用于免疫調節的皰疹病毒的制作方法

專利名稱：用于免疫調節的皰疹病毒的制作方法
技術領域：
本發明涉及能有效感染樹突細胞的減毒單純皰疹病毒。還涉及所述病毒在免疫療法治療疾病中的用途。
若干疾病都會遇到切實需要產生針對腫瘤抗原或其它疾病相關抗原的治療性免疫反應。首先，必須確定其表達是腫瘤或疾病特有的(或至少是選擇性的)分子，并且它本身可以作為免疫反應的靶的分子。這項工作已經證實對于多數普通腫瘤是非常困難的，但是目前例如對宮頸癌來說得到了解決，因為在大多數情況下存在病毒癌基因E6和E7，而對于其它腫瘤來說，正在開始鑒定好的候選抗原。例如MUC-1基因產物在許多腫瘤(包括90％卵巢癌)中過度表達。還有多種其它腫瘤相關抗原已經被鑒定，其中任何抗原都可以用于免疫療法治療癌癥。以后必將不斷發現其它腫瘤相關抗原。其次，鑒定抗原后，必須將抗原以免疫原性形式傳遞給免疫系統。為了產生對腫瘤排斥非常重要的細胞免疫反應，這意味著所述蛋白質必須傳遞到宿主細胞的細胞質內(對于高分子量蛋白抗原來說是一項困難的任務)或者是在基因傳遞或DNA免疫后宿主細胞自身合成抗原。已經公認用于這一目的病毒載體包括牛痘、腺病毒、或反轉錄病毒。
目前公認可以提供最適的免疫刺激的細胞類型是樹突細胞(DC；例如參見Girolomoni和Ricciardi-Casagnoli，1997)。其實所述DC可認為是在體內能夠刺激最初免疫反應的僅有的細胞類型，并且在某些情況下甚至表現出能夠打破已經建立的耐受性。許多組織正在研究DC在自體采用的免疫療法中刺激對腫瘤的免疫反應的用途，希望它們可以表現出治療效果。所述方案包括培養和/或富集外周血DC，體外用抗原加載處理DC，將該DC再引入患者或直接體內將抗原加載DC。但是這一方法由于缺少將抗原加載到這些細胞的有效手段而受到阻礙。然而近期研究表明，在體內通過肽脈沖DC的抗原提呈產生了抗腫瘤反應(Celluzzi等，1996；Zitvogel等，1996)。關于病毒載體，反轉錄病毒不能向樹突細胞高效傳遞基因(Reeves等，1996；Aicher等，1997)，并且據我們掌握的其他的不同的研究報道(Arthur等，1997)，腺病毒只能低效傳遞基因。
我們以前試驗并報道過，單純皰疹病毒(HSV)能有效地感染并將基因傳遞給樹突細胞(Coffin等，1998；WO00/08191)。對于這一目的，與其它載體系統相比HSV具有許多優點，因為它可以有效地感染多種細胞類型(包括一些其它載體系統很難感染的細胞，例如Dilloo等，1997；Coffin等，1998)，它容易操作，并能呈遞大的DNA插入，允許多個基因表達(見綜述Coffin和Latchman 1996)。體外將多種抗原傳遞給樹突細胞接著再導入體內或直接在體內將抗原導入樹突細胞可能為特別有希望的治療某些癌癥和傳染性疾病的方法。
WO00/08191指出，野生型單純皰疹病毒在感染的樹突細胞中阻止發生抗原加工，而缺少功能性UL43和vhs基因的皰疹病毒或包含使立即早期基因表達最小化的突變的皰疹病毒能有效地感染樹突細胞而不阻止在所述感染細胞中發生抗原加工。
發明概述目前我們驚訝地發現在HSV載體中編碼病毒粒體宿主隔絕蛋白(vhs)的基因的破壞能使HSV感染細胞發生有效的樹突細胞活化。所述UL43的破壞也不是必須的。以前認為無論是感染本身還是其它刺激，HSV感染的樹突細胞通常不能被活化(Salio等1999，Kruse等2000)。
我們已經證實了以前未知的在阻止樹突細胞活化中vhs蛋白的功能。樹突細胞活化定義為與非活化狀態相比某些細胞表面標記正調節。這些標記包括CD83和CD86。樹突細胞活化可以通過脂多糖(LPS)處理來刺激。LPS處理HSV感染的樹突細胞不會導致CD83或CD86的上調。我們證明了LPS處理突變HSV(其中vhs失活但是具有功能性UL43基因)感染的樹突細胞的CD83和CD86都上調了。LPS處理用含有功能性vhs基因的病毒感染的樹突細胞沒有觀察到CD83和CD86的上調。因此我們的結果表明，為了皰疹病毒感染后轉導樹突細胞最大地刺激免疫反應，應該破壞編碼vhs的基因但是不必破壞編碼UL43的基因。
我們的結果還證實了vhs在野生型單純皰疹病毒的發病機制中的作用。HSV高效感染樹突細胞，似乎可能的原因是，其如此進化的自然生活周期的一部分使細胞介導免疫反應最小化，這樣可以阻止HSV潛伏感染的有效建立或者導致在潛伏并再活化的重復循環期間清除所述病毒。樹突細胞活化對刺激有效的細胞介導免疫反應是重要的。Vhs是病毒粒體蛋白，這樣盡管HSV基因在樹突細胞中一般不高水平表達，但是vhs蛋白隨同侵入的病毒一起傳遞到樹突細胞。因此vhs在阻止感染了HSV的樹突細胞活化上的新的功能可能是vhs在HSV感染人類后HSV生活周期中的重要功能。
因此，本發明提供在制造用于刺激免疫反應的方法的藥物中減毒皰疹病毒的用途，所述病毒(i)缺少功能性vhs基因或其功能相當的基因；以及(ii)包含功能性UL43基因或其功能相當的基因；所述方法包括用所述病毒感染樹突細胞。所述病毒優選人類單純皰疹病毒。更優選HSV1或HSV2。所述樹突細胞可以在體外或體內感染。
所述病毒可以包含一個或多個額外的突變。所述額外的突變優選使所述病毒的毒性最小化。通常所述突變導致立即早期(IE)基因表達降低或最小化。阻止或減少IE基因的表達就阻止或減少病毒復制。所述突變包括例如，編碼ICP4、ICP27、ICP0和/或ICP22的基因中的失活突變，優選ICP27和/或ICP4。還可以包括在vmw65-編碼基因中除去其反式激活功能的失活突變(例如，象Ace等，1989或Smiley等1997中的vmw65突變)。優選額外的突變還可以使所述病毒的免疫反應-抑制活性最小化。所述突變包括編碼ICP47基因的失活。
圖2所示測定CD40、CD80、CD83和CD86在未刺激(圖2A)和LPS刺激(圖2B)的模擬感染細胞和感染17+、1764/27-/4-和1764/27-/4-/pR20.5/vhs病毒株的細胞上的細胞表面表達水平的FACS分析結果。
圖3所示測定病毒感染對未感染樹突細胞和感染17+、1764/27-/4-和1764/27-/4-/pR20.5/vhs病毒株的樹突細胞分泌IL-6和TNFα的影響的ELLSA分析結果。
圖4所示接種和未接種乙型肝炎個體的T-細胞在HBS-Ag作用下的增殖反應。從每個個體獲取的樹突細胞未處理、與重組HBS-Ag蛋白(HBSAg*)混合、與T-細胞混合前感染對照載體(1764/27-/4-/pR20.5/vhs/HBS-Ag)或感染表達HBS-Ag的載體(1764/27-/4-/pR20.5/vhs/HBS-Ag)。
發明詳述A.病毒本發明的病毒能感染樹突細胞而不阻止所述感染樹突細胞活化。以感染復數(MOI)為1感染本發明病毒的優選樹突細胞可以通過用LPS處理或其它活化刺激處理活化。
本發明的病毒不阻止樹突細胞的活化。為了測定何時病毒允許樹突細胞發生活化，用所述病毒以MOI≥1感染樹突細胞并且將感染的樹突細胞用LPS處理。可以監控隨著樹突細胞的活化上調的細胞表面標記(如CD83和/或CD86)的水平來測定樹突細胞的活化，例如通過FACS分析。如果所述細胞感染的病毒允許樹突細胞發生活化，那么在LPS處理的樹突細胞中所述細胞表面的這些標記的水平明顯高于沒用LPS處理的細胞。感染了允許樹突細胞發生活化的病毒的樹突細胞上的一些或全部這些標記也將高于未感染的樹突細胞。如果用不含vhs失活突變的單純皰疹病毒來感染樹突細胞的話，那么觀察到這些標記很少上調。
本發明的允許感染樹突細胞發生活化的病毒將缺少編碼vhs(在HSV中)的功能性基因或其在其它病毒種類中的同源物或功能等同物。此外，本發明的病毒還具有功能性UL43基因。額外的突變例如在編碼ICP47的基因中包含的突變可以使病毒的免疫反應-抑制作用進一步減少。
本發明的減毒病毒優選能夠感染樹突細胞以至獲得最小毒性。優選在感染后一天至少50％感染后存活細胞，更優選在感染后一天至少60％、70％、80％或90％。為了達到降低毒性，本發明的病毒可以包括一個或多個減少病毒復制的突變。例如，可以包括在編碼VMW65的基因中的突變(該突變使所述蛋白的反式激活活性最小化)和/或在一個或多個調節立即早期基因如ICP4、ICP27、ICP0和ICP22中的突變。因此，本發明的病毒通常缺少功能性vhs、ICP27、ICP4基因并包含編碼不具有轉錄激活活性的蛋白質的VMW65基因，或通常缺少功能性vhs、ICP47和ICP4基因。
對于體內直接應用，某種程度的可復制性通常對加強所誘導的免疫反應有益。因此在這種情況下，本發明的病毒優選缺少功能性vhs基因并且還可以缺少一個或多個對病毒的完整致病性必須的但對病毒復制不是必須的功能性基因。所述基因包括編碼ICP34.5、ICP6、胸苷激酶和糖蛋白如gH的基因。但是優選的編碼胸苷激酶的基因是功能性的，因為這一基因突變將致使所述病毒對抗病毒藥物如無環鳥苷不敏感。
盡管本發明應用單純皰疹病毒舉例說明，但應理解為皰疹病毒科的其它病毒可以修飾成減少感染的樹突細胞的樹突細胞活化的阻礙。特別是所述病毒可以包括水痘-帶狀皰疹病毒、假狂犬病病毒或牛皰疹病毒。
當本發明的病毒是單純皰疹病毒時，所述病毒可以由例如HSV1或HSV2株或其衍生物獲得，優選HSV1。衍生物包括含有HSV1和HSV2株的DNA的型間重組體。所述型間重組體本領域已有介紹，例如Thompson等(1988)和Meignier等(1988)。衍生物優選至少70％序列與HSV1或HSV2基因組同源，更優選至少80％，甚至更優選至少90％或95％，一般通過本文所述方法測定。更優選衍生物具有至少70％序列與HSV1或HSV2基因組相同，更優選至少80％相同，甚至更優選至少90％、95％或98％相同。
衍生物可以具有經核苷酸取代(例如從1、2或3到10、25、50或100個核苷酸取代)修飾的HSV1或HSV2基因組的序列。所述HSV1或HSV2基因組可以二者選一或額外地通過一個或多個插入和/或缺失和/或通過在任一或兩個末端延長來修飾。
可以用來獲得本發明的病毒的衍生物包括已經在基因中具有本發明病毒想要的功能性失活的突變的病毒株，例如vhs失活病毒株(Jones等1995)、ICP47失活病毒株(Goldsmith等1998)、在ICP4中具有缺失的病毒株d120(DeLuca等，1985)、在ICP27中具有缺失的病毒株d27-1(Rice和Knipe，1990)或在ICP27和ICP4中都有缺失的病毒株d92(Samaniego等，1995)。應用這些病毒株可以減少產生本發明的突變HSV病毒株需要的步驟。
用于描述各種HSV基因的術語可在Coffin和Latchman，1996中找到。
既然上述HSV基因的基因同系物存在于其它皰疹病毒種類中，那么可以修飾這些同系物。由于“同系物”是指功能相當于HSV基因的基因，同系物通常具有同源序列，不是氨基酸序列就是核苷酸序列與相應的HSV基因同源性。通常，HSV基因同系物在氨基酸水平與相應的HSV基因至少15％相同，優選至少20％，更優選至少30％、40％或50％相同。
編碼vhs的基因在HSV1和HSV2中是UL41基因。所述UL41基因在HSV1株17+(EMBL登記號HE1CG)中是從核苷酸91,170到核苷酸92,637。所述UL41基因在HSV2株HG52(EMBL登記號z86099)中是從核苷酸91,800到93,275。
測定核苷酸和蛋白質同源性的方法在本領域是眾所周知的。例如UWGCG程序包提供可以用于計算同源性的BESTFIT程序(例如應用其設置默認值)(Devereux等(1984)Nucleic Acids Research 12，第387-395頁)。所述PILEUP和BLAST運算法則可以用于計算同源性或排列序列(通常應用其設置默認值)，例如在Altschul(1993)J.Mol.Evol.36290-300；Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215403-10中所述。
執行BLAST分析的軟件可以通過國家生物技術信息中心(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/)公開獲得。該運算法則包括首先通過確定當與數據庫序列中相同長度的字節(word)排比時匹配或滿足一定的正值閾值T的查詢序列中長度W的短字節(short words)來測定高分序列對(HSP)。T是指鄰近字節分數閾值(Altschul等，1990)。這些起始鄰近字節命中數(hits)作為開始尋找包含它們的HSP的開端。所述累積排列分數能增加多少，所述字節命中數沿著每個序列的兩個方向延長多少。所述字節命中數在每個方向的延長在下列時候停止所述累積排列分數從其達到的最大值下降X數量；由于一個或多個負數-計分殘基排列的積累使所述累積分數變為0或0以下時；或達到任一序列的末端時。所述BLAST運算法則參數W、T和X決定排列對比的靈敏度和速度。所述BLAST程序設置默認值字節長度(W)為11，BLOSUM62計分矩陣(參見Henikoff和Henikoff(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA8910915-10919)排列(B)為50，期望值(E)為10，M＝5，N＝4，并且比較兩條鏈。
所述BLAST運算法則進行兩個序列之間相似性的統計分析；參見例如，Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA905873-5787。一種BLSAT運算法則提供的相似性測量是最小總概率(P(N))，它提供兩個核苷酸或氨基酸序列之間發生偶然匹配的概率。例如，如果比較第一序列與第二序列的最小總概率低于大約1，優選低于大約0.1，更優選低于大約0.01，最優選低于大約0.001，那么認為這一序列與另一序列相似。
HSV基因的同系物可以通過多種方法測定，例如通過用包含全部或部分HSV基因的探針在中到高嚴格條件下(例如0.03M氯化鈉和0.03M檸檬酸鈉，溫度大約50-60℃)探測由其它病毒制備的基因組或cDNA文庫。另外，也可以應用簡并PCR獲得種同系物，所述PCR應用的引物針對變異體中的目標序列和編碼保守氨基酸序列的同系物。所述引物可以包含一個或多個簡并位置，并且在嚴格條件下應用，所述條件低于用對已知序列的單一序列引物來克隆序列所用的條件(例如0.03M氯化鈉和0.03M檸檬酸鈉，溫度大約40℃)。
如果皰疹病毒的同系物與HSV蛋白共享一個或多個功能特性，那么它是HSV蛋白的功能等同物。例如，vhs蛋白在感染的細胞中通過降低mRNA的穩定性起到降低蛋白質表達水平的作用。因此，vhs蛋白功能等同物優選通過降低mRNA的穩定性起到終止宿主細胞基因表達的作用。更優選vhs功能等同物阻止樹突細胞對刺激應答(它可以活化未感染的樹突細胞)的活化。
為了安全，本發明的病毒是減毒的，因此它們一般不能引起疾病，為了減毒而改變的病毒區域可以是去處(完全或部分)、或使其失去功能、或通過其它序列(尤其是通過異源基因序列)取代。減毒突變對于所有用作病毒載體的病毒組都有描述。例如，可以通過在ICP34.5和/或必需基因如ICP4、ICP27和/或vhs基因本身突變致使HSV無毒性。
特別優選的減毒病毒包括除了缺少編碼vhs的功能性基因和任選缺少功能性ICP47基因之外，缺少功能性ICP34.5基因和功能性ICP27基因以及任選缺少功能性ICP4基因和/或編碼具有轉錄激活活性的蛋白的VMW65基因的病毒；以及具有功能性ICP27基因但是缺少功能性ICP4基因和功能性ICP34.5基因以及任選缺少編碼具有轉錄激活活性的蛋白的VMW65基因的病毒。所述病毒描述于WO98/04726和WO99/60145中，其公開的內容通過引用結合到本文中。
當本發明的單純皰疹病毒缺少特定功能必須基因(例如編碼ICP4或ICP27的基因)時，所述病毒用表達所述必須基因的細胞系來繁殖。例如，當病毒缺少功能性ICP27基因時，所述病毒可以應用V27細胞(Rice和Knipe，1990)、2-2細胞(Smith等，1992)或B130/2細胞(WO98/30707)來繁殖，優選B130/2細胞。當病毒缺少功能性ICP4基因時，所述病毒可以應用表達ICP4的細胞系如E5細胞(DeLuca等，1985)來繁殖。當病毒缺少功能性ICP4基因和功能性ICP27基因時，所述病毒應用表達ICP4和ICP27(如E26細胞；Samaniego等，1995)的細胞系來繁殖，當病毒還缺少功能性vmw65基因時，所述病毒可以應用還包含vmw65的非HSV同系物(例如馬皰疹病毒基因12或牛皰疹病毒的BTIF)的細胞系來繁殖。B.突變方法所述多種病毒基因可以通過本領域眾所周知的幾種技術致使其功能失活。例如，可以通過缺失、取代或插入，優選缺失來致使它們功能失活。缺失可以除去一部分基因或全部基因。例如，僅僅一個核苷酸缺失可以導致移碼。但是優選大的缺失，例如從2、3或5到10、20、30、50、100或200個核苷酸的取代。優選缺失或取代總編碼和非編碼序列的至少25％，更優選至少50％(或者以絕對量表示，至少10個核苷酸、更優選至少100個核苷酸、最優選至少1000個核苷酸)。特別優選去除整個基因和一些側翼序列。插入序列可以包括以下所述異源基因。突變可以包括缺失和插入。例如可以在缺失位點中插入。因此異源基因在病毒基因中的插入可以替代部分或全部所述病毒基因。特別優選在vhs、ICP47、ICP27或ICP4中插入異源基因。就VMW65基因來說，不能缺失全部基因，因為它編碼重要的結構蛋白，但是通常進行失活突變，完全破壞VMW65活化轉錄IE基因的能力(例如，Ace等，1989或Smiley等，1997)。
可以通過本領域技術人員眾所周知的同源重組方法使皰疹病毒突變。例如，用載體(優選質粒載體)包含同源HSV序列側翼的突變序列一起轉染HSV基因組DNA。所述突變序列可以包括缺失、插入或取代，所有這些都可以通過常規技術構建。插入可以包括選擇性標記基因例如lacZ或GFP，例如通過β-半乳糖苷酶活性或熒光來篩選重組病毒。C.異源基因和啟動子本發明的病毒可以修飾為攜帶異源基因。術語“異源基因”包括任何基因。盡管異源基因是通常不存在于皰疹病毒的基因組中的基因，但是只要所述編碼序列不是有效連接到與其自然相連的病毒控制序列上就可以應用皰疹基因。所述異源基因可以是野生型基因的任何等位基因變異體或突變基因。術語“基因”包括至少能夠轉錄產生RNA分子的核酸序列，所述RNA分子優選能夠翻譯產生多肽或通過反義作用下調基因表達水平。本發明的病毒可以任選包括部分或全部5’和/或3’轉錄但不翻譯的自然側翼序列，或者與異源基因的翻譯編碼序列相連。它還可以任選包括通常與轉錄序列相連的轉錄控制序列，例如轉錄終止信號、聚腺苷酸化位點和下游增強子元件。
通過HSV病毒株與例如攜帶側翼為HSV序列的異源基因/基因們的質粒載體的同源重組，可以將所述異源基因/基因們插入到病毒基因組中。應用本領域眾所周知的克隆技術可將異源基因/基因們插入到合適的包含皰疹病毒序列的質粒載體中。只要病毒仍然可以繁殖，可將異源基因/基因們插入到病毒基因組的任何位置。優選異源基因/基因們插入到基因中導致病毒減毒。異源基因可以插入到病毒基因組許多位點中。
異源基因/基因們的轉錄序列優選有效連接到允許在樹突細胞(優選哺乳動物樹突細胞、更優選人類樹突細胞)中表達異源基因/基因們的控制序列。術語“有效連接”是指并列其中所述成分的關系允許它們以它們想要的方式作用。控制序列“有效連接”到編碼序列是以這樣的方式連接在與控制序列一致的條件下完成編碼序列的表達。
所述控制序列包含允許表達異源基因/基因們的啟動子和轉錄終止信號。所述啟動子選自哺乳動物優選人類樹突細胞中起作用的啟動子。所述啟動子/啟動子們可以得自真核基因的啟動子序列。例如，啟動子可以得自發生異源基因表達的細胞的基因組，優選哺乳動物樹突細胞或更優選人類樹突細胞。關于真核啟動子，它們可以是以遍在方式(如β-肌動蛋白、微管蛋白的啟動子)或樹突細胞特異性方式作用的啟動子。也可以使用病毒啟動子，例如莫洛尼鼠類白血病毒長末端重復序列(MMLV LTR)啟動子或其它逆轉錄病毒啟動子，人類或小鼠巨細胞病毒(CMV)IE啟動子。
可以應用本領域技術人員已知的常規克隆技術制備表達盒和其它合適的包含異源基因/基因們和控制序列的構建物(參見例如，Sambrook等，1989，分子克隆-實驗指南；Cold Spring Harbor Press)。
此外，任何這些啟動子都可以通過增加更多的調節序列例如增強子序列(包括HSV LAT區域元件)來修飾。也可以使用包含兩個或多個上述不同的啟動子的序列元件的嵌合啟動子，例如MMLV LTR/LAT融合啟動子(Lokensgard等，1994)或包含LAT區域元件的啟動子(WO98/30707)。
異源基因通常編碼治療用途的多肽。例如，為了促進對特定腫瘤的特異性免疫反應，最好用控制表達腫瘤抗原/抗原們的本發明的病毒轉染樹突細胞。腫瘤抗原可以是對腫瘤細胞特異性的，即存在于腫瘤細胞但是在非腫瘤細胞中沒有，或者例如由于抗原表達的上調，它以高于相同類型非腫瘤細胞中的水平存在于腫瘤細胞中。這將有助于癌癥治療，因為本發明的感染的樹突細胞可以用于刺激宿主免疫系統，以與腫瘤-特異的或腫瘤-優勢的抗原/抗原們反應，導致腫瘤縮小/退化。特別優選在腫瘤細胞表面表達的腫瘤抗原/抗原們，例如細胞表面受體或細胞粘著蛋白。腫瘤抗原的實例包括在多種腫瘤包括卵巢癌中過度表達的MUC-1基因產物(Gendler等，1990)；與宮頸癌有關的人乳頭瘤病毒蛋白E6和E7。黑素瘤中的MART-I、MAGE-I、gp100和酪氨酸酶；前列腺癌中的PSA；多種不同類型的腫瘤中的CEA和多種癌癥包括乳癌中的Her2neu。
異源基因也可以編碼能夠增進免疫反應的多肽，例如細胞因子(如α-、β-或γ-干擾素，白細胞介素(包括IL-1、IL-2)，腫瘤壞死因子，或胰島素樣生長因子I或II)或其它免疫調制蛋白，包括趨化因子如RANTES和共同刺激分子如CD80、CD86、CD40和CD40配體。
所述異源基因還可以編碼致病源的多肽/多肽們，使得例如感染本發明病毒的樹突細胞可用于在宿主感染所述病原前或感染后，刺激宿主免疫系統引起對病原的免疫反應。用于疫苗的病毒通常包含編碼抗原多肽的異源基因。優選的所述致病源多肽得自病原微生物，例如寄生物、細菌或病毒。所述抗原性多肽的實例包括丙型肝炎病毒抗原、乙型肝炎病毒表面或核心抗原、乳頭瘤病毒抗原、HIV抗原和瘧疾抗原。包含病原微生物的異源基因的病毒可用于治療和/或預防。
治療應用有充分的理由需要給予多基因。多基因的表達有利于治療多種疾病。皰疹病毒是唯一適當的，因為它們沒有其它病毒載體系統的限制包裝能力。因此多個異源基因可以容納在它的基因組中。例如2-6個基因可以插入到基因組中。
這可以通過至少兩種方法完成。例如可以將一個以上的異源基因和相關控制序列在病毒基因組的單位點或多位點導入到特殊的HSV病毒株中。也可以用兩個啟動子(相同或不同的啟動子)在彼此相反的方向面對，這些啟動子分別驅動如上所述的異源基因(相同或不同的異源基因)的表達。D.樹突細胞樹突細胞可以通過多種方法分離/制備，例如它們可以從外周血直接純化，或由例如通過G-CSF處理轉移到外周血后由CD34+前體細胞產生，或直接由骨髓產生。外周血的貼壁前體細胞可以用GM-CSF/IL-4混合物(Inaba等，1992)處理，或者骨髓的非貼壁CD34+細胞可以用GM-CSF和TNF-α(Caux等，1992)處理。樹突細胞可以應用與Sallusto和Lanzavecchia，1994相似的方法由人類自愿者的外周血常規制備，應用純化的外周血單核細胞(PBMC)并用GM-CSF和IL-4處理貼壁細胞2小時。然后用磁珠除去CD19+B細胞和CD3+、CD2+T細胞(參見Coffin等，1998)。其它方法也可以用于樹突細胞的制備。E.治療應用本發明的病毒和感染本發明病毒的樹突細胞可以用在治療的方法中。尤其是表達腫瘤抗原的本發明的病毒和感染本發明病毒的樹突細胞可以用在治療癌癥的方法中。本發明的病毒和感染本發明病毒的樹突細胞特別可以用于抑制哺乳動物包括人的各種腫瘤的生長，例如卵巢、宮頸、子宮內膜的腫瘤和癌，例如乳癌、肺癌、膀胱癌和結腸癌。可以抑制其生長的其它腫瘤包括肉瘤(例如軟組織和骨肉瘤)和血液癌(如白血病)。可以用表達腫瘤抗原的本發明病毒和/或感染本發明病毒的樹突細胞治療的癌癥的特別實例包括黑素瘤、白血病、宮頸癌和卵巢癌。用于治療癌癥的病毒通常包含編碼腫瘤抗原的異源基因。所述病毒或感染所述病毒的樹突細胞的給予通常可以導致產生對腫瘤抗原的免疫反應。
本發明的病毒和感染本發明病毒的樹突細胞可以用在治療和預防病原性感染(例如寄生物、細菌或病毒的感染)的方法中。用于治療病原性感染的病毒通常包含編碼致病微生物的抗原的異源基因。所述病毒和感染所述病毒的樹突細胞的給予通常導致產生對致病微生物抗原的免疫反應。所述病毒感染包括皰疹病毒感染。因此本發明的病毒可以用于引起對所述病毒本身的免疫反應，例如在HSV1或HSV2感染的治療或接種疫苗中。如果病毒打算用于治療HSV1或HSV2，那么所述病毒可以任選包含異源基因，該異源基因編碼HSV抗原(它不受其自身啟動子控制)或免疫調制分子。在感染前給予所述病毒/樹突細胞可以刺激宿主的保護性免疫反應，在感染后給予可以刺激宿主免疫系統抵抗感染。F.給藥因此，本發明的皰疹病毒可以用于將治療基因傳遞給需要治療的人或動物。應用本發明的皰疹病毒傳遞治療基因可以用于治療例如惡性腫瘤和/或病原性感染。
本發明的病毒可以用于需要治療的患者，優選人類患者。需要治療的患者是患有癌癥的個體或病原體感染的患者。治療的目的是改善患者的病情。應用本發明病毒常規性治療可以減輕癌癥的癥狀。按照本發明治療癌癥的方法包括給予患有癌癥的患者治療有效量的具有功能性UL43基因并缺少功能性vhs基因的病毒，因此所述病毒存在于患者的樹突細胞中。給予患有腫瘤的個體本發明病毒通常可以殺死腫瘤細胞，因此減小腫瘤大小和/或預防腫瘤惡性細胞擴散。
應用本發明病毒對病原性感染的治療通常減輕感染的癥狀，優選殺死致病生物。按照本發明治療病原性感染的方法包括給予病原感染的患者治療有效量的缺少功能性vhs基因的病毒。優選所述病毒進入患者的樹突細胞或者給予患者體外感染所述病毒的樹突細胞。應用本發明病毒預防的治療通常導致癌癥或病原感染風險患者產生針對腫瘤抗原的抗體或針對致病生物抗原的抗體。癌癥風險患者通常遺傳易感患者或可能暴露于致癌物質或具有暴露于致癌物質的風險患者。病原感染風險患者通常可能暴露于致病生物。
實施治療的一種方法包括如上所述將治療基因/基因們插入到本發明皰疹病毒的基因組中，然后將獲得的重組病毒與藥學上可呈遞的載體或稀釋劑混合產生藥用組合物。合適的載體和稀釋劑包括等滲鹽溶液，例如磷酸鹽緩沖液。所述組合物可以制成腸胃外、肌內、靜脈內、腹膜內、皮下或經皮給藥制劑。優選皮下或腹膜內給藥。特別優選經皮或皮內給藥。
本發明病毒感染樹突細胞可以通過給予患者包含所述病毒的組合物體內實現。所述藥用組合物給藥方式使得包含治療基因/基因們的所述病毒可以感染樹突細胞。病毒的給藥量是在104-1010pfu范圍內，優選105-108或105-109pfu，更優選大約106-108pfu。當皮內注射或經皮給藥時，例如應用無針裝置，通常給予10μl-1ml，優選100μl-1ml的在藥學上可呈遞的合適載體或稀釋劑中的或在微粒組合物中的病毒。
另一個方法包括分離/制備外周血或骨髓的樹突細胞并在體外用本發明的病毒感染所述細胞。然后轉導的樹突細胞通常通過肌內、腹膜內、皮下或靜脈內注射給予，或直接注射到患者的淋巴結，優選皮下、腹膜內或直接注射到淋巴結給予患者。通常給予患者105-109轉導的樹突細胞，優選106-108細胞，更優選大約107細胞。
所述給藥途徑和劑量僅作參考，因為熟練的從業者能為任何特定患者容易地確定最佳給藥途徑和劑量。按照不同的參數，尤其按照例如患者的年齡、體重和病情決定劑量。
下列實施例說明本發明。
為了使病毒的VMW65突變，在培養病毒的介質中包括3mM六亞甲基-雙乙酰胺(HMBA)(McFarlane等，1992)。使用下列病毒株(i)17+(野生型HSV1)(ii)17+/pR20.5/UL43應用標準方法通過與純化的基因組HSV1病毒株17+DNA同源重組將來自質粒pR20.5(Thomas等1999b)的盒插入到UL43處，所述盒包括RSV/lacZ/pA序列和HSV LAT區域序列(nts 118，866-120，219)隔離開、反向背對背的CMV/GFP/pA序列。所述pR20.5盒首先在獨特的Nsi I位點插入到包含UL43側翼區域(Coffin等，1996)的質粒中，得到質粒pR20.5/43。當編碼Srf I的寡核苷酸插入到盒任一側時，所述20.5盒可以用Srf I從其pGEM5(Promega)質粒主鏈中切除。從pRc/RSV(Invitrogen)中切除所述RSV啟動子、從pCH110(Pharmacia)中切除lacZ/pA、從pcDNA3(Invitrogen)中切除CMV/pA以及從pEGFP-N1(Clontech)中切除GFP，用于構建質粒pR20.5。
(iii)1764/27-/4-病毒株1764/27-/4-如下構建病毒株1764/27-/4-/pR20.5 DNA與空ICP4側翼區域重排和選擇不表達GFP或lacZ的病毒噬菌斑。病毒株1764/27-/4-/pR20.5描述于Thomas等，1999b，它包括插入到ICP4基因中的pR20.5盒，以致替代病毒編碼ICP4的基因，同時缺失ICP27和ICP34.5，并在編碼VMW65基因中有失活突變。
(iv)1764/27-/4-/pR20.5/vhs病毒株1764/27-/4-/pR20.5/vhs如下構建通過在HSV1病毒株17+的vhs編碼基因中的獨特Nru I位點將pR20.5盒插入到vhs側翼區域中，將獲得的質粒(pR20.5/vhs)重組到HSV病毒株1764/27-/4-DNA中。因此病毒株1764/27-/4-/pR20.5/vhs缺失編碼ICP4、ICP27和ICP34.5的基因，并且在編碼vmw65和vhs的基因中有失活突變。
(v)1764/27-/4-/pR19lacZ病毒株1764/27-/4-/pR19lacZ如同以上病毒(iv)構建，只是將pR19lacZ盒(Wagstaff等，1998)重組到病毒株1764/27-/4-的潛伏相關轉錄(LAT)區域，而不是pR20.5盒插入到vhs。
(vi)1764/27-/4-/pR20.5/vhs/HBS-Ag通過用Xho I和Nsi I消化pHBV130(Gough和Murray，1982)并在Sal I和Sma I位點之間插入釋放的片段到pSP72(Promega)中，將pR20.5/vhs質粒中的lacZ基因替換成編碼肝炎表面抗原(HBS-Ag)的基因。用Xba I和EcoR I消化pR20.5/vhs釋放lacZ基因，所述lacZ基因由用HindIII和EcoR I從pSP72中切除的HBS-Ag基因代替。獲得的質粒重組到1764/27-/4-/pR20.5/vhs病毒DNA中，選擇并純化不表達lacZ的噬菌斑。然后通過DNA印跡確定基因組結構。制備樹突細胞如前所述由外周血制備DC(Coffin等，1998)。簡要地說，用lymphoprep(Nycomed)從60ml健康/乙肝接種的供體血液中制備外周血單核細胞(PBMC)。除去紅細胞后，取出非貼壁細胞(主要是T細胞和B細胞)，用HBSS沖洗并以1400rpm、5分鐘室溫離心。所述細胞沉淀用2ml90％FCS10％二甲基亞砜(DMSO)混合液中重懸浮，等分試樣并貯藏在-80℃用于以后T細胞分離。用添加GM-CSF(0.1μg/ml)和IL-4(0.05μg/ml)的RPMI培養基培養貼壁細胞并在37℃、5％CO2中培養7天。進一步lymphoprep后接著用抗-CD19、抗-CD2(Harlan)和抗CD3(Harlan)抗體磁力去除純化細胞，DC在完全RPMI培養基中重懸浮以備立即使用。CD4+T-細胞的分離將如上所述的冷凍T和B細胞迅速解凍，用HBSS沖洗并以1400rpm離心5分鐘。細胞重懸浮于2ml完全RPMI培養基中，計數并用抗-CD19(BU12-200μl neat，Immunology dept，UCL)、抗-CD14(HB246-200μl neat，Immunology dept，UCL)和抗-HLA-DR(L243-100μlneat，Immunology dept，UCL)mAb孵育，放在冰上30分鐘。所述細胞用HBSS沖洗，重懸浮于2ml完全RPMI培養基中，以10μl珠/106污染細胞的比例與結合到磁珠上的綿羊抗小鼠抗體(Dynabeads，Dynal)混合并在轉動混合器上在4℃孵育45分鐘。然后使所述細胞懸浮液/磁珠混合物在冰上接觸磁體10分鐘后通過去除上清液來取出CD4+T細胞。CD4+T細胞計數，以適合的濃度重懸浮于完全RPMI培養基中，放在冰上或培養在37℃、5％CO2(o/n)中備用。感染DC在室溫下以1400rpm沉淀DC5分鐘。然后通過將DC重懸浮在包含病毒的RPMI培養基中以MOI為1于37℃、5％CO2下感染DC1小時。然后加入1ml添加GM-CSF(0.1μg/ml)和IL-4(0.05μg/ml)的RPMI培養基。DC在37℃、5％CO2下孵育。為了進行LPS刺激，可以使用額外包含100ng/ml的LPS的RPMI。細胞因子分析應用市售可得的ELISA試劑盒(R&D Systems)測量DC培養上清液中的IL-6和TNF-α。ELISA之前，用指示病毒感染DC后42小時收集上清液冰貯藏在-20℃備用。T細胞增殖試驗分離并如上處理來自乙肝接種和未接種的人類個體的DC和CD4+T細胞。DC以1×105DC/ml到1×104DC/ml稀釋渡使用，CD4+T細胞以1×106細胞/ml使用。DC每個濃度的實驗都一式三份。向每個測定加樣孔加入100μl DC和100μl CD4+T細胞。向加樣孔加入指示重組乙肝表面抗原(Austral)至終濃度為1μg/孔。HSV-1-感染和未感染的DC和CD4+T細胞在37℃、5％CO2中培養6天。然后加入1μCu/孔[3H]胸苷(Amersham)，18小時后收獲細胞并計數摻入的[3H]胸苷。實施例1初步數據表明不含功能性vhs基因的HSV病毒株增強病毒感染后的樹突細胞活化本文在所有情況下都用每種病毒感染1×105樹突細胞，所述病毒通過溫和離心，以大約100μl病毒懸浮液重懸浮于DMEM中，在37℃孵育1小時，并與2ml RPMI/10％FCS+100ng/ml GM-CSF、50ng/mlIL-4一起轉移到24孔板中。然后這些板在37℃/5％CO2中孵育過夜。樹突細胞也用已知的樹突細胞活化劑脂多糖(LPS)處理，用未處理的作對照。
然后將這些感染和對照的上清液用于ELISA測定以檢測分泌細胞因子的水平。應用熒光激活細胞分類術(FACS)檢測感染和對照樹突細胞表面CD86的表達水平。在樹突細胞培養物中有兩種與CD86表達水平有關的細胞。FACS分析觀察到兩個峰，即反映細胞的第一個峰與低水平的CD86表達有關，細胞的第二個峰與高水平的CD86表達有關。例如LPS活化時，更多的細胞表達高水平的CD86，因此在第二個峰發現更多細胞。
結果
表1指示病毒以MOI為1感染24小時后培養上清液或對照上清液中細胞因子濃度(ELISA測定)。
表2對照細胞和用指示病毒感染的細胞的CD86表達結論結果表明未處理的樹突細胞分泌最小水平的檢測的細胞因子并在其表面具有預料的“靜止”水平CD86。LPS處理后顯著刺激細胞因子水平并且表面CD86的表達水平顯著增加。應用抗-CD86抗體的FACS分析，在上述實驗中LPS處理細胞的平均熒光強度大約為1×103。這些結果表明樹突細胞處于活化狀態。
指示病毒感染樹突細胞后，可以清楚地了解到，對于樹突細胞發生的這些測定的活化，所述病毒必須在編碼vhs基因中包含失活突變。使用不同無能水平的病毒，只有包含vhs突變的病毒顯著活化上述測定中的樹突細胞。還可以了解到當細胞用LPS處理并用指示病毒感染時如果不包括vhs突變，CD86水平象許多只用LPS處理的細胞一樣不增加。同樣，除非包括vhs突變，否則FACS測量的病毒感染后CD86表達細胞的平均熒光強度從如果細胞用LPS處理所看到的要降低。因此，結論是為了使樹突細胞得到最大免疫刺激，應該在編碼vhs基因中包括失活突變。實施例2不含功能性vhs蛋白的HSV病毒株不妨礙樹突細胞活化應用熒光激活細胞分類術(FACS)檢測感染和對照樹突細胞表面CD86、CD80、CD83和CD40的表達水平。ELISA測定感染的上清液細胞因子的水平。結果ELISA結果(圖3)表明，盡管可以用HSV高效感染，但是野生型(病毒株17+)或失活(病毒株1764/27-/4-)病毒不產生DC活化的指示細胞因子。但是如果將病毒株1764/27-/4-的vhs失活，產生病毒株1764/27-/4-/pR20.5/vhs，那么產生DC活化的指示細胞因子。對無LPS刺激的DC的FACS分析(圖2)表明，基本用野生型HSV(病毒株17+)或不能復制的HSV載體(病毒株1764/27-/4-)感染阻止CD86表達的增加。如上所述，如果DC已經被感染過程活化那么可以預料到CD86表達增加。在HSV感染的細胞中CD40的水平也改變/降低。但是，如果vhs失活(病毒株1764/27-/4-/pR20.5/vhs)，指示活化的CD86水平增加，而CD40水平不受影響。在HSV感染的無刺激DC中CD80和CD83不受很大的影響。CD83(B7.1)和CD86(B7.2)是兩個關鍵的T-細胞共同刺激分子，CD40是關鍵的T-細胞激活劑，CD83是DC成熟和活化期間DC上調的標記。
在感染野生型(病毒株17+)或失活(病毒株1764/27-/4-)病毒的時候用LPS刺激DC，對CD40水平的影響更顯著。但是，如果vhs失活，那么阻止了這些對CD40的影響。LPS刺激的DC通常顯著上調CD83和CD86的表達，但是受HSV阻止(病毒株17+和1764/27-/4-)，除非vhs失活(病毒株1764/27-/4-/pR20.5/vhs)。當vhs失活時，CD83和CD86水平都增加到與LPS刺激的未感染的細胞相同或更高的程度。結論如初步實驗(實施例1)所述，可以清楚地了解到，對于樹突細胞活化，所述活化通過在HSV感染或HSV感染和LPS刺激作用下的表面標記的表達水平來測量，顯然編碼vhs的基因必須失活。編碼功能性vhs的病毒不允許樹突細胞顯著活化，所述活化通過所檢測表面標記的表達水平來測量。實施例3體外用vhs失活的HSV載體轉導DC引導抗原特異性T細胞反應。
上述結果說明，vhs失活的HSV載體可以作為有效的載體用于DC，因為HSV在DC中失活作用已得到阻止。其實用所述HSV突變體感染的DC似乎在感染作用下特異性活化，其根據CD86的上調和特定細胞因子的分泌來測量。為了檢測vhs-失活的HSV突變體是否可以用于在將抗原編碼基因傳遞到DC后引導抗原特異性免疫反應，應用由乙肝接種和未接種個體制備的DC和T-細胞進行實驗。在此首先構建病毒，其中乙肝表面抗原(HBS-Ag)表達盒插入到缺失IE基因病毒的vhs編碼基因中。然后進行T-細胞增殖測定，其中來自接種的或未接種的個體的DC未經處理、通過與重組HBS-Ag蛋白混合而“加載”抗原、用包含對照標記基因的載體感染(1764/27-/4-/pR20.5/vhs，MOI＝1)、用對照載體感染(1764/27-/4-/pR20.5/vhs，MOI＝1)并且還與重組HBS-Ag混合、或者用表達HBS-Ag的載體感染(1764/27-/4-/pR20.5/vhs/HBS-Ag，MOI＝1)。然后將DC分別與得自相同的接種的或未接種的個體的T-細胞混合，在標準的T-細胞增殖測定中觀察對T-細胞增殖的作用。
這些實驗表明(圖)，盡管HBS-Ag重組蛋白和所述對照HSV載體可以在接種個體中引起小的T-細胞增殖反應，所述HSV反應可能表明T-細胞對HSV結構蛋白特異性增殖，所述對照載體與重組HBS-Ag混合能誘發輕微增強的反應，HBS-Ag的表達載體引起比任何這些都顯著的加強反應。因此隨著應用HSV載體將HBS-Ag直接傳遞到DC，引起明顯特異的T-細胞增殖反應，僅與重組抗原混合不會發生這樣的增殖反應。因此vhs失活的HSV載體允許傳遞抗原編碼基因到DC，以便使DC保留刺激抗原特異性T-細胞增殖反應的能力。
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權利要求
1.減毒皰疹病毒在制備用于刺激免疫反應的方法的藥物中的用途，所述病毒(i)缺少功能性vhs基因或其功能等同物；(ii)包含功能性UL43基因或其功能等同物；所述方法包括用所述病毒感染樹突細胞。
2.按照權利要求1的用途，其中所述病毒是單純皰疹病毒1或2。
3.按照權利要求1或2的用途，其中所述病毒缺少編碼ICP47的功能基因。
4.按照任一前述權利要求的用途，其中所述病毒具有VMW65基因或其功能等同物，所述VMW65基因編碼缺少轉錄-激活活性的蛋白質。
5.按照任一前述權利要求的用途，其中所述病毒缺少至少一個功能性立即早期基因。
6.按照權利要求5的用途，其中所述立即早期基因選自編碼ICP0、ICP4、ICP22、ICP27的基因或其功能等同物。
7.按照權利要求5或6的用途，其中所述病毒缺少編碼ICP27的功能基因和編碼ICP4的功能基因。
8.按照權利要求4-7任一項的用途，其中所述病毒缺少編碼ICP27的功能基因和編碼ICP4的功能基因，并且它具有VMW65基因或其功能等同物，所述VMW65基因編碼缺少轉錄-激活活性的蛋白質。
9.按照權利要求5-8任一項的用途，其中所述病毒缺少編碼ICP0、ICP4、ICP22和ICP27的功能基因。
10.按照任一前述權利要求的用途，其中所述病毒還缺少ICP34.5功能基因或其功能等同物。
11.按照任一前述權利要求的用途，其中所述病毒包括異源基因。
12.按照權利要求11的用途，其中所述異源基因與控制序列有效連接，所述控制序列允許在樹突細胞中表達所述異源基因。
13.按照權利要求11或12的用途，其中所述異源基因編碼治療用途的多肽。
14.按照權利要求11-13任一項的用途，其中所述異源基因編碼選自以下的多肽與非腫瘤細胞相比在腫瘤細胞中或腫瘤細胞表面上的表達水平升高的多肽；存在于腫瘤細胞中或在腫瘤細胞表面上但是非腫瘤細胞沒有的多肽；能夠調節免疫反應的多肽；以及寄生物、病毒或細菌來源的多肽。
15.按照權利要求11-14任一項的用途，其中所述病毒包括一種以上的異源基因。
16.按照任一前述權利要求的用途，其中所述病毒包括能夠調節免疫反應的一種或多種異源基因。
17.按照權利要求16的用途，其中所述異源基因編碼趨化因子、細胞因子或共同刺激分子。
18.按照任一前述權利要求的用途，其中所述樹突細胞是人樹突細胞。
19.按照任一前述權利要求的用途，其中所述樹突細胞是在體外感染前從外周血或骨髓中分離或制備的。
20.按照權利要求19的用途，其中所述樹突細胞在感染后送回所述機體內。
21.按照權利要求1-18任一項的用途，其中所述樹突細胞在所述病毒給予到人或動物體內后被感染。
22.按照任一前述權利要求的用途，其中所述藥物是通過注射、輸注、皮內或經皮途徑給藥或利用基因槍方式給藥。
23.按照任一前述權利要求的用途，其中所述藥物用于治療或預防病原性感染或癌癥。
24.一種刺激人體或動物免疫反應、或者治療或預防人或動物病原性感染或癌癥的方法，所述方法包括給予其需要患者有效量的具有UL43功能基因并缺少vhs功能基因的病毒。
全文摘要
本發明提供缺失功能性vhs基因或其功能等同物的減毒皰疹病毒在制備用于免疫療法或接種的藥物中的用途，包括用所述病毒感染樹突細胞。
文檔編號A61P31/04GK1439056SQ0181093
公開日2003年8月27日 申請日期2001年4月12日 優先權日2000年4月12日
發明者R·S·科芬 申請人:拜奧維克斯有限公司