胰島素控釋制劑及其方法

專利名稱：胰島素控釋制劑及其方法
技術領域：
本發明涉及一種胰島素控釋制劑及其方法，更具體的講，涉及一種含有微粒的胰島素控釋制劑及其方法，所述微粒通過用可生物降解的聚合材料將胰島素的均勻微晶微囊化而獲得。
盡管DDS尚未被完整定義，但從廣義上講，DDS指設計用以控制藥物的體內行為的多種配方，包括靶向系統和化學傳遞系統(chemical delivery system)，而從狹義上講，DDS指控釋系統。
自從20世紀70年代以來，藥物控釋方法已經在藥學領域得到快速發展。醫藥領域中通常采用微分子控釋系統，而且它主要用于將藥品傳遞至人體的特定部位。
控釋系統以各種形式存在，包括用于口服給藥的膠囊劑、基片劑(matrix)、用于口服給藥或注射的微囊劑、微球、微粒、毫微粒以及脂質體和植入物(J.Kost，1995)。微囊化微囊化是控釋制劑中最重要的技術。在這一領域中，隨著毫微技術在藥學領域中與藥物傳遞系統開發的結合，微粒的生產得以快速發展。
例如，用水包油(O/W)分散或共溶劑方法、水包油包水(W/O/W)多乳液方法或乳劑-溶劑蒸發方法，將可溶性藥品，鹽酸偽麻黃堿包埋于聚合微球中的實驗已經公開了可以負載適量藥物(R.Bodmeier等，1991)。微囊劑指具有位于中心核的固體或液體藥物的球形粒子，而微球指其中固體或液體藥物分散在聚合材料的多重核。微粒包括微囊劑和微球，它指使用微粒如聚合物基質或脂質作為藥物載體的微粒藥物載體。除非特別說明，在本說明書中這些術語具有如上所述的含義。
微粒可以被生產成具有范圍為0.1μm至幾百微米(μm)的各種直徑。在那些微粒中，直徑為1μm或1μm以下的微粒稱為毫微球(或毫微粒)。通常以固相保存而在使用時將其懸浮的大多數微球已經被常規地用作放射診斷試劑，進來則作為藥物載體倍受關注。藥物載體用于控釋系統的物理載體包括各種類型的合成及天然高分子。其中，可生物降解的聚合物是白蛋白、明膠、膠原、血纖蛋白原、聚交酯(PLA)、聚乙醇酸交酯(PGA)、聚β-羥基丁酸(PHB)、聚己酸內酯、聚酐、聚原酸酯和這些物質的共聚物聚(交酯-共-乙醇酸交酯)(PLGA)等。自從在20世紀60年代開發出這些聚合物作為外科用縫合線以來，從20世紀70年代開始對這些聚合物作為緩釋制劑如類固醇、抗瘧藥、麻醉藥抑制劑或制癌物質的系統進行了各種研究。在Tice等公開了可以通過從微球制劑產生水溶性化合物，例如抗生素和促黃體素釋放素(LHRH)類似物而實現緩釋之后，上述可生物降解的聚合物已受到更多關注(Tice，T.R.(1984)Pharm.Tech.8，26-36)。PLGA為了用共聚物實現肽的微囊化，必須符合以下要求1) 肽必須由可生物降解的聚合物形成；2) 在加工過程中不能發生肽的變性；3) 包囊效率必須足夠高。
目前，對肽和蛋白質微囊化的主要研究是使用聚乳酸(PLA)或聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)的水包油包水(W/O/W)溶劑蒸發技術，PLGA是PLA和聚乙醇酸(PGA)的共聚物。
PLGA和PLA是被毒理學和臨床數據完全支持的聚合物，它們是無毒、生物相容的、可生物降解的聚合物，已被FDA授權用于人體。從這些材料分解(denature)的乙醇酸和乳酸通過體內代謝除去。那些聚合物的水解速度取決于溫度、催化劑的存在、pH的明確變化，沒有觀察到取決于體內位置的分解速度的變化。這滿足適用于藥物傳遞配方的要求。分解速度由聚合物的分子量和結晶度以及PLGA的交酯∶乙醇酸交酯比。由于乳酸具有不對稱碳原子，所以它有兩種光學異構體。因此，聚合物由L，D-和D，L-乳酸組成。L，D-聚合物是晶體形式，而D，L-聚合物是無定型形式，而且這些聚合物快速分解。(Patrick Convreur，Maria Jose，Blanco-Prieto，Francis Puisienx，BemardReques，Elias Fattal，Multiple emulsion technology for the design ofmicrospheres containing peptides and oligopeptide，Advanced DrugDelivery Review 28(1997)85-96)。
PLGA用于水溶性和非水溶性藥品的微囊化。在將牛血清白蛋白(BSA)用作模型蛋白，通過油包油(O/O)、水包油(O/W)、水包油包水(W/O/W)乳液方法生產微球的情況中，發現注入配方介質的總蛋白的50-70％包含在微球中，且其粒度分別為500μm、25-100μm和10-20μm。BSA的釋放類型根據不同生產方法而不同。在通過W/O/W乳液方法生產后真空干燥的微球的情況中，釋放量大。在通過O/W方法生產的含有carbopol-R 951的微球的情況中，初始釋放量大。釋放持續時間分別為54天、36天和34天。
另外，據報道，在通過雙乳液方法從PLGA生產微球的情況中，將微球生產成適于肺傳遞的大小。據報道，在用CNTF(Ciliaryneurotrophic fact)和PLGA混合比為30∶70生產的微球的情況中，(D.Maysinger等，1996)，通過相分析得到微球的平均粒度為1.76±0.0186μm。胰島素胰島素是研究最活躍的控釋制劑的目標之一。目前，最經常使用的胰島素是注射劑和泵形式的。40、80、100IU/ml的Zn-胰島素懸浮液或中性溶液通常具有速效，它們被廣泛使用，而且在使用中100IU/ml是優選的。溶液狀態的胰島素傾向于表現出快速功效，結晶狀態則不然，但溶液狀態的胰島素藥效持續時間短。所以，患者大多在飯前或睡前使用注射劑形式的胰島素。根據活動，分別給予速效胰島素和長效胰島素。由于需要頻繁給予胰島素，這些現有的胰島素制劑可能給患者的日常生活帶來不便。在錯過給藥時間的情況中，可能發生血清葡萄糖濃度急劇下降或低血糖的顯著危險。
已知胰島素晶體比胰島素溶液具有更長的藥效，當給予它們時，其藥效保持約36小時。這是因為胰島素晶體使胰島素在體內緩慢溶解，這可以被有利地用于延長胰島素在血中的活性，其方式類似于從人體的胰產生并分泌胰島素。基于這一事實，在1956年，Schlichtkrull試圖生產小到足以用于治療糖尿病的胰島素晶體。之后，在藥學領域中不斷研究制備胰島素或胰島素衍生物微晶的結晶方法，以使胰島素晶體在體內緩慢溶解。迄今為止，報道了很多胰島素結晶方法，且大部分報導利用胰島素溶液的pH變化(美國專利第3,719,655和第4,959,351號)。但是，這些常規結晶方法都存在一個問題，就是難以以高收率獲得適于通過肺給藥的10μm或10μm以下的微細胰島素晶體。
同時在進行各種胰島素控釋制劑的研究，所述制劑能夠在給藥后在體內長時間連續降低血清葡萄糖濃度，在這些制劑中，幾種胰島素控釋制劑已經顯示出顯著的改善。目前正在研究的大部分胰島素傳遞系統基于結合在藥物傳遞系統(DDS)的聚合物中的葡萄糖氧化酶和存在于血中的葡萄糖的反應。如果葡萄糖和葡萄糖氧化酶之間的反應導致DDS的微環境中pH下降，則聚合物系統膨脹，從而增加釋放的胰島素的量。這里使用的聚合物系統包括甲基丙烯酸N，N-二甲氨基乙酯和聚丙烯酰胺。
或者，為了使用于口服的胰島素免于在消化系統內被分解，可以生產毫微球。根據這一方法，通過聚合物基質阻止在腸M細胞吸收之前的蛋白質變性，并小尺寸的聚合物基質允許通過膜屏障的滲透。從便于給藥的角度而言，這種方法有有點。但是，這一方法的傳遞效果只是腹腔傳遞效果的11％(Gerardo P.Carino，Jules S.Jacob，Edith Mathiowitz，Nanosphere based oral insulin delivery，Journalof controlled release 65(2000)261-269)。
肺傳遞是目前研究最活躍的領域之一。與鼻傳遞相比，肺傳遞提供與大網球場一樣大的相對大的表面積，例如100m2，而且它允許通過存在于薄的上皮細胞壁的大量血管迅速吸收。根據在美國糖尿病協會會議上發表的幾家公司進行的臨床試驗結果，可以獲得與注射胰島素相同的效果。已知目前正在進行III期臨床試驗，其中約1000名患者作為臨床試驗的受試者。利用肺傳遞的蛋白質藥品傳遞系統的開發預期將提出容易且方便地給予通常只通過注射提供的蛋白質藥品的途徑。本發明提供有效的胰島素控釋制劑用于胰島素肺傳遞。蛋白質藥品的穩定性在小肽的情況中，即使其分解很少發生，其穩定性也是關鍵問題。在微粒的生產過程中，給蛋白質或肽施加過度的應力。所以，蛋白質藥品的微囊化過程中必須沒有過量的熱和剪應力、pH的急劇變化、有機溶劑和過度的冷凍和干燥。即使是在保存期間，微囊化的蛋白質也可能被水合，而且在這種環境下蛋白質傾向于變性和聚集。當給藥后聚合物開始分解時，聚合物內部和周圍由于分解的酸性單體二產生高濃縮酸性微環境。在這種環境下，蛋白質傾向于聚集、水解和化學變化。最后，可能導致蛋白質和聚合物的可逆或不可逆分割，從而影響藥物傳遞速度，最終導致蛋白質的變性、聚集和失活。
在以治療為目的的肽中，胰島素不僅成為核酸酶的靶，而且傾向于在溶液或懸浮液中化學、物理變性(J.Brange，L.Andersen，E.D.Laursen，G.Meyn，E.Rasmussen，Toward understanding insulinfibrillation，J.Pharm.Sci.86(1997)517-525)。
在液相溶液中由于胰島素的化學分解可能生成脫酰胺的產物，例如在酸性介質這的脫酰胺基A21、中性溶液中的脫酰胺基B3。另外，通過轉酰胺基作用可能形成具有共價鍵的胰島素二聚體(R.T.Darrington，B.D.Anderson，Evidence for a common intermediate ininsulin deamidation and covalent dimer formation；effects of pH andaniline trapping in dilute acidic solutions，J.Pharm.Sci.84(1995)274-282)。
象其他球狀蛋白質一樣，胰島素具有通過折疊或者各種分子的組裝而使疏水性表面隱藏在內部的三級結構。另外，其天然構象的變化可能受各種因素的影響。具體而言，熱、物理力以及暴露于疏水性表面導致蛋白質的結構變化，從而導致蛋白質聚集和產生不溶性沉淀(B.V.Fisher，P.B.Porter，Stability ofbovine insulin，J.Pharm.Pharmacol.33(1981)203-206)。
蛋白質藥品的變性導致免疫原性或抗原性，伴隨抗體的生成，妨礙所注射的蛋白質的活化，影響人體內自然生成的相同蛋白的作用，這是非常有害的。
因此，從配方和生產角度而言，必須考慮藥品穩定性。本發明涉及保留配方中所含胰島素的穩定性的微囊化方法。
由于胰島素在微囊化過程中容易變性，其容易生成脫酰胺產物，發生全部蛋白質的約50％的損失。此外，在干燥微粒時由于蛋白質表面上的分割而發生的初始釋放可能導致降血糖作用。
因此，本發明的第一個目的是提供一種胰島素控釋制劑及其方法，所述制劑使胰島素的蛋白質變性最小化，并能夠提高在微囊化過程中的穩定性。
為了實現上述目的，本發明提供一種胰島素控釋制劑，其中用聚合物載體將胰島素微粒微囊化。本發明的控釋制劑可以制造成適于肺吸入給藥、注射、口服給藥、經皮吸入等的各種形式。特別地，微粒的大小為10μm或10μm以下，優選為5μm或5μm以下，從而適于肺傳遞。本發明的胰島素控釋制劑是緩釋制劑，由于其持續表現藥效因而可以減少胰島素的給藥次數。而且，根據本發明，可以控制胰島素的初始釋放量，從而防止血清葡萄糖濃度的急速降低。
本發明的另一個目的是提供胰島素的提高的包囊效率和優化。
用于微囊化的可生物降解的聚合物根據其物理性質和成分的不同，其分解速度不同，但完全分解需要相當的時間。以對人體的安全性已得到認證的PLGA為例，盡管PLGA的分解速度根據其成分而不同，但其分解一般需要約50天至約100天。所以，如果連續給予使用可生物降解的聚合物作為載體的微囊化制劑，則可能發生聚合物在體內的蓄積。因此，配方技術的目的是在微囊化中用相同量的聚合物載體包埋更大量的藥物。
在液態藥物的微囊化的情況中，藥物的溶解度決定能包埋在微粒中的藥物濃度。如果藥物的溶解度低，則只有少量藥物得以包埋。在這種情況下，為了傳遞適量藥物，則需要將更大量微粒給予活體。
這一問題在肺傳遞中比較嚴重。一般而言，通過肺傳遞的物質經歷內吸收。不吸收的物質通過使用巨噬細胞的清除過程除去。清除過程在氣道中在24小時內被除去，而在囊胚中則需要更長的時間(Camner，P.1994)。另外，有文章報道，在肺中存在的物質越多，清除過程進行得越緩慢。
因此，特別地，當通過肺給予藥物時，需要通過提高藥物對高分子載體的比例來減少給予機體的聚合物物質的量。在本發明中，提供一種胰島素控釋制劑，其中通過使用胰島素的均勻微粒生產微粒，從而根據需要調節包含在微粒內的胰島素的含量。
本發明的另一目的是提供一種方法，所述方法用于保存液相胰島素微粒，從而解決使用微囊化的胰島素的不便，即微囊化的胰島素應該再次分散在溶液中。
通常凍干微粒進行保存，并在使用前將微粒分散。但是，在蛋白質藥品的情況中，在凍干過程中可能發生變性。并且，在干燥過程中，由于藥物微粒的表面分割可能發生初始釋放。因此，為了方便給藥并防止初始釋放，本發明提供不用凍干胰島素微粒制劑，而利用等電點保存溶液中的胰島素微粒制劑的方法。
或者，本發明提供一種胰島素控釋制劑及其方法，其中通過在制劑中包含速效胰島素部分和胰島素晶體微粒，在一次給藥能夠同時獲得速效和延長的作用。
本發明的其他目的和優點將在下面加以描述，并且通過本發明的實施方案將更為清楚。
為了用胰島素均勻微晶生產微粒，需要找到能以高收率生產胰島素微晶的胰島素結晶方法。本發明的發明人在在先申請中提出了通過調節胰島素溶液的溶解度，形成可以起到晶核作用的胰島素微粒，降低胰島素溶液的溶解度以進行結晶，從而以高收率生產10μm或10μm以下，優選為5μm或5μm以下的胰島素微晶的方法(韓國專利申請第99-14957號)。在本發明中，發明人實現了通過采用所提出的胰島素結晶方法制成的胰島素微晶的微囊化。
現在描述獲得胰島素均勻微晶的方法。將在等電點或等電點以下pH水平的酸性胰島素溶液的pH調至約9至約10.5，此時形成能夠在胰島素溶液中作為種子發揮作用的微粒，然后降低該胰島素溶液的溶解度，從而獲得10μm或10μm以下，優選5μm或5μm以下的胰島素微晶。
一般而言，微粒如下生產將基質聚合物與藥物一起乳化，并通過加熱變性；用福爾馬林化學交聯；或者用輻射聚合硬化并在水中干燥。粒度是決定藥物的體內行為的重要因素，通過選擇制備條件可以調節粒度。
當肽的N-和C-末端未被環形成、酰胺化或酯化所保護時，其具有親水性。因此，肽和蛋白質由于親水性而難以在由疏水性聚合物組成的聚合物基質中被微囊化。因為這些性質，已經開發了采用W/W/W溶劑蒸發方法生產微粒的方法。
多重乳化溶劑蒸發方法包括內水相(IWP)和有機溶劑(OS)，所述內水相是溶解在蒸餾水或緩沖溶液中的藥物，所述有機溶劑是溶解在與水不混溶的高揮發性有機溶劑的聚合物溶液。將IWP在OS中乳化，從而制備第一乳液(W/O)，然后攪拌下將該乳液傾入含有乳化劑的外水相(OWP)中，從而獲得第二乳液(W/O/W)。連續攪拌所得的多重乳液以蒸發OS，導致聚合物沉淀，從而形成負載藥物的微粒。
存在于OWP中的乳化劑在矩形微粒的形成中發揮重要作用。乳化劑在除去OS的過程中起到防止微粒聚沉的作用。聚乙烯醇(PVA)一般用作乳化劑，可用的乳化劑包括聚乙烯吡咯烷酮、藻酸鹽、甲基纖維素、明膠等。
OS的除去在正常壓力或者減壓下進行。OS的徹底除去可以通過如下三種方法進行1)中斷方法在室溫下進行蒸發，將部分硬化的微粒轉移至低濃度乳化劑溶液或無乳化劑的溶液中繼續蒸發；2)連續方法在室溫下進行連續攪拌，直到OS被完全除去；以及3)旋轉蒸發用旋轉蒸發儀在約30℃下除去OS。
除去OS之后，通過過濾或離心分離硬化的微囊，洗滌數次以除去乳化劑，然后真空干燥或冷凍干燥。
在本發明中，微囊化優選通過雙乳液方法進行，并使用可生物降解的聚合物。可生物降解的聚合物包括白蛋白、明膠、膠原、血纖蛋白原；羥基酸如聚交酯(PLA)和聚乙醇酸交酯(PGA)；聚(交酯-共-乙醇酸交酯)(PLGA)、PEG、聚β-羥基丁酸(PHB)、聚己酸內酯、聚酐、聚原酸酯、聚氨基甲酸酯、聚丁酸、聚戊酸、聚(交酯-共-己內酯)，及它們的衍生物，以及它們的共聚物和混合物。本文所用的術語“衍生物”包括具有化學基例如烷基或亞烷基取代、加成、羥基化、氧化及本領域技術人員以常規方式做出的其他修飾的聚合物。一般而言，可生物降解的聚合材料通過非酶促和酶促水解以及表面或體侵蝕而在體內分解。可用的聚合材料優選是聚(交酯-供-乙醇酸交酯)(PLGA)。
以下詳細描述采用雙重乳化溶劑蒸發工藝的本發明的微囊化。
首先，按上述方式獲得胰島素微晶并將其懸浮在處于胰島素等電沉淀區的pH為4.5-6.5的溶液中，然后使用。
這里，可用的懸浮液包括從1％乙酸鹽溶液制成的脫乙酰殼多糖溶液并pH調節到4.5至6.5，也就是處于等電沉淀區，在此pH胰島素晶體不溶解。這里，可以使用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)代替脫乙酰殼多糖。另外，也可以使用結晶過程中以溶液狀態獲得的胰島素晶體的上清液。
將在上述方法中制備的胰島素懸浮液加入聚合物溶液中，例如PLGA/DCM溶液，制成第一乳液。然后將第一乳液緩慢加入乳化劑，例如1％PVA溶液中，制成第二乳液，然后，攪拌使其凝固。然后，通過離心回收顆粒，用蒸餾水洗滌三次并冷凍干燥，從而獲得本發明的微粒。
常規乳化劑如聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮、藻酸鹽、甲基纖維素、明膠等可以用作乳化劑。
通過上述方法制備的本發明的微粒具有體積平均直徑10μm或10μm以下，優選0.1μm或0.1μm以上的小且均勻的粒度分布。特別地，在用于肺給藥的配方的情況中，微粒的直徑優選為5μm或5μm以下。粒度不受包含在微粒內的胰島素晶體的量的影響。
在以下實施例中，對通過胰島素晶體的微囊化和胰島素溶液的微囊化制備的本發明的微粒進行了比較。所用的胰島素溶液通過將胰島素溶解于乙酸溶液中而制備。
各種比較例的結果顯示在將胰島素晶體微囊化的情況中，形成藥物位于中心核的微囊，稱為“晶體/PLGA”，而在將液相胰島素溶液微囊化情況中，形成藥物分散在聚合材料中的微球，稱為“溶液/PLGA”(參見

圖1)。基于配方結構，與溶液/PLGA相比，本發明的晶體/PLGA顯示更小、更均勻的粒度分布(參見圖3和圖4)。
另外，在按照本發明將胰島素晶體微囊化的情況中，與有機溶劑之間的接觸面減小，這抑制在加工過程中可能發生的蛋白質變性，從而大大提高了配方的穩定性(參見圖6和圖7)。
另外，晶體/PLGA比溶液/PLGA顯示更高的微囊化效率(參見圖8)，還降低了在硬化過程中可能發生的蛋白質損失。
本發明者的實驗結果顯示，胰島素在0.1N乙酸溶液(pH2.0)中溶解約254IU/0.3ml。相反，由于胰島素晶體沒有溶解度的限制，所以，可以將超過約425IU/0.3ml的胰島素微囊化。晶體/PLGA顯示約79％的包囊效率，并顯示隨胰島素含量增加的藥物含量線性增加。在另一方面，慮胰島素的溶解度，溶液/PLGA顯示最大3％的藥物含量，而且隨胰島素濃度增加包囊效率減降低。因此，證實了在用胰島素晶體進行微囊化的情況中，通過提高藥物對聚合物載體的比來減少給入體內的聚合物化合物的量，可以降低肺清除過程的負擔。
另外，本發明提供一種以液相形式保存胰島素微粒制劑的方法，其中將微粒制劑保存在等電緩沖溶液中，利用胰島素的等電點，而不對微粒制劑進行冷凍干燥。證實了當在胰島素的等電沉淀區，即pH4.5至6.5的等電緩沖溶液中保存胰島素晶體的微粒制劑時，即使經過15小時之后，在微粒中依然存在96％的胰島素。由于液相形式的胰島素微粒制劑在使用時無需在溶液中進行分散，而可以直接給如患者體內，因而方便了給藥。而且，由于沒有在冷凍干燥過程中可能發生的蛋白質變性，因此當將胰島素微粒制劑給入體內時，初始釋放顯著降低。
證實體內顯示藥效的動物試驗顯示，晶體/PLGA比未微囊化的胰島素晶體更長時間維持更低水平的血清葡萄糖濃度，同時以更穩定的方式在體內保持延長的藥效(參見圖11)。
通過將胰島素微晶微囊化而制備的本發明的微粒用作胰島素控釋制劑，其可以連續保持胰島素藥效。
胰島素控釋制劑可以進一步包含藥學可接受的稀釋劑、載體或添加劑。
優選地，本發明的胰島素控釋制劑可以制成適于肺吸入給藥、注射、口服給藥、經皮吸入等的各種形式。肺吸入給藥形式是最優選的。
可以使用現有配方技術生產本發明的胰島素控釋制劑，從而通過在制劑中包含速效胰島素部分和胰島素晶體微粒而同時獲得速效和長效。這里，可用的速效胰島素部分可以包括胰島素溶液、現有速效胰島素制劑等。
以下將通過各種實施例更詳細地描述本發明。但是，本發明的范圍并不限于這些實施例，在如權利要求中所述的本發明的實質內，可以對其做出其他和進一步的修飾和改變。實施例1胰島素晶體的微囊化(1)將胰島素粉末溶解于pH2.0的乙酸鹽溶液中，用1N NaOH和10N NaOH改變所得溶液的酸度。然后，當pH達到4.5時，聚集體開始形成。當pH進一步升高到6.0時，產生65％以上的直徑為5μm或5μm以下的胰島素晶體。若將pH9.0至10.5的胰島素溶液的pH水平急劇降低至pH6，則在幾秒至約2分鐘的時間內生成90％以上的直徑為5μm或5μm以下的胰島素微晶。以這種方式，制備了以溶液相形式存在的胰島素晶體。
(2)將制備的溶液相胰島素微晶在4500rpm下離心15分鐘，以除去上清溶液并分離胰島素微晶。
(3)將分離的胰島素微晶用蒸餾水洗滌，以除去存在于溶液中的胰島素分子，然后懸浮在0.3ml上述步驟(2)中分離的上清溶液中。
(4)將懸浮液傾入玻璃試管內的4ml PLGA/CH2Cl2溶液中，用組織粉碎機制成乳液。
(5)將上述乳液慢慢傾入50ml 1％的PVP溶液中，制成雙重乳液。
(6)將雙重乳液攪拌3小時，從而除去CH2Cl2，在2300rpm下離心5分鐘，以除去上清溶液，然后用蒸餾水洗滌三次，獲得本發明的微粒，即微囊樣晶體/PLGA。實施例2胰島素溶液的微囊化除了用溶解在0.1N乙酸溶液中的胰島素溶液代替胰島素微晶之外，以與實施例1中相同的方式制備本發明的胰島素溶液微粒，即微球樣溶液/PLGA。實施例3測量胰島素微粒的大小用倒置顯微鏡(CK2型，Olympus，日本東京)觀察在實施例1和2中制備的微粒，觀察結果顯示在圖1中，用掃描電子顯微鏡(SEM)觀察微粒表面，觀察結果顯示在圖2中。此外，還測量了在實施例1和2中制備的微粒的大小，測量結果顯示在圖3中。分析了在實施例1(1)中制備的胰島素晶體和在實施例1中制備的微粒(晶體/PLGA)的粒度，分析結果顯示在圖4中。
圖1A及1C是由倒置顯微鏡拍攝的照片，顯示在實施例2中制備的溶液/PLGA(×400和×200)，圖1B和1D是由倒置顯微鏡拍攝的照片，顯示在實施例1中制備的晶體/PLGA(×400和×200)。如圖1中所證實，生成了均勻的矩形微粒。
參見圖2，在實施例1中制備的晶體/PLGA在其表面上顯示更少的孔，且具有其中具有胰島素微晶的微囊形狀。在另一方面，在實施例2中制備的溶液/PLGA在其表面上顯示更多孔，且具有其中具有多核的微球形狀。
參見圖3，在實施例1中制備的晶體/PLGA具有比在實施例2中制備的溶液/PLGA更小的粒度。參見顯示胰島素晶體和微囊化的胰島素晶體的比較結果的圖4，微囊化的胰島素晶體的粒度比未微囊化的稍大。盡管不同實驗組之間有輕微差異，但是在實施例1中制備的微粒的平均體積直徑為5.09±0.92μm，其對于肺傳遞是足夠大三。特別地，約60％的微粒的體積直徑為適于通過肺給藥的5μm或5μm以下，而約99％的微粒具有適宜的數-直徑。實施例4穩定性試驗將在實施例1中制備的晶體/PLGA和在實施例2中制備的溶液/PLGA分散在pH7.4的PBS溶液中，并在37℃下釋放。釋放7天之后，離心所得的液體，從而回收上清溶液，并用RP-HPLC進行分析，結果顯示在圖5C和5D中。
如圖5A至圖5D所證實，在實施例4和5中均觀察到脫酰胺的產物。為了得到更準確的結果，計算相對于總胰島素峰面積的比，并比較未凍干的樣品與凍干的樣品，比較結果顯示在以下表1中。
表1

如表1所示，在實施例1中制備的晶體/PLGA具有比在實施例2中制備的溶液/PLGA低得多的脫酰胺化量，脫酰胺化量在英國藥典或美國藥典中規定為小于3％。
因此，微囊化的胰島素晶體的穩定性顯著高于微囊化的胰島素溶液，甚至在冷凍干燥后穩定性也得以保持。實施例6胰島素的加工損失在實施例1和2的微粒生產過程中，在除去CH2Cl2的步驟中，以固定時間間隔取樣并分離為微粒和OWP。將微粒溶解在CH2Cl2中，向其中加入0.1N乙酸溶液，然后提取包埋在內部的胰島素。將OWP的pH水平降低到2從而溶解可能殘留在內部的胰島素微晶。這些都通過Bradford測定而測量，其結果顯示在圖6和圖7中。
溶液/PLGA顯示藥物含量降低，而晶體/PLGA不顯示藥物含量降低(圖6)。
溶液/PLGA向OWP釋放的胰島素的量連續增加，3小時后，加入整個系統內的胰島素的9％左右釋放到外部(圖7)。
所以，可以理解，微囊化的胰島素晶體的加工損失顯著低于微囊化的胰島素溶液。實施例7微粒中的藥物含量和包囊效率從以與實施例1(1)相同的方式制備的胰島素懸浮液取預訂的量，以給出3mg、6mg、10.5mg、15mg胰島素晶體。將樣品離心并分散在0.3ml結晶湯中，棄去上清液。然后，以與實施例2中相同的方式生產微粒。將所得微粒冷凍干燥，分別取約5mg各樣品，然后以與實施例6中相同的方式提取包含于其中的胰島素，以測定藥物含量和包囊效率。結果顯示在圖8和表2中。
表2溶液/PLGA和晶體/PLGA的包囊效率

(S.D標準偏差；S.E標準誤差)以上表2顯示三次實驗結果數據的平均值。
晶體/PLGA顯示約79％的恒定包囊效率，隨胰島素含量增加藥物含量線性增加。另一方面，考慮胰島素的溶解度，溶液/PLGA顯示最大3％的藥物含量，且包囊效率隨胰島素濃度增加而降低。因此，證實了在將胰島素微晶微囊化的情況中，與其中將胰島素溶液包囊的常規方法相比，微粒中的藥物含量增加，同時加工損失也降低，導致包囊效率提高。實施例8釋放試驗為了評價有關胰島素釋放的微囊化的影響，將胰島素晶體微囊化，一部分冷凍干燥，而其余部分不進行冷凍干燥。然后，用胰島素晶體進行釋放試驗。將胰島素晶體(●)、在實施例1中制備的凍干微囊(○)以及在實施例1中制備的未凍干微囊()與0.4ml pH7.4的PBS溶液混合，然后在37℃下釋放。以恒定的時間間隔進行離心，回收上清溶液，并補充新的溶液。通過Bradford測定測量所釋放的胰島素的量，其結果顯示在圖9中。
如圖9所示，胰島素顯示雙相釋放現象，即，初始釋放和零級釋放相。盡管胰島素晶體的釋放量約為28％，但微囊化且凍干的胰島素晶體(晶體/PLGA)的釋放量為36％，也就是，增加了約8％。相反，未凍干微粒(晶體/PLGA)的初始釋放為約24％，也就是，比胰島素晶體減少了約4％，比凍干微粒減少了約12％。總之，釋放量可能受聚合物層控制。
在胰島素微晶的情況中，大量所釋放的胰島素連續釋放，直到4小時后完全釋放，沒有胰島素微晶剩余。但是，在微囊化的胰島素晶體的情況中，初始階段釋放大量胰島素，然后連續釋放少量胰島素。即使是胰島素開始釋放4小時后，未凍干胰島素微晶的38％和凍干胰島素微晶的18％仍保留在微粒內。
結果，證實了未凍干和微囊化可以顯著降低胰島素的初始釋放。特別地，在未凍干和微囊化的情況中，與胰島素晶體的情況相比，更長久地連續釋放均勻量的胰島素。實施例9利用等電點的保存試驗以其中在實施例1中制備的微囊未冷凍干燥的狀態，以與實施例8中相同的方式，在胰島素可以完全溶解的pH3的PBS溶液中(●)、在胰島素等電沉淀區pH6的PBS溶液中(○)，以及pH7.4的PBS溶液中()進行釋放試驗，結果顯示在圖10中。
試驗結果顯示，在pH6的溶液中(○)，4小時后總胰島素的約20％釋放，也就是，80％的胰島素保留，在pH3(●)和pH7.4()的溶液中，分別有15％和38％的胰島素保留。結果，小量胰島素在pH6緩慢釋放，不同于pH3或pH7.4的情況。
此外，當將樣品保存在4℃、pH6的PBS溶液中時，即使15小時后，仍有96％的胰島素保留在微粒中。實施例10胰島素配方的初步臨床試驗將溶解在pH7.2的PBS溶液中的胰島素溶液、在實施例1中使用的胰島素微晶以及在實施例1中制備的微囊腹腔注射入SD大鼠內。使胰島素溶液完全溶解在pH2.14的PBS溶液中，然后用NaOH和HCl將其pH水平調到7.2。選擇各制劑的最佳適量，然后給予大鼠。在胰島素溶液的情況中，將2IU/kg的胰島素溶液給入9只SD大鼠的腹腔。在平均粒度為4.16μm的胰島素微晶的情況中，收率為94.25％，將5IU/kg的胰島素微晶給入9只大鼠的腹腔。將20IU/kg的微囊化的胰島素微晶給入8只SD大鼠的腹腔。作為比較，將pH7.2的PBS溶液給入9只SD大鼠對照組。根據每只大鼠的重量，每只大鼠的劑量以胰島素懸浮液計算是相同的。其結果顯示在圖11中。
證實了與對照組(●)相比，在注射胰島素的大鼠(○、、)中觀察到的血清葡萄糖濃度顯著降低。在胰島素溶液(○)的情況中，其藥效僅持續6小時左右，在胰島素晶體()的情況中，其藥效持藥效僅持續6小時左右，在胰島素晶體()的情況中，其藥效持續約8小時。在晶體/PLGA()的情況中，其藥效持續約12小時。
而且，證實了微囊化的晶體/PLGA()比胰島素晶體()更長久地維持更低的血清葡萄糖濃度。
換句話說，胰島素溶液(○)在2小時過去時顯示最低血清葡萄糖濃度水平，同樣的情況也適用于胰島素晶體()。胰島素微囊()在3小時過去時顯示最低血清葡萄糖濃度水平。因為可以從血清葡萄糖濃度的模型推出胰島素的釋放模式，所以當血清葡萄糖濃度處于最低水平時，可以判斷胰島素的最大釋放量。
在2小時過去時，在胰島素溶液(○)和胰島素晶體()的情況中均顯示血清葡萄糖濃度的最低水平，此后血清葡萄糖水平在6至8小時后恢復到正常水平。另一方面，在3小時過去時的基礎上，胰島素微囊()的血清葡萄糖水平直到12小時過去后仍未恢復到正常水平。這說明微囊在體內緩慢釋放胰島素，從而增加藥效的持續時間。
如果給予超過5IU/kg的胰島素溶液，或者給予超過10IU/kg的胰島素微晶，大鼠因低血糖而死亡。但是，在胰島素微囊()的情況中，即使給予20IU/kg的劑量，血清葡萄糖水平下降，然后仍緩慢恢復至正常水平。這表明，聚合物材料在體內緩慢釋放藥物，以延長表現藥效的時間，從而有效地防止糖尿病患者死于休克，或者因低血糖導致的休克而死亡。
表3顯示劑量、血漿葡萄糖的最小降低(MRPG)、最小血清葡萄糖濃度的時間、血清葡萄糖濃度-時間曲線下的面積(AUC)、總血漿葡萄糖減少(TRPG)。也就是說，可以從表3了解胰島素的體內行為。
表3

AUC血清葡萄糖濃度-時間曲線下的面積；MRPG血漿葡萄糖濃度的最低減少；TRPG總血漿葡萄糖減少；％TRPG100×[1-(AUC/時間×最大點)工業實用性如上述實施例所證實，其中將胰島素微晶微囊化的本發明的胰島素控釋制劑可以減少微囊化過程中發生的胰島素變性，而且可以提高制劑的穩定性，從而減少在活體內的胰島素初始釋放，并防止低血糖的危險。此外，根據本發明，獲得了適于肺傳遞的小而均勻的微粒。此外，微囊化效率，即藥物對聚合物載體的比得以提高，其適于通過肺或注射給藥。由于本發明的胰島素控釋制劑在活體內連續長時間地顯示穩定的藥效，因此可能以更穩定的方式調節糖尿病患者的血清葡萄糖濃度，同時減少給藥次數。
權利要求
1.一種胰島素控釋制劑，所述制劑含有體積平均直徑為10μm或10μm以下的微粒，所述微粒通過使用雙乳液方法微囊化而獲得，其中將在等電點或等電點以下pH水平的酸性胰島素溶液的pH調至約9至約10.5，此時形成能夠在胰島素溶液中作為種子發揮作用的微粒，降低該胰島素溶液的溶解度，從而獲得體積平均直徑為10μm或10μm以下的胰島素微晶，將該胰島素微晶懸浮于處于等電沉淀區pH為4.5-6.5的溶液中，將其加入可生物降解的聚合物中，從而制備第一乳液，向所得第一乳液中加入乳化劑，從而制備第二乳液，然后攪拌第二乳液。
2.根據權利要求1所述的胰島素控釋制劑，其中所述微粒保存在pH4.5-6.5的等電緩沖溶液中。
3.根據權利要求1或2所述的胰島素控釋制劑，其中所述可生物降解的聚合物選自白蛋白、明膠、膠原、血纖蛋白原；羥基酸如聚交酯(PLA)和聚乙醇酸交酯(PGA)；聚(交酯-共-乙醇酸交酯)(PLGA)、PEG、聚β-羥基丁酸(PHB)、聚己酸內酯、聚酐、聚原酸酯、聚氨基甲酸酯、聚丁酸、聚戊酸、聚(交酯-共-己內酯)，及它們的衍生物，以及它們的共聚物和混合物。
4.根據權利要求3所述的胰島素控釋制劑，其中所述聚合物是聚(交酯-共-乙醇酸交酯)(PLGA)。
5.根據權利要求1或2所述的胰島素控釋制劑，其中用于懸浮胰島素晶體的溶液是以下溶液之一從1％乙酸鹽溶液制成的脫乙酰殼多糖溶液、磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)溶液以及結晶過程中以溶液狀態得到的胰島素晶體的上清液。
6.根據權利要求1或2所述的胰島素控釋制劑，其中所述制劑具有用于肺吸入給藥、注射、口服給藥和經皮吸入的配方中的一種配方。
7.根據權利要求1或2所述的胰島素控釋制劑，其中所述微粒的體積平均直徑為5μm或5μm以下，且所述微粒是肺吸入給藥的形式。
8.根據權利要求1或2所述的胰島素控釋制劑，其進一步包含藥學可接受的稀釋劑、載體和添加劑。
9.根據權利要求1或2所述的胰島素控釋制劑，其中還包括速效性胰島素部分。
10.一種控釋制劑的生產方法，所述方法包括以下步驟(a)將在等電點或等電點以下pH水平的酸性胰島素溶液的pH調至約9至約10.5，此時形成能夠在胰島素溶液中作為種子發揮作用的微粒，降低該胰島素溶液的溶解度，從而獲得體積平均直徑為10μm或10μm以下的胰島素微晶；(b)將步驟(a)中得到的胰島素微晶懸浮于處于等電沉淀區pH為4.5-6.5的溶液中，將該懸浮液加入可生物降解的聚合物中，從而制備第一乳液，向所得第一乳液中加入乳化劑，從而制備第二乳液，然后攪拌第二乳液，從而獲得體積平均直徑為10μm或10μm以下的微粒；以及(c)通過向在步驟(b)中得到的微粒中加入藥學可接受的輔助成分或添加劑，通過常規藥學方法制備配方。
11.根據權利要求10所述的方法，其中步驟(c)包括在pH4.5-6.5的等電緩沖溶液中保存所述微粒的步驟。
12.根據權利要求10或11所述的方法，其中所述乳化劑是聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮、藻酸鹽、甲基纖維素和明膠中的一種。
13.根據權利要求10或11所述的方法，其中用于懸浮所述胰島素晶體的溶液是以下溶液之一從1％乙酸鹽溶液制成的脫乙酰殼多糖溶液、磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)溶液以及結晶過程中以溶液狀態得到的胰島素晶體的上清液。
全文摘要
本發明提供一種胰島素控釋制劑及其方法。該胰島素控釋制劑含有通過可生物降解的聚合物材料將胰島素的均勻微晶微囊化而獲得的微粒。由于減少了在微囊化過程中可能發生的胰島素變性，所以制劑的穩定性可以得到提高。同時，增加了胰島素對聚合物載體的比例，這適于肺傳遞。此外，該胰島素控釋制劑可以在體內以穩定的方式長時間地連續顯示藥效。
文檔編號A61P5/50GK1438881SQ01811821
公開日2003年8月27日 申請日期2001年6月25日 優先權日2000年6月27日
發明者金纘和, 權宰鉉, 崔誠熙 申請人:株式會社Mi Tech