雜環(huán)衍生物與使用方法

專利名稱：雜環(huán)衍生物與使用方法
繼續(xù)申請的日期該申請要求保護(hù)2000年6月8日提出的美國臨時(shí)申請序號60/210412的利益。
政府基金本發(fā)明得到美國政府的支持，由國家變態(tài)反應(yīng)和感染疾病研究所(NIAID)授予的撥款號2 R01 AI 21463，由NIAID授予的撥款號2 R01AI 18401，由國家環(huán)境衛(wèi)生科學(xué)研究所(NIEHS)授予的撥款號ES06676；以及由NIEHS授予的撥款號R01 ES06839。政府對本發(fā)明擁有一些權(quán)利。
背景技術(shù)：
人體與非人動物體內(nèi)腹瀉疾病可能由幾類病原體引起，其中包括病毒、細(xì)菌、寄生蟲和輪狀病毒。最流行的是大腸桿菌和霍亂弧菌。腹瀉疾病是在欠發(fā)達(dá)國家中發(fā)病率和死亡率的普遍病因。這些疾病也折磨著發(fā)達(dá)國家中的人們。例如，在美國每年有200 000多個5歲或更小的兒童因急性腹瀉疾病而住院。傳染性腹瀉在全世界是發(fā)病率和死亡率的主要原因，在美國也是很普遍一類的疾病。
由于腹瀉起因很多，對于同一個人可能發(fā)生急性傳染性腹瀉一次以上，因此與典型地出現(xiàn)一次的大多數(shù)慢性病癥不一樣。與其它消化性疾病不一樣，傳染性腹瀉是通過人與人接觸傳染的，或通過污染的食品或水傳染的，并通過家庭、學(xué)校、日間托兒中心、療養(yǎng)院和社區(qū)呈地域性地傳播或傳染。腹瀉疾病對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中飼養(yǎng)的動物，特別是牛犢和豬也是嚴(yán)峻的問題。
發(fā)明的簡要說明本發(fā)明在治療受治療者小腸液虧損技術(shù)中是超前的。本發(fā)明提供一種治療受治療者小腸液虧損的方法。該方法包括給患有小腸液虧損或有小腸液虧損發(fā)展危險(xiǎn)的受治療者服用一種組合物，該組合物含有有效量的含雜環(huán)化合物如雜環(huán)衍生物，像聯(lián)苯雜環(huán)衍生物、前列腺素類似物或它們的組合。在本發(fā)明這個方面的某些具體實(shí)施方案中，小腸液虧損與具有ADP-核糖基化活性的病原體多肽不相關(guān)，而在另一方面，小腸液虧損與具有ADP-核糖基化活性的病原體多肽有關(guān)系。
本發(fā)明在抑制腺苷酸環(huán)化酶技術(shù)里是超前的。該化合物抑制腺苷酸環(huán)化酶的能力是令人驚奇的和出乎意外的，因?yàn)樵O(shè)計(jì)某些化合物專用于與環(huán)加氧酶1或環(huán)加氧酶2的活性位點(diǎn)進(jìn)行反應(yīng)。本發(fā)明提供一種在活體外抑制腺苷酸環(huán)化酶的方法。該方法包括讓腺苷酸環(huán)化酶與一種含有一定量含雜環(huán)化合物的組合物接觸，該化合物能有效抑制由三磷酸腺苷(ATP)產(chǎn)生3′，5′-單磷酸腺苷(cAMP)。腺苷酸環(huán)化酶可以是在活體內(nèi)，在這種情況下，該方法包括讓含有腺苷酸環(huán)化酶的細(xì)胞與該組合物接觸。在某些具體實(shí)施方案中，這種細(xì)胞并不含有具有ADP-核糖基化活性的病原體多肽。在這些具體實(shí)施方案中，含雜環(huán)的化合物優(yōu)選地是聯(lián)苯基雜環(huán)衍生物、前列腺素類似物或它們的組合。在其它具體實(shí)施方案中，該細(xì)胞含有具有ADP-核糖基化活性的病原體多肽。
本發(fā)明也提供一種抑制受治療者平滑肌收縮的方法。該方法包括讓患有與平滑肌收縮相關(guān)的病癥或有與平滑肌收縮相關(guān)的病癥發(fā)展危險(xiǎn)的受治療者服用一種組合物，該組合物含有有效量的雜環(huán)衍生物，例如聯(lián)苯基雜環(huán)衍生物，前列腺素類似物或它們的組合。
本發(fā)明還提供一種治療患百日咳病人的方法，其中包括讓患有百日咳或有百日咳發(fā)展危險(xiǎn)的受治療者服用一種組合物，該組合物含有有效量的含雜環(huán)化合物。
本發(fā)明還提供一種治療患炭疽病病人的方法，其中包括讓患有炭疽病或有炭疽病發(fā)展危險(xiǎn)的受治療者，服用一種組合物，該組合物含有有效量的含雜環(huán)化合物。
除非特別指出，不定冠詞“一”、定冠詞“該”和“至少一個”可互換使用，意指一個或一個以上。
附圖簡要說明

圖1.與對照小鼠相比，組氨酸對由霍亂毒素(1微克)引起小腸液在小鼠腸袢中積累的抑制作用。垂直線條表示在算術(shù)平均值上下的標(biāo)準(zhǔn)誤差。星號表示如由Dunnett′s Multiple Group Comparison檢驗(yàn)確定的顯著性差異(P＜0.05)。在每個線條上標(biāo)出每組鼠的數(shù)量。CT對照，小鼠只接受霍亂毒素(CT)；CT+L-his(0.93毫克)，小鼠接受CT和0.93毫克L-組氨酸；CT+L-his(0.37毫克)，小鼠接受CT和3.7毫克L-組氨酸；CT+L-his(14.8毫克)，小鼠接受CT和14.8毫克L-組氨酸。
圖2.在Ussing室中Isc的標(biāo)準(zhǔn)化值。對照，該組織在兩側(cè)用氯化鈉溶液沖洗；PGE2，往基底外側(cè)溶液添加1微摩爾PGE2，該溶液刺激Na+傳輸，增加穩(wěn)態(tài)短路電流(Isc)達(dá)14％(誘導(dǎo)最大PGE2的Isc變化是18±3％，p＜0.01)；PGE2+L-組氨酸，1微摩爾PGE2+10毫摩爾L-組氨酸溶液在37℃培養(yǎng)30分鐘，然后加到基底外側(cè)(Isc降低到30±9％對照)；差，PGE2與PGE2+L-組氨酸的差，它是78±21％(p＜0.025)；Isc(微安/厘米2)，短路電流(每平方厘米微安培)。
圖3.板A。PGE2與PGE2加合物的C-18反-相分離。板B。[3H]-PGE2和咪唑的C-18反-相色譜。Imi，咪唑；PGE2-IMI和PGE2-Imi，PGE2-咪唑。
圖4.使用純化的PGE2-咪唑共價(jià)加合物抑制CT-誘導(dǎo)cAMP生成。垂直線條表示由用cAMPELISA復(fù)制時(shí)分析典型實(shí)驗(yàn)得到的三份相同樣品平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差。星號表示由Dunnett′s Multiple GroupComparison檢驗(yàn)確定的統(tǒng)計(jì)顯著性差異(P＜0.05)。cAMP(微微摩爾)，微微摩爾環(huán)AMP；CT，霍亂毒素；PGE2-Imi，PGE2-咪唑。
圖5.使用PGE2-咪唑加合物降低CT-誘導(dǎo)的小腸液在鼠腸袢中的積累。在用CT(1微克/環(huán))激發(fā)的時(shí)間里，PGE2-咪唑加合物滴入扎結(jié)腸袢。在橫軸上列出往每個袢注入純化的PGE2-咪唑量。板A-在標(biāo)準(zhǔn)6小時(shí)培養(yǎng)期后鼠進(jìn)行尸體剖檢，測量積累的小腸液。垂直線條表示由每組5-8鼠得到的在算術(shù)平均值上下的標(biāo)準(zhǔn)偏差。星號表示如由Dunnett′s Multiple Group Comparison檢驗(yàn)確定的顯著性差異(P＜0.05)。板-B-采用cAMPELISA分析在板A鼠的小腸液和負(fù)袢PBS洗液中的環(huán)AMP水平。垂直線條表示由每組5-8鼠得到的在算術(shù)平均值上下的標(biāo)準(zhǔn)偏差。
圖6.PGE2-(4.7毫摩爾)與181毫摩爾組氨酸混合時(shí)，PGE2-組氨酸共價(jià)加合物的生成。在37℃(pH7.0)在N2下培養(yǎng)直到24小時(shí)后，使用26％乙腈和0.1％TFA洗脫，采用C-18反相柱色譜分離反應(yīng)混合物。測定在每個時(shí)限里在12.5分鐘內(nèi)移動的PGE2-組氨酸峰(190納nm)面積。
圖7.PGE2-組氨酸加合物的穩(wěn)定性。小的峰I，來自圖3A的峰I。
圖8.實(shí)驗(yàn)對象A。PGE2-組氨酸加合物在m/z403處由假-分子離子得到的電噴霧-MS/MS子離子譜。實(shí)驗(yàn)對象B。甲基酯化的PGE2-咪唑(15N)加合物在m/z419處由假-分子離子得到的電噴霧-MS/MS子離子譜。
圖9.(A)一維質(zhì)子核磁共振(1H NMR)譜，(B)二維總校正光譜法(2DTOCSY)譜，以及(C)在600MHz在D2O中PGE2-咪唑(15N)加合物的2D15N-標(biāo)記質(zhì)子異核多帶相干光譜法(15N/1H HMBC譜)，在(C)中，F(xiàn)1是15N二維，而F2是1H二維。
圖10.(A)提出的PGE2-咪唑加合物生成機(jī)制，(B)PGB2和PGB2-咪唑加合物的結(jié)構(gòu)。
圖11.Celecoxib降低CT-誘導(dǎo)小腸液在鼠腸袢中積累。CT，霍亂毒素；CT+袢中celecoxib，用霍亂毒素和兩份80微克劑量的celecoxib(一份在用CT激發(fā)時(shí)注入腸腔，兩小時(shí)后腹膜內(nèi)第二次注射)；CT+只是celecoxib IP，用霍亂毒素和兩份80微克劑量的celecoxib(一份在用CT激發(fā)時(shí)注入腹膜內(nèi)，兩小時(shí)后腹膜內(nèi)第二次注射)。垂直線條表示平均值上下的標(biāo)準(zhǔn)偏差。星號表示如采用Tukey檢驗(yàn)確定的與正對照的顯著性差異(P＜0.05)。
圖12.咪唑(2.7毫摩爾)、PGE2-組氨酸加合物(52微摩爾)和celecoxib(0.52微摩爾)對酶腺苷酸環(huán)化酶(4.6納摩爾)的影響?？瞻讻]有任何酶和抑制劑，而酶(E)僅有酶，無任何抑制劑。含有特定抑制劑的酶表示為E+咪唑，E+PGE2-氨組酸和E+celecoxib。如采用Student檢驗(yàn)確定的，與對照值(E)的顯著性差異可用*P≤0.05和*P≤0.001表示。
圖13.小腸液的霍亂毒素積累激發(fā)用COX-1抑制劑SC-560處理的鼠腸扎結(jié)袢。N，動物數(shù)；CT1微克/袢，每個袢加1微克霍亂毒素；CT+9Nm sc-560，每個袢加1微摩爾霍亂毒素和9納摩爾SC-560。星號表示如采用Tukey檢驗(yàn)確定的與正對照的顯著性差異(P＜0.05)。
圖14.腺苷酸環(huán)化酶的PGE2-組氨酸加合物IC50。
圖15.腺苷酸環(huán)化酶的celecoxib IC50。
圖16.腺苷酸環(huán)化酶的咪唑加合物IC50。
本發(fā)明優(yōu)選具體實(shí)施方案的詳細(xì)描述本發(fā)明提供涉及使用組合物的方法，該組合物含有一種含雜環(huán)化合物，特別地雜環(huán)衍生物。如本文所使用的“含雜環(huán)”化合物包括未取代的雜環(huán)化合物(優(yōu)選地，咪唑、吡唑、噻吩以及呋喃)，更優(yōu)選地，咪唑以及它們的衍生物。如本文所使用的“含雜環(huán)化合物”是包含雜環(huán)結(jié)構(gòu)的化合物，其中5個原子構(gòu)成封閉環(huán)，并且5元環(huán)中至少一元是雜原子。該雜原子優(yōu)選地是氮、氧或硫。優(yōu)選地，含雜環(huán)化合物是一種“雜環(huán)衍生物”，它包含5-元芯的雜環(huán)，有至少一個環(huán)取代基。形成雜環(huán)衍生物芯結(jié)構(gòu)的含雜環(huán)化合物實(shí)例包括咪唑、、吡唑、噻吩以及呋喃。
優(yōu)選地，使用至少一個非稠環(huán)結(jié)構(gòu)，優(yōu)選地，非稠5-或6-元環(huán)取代雜環(huán)衍生物，這些環(huán)可以選擇性地被進(jìn)一步取代。這種環(huán)結(jié)構(gòu)可以與該芯雜環(huán)中的雜原子鍵合或不鍵合。該芯雜環(huán)可以選擇性地用非環(huán)取代基取代。這樣的取代基包括鹵素原子(優(yōu)選地溴)，(C1-C4)烷基(優(yōu)選地，甲基)，全氟化(C1-C4)烷基(優(yōu)選地，CF3)，羰基，N2O，(C1-C4)烷氧基(優(yōu)選地，OCH3)，羥基取代(C1-C4)烷基(優(yōu)選地，CH2CH2OH)，羧酸取代(C1-C4)烷基(優(yōu)選地，CH2COOH)，和CH2CH(NH2)COOH。
如果在雜環(huán)衍生物中有取代的5-或6-元環(huán)，則可用鹵素原子(優(yōu)選地氟或氯)、(C1-C4)烷氧基(優(yōu)選地，OCH3)，(C1-C4)烷基(優(yōu)選地，甲基)，飽和或未飽和的(C1-C10)烷基取代，選擇性地用羥基，羰基，和/或羧酸，或下述基團(tuán)取代 與該芯雜環(huán)鍵合的優(yōu)選環(huán)結(jié)構(gòu)是如下結(jié)構(gòu)
對于本發(fā)明某些優(yōu)選的方法，環(huán)結(jié)構(gòu)是前列腺素。這樣的雜環(huán)衍生物在本文稱之“前列腺素類似物”。對于本發(fā)明某些其它的優(yōu)選方法，該環(huán)結(jié)構(gòu)是取代或未取代的苯環(huán)。對于特別優(yōu)選的方法，雜環(huán)衍生物有兩個苯環(huán)，它們可以被取代或不被取代。這樣的雜環(huán)衍生物在本文稱之“聯(lián)苯雜環(huán)”衍生物。優(yōu)選地，取代或未取代的苯環(huán)是非稠環(huán)。同樣地，在本發(fā)明的某些方面，聯(lián)苯基雜環(huán)不包括消炎痛，它具有下述結(jié)構(gòu) 聯(lián)苯基雜環(huán)衍生物的優(yōu)選實(shí)例包括下述衍生物
式中R1是全氟化(C1-C4)烷基(優(yōu)選地，CF3)或H；R2和R3每個各自是鹵素原子(優(yōu)選地氟或氯)、(C1-C4)烷氧基(優(yōu)選地，-OCH3)，(C1-C4)烷基(優(yōu)選地，甲基)，H，或 式中R4和R5每個各自是H，或
式中R6是鹵素原子(優(yōu)選地，溴)或H；以及R7和R8每個各自是鹵素原子(優(yōu)選地，F(xiàn))，H，或 式中R9和R10每個各自是飽和或未飽和的(C1-C10)烷基，選擇性地用羥基、羰基和/或羧酸取代的飽和或未飽和的(C1-C10)烷基。
優(yōu)選地，R9是下述基團(tuán) R10是下述基團(tuán)
聯(lián)苯基雜環(huán)的更優(yōu)選實(shí)例包括rofecoxib(由紐約，whitehouse station，Merck & Co.，以商品名VIOXX獲得的產(chǎn)品)，它具有下述的結(jié)構(gòu) celecoxib(由伊利諾斯州，斯科基，Searle & Co.，以商品名CELEBREX獲得的產(chǎn)品)，它具有下述的結(jié)構(gòu) 一種由密執(zhí)安州，安阿伯，Cayman Chemical Co.，以商品名SC-560獲得的化合物，它具有下述的結(jié)構(gòu)
以及一種由Cayman Chemical Co.，以商品名DuP-697獲得的化合物，它具有下述的結(jié)構(gòu) 作為本文使用的術(shù)語“前列腺素類似物”，它系指一類除了芯5-元雜環(huán)外還有前列腺素的雜環(huán)衍生物。作為本文使用的術(shù)語“前列腺素”，它是20-碳脂肪酸，典型地由花生四烯酸得到的20-碳脂肪酸。優(yōu)選地，前列腺素是PGE2，它具有下述的結(jié)構(gòu) 前列腺素是PGE2時(shí)，優(yōu)選地該雜環(huán)與前列腺素的C11共價(jià)結(jié)合。前列腺素類似物的優(yōu)選實(shí)例包括前列腺素E2-咪唑(PGE2-咪唑)加合物，它具有下述的結(jié)構(gòu)
以及列腺素E2-組氨酸(PGE2-組氨酸)加合物，它具有下述的結(jié)構(gòu) 在與前列腺素共價(jià)結(jié)合的這種雜環(huán)存在下，通過培養(yǎng)前列腺素可以生產(chǎn)出本發(fā)明的前列腺素類似物。優(yōu)選地，使用的前列腺素是PGE2、PGA2或PGB2。由密蘇里州，圣路易斯，Sigma Chemical Co.可以得到前列腺素。培養(yǎng)條件優(yōu)選地包括溫度約25-40℃，更優(yōu)選地約37℃。混合物的pH優(yōu)選地是約6.5以上，更優(yōu)選地約pH7.4。任選地，該混合物可以含有緩沖液，將pH保持在所希望的值。這種培養(yǎng)優(yōu)選地進(jìn)行約1小時(shí)至約24小時(shí)，更優(yōu)選地約24小時(shí)。由于在氧存在下前列腺素有被氧化的趨勢，所以優(yōu)選地在例如氮?dú)獾亩栊詺怏w存在下前列腺素與該雜環(huán)之間進(jìn)行反應(yīng)。優(yōu)選地，當(dāng)加到前列腺素的雜環(huán)是組氨酸時(shí)，使用L-組氨酸。采用該技術(shù)領(lǐng)域中已知的方法，其中包括例如質(zhì)譜和核磁共振(NMR)可以確定前列腺素類似物的結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明方法中使用的組合物還可以含有藥用載體。典型地，如下面“使用方法中”描述的，使用該組合物時(shí)，該組合物包括藥用載體。本發(fā)明組合物可以配制成適合所選擇服用方法的各種形式的藥物制劑。配方包括適合口服、直腸、陰道、腸內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、鼻內(nèi)、靜脈內(nèi)、子宮頸或子宮植入的、經(jīng)粘膜、經(jīng)皮用的或其組合使用的配方。這里描述該化合物的日劑量典型地是約1毫克/千克，直到約10毫克/千克。
這些配方通常為單位劑量形式，采用藥劑學(xué)技術(shù)領(lǐng)域中熟知的方法可以制備這些配方。所有制備藥物組合物的方法包括將活性組分(例如雜環(huán)衍生物)與載體放在一起的步驟，該載體是一種或多種補(bǔ)充組分。一般地，將活性化合物與液體載體、細(xì)粒固體載體或這兩者充分均勻地混在一起制備配方，然后如果必要的話，使產(chǎn)品成型成合乎需要的配方。
典型地，本發(fā)明的組合物可以每天服用約1-5次?？梢耘c載體材料組合以生產(chǎn)單次用藥量形式的活性組分的量將隨受治療者與特別的服用方式而改變。典型的制劑含有約5-95％活性化合物(重量/重量)。優(yōu)選地，這樣的制劑含有約20-80％活性化合物。在這樣治療使用的組合物中含有雜環(huán)化合物的量是這樣的，用藥量水平對于防止或抑制受治療者有這種病癥或有這種病癥危險(xiǎn)應(yīng)是有效的。
適合于腸胃道用藥的配方通常包括無菌的組合物水制劑或無菌粉劑分散液，它們與接受者的血液優(yōu)選地是等滲的?？梢栽谝后w制劑中含有的等滲劑，它包括糖、緩沖液和氯化鈉?？梢灾苽湓摻M合物水溶液，并且任選地與無毒性的表面活性劑混合。可以制備在水、乙醇、多元醇(例如乙二醇、丙二醇、液體聚乙二醇等)、植物油、乙二醇酯及其混合物中的分散液。最終的用藥量形式是無菌流體，在生產(chǎn)與儲存條件下是穩(wěn)定的。例如使用脂質(zhì)體，在分散液的情況下使用適當(dāng)?shù)牧６然蚴褂帽砻婊钚詣┛梢赃_(dá)到必需的流動性。采用任何能夠保持組合物生物活性的一般方法，優(yōu)選地采用過濾器滅菌，可以達(dá)到液體制劑滅菌。制備粉劑的優(yōu)選方法包括真空干燥和無菌注射液的冷凍干燥。使用各種殺菌劑，例如殺細(xì)菌、殺病毒和殺真菌劑，其中包括對羥基苯甲酸酯類、氯丁醇、酚、山梨酸、硫柳汞等，都可以防止后續(xù)的微生物污染。含有緩釋劑，例如單硬脂酸鋁和明膠，可以達(dá)到動物長期吸收這種組合物。
適合口服的本發(fā)明配方可以呈分立單位，例如片劑、錠劑、膠囊、糖錠、囊劑或扁囊劑，每種含有預(yù)定量的活性化合物，這些化合物呈粉狀或顆粒狀、呈含有有雜環(huán)化合物的脂質(zhì)體形式，或呈在含水液體或非含水液體中溶液或懸液形式，例如糖漿、酏劑、乳劑或飲劑。
片劑、錠劑、丸劑、膠囊等還可以含有一種或多種下述物質(zhì)粘結(jié)劑如黃耆膠、阿拉伯樹膠、玉米淀粉或明膠；賦形劑如磷酸二鈣；崩解劑如玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、藻酸等；潤滑劑如硬脂酸鎂；甜味劑如蔗糖、果糖、乳糖或天冬酰苯丙氨酸甲酯；以及天然或人工調(diào)味劑。單元用藥量形式是膠囊時(shí)，它還可以含有液體載體，例如植物油或聚乙二醇。各種其它材料可以涂層存在，或以別的形式改性固體單元用藥量形式的物理形式。例如，片劑、丸劑或膠囊可以涂布明膠、蠟、蟲膠或糖等。糖漿或酏劑可以含有一種或多種甜味劑、防腐劑如對羥基苯甲酸甲酯或?qū)αu基苯甲酸丙酯、延遲糖結(jié)晶的試劑、提高任何其它組分溶解度的試劑如多元醇，例如甘油或山梨糖醇、染料和調(diào)味劑。在制備任何單元用藥量形式時(shí)使用的材料在使用量方面是基本無毒性的。含雜環(huán)化合物可以加入到緩釋制劑和組合中。
本文描述的含雜環(huán)化合物可以直接加入受治療者所吃的食物里，像添加劑，增補(bǔ)劑等。任何食物都適合于這個目的，盡管已經(jīng)用作營養(yǎng)增補(bǔ)或營養(yǎng)強(qiáng)化源的加工食物，例如面包、谷類食品、乳等，可能是比較方便用于這種目的的。
使用方法本發(fā)明還涉及受治療者的某些病癥以及各種活體外的治療方法。病癥包括例如小腸液虧損、百日咳、炭疽病和平滑肌收縮，這里更詳細(xì)地描述這些病癥。這些方法包括受治療者服用一種組合物，該組合物含有有雜環(huán)化合物，而受治療者有其中一種病癥正在發(fā)展或已發(fā)展的危險(xiǎn)。如本文使用的術(shù)語“受治療者”包括人，農(nóng)業(yè)上重要的動物如牛、豬、家禽、羊和馬以及其它動物(例如小鼠、老鼠、狗、貓和兔)，它們可以用作研究本文所述病癥的動物模型。
治療本文所述病癥可以是預(yù)防性的，或另外可以在本文所述病癥發(fā)展后開始治療。預(yù)防性治療，例如在受治療者表現(xiàn)出本文所述病癥的癥狀之前和/或在暴露于與本文所述一種病癥相關(guān)的病原體(即由其引起的)之前，這種治療在本文稱之有發(fā)展這種病癥危險(xiǎn)的受治療者的治療。因此，在本文所述病癥出現(xiàn)之前、期間或之后，可以服用組合物。在病癥發(fā)展后開始治療可以減輕其中一種病癥的癥狀嚴(yán)重性，或完全消除這些癥狀。特別適合于接受該組合物的治療者非限制性實(shí)例是接受抗生素治療的那些治療者，特別是中年以上的和非常年輕的治療者，優(yōu)選地與抗生素相關(guān)結(jié)腸炎的有關(guān)抗生素治療，那些旅行到引起小腸液虧損的病原體的地方(例如，可能感染Traveler腹瀉的那些地方)的治療者，以及受HIV感染的那些治療者。
患有本文所述病癥或有本文所述病癥發(fā)展危險(xiǎn)的受治療者服用的組合物包括有效量的含雜環(huán)化合物，優(yōu)選地，雜環(huán)衍生物，在某些具體實(shí)施方案中，聯(lián)苯-取代的雜環(huán)衍生物和/或前列腺素類似物。本文所使用的“有效量”是有效降低或防止(對于預(yù)防治療)受治療者與本文所述病癥相關(guān)的癥狀的量。
本發(fā)明的一個方面涉及治療受治療者小腸液虧損的方法。本文所使用的“小腸液虧損”系指各類腹瀉(即能形成大便的正常個體相比，糞便排瀉頻率和/或糞便排瀉的流動性增加)。小腸液虧損可能由例如從腸細(xì)胞到腸管腔的小腸液分泌(例如水和/或電解質(zhì))增加，從腸管腔吸收水和/或電解質(zhì)減少，和/或血液和粘液移動到腸管腔造成的。小腸液虧損通常與病原體存在相關(guān)，盡管具有高滲透壓性的食物可能引出過量分泌水和電解質(zhì)。這種情況與先天性腸炎疾病相反，這種疾病包括Crohn疾病和潰瘍性結(jié)腸炎。后一種慢性病與任何特別的感染因素?zé)o關(guān)，是由結(jié)腸和腸道其它部位的無法控制的炎癥所造成的。
引起小腸液虧損的病原體包括在腸管腔存在的病原體(例如霍亂弧菌)或在腸細(xì)胞存在的病原體(例如，志賀菌屬)，以及可能不是在腸管腔和腸細(xì)胞中的病原體(HIV)。病原體實(shí)例包括病毒、寄生蟲和細(xì)菌(例如參見Cotran等人《疾病的羅賓斯病理基礎(chǔ)》(RobbinsPathologic Basis of Disease)，第5版，W.B.Sanders Co.費(fèi)城，第328-335頁(1994))。由病原體引起的小腸液虧損在該技術(shù)領(lǐng)域中是指許多途徑，其中包括例如腹瀉、痢疾、Travelers腹瀉和腹瀉(scours)(在小牛中)。
與小腸液虧損相關(guān)的病毒包括腸的病毒(例如，輪狀病毒、腸的腺病毒和Norwalk-狀病毒)以及HIV。腸病毒典型地侵入和破壞中上絨毛的成熟宿主上皮細(xì)胞，這樣由于從腸管腔吸收鈉和水減少而引起小腸液虧損。HIV感染常常造成小腸液虧損。典型地，小腸液虧損與一種病原體存在相關(guān)，因免疫受到抑制，受治療者不能從腸道清除這種病原體。在受到HIV感染的受治療者體內(nèi)，與小腸液虧損相關(guān)的病原體包括隱孢子蟲屬、貝氏等孢子球蟲、沙門氏菌屬、大腸桿菌、空腸彎曲桿菌和志賀菌屬。與小腸液虧損相關(guān)的寄生蟲包括溶組織內(nèi)阿米巴、結(jié)腸內(nèi)阿米巴、隱孢子蟲屬和蘭伯賈第蟲。
與小腸液虧損相關(guān)的細(xì)菌包括空腸彎曲桿菌、耶爾森氏菌屬(其中包括小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌和假結(jié)核耶爾森氏菌)、志賀菌屬(其中包括志賀痢疾桿菌、弗氏志賀菌、波伊德志賀菌和宋內(nèi)志賀菌)、沙門氏菌屬(其中包括例如鼠傷寒沙門氏菌和腸炎沙門氏菌)、艱難梭狀芽孢桿菌、致腸病的大腸桿菌(EPEC)、enterohemmorhagic大腸桿菌(EHEC)、腸侵襲性大腸桿菌(EIEC)和腸產(chǎn)毒性大腸桿菌(ETEC)和霍亂弧菌。
與小腸液虧損相關(guān)的病原體可以分成兩組，一組為通過產(chǎn)生多肽造成小腸液虧損，而多肽可引起Gsα的ADP-核糖基化作用(在腸細(xì)胞中有49kDa多肽G蛋白質(zhì))，另一組造成小腸液虧損，但產(chǎn)生具有ADP-核糖基化作用活性的多肽。如本文使用的術(shù)語“多肽”，是指一種氨基酸聚合物，不是指特定長度的氨基酸聚合物。因此，例如，在多肽定義中包括術(shù)語肽、低聚肽、蛋白質(zhì)、酶和毒素?！安≡w多肽”是由病原體產(chǎn)生的多肽。如本文使用的術(shù)語“ADP-核糖基化作用”，是指二磷酸腺苷核糖(ADP核糖)與Gsα的氨基酸的共價(jià)加合物。催化這種加合物的多肽具有“ADP-核糖基化作用活性”。
產(chǎn)生具有ADP-核糖基化作用活性的多肽的病原體包括ETEC菌株，這些菌株產(chǎn)生對熱不穩(wěn)定的腸毒素和霍亂弧菌。該多肽在該技術(shù)領(lǐng)域中典型地稱之“腸毒素”。由霍亂弧菌產(chǎn)生的腸毒素常常稱之“霍亂毒素”。往病原菌生長的介質(zhì)里分泌具有ADP-核糖基化作用活性的病原體多肽。
可以通過在緩沖液存在下，分析ADP-核糖從尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸轉(zhuǎn)移到精氨酸氨基酸來測定多肽的ADP-核糖基化活性(例如參見Lai等人《Biochem.Biophys.Res.Commun.》，102，1021-1027(1981))。優(yōu)選地，ADP-核糖基化活性的待試驗(yàn)多肽的濃度是約1-10微摩爾。優(yōu)選地，該緩沖液含有約0.1摩爾4-(2-羥基乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸(HEPES)緩沖液，約pH7.0，約0-20％乙二醇，約0-50毫摩爾dithiohthreitol(DTE)，約300微克多精氨酸以及41.4毫摩爾含有約10微居里[14C]NAD+的NAD+。典型地，在約24℃培養(yǎng)該分析物約1-60分鐘?？杉尤肜涞?0％三氯乙酸(TCA)停止反應(yīng)，多精氨酸沉淀，接著在微纖維過濾器上用冷的10％TCA洗滌。用閃爍法測量結(jié)合的[14C]NAD+-核糖基化多精氨酸的放射性。在這種沉淀中的14C水平高于在負(fù)對照沉淀中的14C水平，表明多肽具有ADP-核糖基化作用活性。以每分鐘計(jì)數(shù)(cpm)的14C水平應(yīng)隨腸毒素而改變。典型分析表明，0.2微摩爾霍亂毒素有500cpm，而1.3微摩爾應(yīng)有14000cpm。使用分離的多肽或使用在培養(yǎng)物上清液中存在的多肽，都可以采用這種分析方法?！胺蛛x”的多肽是指從其自然環(huán)境獲得的或采用化學(xué)或酶方法合成的多肽?？梢允褂玫恼龑φ諛悠钒ū磉_(dá)霍亂毒素的霍亂弧菌培養(yǎng)上清液或表達(dá)腸毒素的大腸桿菌的培養(yǎng)上清液。
由細(xì)菌引起的另一類小腸液虧損在本技術(shù)領(lǐng)域中常常稱之與抗生素相關(guān)的結(jié)腸炎或假膜結(jié)腸炎。受治療者在接受廣譜抗生素治療后通常會出現(xiàn)這種情況，主要在急性或慢性小腸液虧損的成人上出現(xiàn)這種情況。未接受抗生素治療的受治療者，例如在外科手術(shù)后或除慢性虛弱疾病外，很少出現(xiàn)這種病癥(參見例如Cotran等人，《疾病的羅賓斯病理基礎(chǔ)》，第5版，W.B.Sanders Co.費(fèi)城，第795頁(1994))。與抗生素相關(guān)的結(jié)腸炎典型地是由殺艱梭狀芽孢桿菌(clostridiumdifficile)引起的，盡管其它的細(xì)菌也可以引起這種疾病。
在本發(fā)明的某些方面，當(dāng)小腸液虧損與具有ADP-核糖基化作用活性的病原體多肽無關(guān)聯(lián)(例如小腸液虧損與抗生素治療、受治療者年齡和/或例如被病毒、細(xì)菌、寄生蟲或其組合感染相關(guān))時(shí)，在組合物中有含雜環(huán)化合物是聯(lián)苯基雜環(huán)衍生物、前列腺素類似物或它們的組合。在本發(fā)明這個方面種可以使用的聯(lián)苯基雜環(huán)實(shí)例包括celecoxib，rofecoxib、SC-560和DuP-697。在本發(fā)明這個方面種可以使用的前列腺素類似物包括PGE2-組氨酸和PGE2-咪唑。任選地，除了這些雜環(huán)衍生物外，該組合物可以含有有效量的甲硝基羥乙唑(由Searly and Co.以商品名FLAGYL獲得)和/或有效量的消炎痛(從Merck & Co.以商品名INDOCIN獲得)。這兩者之中，硝基羥乙唑是優(yōu)選的。
在本發(fā)明另一個方面，當(dāng)小腸液虧損與具有ADP-核糖基化作用活性的病原體多肽相關(guān)(例如小腸液虧損與霍亂弧菌、ETEC或其組合相關(guān))時(shí)，在組合物中有含雜環(huán)化合物優(yōu)選地是未取代的雜環(huán)化合物(例如咪唑)、聯(lián)苯基雜環(huán)衍生物，前列腺素類似物或它們的組合。更優(yōu)選地，在組合物中有含雜環(huán)化合物可以是未取代的雜環(huán)化合物(例如咪唑)、聯(lián)苯基雜環(huán)衍生物、或它們的組合。在本發(fā)明這個方面種可以使用的聯(lián)苯基雜環(huán)實(shí)例包括rofecoxib、SC-560、DuP-697，在某些具體實(shí)施方案中，celecoxib。優(yōu)選地，對這種方法該組合物不含有celecoxib。在本發(fā)明這個方面種可以使用的前列腺素類似物實(shí)例包括PGE2-咪唑和PGE2-組氨酸。在這種方法中適用的組合物含有有效量的甲硝基羥乙唑和/或有效量的消炎痛。這兩者之中，硝基羥乙唑是優(yōu)選的。
本發(fā)明還涉及一種治療者中百日咳的治療方法。百日咳是一種由百日咳博代氏桿菌引起的呼吸道疾病。在接觸百日咳博代氏桿菌后，呼吸道細(xì)胞就增加了cAMP水平。該方法包括患百日咳或有百日咳發(fā)展危險(xiǎn)的受治療者服用含有有效量的含有雜環(huán)化合物的組合物。在該組合物中含雜環(huán)化合物優(yōu)選地是未取代的雜環(huán)化合物(例如咪唑)、聯(lián)苯基雜環(huán)衍生物、前列腺素衍生物或它們的組合。在該組合物中含雜環(huán)化合物更優(yōu)選地是聯(lián)苯基雜環(huán)衍生物、前列腺素衍生物或它們的組合。選擇性地，除了這些雜環(huán)衍生物外，該組合物可以含有有效量的甲硝基羥乙唑和/或有效量的消炎痛。這兩者之中，硝基羥乙唑是優(yōu)選的。
本發(fā)明的另一方面涉及治療者中炭疽病治療方法。炭疽病是一種由炭疽桿菌引起的常見致命疾病。一個在引起疾病中很重要的由炭疽桿菌表達(dá)的因子是浮腫因子，一種通過提高cAMP水平而引起組織浮腫的腺苷酸環(huán)化酶。這種方法包括患有炭疽病或有炭疽病發(fā)展危險(xiǎn)的受治療者，服用一種含有有效量的含有雜環(huán)化合物的組合物。在該組合物中含有雜環(huán)化合物優(yōu)選地是未取代的雜環(huán)化合物(例如咪唑)、聯(lián)苯基雜環(huán)衍生物、前列腺素衍生物或它們的組合。在該組合物中含雜環(huán)化合物更優(yōu)選地是聯(lián)苯基雜環(huán)衍生物、前列腺素衍生物或它們的組合。在該組合物中含雜環(huán)化合物更優(yōu)選地是聯(lián)苯基雜環(huán)衍生物、前列腺素衍生物或它們的組合。選擇性地，除了這些優(yōu)選的雜環(huán)衍生物外，該組合物可以含有有效量的甲硝基羥乙唑和/或消炎痛。這兩者之中，硝基羥乙唑是優(yōu)選的。
本發(fā)明提供在活體外或在活體內(nèi)抑制腺苷酸環(huán)化酶的方法。腺苷酸環(huán)化酶可以來自原核生物體或來自真核生物體。產(chǎn)生腺苷酸環(huán)化酶的原核生物體實(shí)例包括例如銅綠假單孢菌(它產(chǎn)生腺苷酸環(huán)化酶ExoY，在急性眼睛發(fā)病機(jī)理中起作用，例如參見Yahr等人《Proc.Natl.Acad.Sci.USA.》，95，13899-13904(1998))，百日咳博代氏桿菌(它產(chǎn)生腺苷酸環(huán)化酶CyaA，在百日咳中起作用，例如參見Ladant和Ullmann，《Trends Microbiol》，7，172-176(1999))，以及炭疽桿菌(它產(chǎn)生腺苷酸環(huán)化酶浮腫因子，并且在炭疽病中起作用，Leppla，《Adv.Cyclic.Nucl.Prot.Phosphor.Res.》17，189-198(1984))。如本文使用的術(shù)語“在活體外”是指無細(xì)胞系統(tǒng)，其中包括例如分離的腺苷酸環(huán)化酶或含有腺苷酸環(huán)化酶的細(xì)胞提取物。在活體外抑制腺苷酸環(huán)化酶的方法包括讓腺苷酸環(huán)化酶與含有一定量的含雜環(huán)化合物的組合物進(jìn)行接觸，而該化合物可有效抑制由三磷酸腺苷(ATP)產(chǎn)生3′，5′-一磷酸腺苷(cAMP)?？梢詮募?xì)胞中分離或采用化學(xué)或酶方法合成腺苷酸環(huán)化酶。這樣的在活體外的方法可以用于各種應(yīng)用，例如篩選具有抑制腺苷酸環(huán)化酶的活性的化合物。
如本文使用的術(shù)語“在活體內(nèi)”是指在受治療者體內(nèi)存在的細(xì)胞。術(shù)語“在活體內(nèi)”也包括從受治療者體內(nèi)取出的細(xì)胞，例如原細(xì)胞或細(xì)胞系，在扎結(jié)袢內(nèi)存在的細(xì)胞。這樣在活體內(nèi)的方法可以用于例如篩選和效力分析。扎結(jié)袢系指本技術(shù)領(lǐng)域已知的模型系統(tǒng)，這種系統(tǒng)可以用于分析由具有ADP-核糖基化作用活性的病原體多肽增加腺苷酸環(huán)化酶活性所引起的小腸液虧損。典型地，暴露出一部分鼠腸，并采用縫合方法分離這些片段?？梢酝渭尤肽芴岣吣c細(xì)胞腺苷酸環(huán)化酶活性的化合物，例如腸毒素，再可以測量在加入一定時(shí)間后在其片段積累的小腸液的量。除了加入例如腸毒素的化合物外，本發(fā)明的組合物也可以加入，再可以確定該抑制腺苷酸環(huán)化酶的能力。
抑制在活體內(nèi)腺苷酸環(huán)化酶的方法包括讓從受治療者取出的細(xì)胞或在受治療者體內(nèi)的細(xì)胞與一種組合物進(jìn)行接觸，該組合物含有一定量的可有效抑制從ATP產(chǎn)生cAMP的雜環(huán)衍生物。該細(xì)胞含有腺苷酸環(huán)化酶和具有ADP-核糖基化活性的病原體多肽。幾種病癥是與過量的腺苷酸環(huán)化酶活性相關(guān)的，并且包括例如在腹瀉疾病中的小腸液虧損，如百日咳中氣管或支氣管水腫，以及如在炭疽病中肺、胃腸道和散布的水腫。本文描述這樣的病癥。抑制腺苷酸環(huán)化酶的方法可以用于治療這樣的病癥。
在另一方面，抑制在活體內(nèi)腺苷酸環(huán)化酶的方法包括讓從受治療者取出的細(xì)胞或在受治療者體內(nèi)的細(xì)胞與一定量的可有效抑制從ATP產(chǎn)生cAMP的雜環(huán)衍生物進(jìn)行接觸。該細(xì)胞含有腺苷酸環(huán)化酶，不含有具有ADP-核糖基化活性的病原體多肽。
通過測量腺苷酸環(huán)化酶的活性，可以確定本發(fā)明含雜環(huán)化合物是否能抑制腺苷酸環(huán)化酶。這可以通過測量組織的cAMP和在結(jié)扎袢模型中得到分泌液的量進(jìn)行確定，這在實(shí)施例1描述了。通過活體外酶分析中由ATP產(chǎn)生cAMP也可以測量腺苷酸環(huán)化酶的活性。如本文使用的術(shù)語“抑制”是指防止、降低或倒轉(zhuǎn)分泌液的量，或生成cAMP。典型地，對ATP的α磷酸進(jìn)行放射性標(biāo)記，例如用32P標(biāo)記。這種分析可以在含有約20毫摩爾HEPES緩沖液(約pH7.4)，約4毫摩爾氯化鎂，約0.2毫克/毫升BSA，約1毫摩爾cAMP以及約1毫摩爾DTT的緩沖液進(jìn)行。該雜環(huán)衍生物和從市場獲得的腺苷酸環(huán)化酶(由百日咳博代氏桿菌或其它來源)加到緩沖液，讓其在37℃培養(yǎng)約20分鐘。分離cAMP，例如采用氧化鋁分離，測定放射性cAMP的量。
對于抑制腺苷酸環(huán)化酶的方法，該組合物中含雜環(huán)化合物優(yōu)選地是未取代的雜環(huán)化合物(例如咪唑)、聯(lián)苯基雜環(huán)衍生物、前列腺素類似物或它們的組合。更優(yōu)選地，在組合物中含雜環(huán)化合物可以是未取代的雜環(huán)化合物(例如咪唑)、聯(lián)苯基雜環(huán)衍生物、或它們的組合。在本發(fā)明這個方面種可以使用的聯(lián)苯基雜環(huán)實(shí)例包括rofecoxib、SC-560、DuP-697，在某些具體實(shí)施方案中，celecoxib。優(yōu)選地，抑制腺苷酸環(huán)化酶的方法含有celecoxib和DuP-697。在這種方法中使用的組合物可以含有有效量的甲硝基羥乙唑和/或有效量的消炎痛。這兩者之中，硝基羥乙唑是優(yōu)選的。
本發(fā)明還涉及平滑肌收縮的治療方法，其中包括例如在早產(chǎn)期間收縮子宮。該方法包括讓患有平滑肌收縮或有平滑肌收縮發(fā)展危險(xiǎn)的受治療者服用一種組合物，該組合物含有一定量的含雜環(huán)化合物，而這種化合物可有效抑制或控制早產(chǎn)，延長至基本上足月。在這種組合物中的含雜環(huán)化合物是聯(lián)苯基雜環(huán)衍生物、前列腺素類似物或它們的組合。
本發(fā)明還涉及改善由PGE2調(diào)節(jié)的炎癥反應(yīng)的方法。前列腺素，例如PGE2以及白細(xì)胞三烯(例如LTB4)是已知在炎癥期間產(chǎn)生的。在高水平的情況下，PGE2是原-炎癥的，因?yàn)樗碳ず铣蒊L-8，而在低水平的情況下，它可以是保護(hù)細(xì)胞的，因?yàn)樗哂写碳ぎa(chǎn)生細(xì)胞活素IL-10的能力。后者細(xì)胞活素(IL-10)可降低炎癥，而前者(IL-8)發(fā)出信號，讓多形核白細(xì)胞的中性白細(xì)胞(一類白細(xì)胞)浸潤到受侵襲的組織。由一種細(xì)胞，例如受損傷的細(xì)胞典型地產(chǎn)生PGE2，并且由這種細(xì)胞釋放出來，與第二個細(xì)胞上的受體相互作用。第二個細(xì)胞可以是白細(xì)胞，它的功能是釋放對微生物有毒的物質(zhì)。這些物質(zhì)包括活性氧物種(其中包括游離羥基、過氧化物陰離子和單態(tài)氧)、溶解蛋白酶和酸。對微生物有毒時(shí)，它們對于宿主自己的組織也是非常毒的。可預(yù)料本發(fā)明的前列腺素，優(yōu)選地PGE2-咪唑或PGE2-組氨酸，會與PGE2受體結(jié)合，并且抑制PGE2結(jié)合，以及可能其它的前列腺素?？蛇M(jìn)一步預(yù)料PGE2-咪唑或PGE2-組氨酸與PGE2受體結(jié)合不會引起在該受體含有的細(xì)胞中的反應(yīng)。通過改善由PGE2調(diào)節(jié)的炎癥反應(yīng)可以治療的病癥實(shí)例包括例如牛的大腸桿菌病和乳腺炎，胰腺炎，Barrett食道，胃食管回流疾病綜合癥(GERDS)和肝炎。
通過下述實(shí)施例說明本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)理解，要根據(jù)本文提出的本發(fā)明的保護(hù)范圍和實(shí)質(zhì)全面理解特別實(shí)施例，材料，量和方法步驟。
實(shí)施例實(shí)施例1通過與L-組氨酸的反應(yīng)降低霍亂毒素誘導(dǎo)的PGE2活性。
材料與方法試劑。從Sigma Chemical公司(密蘇里州，圣路易)購買霍亂毒素(CT)和L-組氨酸(HCI)。在用0.2微米(μm)過濾器滅菌之前，用氯化鈉調(diào)節(jié)到300毫滲透壓摩爾(mosmol)來新制備注射用175毫摩爾(Mm)1-組氨酸(pH7.0)溶液。咪唑、1-甲基-L-組氨酸和3-甲基-L-組氨酸是從Sigma Chemical公司(密蘇里州，圣路易)購買的，U-[15N]-咪唑是從劍橋同位素實(shí)驗(yàn)室(安杜佛，馬薩諸塞州)獲得。磷酸鹽緩沖鹽溶液(PBS)是用137毫摩爾NaCl、2.7毫摩爾KCl、1.2毫摩爾CaCl2·2H2O、0.49毫摩爾MgCl2·6H2O、8.1毫摩爾Na2HPO4和1.47毫摩爾KH2PO4(pH7.4)制得。
鼠腸袢分析。雌成鼠Swiss-Webster鼠(鼠齡6-8星期)從TaconicFarm公司(germantown，紐約)購買，裝在德克薩斯州，加爾維斯敦，UTMB處的特別無病原體的動物設(shè)備中。在外科手術(shù)之前，給鼠喂水，不喂食物18小時(shí)，以減少小腸食物量。在三氟溴氯乙烷麻醉下，切開腹中線，露出小腸。在每支鼠中構(gòu)造用“00”縫合絲線結(jié)扎的單根5厘米小腸段。在觀察6小時(shí)后，通過子宮頸離位使這些動物無痛致死，再取出腸袢。測量腔流體的量，并以每厘米微升(μl/cm)表示。注入1微克(μg)CT，其中有或沒有175毫摩爾L-組氨酸在100微升PBS中的溶液，完成腸激發(fā)，接著在激發(fā)時(shí)腹膜內(nèi)注射(100微升)175毫摩爾L-組氨酸，此后每2小時(shí)，直到在6小時(shí)結(jié)束試驗(yàn)。在另外試驗(yàn)中，改變L-組氨酸劑量，與在激發(fā)時(shí)與其后在不同的時(shí)間，采用腔或腹膜內(nèi)方法用藥。流體積累與細(xì)胞培養(yǎng)數(shù)據(jù)(見下面)，獨(dú)立樣品采用兩-端Student T檢驗(yàn)，或采用Dunnett′s Multiple GroupComparison檢驗(yàn)進(jìn)行分析(Epistat Services，理查森，德克薩斯州)。
細(xì)胞培養(yǎng)液分析。使用cAMP ELISA測量了在中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞中L-組氨酸對PRG2刺激腺苷酸環(huán)化酶活性的抑制作用。在35毫米盤中平鋪CHO細(xì)胞(4×105)，該盤所在的Ham′s F12介質(zhì)含有10％胎牛血清(FBS)。在有5％CO2氣氛下于37℃培養(yǎng)過夜后，用2毫升有或沒有L-組氨酸(4.7毫摩爾)的介質(zhì)覆蓋已附著的細(xì)胞。在指定濃度下用CT刺激所有細(xì)胞6小時(shí)。
離子傳輸研究。在配置平滑的非洲爪蟾表皮的Ussing室中，由短路電流估算L-組氨酸對對PRG2刺激的鈉傳輸?shù)囊种谱饔?。Ussing室可以用于分析PEG2-咪唑、PEG2-組氨酸、L-組氨酸和其它化合物對Cl-傳輸通過上皮細(xì)胞的影響，或用于分析安裝在Ussing室單元中生長在透明膜插入物上的極化腸上皮細(xì)胞融合單層。組織或細(xì)胞可以用不同濃度(10-1000納克/毫升)細(xì)菌毒素刺激，這些細(xì)菌毒素包括CT、大腸桿菌STa、大腸桿菌STb或大腸桿菌LTs(I和II)。選擇了這些蛋白質(zhì)毒素，因?yàn)槟承┰黾觕AMP水平(例如CT和LTs)，而另一些增加cGMP水平(STa)。在這些研究中，在補(bǔ)充10％胎牛血清、L-谷氨酰胺和青霉素/鏈霉素的DMEM中，在5％CO2氣氛下于37℃培養(yǎng)細(xì)胞。按照0.5×106細(xì)胞/毫升密度接種細(xì)胞，并在1厘米2PET徑跡蝕刻的、透明的、0.4毫米膜插入物上生長(Falcon)。如用伏特-歐姆表測量的電阻達(dá)到200Wcm2時(shí)，可達(dá)到單層融合(EVOM，World PrecisionInstruments)。另外，上皮組織可以拉伸通過該膜，并直接用于分析Cl-離子傳輸。裝有上皮細(xì)胞或細(xì)胞融合單層的過濾器放進(jìn)Ussing室中(World Precision Instruments)，如Beltinger等人所描述的(《Amer.J.Physiol》，276，C848-C855(1999))，并且在刺激前，讓單層平衡30分鐘。在有或沒有PEG2-組氨酸(5毫克/毫升)或CT+PEG2-咪唑(5毫克/毫升)的情況下，使用含有CT(10-1000毫克/毫升)或其它腸毒素(STa，STb和LTs)的介質(zhì)培養(yǎng)單層。對照只含有介質(zhì)和含有PEG2-組氨酸、PEG2-咪唑或其它抑制藥物的介質(zhì)。使用雙電壓夾鉗(World Precision Instruments)，測量基部短路電流(SCC毫安/厘米2)和電阻(Wcm2)。刺激腸毒素和PEG2加合物加到基底外側(cè)和頂上表面，測量SSC的變化。
PEG2(Sigma Chemical公司)稀釋達(dá)到濃度1微摩爾，在加到室之前在37℃與10毫摩爾L-組氨酸一起培養(yǎng)30分鐘。短路電流Isc降低是L-組氨酸改變PEG2生物學(xué)活性的指示。在Ussing室研究中使用的主要溶液是由90毫摩爾NaCl、2.5毫摩爾KCl、1.0毫摩爾MgCl2、0.5毫摩爾NaH2PO4、1.8毫摩爾CaCl2和10.0毫摩爾Hepes組成的NaCl林格溶液。使用四甲基-氯化銨(TMA-Cl)林格溶液，其中用90毫摩爾TMA-Cl代替NaCl，KCl、CaCl2和Hepes保持如NaCl林格同樣的濃度。使用與NaCl林格同樣的組分和濃度，只是NaCl濃度降低到85毫摩爾，制備10毫摩爾L-組氨酸。20微升PGE2溶于水中的的溶液加入NaCl林格或L-組氨酸溶液，達(dá)到所希望濃度1微摩爾，這樣制得PGE2溶液。這些溶液中每種溶液滴定到pH7.6，摩爾滲透壓濃度為205-220mosmol/ml。
環(huán)AMP分析。從培養(yǎng)液上清液提取3′，5′-一磷酸腺苷(cAMP)，采用以前描述的輻射測量蛋白質(zhì)激酶-結(jié)合分析進(jìn)行定量(Peterson等人《Toxicon》，21，761-775(1983))，或采用輻射測量cAMP結(jié)合分析分析上清液(Peterson等人《Toxicon》，21，761-775(1983))，或采用生產(chǎn)者建議的方法的ELISA(Biomedical Technologies公司，斯托頓，馬薩諸塞，目錄號BT-730)。ELISA是以cAMP和cAMP的堿性磷酸鹽衍生物對有限量抗體的競爭性結(jié)合為基的。與抗體結(jié)合的酶-標(biāo)記的cAMP量隨cAMP濃度增加而降低。
PGE2與咪唑的反應(yīng)。把U-[15N]-咪唑加到反應(yīng)化合物，有利于采用質(zhì)譜和NMR進(jìn)行PGE2與咪唑的結(jié)構(gòu)分析，該反應(yīng)混合物在37℃培養(yǎng)不同的時(shí)限，直到24小時(shí)。使用2.5微居里[5，6，8，11，12，14，153H]-PGE2代替PGE2進(jìn)行了一些反應(yīng)(Amersham Radiolabled Chemicals，圣路易斯，密蘇里州)。5毫摩爾PGE2(Sigma Chemical公司)與58毫摩爾咪唑或U-[15N]-咪唑合并制備出反應(yīng)混合物。為了使pH保持在7.4，反應(yīng)混合物含有濃縮的(3.3x)PBS(457毫摩爾NaCl、9毫摩爾KCl、4毫摩爾CaCl2·2H2O、1.6毫摩爾MgCl2·6H2O、27毫摩爾NaH2PO4和4.9毫摩爾KH2PO4)。這種反應(yīng)沒有任何PBS是實(shí)質(zhì)性的，因?yàn)楫?dāng)用0.01N NaOH將水溶液手工調(diào)節(jié)到中性pH，并采用質(zhì)譜分析24小時(shí)-粗制反應(yīng)混合物時(shí)，在37℃出現(xiàn)生成加合物。
反相色譜。采用在C18(Serva，帕拉母斯，新澤西州)柱(4.6×250毫米)上反相色譜分離PGE2和L-組氨酸/咪唑共價(jià)加合物，所述柱用26％乙腈在0.1％TEA中的溶液，以1.5毫升/分流動進(jìn)行平衡。在190nm處柱洗脫液中檢測出PGE2和L-組氨酸(或咪唑)共價(jià)加合物，選擇的餾分(1.5毫升)在真空下干燥。采用質(zhì)譜法(MS)和核磁共振(NMR)光譜法表征新生成衍生物的分子結(jié)構(gòu)。
NMR光譜學(xué)。HPLC純化樣品匯集起來溶于750微升100％的D2O(劍橋同位素公司)中，再在20℃下分析。采用2D-自動相關(guān)(COSY)和2D-總相關(guān)(TOCSY；80毫秒混合時(shí)間)光譜提供PGE2-咪唑-加合物所有氫的光譜查定(Bax和Davis，《J.Magn.Reson》，65，355-360(1985)；Aue等人《化學(xué)物理雜志》(J.Chem.Phys.)，64，2229-2246(1976)以及Bax和Summers《美國化學(xué)學(xué)會雜志》，(J.Am.Chem.Soc.)108，2093-2094(1986))。采用15N-1H反相檢測2D-異核多重鍵相關(guān)光譜測定咪唑與PGE2共價(jià)結(jié)合位置。所有光譜都收集在有外參考HDO(4.70ppm)的Varian Unity-Plus 600MHz光譜儀上。
質(zhì)譜。用VG Analystical ZAB-2SE高-場質(zhì)譜儀進(jìn)行正離子快原子轟擊-質(zhì)譜法(FAB-MS)。使用銫離子槍轟擊樣品，該樣品在甘油/硫代甘油(以體積/體積計(jì)，1∶1)基體中進(jìn)行分析。使用VG Bio-Q(QuattroII以上)四極質(zhì)譜儀進(jìn)行電噴霧離子化-MS。樣品以10微升/分流速注入乙腈∶水(以體積/體積計(jì)，1∶1)的溶劑中，該溶劑含有0.1％三氟醋酸。以氬氣作為碰撞氣體，使用碰撞-活化離解法，由單電荷母離子產(chǎn)生子離子譜。
使用甲醇∶HCl(以體積/體積計(jì)，3∶1)或d3甲醇∶HCl(以體積/體積計(jì)，3∶1)反應(yīng)劑進(jìn)行甲基酯化。在把該反應(yīng)劑加到凍干的多份樣品之后，在室溫下進(jìn)行反應(yīng)10分鐘，最后在氮?dú)庀赂稍?。使用由三氟醋酸酐∶醋?以體積/體積計(jì)，2∶1)構(gòu)成的反應(yīng)劑，對凍干的多份樣品進(jìn)行乙?；??；旌虾螅谑覝叵逻M(jìn)行反應(yīng)10分鐘，最后在氮?dú)庀赂稍铩?br> 結(jié)果L-組氨酸降低小場液在用霍亂毒素激發(fā)的鼠腸袢中的積累。圖1總結(jié)了對照鼠與服用L-組氨酸的CT激發(fā)鼠的小場液積累反應(yīng)。在這個實(shí)驗(yàn)中，讓鼠服用不同劑量的L-組氨酸在六小時(shí)觀察期，在激發(fā)時(shí)間通過腔注入100微升175、44或11毫摩爾L-組氨酸，接著在0、2和4小時(shí)三次100微升腹膜內(nèi)注入175、44或11毫摩爾L-組氨酸。6小時(shí)后結(jié)束實(shí)驗(yàn)。由于鼠接受4次注射，每支鼠的總L-組氨酸劑量是14.8、3.7和0.93毫克(592、148和39.7毫克/千克)。這些結(jié)果表明，隨著L-組氨酸劑量增加，小腸液積累量降低。但是，只是在試驗(yàn)的最高L-組氨酸劑量(14.8毫克)觀察到統(tǒng)計(jì)的顯著性差異(P＜0.05)。
L-組氨酸對PGE2-誘導(dǎo)的鈉傳輸?shù)挠绊憽-組氨酸可以降低CT-誘導(dǎo)小腸液在鼠腸袢中積累的一個可能機(jī)制可能是L-組氨酸與PGE2進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)的能力，從而降低其生物學(xué)活性。在活體外，L-組氨酸降低安裝在改進(jìn)Ussing室中的平滑的非洲爪蟾表皮中的鈉傳輸和PGE2-誘導(dǎo)的鈉傳輸(圖2)。PGE2(1微摩爾)增加由穩(wěn)態(tài)Na+決定的電流(Isc)達(dá)14％(最大的PGE2-誘導(dǎo)的Isc變化是18±3％，n＝5，P＜0.01)，1微摩爾PGE2加10毫摩爾L-組氨酸使Isc降低到對照的30±9％(n＝5，P＜0.025)。由這些數(shù)據(jù)可以認(rèn)為，PGE2和L-組氨酸之間的相互作用可能降低PGE2對離子傳輸?shù)拇碳ばЧ?br> PGE2-咪唑-組氨酸加合物的分離。PGE2-咪唑或組氨酸一起在活體外在氮?dú)庀屡囵B(yǎng)(pH7.4，37℃，24小時(shí))導(dǎo)致生成PGE2-咪唑或PGE2-組氨酸共價(jià)加合物。如PGE2-咪唑共價(jià)加合物所說明的(圖3A)，采用C18反相色譜法分離這些加合物。使用C18反相色譜柱，使用在0.1％TFA中的26％的乙腈溶液洗脫，得到色譜圖。因?yàn)檫溥虻挠H水性，在柱的空白體積洗脫咪唑。相反地，在21分鐘洗脫P(yáng)GE2-，而分別在約44和46分鐘洗脫P(yáng)GA2和PGB2。在37℃，pH7.0，培養(yǎng)24小時(shí)的PGE2和咪唑混合物進(jìn)行色譜分離時(shí)，在約10和12分鐘出現(xiàn)兩個新峰。L-組氨酸反應(yīng)混合物(37℃，pH7.0，24小時(shí))得到類似的圖案，只是PGE2-組氨酸峰在8和9分鐘洗脫出來。峰I和II的干餾分含有PGE2-咪唑加合物，它們再進(jìn)行色譜分離，可洗脫出可與圖3A峰II比較的單峰。含有[3H]-PGE2和咪唑的反應(yīng)混合物的色譜(圖3B)，也得到與峰II(圖3A)相符的單峰，該混合物含有極少量的磷酸鹽緩沖液。使用與板A同樣的柱和同樣的條件得到色譜圖。觀察到與峰II(板A)相同的單放射性峰。板A PGE2-咪唑峰I或II的再色譜分離，以與[3H]-PGE2-咪唑洗脫相符的單峰洗脫。觀察到PGE2-組氨酸共價(jià)加合物的真正相同色譜圖，只是在稍微更早的時(shí)間(8和9分鐘)洗脫兩個PGE2-組氨酸峰。
質(zhì)譜法揭示，含有PGE2-組氨酸的兩個HPLC峰的分子量是489Da，而每個PGE2-咪唑峰的分子量是403Da。在對照實(shí)驗(yàn)中，生成加合物不需要低pH的HPLC緩沖液，因?yàn)槲醇兓拇种芇GE2和咪唑混合物(37℃，pH7.0，24小時(shí))的質(zhì)譜分析揭示了存在加合物。同樣地，我們觀察到咪唑與PGA2和PGB2反應(yīng)，它們在結(jié)構(gòu)上與PGE2相似，但在第11個碳上缺少-OH基團(tuán)(見圖10A和10B)。采用ESI-MS得到的PGA2-咪唑和PGB2-咪唑加合物質(zhì)量與PGE2-咪唑共價(jià)加合物質(zhì)量(403Da)相同。
通過用甲基阻斷L-組氨酸咪唑環(huán)中的π或τ氮原子，確定與PGE2的C11反應(yīng)的在L-組氨酸咪唑環(huán)中兩個氮原子。制備了含有1-甲基-L-組氨酸或3-甲基--L-組氨酸的PGE2混合物，并進(jìn)行了色譜分離。使用1-甲基-L-組氨酸時(shí)檢測了加合物，因?yàn)榕cC11共價(jià)結(jié)合獲得了τ氮原子。相反地，τ氮原子被3-甲基--L-組氨酸的甲基保護(hù)，不能生成任何加合物。因此，L-組氨酸的τ氮原子對于與PGE2的C11共加鍵合是很重要的。
L-組氨酸/咪唑?qū)T-誘導(dǎo)的cAMP生成的影響。采用競爭性結(jié)合cAMP的放射性測量，L-組氨酸降低了PGE2和CT刺激在活體外CHO細(xì)胞中cAMP生成的能力(圖4)。這些結(jié)果表明如圖6中分離的純化PGE2-咪唑加合物對CT-刺激CHO細(xì)胞中cAMP水平的影響。往CT刺激的CHO細(xì)胞培養(yǎng)物加入純化PGE2-咪唑加合物可造成顯著抑制CT誘導(dǎo)的cAMP生成(P＜0.05)。濃度0.5微克/毫升在6小時(shí)培養(yǎng)期降低cAMP水平達(dá)約50％。
PGE2-咪唑加合物可降低CT誘導(dǎo)的小腸液的積累。考慮到純化PGE2-咪唑能抑制CT-刺激CHO細(xì)胞中cAMP生成(圖4)，試驗(yàn)了這種加合物阻斷CT-誘導(dǎo)的小腸液在鼠腸袢中積累的能力。圖5表明緩慢加入腸腔的劑量低到100微克的PGE2-咪唑顯著地降低CT-誘導(dǎo)的小腸液積累。在6小時(shí)觀察期間，劑量200微克完全阻斷小腸液虧損，接著CT激發(fā)。PGE2-咪唑處理可明顯降低在腸袢小腸液中的cAMP水平(圖5B)，并且與小腸液積累減少相一致。
PGE2-組氨酸加合物的生成速率。通過測量C18反相色譜的190nm主要吸收峰下相對面積(約10-12分)確定加合物的生成速率(圖3A)。確定了反應(yīng)混合物的pH6.5或更高時(shí)，PGE2-組氨酸加合物生成量最大。PGE2與組氨酸之間生成(峰II)的加合物的量是與培養(yǎng)時(shí)間相關(guān)的，其中T1/2等于約10小時(shí)(圖6)。PGE2曲線向下傾斜表明反應(yīng)中消耗PGE2，而加合物曲線顯示向上傾斜，它的生成增加。PGA2曲線表明在反應(yīng)期間由于PGE2或加合物降解而生成PGA2。PGE2-咪唑生成動力學(xué)與PGE2-組氨酸非常類似。
PGE2-咪唑加合物的穩(wěn)定性。如圖3A所描述的，采用C18反相色譜分離純化的PGE2-咪唑加合物(峰II)，并凍干儲存。接著，20微克等分樣品稀釋在水(200微克/毫升)中，在37℃、pH5.5下培養(yǎng)指定時(shí)間。樣品進(jìn)再行色譜分離，并對每個峰下面積進(jìn)行積分。該加合物出現(xiàn)穩(wěn)定約12小時(shí)，此后到24小時(shí)有一些很明顯的降低，在1星期內(nèi)僅僅留下10％(圖7)。加合物降解時(shí)，PGA2峰(44分)濃度增加，含有咪唑的空體積峰變得更大。除了PGA2外，出現(xiàn)了第二個很小的峰，它比PGE2-咪唑峰早1-2分鐘。這個峰與在PGE2和咪唑粗制反應(yīng)混合物最初色譜期間觀察的PGE2-咪唑加合物峰(圖3A)類似。色譜前用PBS中和加合物可促進(jìn)從PGE2-咪唑加合物快速除去咪唑基團(tuán)，完全轉(zhuǎn)化需12-24小時(shí)。在4℃下儲存時(shí)含有加合物的部分逐漸變壞，但是在N2下儲存凍干加合物制劑在-70℃是穩(wěn)定的。
PGE2-咪唑加合物的質(zhì)譜分析。從HPLC峰(圖3A-峰I或峰II)分離的PGE2-咪唑加合物快速原子轟擊質(zhì)譜(FAB-MS)分析顯示了在m/z403處強(qiáng)(M+H)+假分子離子。采用電噴霧離子化光譜(ESI-MS)得到類似的結(jié)果。分析U-[15N]-咪唑產(chǎn)物證實(shí)了加合物中存在單咪唑部分，這種產(chǎn)物給出了在m/z405處強(qiáng)假分子離子。PGE2-咪唑加合物成功酯化表明存在游離羧酸。這可通過產(chǎn)物的FAB-MS譜予以證實(shí)，該譜表明在m/z419(甲醇)和m/z422(d3-甲醇)處(M+H)+假分子離子。采用ESI-MS分析乙?；雍衔?U-[15N]-標(biāo)記的)表明在m/z489處(M+H)+與兩個乙?；鶊F(tuán)的反應(yīng)相一致。
還進(jìn)行過PGE2-咪唑加合物和許多衍生物的碰撞-誘導(dǎo)離解(CID)(Zirrolli等人，《J.Am.Soc.Mass Spectrom.》，1，325-335(1990))。得到的PGE2-咪唑加合物譜列于圖8A。在m/z69和95處主要子離子可以指定是咪唑部分碎裂，這可以用U-[15N]-標(biāo)記的加合物的相應(yīng)子離子譜加以證實(shí)，該譜表明在m/z71和m/z97處類似強(qiáng)子離子(圖8B)。在U-[15N]-加合物譜中保留的在m/z263的信號是與有關(guān)碎裂機(jī)制是一致的，該機(jī)制涉及除去咪唑和在C15劈裂?？烧J(rèn)為在m.z385的信號為從分子離子除去水，然而在m/z100-200之間的低強(qiáng)度離子是與沿亞甲基鏈裂解相一致的。圖8B說明了酯化PGE2-咪唑加合物的ESI-MS/MS子離子譜，支持已經(jīng)給出的離子指定。
采用NMR導(dǎo)出PGE2-咪唑加合物的結(jié)構(gòu)。由NMR分析和質(zhì)譜的碎裂過程圖形可導(dǎo)出有關(guān)PGE2-咪唑化學(xué)結(jié)構(gòu)的特別信息。PGE2-咪唑加合物的1D1H NMR譜(峰II)示于圖9A。通過2D COSY和TOCSY譜的分析完成了1H信號的指定(圖9B)。在獲得2D NMR譜的過程中，因出現(xiàn)幾個新峰而注意到樣品有一些降解。這些指定是簡單明了的，在TOCSY譜中交叉的峰與許多偶合質(zhì)子相關(guān)。因此，可看到H-13(5.55ppm)到H-14、H-15和H-12(為了交叉峰的出現(xiàn)；參見圖10，鑒定質(zhì)子)的TOCSY相關(guān)性。H-5(5.45ppm)表明與H-7、H-2、H-4和H-3的相關(guān)性。H-14(5.45ppm)是與H-13、H-15和H-12相關(guān)的。H-6(5.32ppm)是與H-5、H-7、H-2和H-4相關(guān)的。H-11(4.84ppm)表明在二維F-2上與H-10、H-12、H-8和H-7相關(guān)(水預(yù)飽和使斜峰和在F1二維中的相關(guān)性變得不清晰)。H-15(4.03ppm)與H-13、H-14、H-15、H-16、H-16′、H-17和H-17′相關(guān)。H-10(3.07ppm)與H-11、H-12、H-8和H-17相關(guān)。連續(xù)的高磁場，H-12、H-8、H-7、H-2、H-4和H-3顯示預(yù)期的交叉峰。最后，H-19(1.16ppm)、H-18(1.08ppm)和H-20(0.76ppm)以及H-15和H-16顯示出彼此相關(guān)，因此完成前列腺素加合物質(zhì)子的順序連接性。通過COSY和TOCSY譜以及U-15N-標(biāo)記的咪唑PGE2-咪唑加合物樣品的15N/1H HMBC譜指定低磁場咪唑環(huán)質(zhì)子(圖9C)。后一譜把15N/1H偶合咪唑氮與咪唑質(zhì)子H-2、H-4和H-5以及兩個前列腺素質(zhì)子關(guān)聯(lián)起來。因此，咪唑的N-1(5.02ppm)顯示出與咪唑H-2(8.81ppm)、H-4(7.46ppm)和H-5(7.62ppm)以及前列腺素質(zhì)子H-12(2.90ppm)和H-10′(2.79ppm)相關(guān)?？上?，或者因?yàn)榕己闲?，或者因?yàn)樽罱咏麳DO共振，部分信號飽和，只是觀察到H-11質(zhì)子很小的暫時(shí)確定的交叉峰。H-10和H-12的相關(guān)性(強(qiáng)三-鍵偶合)證實(shí)咪唑環(huán)與前列腺素骨架共價(jià)連接的位點(diǎn)。另外，發(fā)現(xiàn)H-11(+0.74ppm；+值表示加合物低磁場位移)，H-10′，H-10′(+0.65和+0.35ppm)，H-12(+0.47ppm)，H-8(+0.27ppm)和H-14(-0.19ppm)在與游離PGE2加合物相關(guān)的加合物中顯著的化學(xué)位移擾動。
討論用CT激發(fā)并施用L-組氨酸的鼠腸袢積累小腸液顯著低于相應(yīng)CT激發(fā)對照鼠(圖1)。一般地，觀察的L-組氨酸劑量，以最大保護(hù)免受CT-誘導(dǎo)小腸液積累的鼠腸袢是相當(dāng)大的(592毫克/千克)，甚至在毒素激發(fā)的同時(shí)開始治療也是如此。
PGE2和咪唑或L-組氨酸反應(yīng)混合物的C18反相色譜揭示了在約10-12分的相鄰峰(圖3A)。峰I可能是加合物的不穩(wěn)定異構(gòu)體，因?yàn)榉錓餾分干燥后，其材料用同樣柱再進(jìn)行色譜分離，只是得到峰II。在相鄰峰中含有的加合物(異構(gòu)體)質(zhì)量經(jīng)測定是PGE2-咪唑403Da和PGE2-組氨酸489Da。由洗脫[3H]-PGE2-咪唑?yàn)轭愃朴诜錓I(圖3A)的單峰(圖3B)，提供了進(jìn)一步的證據(jù)。通過在37℃，pH5.5水中培養(yǎng)不同時(shí)間，研究了純化PGE2-咪唑加合物(峰II)的穩(wěn)定性。在這些條件下，純化PGE2-咪唑加合物的半壽命是約2.5天。隨著PGE2-咪唑加合物變壞，除去了咪唑基團(tuán)，導(dǎo)致出現(xiàn)PGA2?？阵w積峰含有釋放的咪唑，盡管注意到少量的峰I加合物。
證明L-組氨酸與PGE2進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)(圖3)，我們認(rèn)為L-組氨酸抑制PGE2在用CT激發(fā)的鼠腸袢中起作用的可能性。曾證明，純化PGE2-咪唑加合物可降低在用CT刺激的CHO細(xì)胞培養(yǎng)上清液中cAMP水平(圖4)。曾猜測L-組氨酸以及PGE2-咪唑加合物會干擾在CT-處理的細(xì)胞中PGE2的活性。采用PGE2-特別放射性免疫檢測測量在活體內(nèi)或在活體外PGE2的減少是不可能的，因?yàn)镻GE2-組氨酸(或咪唑)加合物顯示出與抗體同樣好地同PGE2反應(yīng)。部分地，L-組氨酸可以用作PGE2-失活化合物，這就為PGE2在小腸中在CT-誘導(dǎo)分泌水和電解質(zhì)時(shí)的作用提供附加的支持。另外，PGE2-組氨酸共價(jià)加合物可以用作抑制PGE2刺激腺苷酸環(huán)化酶的有影響的化合物。的確，純化的PGE2-咪唑加合物抑制CT-誘導(dǎo)的小腸液在鼠腸袢中的積累(圖5A)。在這種情況下，咪唑部分可能使PGE2在離子傳輸時(shí)的自然刺激作用失活，但PGE2-加合物與PGE2的結(jié)構(gòu)類似性是可能的，這種結(jié)構(gòu)類似性能使它干擾CT-誘導(dǎo)的PGE2的作用和小腸液積累。其它PGE2類似物(例如PGA2和PGB2)也以較低效力降低在鼠腸袢中積累CT-誘導(dǎo)的小腸液。
試驗(yàn)了另一種有效的親核試劑，N-乙酰基-L-半胱氨酸(NAC)，以測定它是否抑制分泌CT-誘導(dǎo)的小腸液。按照劑量238毫摩爾(100微升)，在6小時(shí)內(nèi)每小時(shí)注入I.P.，NAC(pH7.0)對于鼠阻止在小腸袢中分泌CT-誘導(dǎo)小腸液是沒有任何保護(hù)作用的。往腸腔注入NAC和CT混合物(pH沒有預(yù)先調(diào)節(jié)到7.0)阻斷了所有腸液積累。NAC對離子傳輸?shù)淖饔每赡茉从贜AC溶液的低pH。結(jié)論是NAC可能損害CT蛋白質(zhì)毒素，或降低小腸上皮細(xì)胞的生存能力。
NMR結(jié)果確定了，咪唑環(huán)在C11與PGE2共價(jià)連接，事實(shí)上，在這個碳上取代羥基(圖解I)。PGE2-組氨酸得到類似的數(shù)據(jù)。另外，使用L-組氨酸的甲基化衍生物，確定了離碳鏈最遠(yuǎn)的τ氮原子與PGE2的C11進(jìn)行反應(yīng)。這種化學(xué)轉(zhuǎn)化最合理的解釋是PGE2開始脫水(可能地通過咪唑基團(tuán)的一般酸/堿催化)得到PGA2或PGB2(圖10A)。往這種α，β-未飽和酮中添加Facile Michael-咪唑會得到11-脫氧-11-咪唑基-PGE2(PGA2)。如由pH依賴于生成這種加合物所表明的，這是通過咪唑的堿形式出現(xiàn)的。在附加實(shí)驗(yàn)中，實(shí)質(zhì)上如本文所描述的，使用用PGA2和PGB2取代PGE2的咪唑制備反應(yīng)混合物。我們觀察到所有三種二十碳酸酐與咪唑生成共價(jià)加合物，每種都精確地具有相同的質(zhì)量(403Da)。這些結(jié)果支持了圖10A中示出的結(jié)果順序。
前列腺素是反應(yīng)性很強(qiáng)的物質(zhì)，很容易脫水。的確，曾證明白蛋白可以催化相關(guān)PGD2前列腺素的類似脫水反應(yīng)。PGE2也脫水。在前列腺素中特別共同的雙鍵異構(gòu)化，并且可能的是開始的11-脫氧-Δ10-PGE2也可以重排成比較完全的共軛PGB2。在HPLC曲線中觀察到的峰II(圖3A)或者是11-脫氧-11-咪唑基-PGE2產(chǎn)物的另一個異構(gòu)體，或者是咪唑與PGB2的C-12加合生成的12-脫氧-12-咪唑基-PGB2(圖10B)是特別可能的。因此，值得注意的是，PGB2與咪唑生成加合物，其分子量與11-脫氧-11-咪唑基-PGE2的相同(圖10B)。PGB2加合物譜確定了，該加合物在結(jié)構(gòu)上與由PGE2生成的加合物類似。因此，這樣支持了咪唑-催化脫水或堿催化脫水(或兩者)可以解釋PGE2與咪唑之間反應(yīng)的觀點(diǎn)。
前面已指出，白蛋白可以與各種前列脲素共價(jià)結(jié)合，例如15-酮-13，14-二氫-PGE2，以及一種可能的機(jī)制是在C-11通過親核加到α，β-未飽和酮脫水產(chǎn)物上。詳細(xì)是NMR結(jié)構(gòu)分析說明11-脫氧-11-咪唑基-PGE2證實(shí)了這樣一種轉(zhuǎn)化的確是特別可能的。容易加入咪唑以及組氨酸的咪唑環(huán)，可強(qiáng)烈地認(rèn)為組氨酸可以是負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)與PGE2共價(jià)連接的一種殘基。這樣增加了前列腺素可能以共價(jià)方式通過組氨酸的咪唑環(huán)改變蛋白質(zhì)，從而改變蛋白質(zhì)或二十碳酸酐活性的可能性。
實(shí)施例2聯(lián)苯雜環(huán)抑制小腸液虧損鼠腸袢的分析雌性成年鼠Swiss-Webster鼠(25-30克)從Taconic Farm公司(Germantown，紐約)購買，裝在德克薩斯州，加爾維斯敦，UTMB處的特別無病原體的動物設(shè)備中。在外科手術(shù)之前，給鼠喂水，不喂食物18小時(shí)，以減少小腸食物量。在醚麻醉下，切開腹中線，露出小腸。用“00”縫合絲線結(jié)扎的單根5厘米小腸段，注入在100微升中1微克霍亂毒素。在觀察6小時(shí)后，通過子宮頸離位使這些動物無痛致死，再取出腸袢。測量腔流體的量，并以每厘米微升(μl/cm)表示，同時(shí)為光學(xué)顯微鏡或電子顯微鏡準(zhǔn)備組織。在某些實(shí)驗(yàn)中，注入100微克(μg)CT，接著在激發(fā)同時(shí)立刻注入160微克/100微升celecoxib(溶于3％在磷酸鹽緩沖鹽溶液中的二甲基亞砜里)。在激發(fā)后6小時(shí)測量小腸液的體積。在尸檢時(shí)收集小腸液和組織樣品。使用報(bào)告COX-2特效的celecoxib用藥量，觀察到對CT-誘導(dǎo)的小腸液積累的抑制影響。
結(jié)果圖11表明celecoxib顯著降低CT-誘導(dǎo)的小腸液在鼠腸袢中積累。
實(shí)施例3雜環(huán)衍生物抑制腺苷酸環(huán)化酶腺苷酸環(huán)化酶活性的分析。
通過測量酶與[32P]-ATP作用產(chǎn)生釋放的[32P]-cAMP，確定腺苷酸環(huán)化酶活性。該反應(yīng)如下[32P]-ATP+腺苷酸環(huán)化酶＝[32P]-cAMP+PPi下面描述的腺苷酸環(huán)化酶分析與大多數(shù)其它在活體外酶分析是類似的，其中純化的腺苷酸環(huán)化酶在緩沖液中與放射性標(biāo)記底物三磷酸腺苷([32P]-ATP)混合在一起。含有腺苷酸環(huán)化酶的粗制酶或真核細(xì)胞膜可以代替純化的酶。在培養(yǎng)20分鐘后，通過計(jì)數(shù)生成32P-cAMP的水平，可確定[32P]-ATP向32P-cAMP的轉(zhuǎn)化。
方法。在含有20毫摩爾Hepes緩沖液、4毫摩爾MgCl2、0.2毫克/毫升BSA、1毫摩爾cAMP和1毫摩爾DTT，pH7.4的反應(yīng)緩沖液中，構(gòu)建底物[32P]-ATP(NEN，波士頓，馬薩諸塞州)。由純化腺苷酸環(huán)化酶(0.46-4.6納摩爾)(List Biological Cambell CA)，底物和激動劑/抑制劑(1-10納摩爾)組成的40微升反應(yīng)物在37℃下進(jìn)行20分鐘，使用10微升0.5N HCl停止該反應(yīng)。該反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)移到小氧化鋁柱(Pierce，羅克福德，伊利諾斯州)中，與0.005N HCl平衡，再在500×克下離心。該柱用2 00微升0.005N HCl，在上述速度下旋轉(zhuǎn)洗滌三次。用200微升醋酸銨緩沖液沖洗樹脂三次，將[32P]-cAMP洗脫到管中。裝有洗脫[32P]-cAMP的管轉(zhuǎn)移到閃爍管。加閃爍雞尾酒，混合與計(jì)數(shù)。產(chǎn)生的[32P]-cAMP是腺苷酸環(huán)化酶活性的度量。
統(tǒng)計(jì)分析。由3個值得到平均和標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)。數(shù)據(jù)用Student t檢驗(yàn)(一尾)進(jìn)行評價(jià)，P值≤0.05被認(rèn)為是與對照有顯著差異。
結(jié)果。這些結(jié)果表明，celecoxib、PGE2組氨酸和咪唑每種都抑制腺苷酸環(huán)化酶酶活性(圖12)。圖12中的數(shù)據(jù)還表明，SC560和rofecoxib在試驗(yàn)條件下無腺苷酸環(huán)化酶活性。圖13表明SC560抑制霍亂毒素誘導(dǎo)的小腸液分泌，盡管未曾證明在試驗(yàn)條件下通過抑制腺苷酸環(huán)化酶可做到這一點(diǎn)(圖12)。在試驗(yàn)條件下，Rofecoxib不抑制霍亂毒素誘導(dǎo)的分泌。Celecoxib被認(rèn)定是環(huán)加氧酶-2(COX-2)的高特效抑制劑。Celecoxib抑制腺苷酸環(huán)化酶的機(jī)制還不清楚；但是，觀察到咪唑也抑制腺苷酸環(huán)化酶。由于咪唑是celecoxib化學(xué)結(jié)構(gòu)的一部分，這個部分參與抑制腺苷酸環(huán)化酶的功能活性是可疑的。已知咪唑結(jié)合二價(jià)陽離子(例如Mg++，Zn++和Ca++)，還知道這些金屬陽離子是腺苷酸環(huán)化酶活性所需要的。事實(shí)上，近來有關(guān)測定由X-射線結(jié)晶學(xué)導(dǎo)出的鼠腺苷酸環(huán)化酶結(jié)構(gòu)的報(bào)告表明，在腺苷酸環(huán)化酶二價(jià)陽離子(Mg++和Zn++)的催化位點(diǎn)存在兩個結(jié)合部位。我們覺得celecoxib的咪唑基團(tuán)能讓藥物在酶的活性位點(diǎn)與金屬離子結(jié)合，這樣會不讓底物(ATP)進(jìn)入。最后結(jié)果應(yīng)是抑制腺苷酸環(huán)化酶活性。從小腸生理學(xué)觀點(diǎn)來看，這樣一種抑制劑會降低或阻止霍亂毒素誘導(dǎo)的小腸液虧損(腹瀉)。
劑量反應(yīng)曲線的獲得方法。如實(shí)施例1較早所描述的進(jìn)行腺苷酸環(huán)化酶酶活性的分析；但是，運(yùn)用這種分析來評價(jià)各種抑制劑(例如PGE2-組氨酸、celecoxib和咪唑)。每個實(shí)驗(yàn)的酶量是0.46納摩爾，每種抑制劑的濃度改變，以便確定阻止50％酶活性的劑量(IC50)。
結(jié)果。圖14-16匯集的結(jié)果表明，可以抑制腺苷酸環(huán)化酶，這形成一種降低或阻止由幾種腹瀉疾病因子引起的腸液分泌的策略。圖14說明了在抑制腺苷酸環(huán)化酶時(shí)PGE2-組氨酸的劑量反應(yīng)。抑制50％酶活性(0.46納摩爾)的PGE2-組氨酸的IC50劑量是21.5微摩爾。圖15說明用celecoxib進(jìn)行類似實(shí)驗(yàn)時(shí)，它的IC50劑量是20毫摩爾。圖16說明只是咪唑具有抑制腺苷酸環(huán)化酶活性；但是，它的效力不高(IC50＝1.57毫摩爾)。表1匯集了各種腺苷酸環(huán)化酶抑制劑的抑制效力。B.acthracis的水腫因子用作腺苷酸環(huán)化酶時(shí)觀察到類似結(jié)果。
表1、抑制腺苷酸環(huán)化酶所需要通常獲得藥物的摩爾濃度

實(shí)施例4PGE2抑制霍亂毒素誘導(dǎo)產(chǎn)生環(huán)AMPPGE2-咪唑加合物抑制在鼠粘膜中CT-誘導(dǎo)產(chǎn)生cAMP。出現(xiàn)對cAMP影響的一種可能機(jī)制是PGE2加合物可能阻止PGE2對腺苷酸環(huán)化酶的刺激作用。在CT激發(fā)時(shí)通過腹內(nèi)注射服用純化的PGE2-咪唑或PGE2-組氨酸的實(shí)驗(yàn)，得到了事實(shí)上完全抑制CT小腸液反應(yīng)(圖5A)。后一個實(shí)驗(yàn)提供了加合物對CT蛋白質(zhì)生物活性有直接影響的反對證據(jù)。圖5B說明了在鼠的腔液中PGE2-咪唑加合物對降低cAMP水平的影響。可以根據(jù)馬薩諸塞，斯托頓的Biomedical Technologies公司提供的說明書，采用ELISA測定小腸液中cAMP的含量。后面數(shù)據(jù)表明PGE2共價(jià)加合物可降低小腸中的cAMP水平。我們的研究還表明PGE2-咪唑和PGE2-組氨酸加合物對細(xì)胞無毒性。
這些初步數(shù)據(jù)表明PGE2在CT-誘導(dǎo)分泌反應(yīng)中的重要性。這些結(jié)果的可能解釋包括1)PGE2加合物與PGE2在結(jié)構(gòu)上類似性，可能使這些加合物與PGE2在對CT的腸反應(yīng)期間都競爭受體；或2)PGE2加合物也可能成為COX-1和COX-2酶的競爭抑制劑。令人感興趣的是，認(rèn)為PGE2加合物可以用于研制進(jìn)一步治療抗霍亂和其它分泌性腹瀉疾病，其中特別阻止PGE2和cAMP(來自腺苷酸環(huán)化酶)的生理學(xué)作用。
PGE2-咪唑加合物降低在CHO細(xì)胞中產(chǎn)生CT-誘導(dǎo)的cAMP。圖4表明PGE2-咪唑加合物降低在CT刺激的中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞中cAMP水平。在這個實(shí)驗(yàn)中，在用CT(1微克/毫升)激發(fā)時(shí)，HPLC-純化的的PGE2-咪唑加合物加到CHO細(xì)胞培養(yǎng)物中。根據(jù)根據(jù)馬薩諸塞，斯托頓的Biomedical Technologies公司提供的說明書，采用ELISA測定小腸液中cAMP的含量。其中得到的一些cAMP是由毒素的刺激腺苷酸環(huán)化酶的ADP-核糖基化能力Gsα所形成的。另外，這些數(shù)據(jù)表明一些cAMP因CT刺激生成PGE2的能力而產(chǎn)生的，而PGE2反過來又刺激腺苷酸環(huán)化酶。重要地，這些數(shù)據(jù)表明純化的PGE2-咪唑加合物抑制CT-誘導(dǎo)的PGE2對腺苷酸環(huán)化酶的作用。
本文引用的所有專利、專利申請和出版物以及獲得電子材料(例如GenBank氨基酸和核苷酸順序submission)都以參考文獻(xiàn)引入本文。僅僅為了清晰理解才給出前面詳細(xì)說明和實(shí)施例。本發(fā)明不限于嚴(yán)格的詳細(xì)展示和說明，對于本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員來說許多顯而易見的變化都將包括在權(quán)利要求所限定的本發(fā)明中。
權(quán)利要求
1.一種在活體外抑制腺苷酸環(huán)化酶的方法，該方法包括讓腺苷酸環(huán)化酶與含有一定量的含雜環(huán)化合物的組合物接觸，該化合物能有效抑制由三磷酸腺苷(ATP)產(chǎn)生3′，5′-單磷酸腺苷(cAMP)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中含雜環(huán)化合物選自未取代的雜環(huán)化合物、聯(lián)苯基雜環(huán)衍生物、前列腺素類似物或它們的組合。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中含雜環(huán)化合物選自未取代的雜環(huán)化合物、聯(lián)苯基雜環(huán)衍生物或它們的組合。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中含雜環(huán)化合物是未取代的雜環(huán)化合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中未取代的雜環(huán)化合物是咪唑。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中含雜環(huán)化合物是聯(lián)苯基雜環(huán)衍生物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中聯(lián)苯基雜環(huán)衍生物選自如下 及其組合。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中聯(lián)苯基雜環(huán)衍生物是celebrex或DuP-697。
9.一種在活體內(nèi)抑制腺苷酸環(huán)化酶的方法，該方法包括讓含有腺苷酸環(huán)化酶的細(xì)胞與含有一定量的含雜環(huán)化合物的組合物接觸，該化合物能有效抑制由(ATP)產(chǎn)生cAMP。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中含雜環(huán)化合物選自未取代的雜環(huán)化合物、聯(lián)苯基雜環(huán)衍生物、前列腺素類似物或它們的組合。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中含雜環(huán)化合物選自未取代的雜環(huán)化合物、聯(lián)苯基雜環(huán)衍生物或它們的組合。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中含雜環(huán)化合物是未取代的雜環(huán)化合物。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中未取代的雜環(huán)化合物是咪唑。
14.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中含雜環(huán)化合物是聯(lián)苯基雜環(huán)衍生物。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中聯(lián)苯基雜環(huán)衍生物選自如下 及其組合。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中聯(lián)苯基雜環(huán)衍生物是celebrex或DuP-697。
17.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中細(xì)胞取自受治療者。
18.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中細(xì)胞是在受治療者體內(nèi)。
19.一種在活體內(nèi)抑制腺苷酸環(huán)化酶的方法，該方法包括讓含有腺苷酸環(huán)化酶的細(xì)胞與含有一定量的含雜環(huán)衍生物的組合物接觸，該衍生物能有效抑制由(ATP)產(chǎn)生cAMP，其中該細(xì)胞不含有具有ADP-核糖基化活性的病原體多肽，以及其中雜環(huán)衍生物選自聯(lián)苯基雜環(huán)衍生物、前列腺素類似物或它們的組合。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中雜環(huán)衍生物選自如下 及其組合。
21.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中細(xì)胞取自受治療者。
22.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中細(xì)胞是在受治療者體內(nèi)。
23.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中該組合物還含有有效量的甲硝基羥乙唑。
24.一種治療受治療者小腸液虧損的方法，該方法包括給患有小腸液虧損或有小腸液虧損發(fā)展危險(xiǎn)的受治療者服用一種組合物，該組合物含有有效量的雜環(huán)衍生物，該衍生物選自聯(lián)苯雜環(huán)衍生物、前列腺素類似物或它們的組合，其中小腸液虧損與具有ADP-核糖基化活性的病原體多肽沒有關(guān)系。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中雜環(huán)衍生物選自如下 及其組合。
26.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中該組合物還含有有效量的甲硝基羥乙唑、消炎痛或它們的組合。
27.一種在活體內(nèi)抑制腺苷酸環(huán)化酶的方法，該方法包括讓含有腺苷酸環(huán)化酶的細(xì)胞與含有一定量的含雜環(huán)化合物的組合物接觸，該化合物能有效抑制由(ATP)產(chǎn)生cAMP，其中該細(xì)胞含有具有ADP-核糖基化活性的病原體多肽。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中含雜環(huán)化合物選自未取代的雜環(huán)化合物、聯(lián)苯基雜環(huán)衍生物、前列腺素類似物或它們的組合。
29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中含雜環(huán)化合物選自未取代的雜環(huán)化合物、聯(lián)苯基雜環(huán)衍生物或它們的組合。
30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其中含雜環(huán)化合物是未取代的雜環(huán)化合物。
31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中未取代的雜環(huán)化合物是咪唑。
32.根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中含雜環(huán)化合物是聯(lián)苯基雜環(huán)衍生物。
33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中聯(lián)苯基雜環(huán)衍生物選自如下 及其組合。
34.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中含雜環(huán)化合物是甲硝基羥乙唑。
35.一種治療受治療者小腸液虧損的方法，該方法包括給患有小腸液虧損或有小腸液虧損發(fā)展危險(xiǎn)的受治療者服用一種組合物，該組合物含有有效量的含雜環(huán)化合物，其中小腸液虧損與具有ADP-核糖基化活性的病原體多肽沒有關(guān)系。
36.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中含雜環(huán)化合物選自未取代的雜環(huán)化合物、聯(lián)苯基雜環(huán)衍生物、前列腺素類似物或它們的組合。
37.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中含雜環(huán)化合物選自未取代的雜環(huán)化合物、聯(lián)苯基雜環(huán)衍生物或它們的組合。
38.根據(jù)權(quán)利要求37所述的方法，其中含雜環(huán)化合物是未取代的雜環(huán)化合物。
39.根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法，其中未取代的雜環(huán)化合物是咪唑。
40.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中含雜環(huán)化合物是聯(lián)苯基雜環(huán)衍生物。
41.根據(jù)權(quán)利要求40，其中聯(lián)苯基雜環(huán)衍生物選自如下 及其組合。
42.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中含雜環(huán)化合物是甲硝基羥乙唑、消炎痛或它們的組合。
43.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中雜環(huán)衍生物不是celecoxib。
44.一種抑制受治療者平滑肌收縮的方法，該方法包括給患有與平滑肌收縮相關(guān)病癥或有與平滑肌收縮相關(guān)病癥發(fā)展危險(xiǎn)的受治療者服用一種組合物，該組合物含有有效量的含雜環(huán)衍生物，該雜環(huán)衍生物選自聯(lián)苯基雜環(huán)衍生物、前列腺素類似物或它們的組合。
45.根據(jù)權(quán)利要求44，其中雜環(huán)衍生物選自如下 及其組合。
46.根據(jù)權(quán)利要求44所述的方法，其中該組合物還含有有效量的甲硝基羥乙唑、消炎痛或它們的組合。
47.一種治療受治療者百日咳的方法，該方法包括給患有百日咳或有百日咳發(fā)展危險(xiǎn)的受治療者服用一種組合物，該組合物含有有效量的含雜環(huán)化合物。
48.根據(jù)權(quán)利要求47所述的方法，其中含雜環(huán)化合物選自未取代的雜環(huán)化合物、聯(lián)苯基雜環(huán)衍生物、前列腺素類似物或它們的組合。
49.根據(jù)權(quán)利要求48所述的方法，其中含雜環(huán)化合物選自未取代的雜環(huán)化合物、聯(lián)苯基雜環(huán)衍生物或它們的組合。
50.根據(jù)權(quán)利要求49所述的方法，其中含雜環(huán)化合物是未取代的雜環(huán)化合物。
51.根據(jù)權(quán)利要求50所述的方法，其中未取代的雜環(huán)化合物是咪唑。
52.根據(jù)權(quán)利要求48所述的方法，其中含雜環(huán)化合物是聯(lián)苯基雜環(huán)衍生物。
53.根據(jù)權(quán)利要求52，其中聯(lián)苯基雜環(huán)衍生物選自如下 及其組合。
54.根據(jù)權(quán)利要求47所述的方法，其中含雜環(huán)化合物是甲硝基羥乙唑、消炎痛或它們的組合。
55.一種治療受治療者炭疽病的方法，該方法包括給患有炭疽病或有炭疽病發(fā)展危險(xiǎn)的受治療者服用一種組合物，該組合物含有有效量的含雜環(huán)化合物。
56.根據(jù)權(quán)利要求55所述的方法，其中含雜環(huán)化合物選自未取代的雜環(huán)化合物、聯(lián)苯基雜環(huán)衍生物、前列腺素類似物或它們的組合。
57.根據(jù)權(quán)利要求56所述的方法，其中含雜環(huán)化合物選自未取代的雜環(huán)化合物、聯(lián)苯基雜環(huán)衍生物或它們的組合。
58.根據(jù)權(quán)利要求57所述的方法，其中含雜環(huán)化合物是未取代的雜環(huán)化合物。
59.根據(jù)權(quán)利要求58所述的方法，其中未取代的雜環(huán)化合物是咪唑。
60.根據(jù)權(quán)利要求55所述的方法，其中含雜環(huán)化合物是聯(lián)苯基雜環(huán)衍生物。
61.根據(jù)權(quán)利要求60，其中聯(lián)苯基雜環(huán)衍生物選自如下 及其組合。
62.根據(jù)權(quán)利要求55所述的方法，其中含雜環(huán)化合物是甲硝基羥乙唑、消炎痛或它們的組合。
全文摘要
本發(fā)明提供治療小腸液虧損、百日咳、炭疽病以及與平滑肌受縮相關(guān)病癥的方法。本發(fā)明還提供在活體內(nèi)和在活體外抑制腺苷酸環(huán)化酶的方法。
文檔編號A61K31/365GK1617716SQ01810828
公開日2005年5月18日 申請日期2001年5月19日 優(yōu)先權(quán)日2000年6月8日
發(fā)明者J·W·彼得森, D·L·格塞爾－李, S·S·賽尼 申請人:德克薩斯系統(tǒng)大學(xué)評議會