。
C.研究設計單升高劑量和多升高劑量研究用于評估免疫粘附素的安全性。在所有情況下，每個劑量水平評估三位受試者，兩位接受免疫粘附素治療，一位接受安慰劑。在單升高劑量研究中評估四種劑量水平。最低的個體劑量是侵襲研究中預期劑量的半數，而最高量是侵襲研究中預期劑量的兩倍。以下是劑量水平每鼻孔噴一次(總量366μg)，每鼻孔噴兩次(總量732μg)，每鼻孔噴三次(總量1098μg)，每鼻孔噴四次(總量1464μg)。
同樣的劑量水平也用于多升高劑量研究。受試者在5天內每3小時(每日6次)接受一定量藥物。兩個研究均在每個劑量水平評估受試者，直到明確在前一個水平沒有急性毒性才開始每個后續水平。所有受試者在第一個劑量后21天后返回單劑量，并在6周進行隨訪(檢測血清抗免疫粘附素抗體)。
一個獨立的實驗組內有12個受試者，給藥劑量是每個鼻孔噴兩(總量732μg)，并在1、2、4、8和16小時進行鼻灌洗(每個時間點兩個受試者)。為了計算免疫粘附素在體內的半衰期，通過ELISA在PanoramaResearch分析灌洗物中的免疫粘附素。在劑量遞增和半衰期測定研究(共28位受試者)中使用的免疫粘附素總量約為270mg。
D.安全性評估除了常規不良事件記錄，通過三種途徑評定免疫粘附素的安全性。首先，在首次給藥前和末次給藥后，研究者對受試者鼻粘膜進行視診，特別觀察刺激或炎癥癥狀。記錄任何可見的變化。其次，在治療前和末次給藥后1、4和8天(多升高劑量研究中21天)采集樣品用于標準血液安全評估。第三，血清樣品保存，冷凍，并用于測定是否免疫粘附素可以穿透鼻粘膜進入血液。其通過兩種方式完成。第一，通過ELISA檢測血清樣品中免疫粘附素的存在。在此分析中，吸附于微量滴定板的抗人IgA抗體捕獲血清內所有的免疫粘附素，其通過一種抗ICAM抗體檢測。使用含有已知濃度免疫粘附素的正常人類血清樣品測定所述分析的敏感性。也可選擇使用抗ICAM抗體吸附于平板并捕獲血清中的免疫粘附素，這可以通過抗IgA抗體檢測。第二，使用ELISA方法分析對于免疫粘附素的免疫應答，該方法使用吸附于微量滴定板的免疫粘附素。血清內的任何抗免疫粘附素抗體與之結合，并通過抗人IgG或抗人IgM檢測。對比治療前和治療后血清樣品，滴度的任何變化都被認為是攝取免疫粘附素治療的跡象。如果有抗免疫粘附素抗體存在的陽性跡象，應進行額外的實驗進一步區分抗ICAM-1和抗IgA的活性。
篩選發生對免疫粘附素的變態反應的患者。(在先前的研究中，可溶性ICAM局部施用于鼻部或在口腔中局部使用都沒有發生不良反應。)使用一種敏感的兩步ELISA(R&D System)檢測鼻灌洗物中抗免疫粘附素特異性IgE抗體，檢測個體表現的鼻變態反應癥狀。
E.統計學分析這些研究使用的樣本大小基于使用鼻病毒侵襲模型的先前研究。保護研究設計的樣本大小應能夠充分檢測到臨床感冒發生率從安慰劑組的75％至主動治療組的25％的降低，其一側水平為α＝.05和1-β＝.80。而且，假定SD為5.8單位時，樣本大小應能夠充分檢測到總體癥狀分值變化5個單位。
9.臨床研究證實免疫粘附素降低在人類中的感染性的能力侵襲研究侵襲研究用于證實，在病毒侵襲后，使用本發明免疫粘附素治療可以抵御臨床感冒或減輕感冒癥狀。
A.侵襲病毒本研究使用的侵襲病毒是鼻病毒39(HRV-39)。鼻病毒39型是一類主要的鼻病毒，其粘附于細胞需要ICAM-1。根據共同認可的原則對所述侵襲病毒池進行安全檢測(Gwaltney等，Prog.Med.Virol.39256-263，1992)。所有的受試者均接種約200倍的平均組織培養感染量(TCID50)。在患者仰臥體位時，每隔15分鐘向患者鼻孔內分別滴入兩次250μl的病毒接種物。
表1
B.研究設計進行兩個隨機鼻病毒侵襲研究(見表1)。在接種前和接種后評估本發明免疫粘附素的同樣制劑。在兩個研究中，藥物在5天內每天給藥6次。在受試者登記參與每個研究時，既被隨機分配接受免疫粘附素或匹配安慰劑治療。該研究采用盲法，所有臨床實驗人員、受試者和PanoramaResearch的雇員保持雙盲，直到收集完所有的數據。
接種前研究在病毒侵襲前4小時(2個劑量)開始給藥。在第二次給予免疫粘附素(或安慰劑)后1小時開始病毒侵襲，然后繼續按照方案給予第一天剩余的四個研究藥物劑量。該研究的18位受試者接受主動治療，18位受試者接受安慰劑。
在接種后研究中，在病毒侵襲后24小時開始給藥。因為已經用于其它有關病毒侵襲保護的研究(Harris和Gwaltney，Clin.Infect.Dis.231287-90，1996)和出現明顯的感冒癥狀，所以選擇使用該時間點。本研究的病毒侵襲在研究第0天的早晨給藥，約為研究第1天早晨初次給藥前24小時。該研究的36位受試者接受主動治療，18位受試者接受安慰劑。
從研究的第0天(病毒侵襲日)至第6天，受試者被分離在獨立的旅館房間內。研究期間，每天早晨第一次給藥前記錄癥狀分值并進行鼻灌洗分離病毒，每晚再次記錄癥狀分值。在研究第6天，解除受試者的隔離狀態，但每晚記錄癥狀分值直到第14天。受試者在研究第21天返回研究點，此時采集最后的血清樣本用于檢測抗免疫粘附素抗體。兩個病毒侵襲研究(共54位受試者)使用的免疫粘附素總量約為1200mg。
C.病毒分離在細胞培養物內通過病毒分離檢測病毒釋放。通過在每個鼻腔內滴入5ml 0.9％的生理鹽水采集鼻沖洗樣品。該沖洗液排入一塑料杯中，在用于病毒培養前，可冷藏1～2小時。通過吸附于一種瓊脂糖支持物(Affi-Gel 10，Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)上的抗ICAM-1抗體處理，從樣品分離免疫粘附素。在-80℃儲存每次處理的部分樣品，其余樣品被接種于兩管HeLa-1細胞，HeLa細胞系的富集是為了產生ICAM-1(Arruda等，J.Clin.Microb.341277-1279，1996)。
通過典型細胞病變效應的發生識別鼻病毒。在病毒侵襲后任一研究日出現病毒培養陽性的受試者認為被病毒感染。通過在HeLa-1細胞的微量滴定板中培養10倍系列稀釋液，測定儲存于-80℃的樣品中的病毒滴度。
通過使用標準方法檢測血清中和抗體滴度來測定侵襲病毒抗體(Gwaltney等，Diagnostic Procedures for Virol Rickettsial andChlamydial Infections，p.579-614，American Public HealthAssociation)。在篩選過程中進行血清樣品抗體檢測，具體時間為病毒侵襲前(急性期)和21天后(恢復期)。恢復期血清樣品的侵襲病毒抗體滴度較急性期血清樣品至少升高4倍的受試者認為被病毒感染。
D.疾病嚴重性評估使用先前描述的方法(Turner等，.JAMA 2811797-804，1999)進行疾病嚴重性評估。在病毒侵襲前(基線)記錄癥狀分值，并在以后的6天內每天記錄兩次，間隔約12小時。在研究的第7至14天，每個受試者在晚上記錄一次他/她的癥狀分值。在每次評估中，受試者被要求判斷從上次癥狀評估后的期間內以下8種癥狀的最大嚴重性打噴嚏、流鼻涕、鼻阻、咽喉痛、咳嗽、頭痛、不適和寒戰。每種癥狀被標以0至3的嚴重性分值，其分值相當于報告癥狀無癥狀、輕微、中度或嚴重。如果在基線處出現癥狀，該基線癥狀分值應從報告癥狀分值中減去。每日兩次評估中的較高值被認為是該癥狀的每日癥狀分值。8個獨立癥狀的每日癥狀分值相加得到總體每日癥狀分值。病毒侵襲后最初5天(研究第1-5天)的總體每日癥狀分值被相加，并在研究第5天晚上詢問每個受試者“你認為患感冒了嗎？”總體癥狀分值至少為6、流鼻涕至少3天和主觀認為患感冒的受試者被定義為患有臨床感冒。
排出的鼻分泌物的量在第1-7天通過向所有受試者提供預先稱重的鼻組織包檢測。該組織在使用后被存放于密封的塑料袋內。每天早晨采集并稱量使用的組織和原包內未使用的組織。
E.IL-8分析目前研究提示，宿主炎癥反應，特別是白介素8(IL-8)，可能在鼻病毒感染引起感冒癥狀的發病機理中起重要作用。使用一種先前描述的商購ELISA(R&D Systems，Minneapolos，Minn)測定鼻灌洗物中的IL-8濃度(Turner等，JAMA 2811797-804，1999)。
F.安全性評估侵襲研究使用同實施例8描述的劑量遞增研究中同樣的評估方法。
G.統計學分析統計學分析使用同實施例8描述的劑量遞增研究中相似的方法。
權利要求
1.一種免疫粘附素，包含嵌合ICAM-1分子，所述嵌合ICAM-1分子包含連接于免疫球蛋白重鏈的至少一部分的鼻病毒受體蛋白；和結合于該嵌合ICAM-1分子的J鏈和分泌成分。
2.權利要求1的免疫粘附素，其中所述鼻病毒受體蛋白由ICAM-1的細胞外結構域1、2、3、4和5的任意組合組成。
3.權利要求1的免疫粘附素，其中所述免疫球蛋白選自IgA、IgA1、IgA2、IgM和嵌合免疫球蛋白重鏈。
4.權利要求1的免疫粘附素，進一步包含至少一種額外的嵌合ICAM-1分子。
5.權利要求1的免疫粘附素，其中所述鼻病毒受體蛋白由ICAM-1的細胞外結構域1、2、3、4和5的任意組合組成；并且該免疫球蛋白重鏈至少包含IgA2重鏈的一部分。
6.表達于轉基因植物的權利要求1的免疫粘附素。
7.表達于單子葉植物的權利要求1的免疫粘附素。
8.表達于雙子葉植物的權利要求1的免疫粘附素。
9.權利要求1的免疫粘附素，其中所有蛋白為人類蛋白。
10.表達于異源細胞的權利要求1的免疫粘附素，該異源細胞來源于植物、脊椎動物或無脊椎動物。
11.表達于哺乳動物細胞的權利要求1的免疫粘附素。
12.表達于毛根培養物的權利要求1的免疫粘附素。
13.表達于組織培養的植物細胞的權利要求1的免疫粘附素。
14.一種免疫粘附素，包括嵌合ICAM-1分子，所述嵌合ICAM-1分子包含與免疫球蛋白重鏈的至少一部分連接的鼻病毒受體蛋白，其中免疫粘附素具有植物特異的糖基化作用。
15.權利要求14的免疫粘附素，其中所述免疫粘附素進一步包含與該嵌合ICAM-1分子結合的J鏈和分泌成分。
16.權利要求14的免疫粘附素，其中所述鼻病毒受體蛋白由ICAM-1的細胞外結構域1、2、3、4和5的任意組合組成。
17.權利要求1 4的免疫粘附素，其中所述免疫球蛋白重鏈選自IgA、IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgD、IgE和嵌合免疫球蛋白重鏈。
18.權利要求14的免疫粘附素，進一步包含至少一種額外的嵌合ICAM-1分子。
19.權利要求14的免疫粘附素，其中所述鼻病毒受體蛋白由ICAM-1的細胞外結構域1、2、3、4和5的任意組合組成；該免疫球蛋白重鏈至少包含IgA2重鏈的一部分。
20.權利要求14的免疫粘附素，其中所有蛋白為人類蛋白。
21.表達于來源于植物的異源細胞的權利要求14的免疫粘附素。
22.表達于毛根培養物的權利要求14的免疫粘附素。
23.表達于組織培養的植物細胞的權利要求14的免疫粘附素。
24.表達于植物的權利要求14的免疫粘附素。
25.表達于單子葉植物的權利要求14的免疫粘附素。
26.表達于雙子葉植物的權利要求14的免疫粘附素。
27.一種組合物，包含免疫粘附素和植物材料，其中所述免疫粘附素包括嵌合ICAM-1分子，該嵌合ICAM-1分子包含與免疫球蛋白重鏈的至少一部分連接的鼻病毒受體蛋白。
28.權利要求27的組合物，進一步包含與所述嵌合ICAM-1分子結合的J鏈和分泌成分。
29.權利要求27的組合物，其中所述鼻病毒受體蛋白由ICAM-1的細胞外結構域1、2、3、4和5的任意組合組成；該免疫粘附素具有植物特異的糖基化作用。
30.權利要求27的組合物，其中所述免疫球蛋白選自IgA、IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgD、IgE和嵌合免疫球蛋白重鏈。
31.權利要求27的組合物，進一步包含至少一種額外的嵌合ICAM-1分子。
32.權利要求27的組合物，其中所述鼻病毒受體蛋白由ICAM-1的細胞外結構域1、2、3、4和5的任意組合組成；該免疫球蛋白重鏈是一種IgA2重鏈。
33.一種減少人類鼻病毒對易感于人類鼻病毒的宿主的感染的方法，所述方法包括用權利要求1、14或27的免疫粘附素接觸病毒，其中該免疫粘附素結合人類鼻病毒并降低其感染性。
34.一種減少由人類鼻病毒引起感冒的起始或散播的方法，所述方法包括用權利要求1、14或27的免疫粘附素接觸病毒，其中該免疫粘附素結合人類鼻病毒并降低其感染性。
35.一種治療或預防人類鼻病毒感染人類受試者的方法，所述方法包括給予受試者有效量的權利要求1、14或27的免疫粘附素，其中該免疫粘附素降低人類鼻病毒的感染性。
36.一種治療或預防人類鼻病毒感染受試者的方法，所述方法包括鼻內給予受試者有效量的權利要求1、14或27的免疫粘附素，其中該免疫粘附素降低人類鼻病毒的感染性。
37.一種治療或預防人類鼻病毒感染受試者的方法，所述方法包括口腔給予受試者有效量的權利要求1、14或27的免疫粘附素，其中該免疫粘附素降低人類鼻病毒的感染性。
38.一種藥物組合物，其中包含存在于藥物可接受緩沖液內的權利要求1、14或27的免疫粘附素。
39.一種表達載體，其中包含編碼操作性連接于植物啟動子的嵌合ICAM-1分子，該嵌合ICAM-1分子包含與免疫球蛋白重鏈的至少一部分連接的鼻病毒受體蛋白。
全文摘要
本發明的免疫粘附素可以用于治療鼻病毒感染。所述免疫粘附素包含嵌合ICAM分子，也可任選包含J鏈和分泌成分。該嵌合ICAM分子是具有連接于免疫球蛋白的鼻病毒受體蛋白的一種融合蛋白。本發明還包括較大提高和改進的在植物內生產免疫粘附素方法。該免疫粘附素的每種成分都在植物細胞內生產，并因此在植物細胞內組裝。生產本發明免疫粘附素的方法使這些分子的生產具有有效性和經濟性。本發明也涉及在植物和哺乳動物細胞等多種真核細胞內生產該免疫粘附素。本發明免疫粘附素可以用作鼻病毒引起人類的感冒的治療藥物。
文檔編號A61K47/48GK1440423SQ01812138
公開日2003年9月3日 申請日期2001年4月28日 優先權日2000年4月28日
發明者J·W·拉里克, K·L·維科夫 申請人:行星生物技術有限公司