包含高分子量聚環(huán)氧乙烷的多價平臺分子的制作方法

專利名稱：包含高分子量聚環(huán)氧乙烷的多價平臺分子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請涉及包含聚環(huán)氧乙烷基團(tuán)的化合價平臺分子，一個或多個分子、例如生物學(xué)活性分子可以與之結(jié)合構(gòu)成綴合物。
背景技術(shù)：
“化合價平臺”是具有一個或更多(通常為多個)結(jié)合位點(diǎn)的分子，這些位點(diǎn)可以用于共價結(jié)合有關(guān)生物學(xué)活性分子至共同的支架。將生物學(xué)活性分子結(jié)合于共同的支架可提供多價的綴合物，其中多個生物學(xué)活性分子副本共價連接在同一平臺上?！按_定的”或“化學(xué)上確定的”化合價平臺是具有確定結(jié)構(gòu)、從而具有確定數(shù)量的結(jié)合點(diǎn)和確定的化合價的平臺。確定的化合價平臺綴合物是具有確定結(jié)構(gòu)的綴合物，并且結(jié)合有確定數(shù)量的生物學(xué)活性化合物。生物學(xué)活性分子的實(shí)例包括寡核苷酸、肽、多肽、蛋白質(zhì)、抗體、糖、多糖、表位、模擬表位、藥物等。例如，生物學(xué)活性化合物可以特異性地相互作用于蛋白質(zhì)受體。
某些種類的化學(xué)上確定的化合價平臺、它們的制備方法、包含它們的綴合物和這類綴合物的制備方法已經(jīng)描述在美國專利號5,162,515、5,391,785、5,276,013、5,786,512、5,726,329、5,268,454、5,552,391、5,606,047和5,663,395中。包含氨基甲酸酯鍵的化合價平臺分子描述在美國臨時專利申請系列號60/111,641、1999年12月8日提交的U.S.系列號09/457,607和WO 00/34231中。包含氨基氧基的化合價平臺分子描述在1999年6月8日提交的美國臨時專利申請?zhí)?0/138,260和PCT/US00/15968中。
聚乙二醇綴合物描述在例如1999年9月16日公布的PCT WO99/45964、美國專利號5,672,662、美國專利號5,932,462、PCT WO99/34833、PCT WO 95/34326和美國專利號5,990,237中。包括線性與樹狀嵌段的聚醚共聚物描述在Gitsov等，Angew Chem.Int.Ed.Engl.，1992，311200-1203中。作為抗癌藥阿霉素載體的聚乙二醇多嵌段共聚物描述在Pechar等，Bioconjugate Chem.(生物綴合物化學(xué))，11131-139(2000)中。用于攜帶和釋放多個肽副本的聚乙二醇共聚物描述在Huang等，Bioconjugate Chem.(生物綴合物化學(xué))，9612-617(1998)中。聚乙二醇共聚物和它們與DNA的自體組裝描述在Choi等，J.Am.Chem.Soc.(美國化學(xué)會志)，122474-480(2000)中。含有葉酸殘基的聚醚樹狀化合物描述在Kono等，Bioconjugate Chemistry，(生物綴合物化學(xué))101115-1121(1999)中。
多肽的直接PEG化作用一般是通過結(jié)合于賴氨酸的氨基或其他側(cè)鏈官能團(tuán)而進(jìn)行的。這經(jīng)常生成產(chǎn)物的異種混合物，并且可以引起生物活性的喪失。因此，需要生成生物學(xué)活性分子與聚環(huán)氧乙烷基團(tuán)的多價綴合物的改進(jìn)方法。
發(fā)明的公開本發(fā)明提供了包含至少一個高分子量聚環(huán)氧乙烷基團(tuán)的化學(xué)上確定的化合價平臺分子。該化合價平臺分子可以包含例如至少2、3、4個或更多高分子量聚環(huán)氧乙烷基團(tuán)。高分子量聚環(huán)氧乙烷基團(tuán)的分子量為例如大于18,000道爾頓；大于22,000道爾頓；大于40,000道爾頓；大于50,000道爾頓；大于80,000道爾頓；大于100,000道爾頓或者至少為40,000道爾頓。
在一種實(shí)施方式中，在化合價平臺分子中，高分子量聚環(huán)氧乙烷基團(tuán)具有下式-(CH2CH2O)n-
其中n大于500；n大于400；n大于500；n大于600；n大于700；或n大于800。
在一種實(shí)施方式中，化合價平臺分子包含一個核心基團(tuán)和至少三條臂，其中每條臂包含一個末端。核心基團(tuán)和/或臂可以包含高分子量聚環(huán)氧乙烷基團(tuán)。高分子量聚環(huán)氧乙烷基團(tuán)也可以結(jié)合于核心或臂。
在一種實(shí)施方式中，提供了包含如本文所公開的化合價平臺分子的組合物，其中這些分子的多分散性小于1.2。
在一種實(shí)施方式中，化合價平臺分子可以包含至少三個反應(yīng)性綴合基團(tuán)，例如羥基、硫醇、異氰酸酯、異硫氰酸酯、胺、烷基鹵化物、烷基汞鹵化物、醛、酮、羧酸鹵化物、α-鹵代羰基、α，β-不飽和羰基、鹵代甲酸酯、羧酸、羧酸酯、羧酸酐、O-?；愲?、酰肼、馬來酰亞胺、亞氨酸酯、磺酸酯、磺酰鹵、α，β-不飽和砜、氨基氧基、氨基脲或β-氨基硫醇。在一種實(shí)施方式中，化合價平臺分子包含至少3個氨基氧基和/或至少3個氨基甲酸酯基。
在一種實(shí)施方式中，提供了如本文所公開的化合價平臺分子與一個或多個、例如3個或多個生物學(xué)活性分子的綴合物，所述生物學(xué)活性分子為例如糖、多糖、氨基酸、多(氨基酸)、核酸或脂質(zhì)。在一種實(shí)施方式中，綴合物是B細(xì)胞耐受原。
在一種實(shí)施方式中，生物學(xué)活性分子是核酸或其類似物，該綴合物可有效降低抗雙鏈DNA抗體的水平，例如用于治療或減輕狼瘡。在另一種實(shí)施方式中，生物學(xué)活性分子是包含β2GPI結(jié)構(gòu)域1多肽的多肽或其類似物，該綴合物可有效降低抗磷脂(aPL)抗體的水平和/或治療例如與抗磷脂綜合征有關(guān)的疾病，例如抗體介導(dǎo)的血栓形成。在一種實(shí)施方式中，生物學(xué)活性分子是αGal表位或其類似物，它特異性地結(jié)合抗αGal抗體；并且，任選地，該綴合物可有效誘導(dǎo)異種移植中的免疫耐受性。
在一種實(shí)施方式中，生物學(xué)活性分子是T細(xì)胞依賴性免疫原的類似物，其中該類似物可特異性結(jié)合B細(xì)胞上與T細(xì)胞依賴性免疫原特異性結(jié)合的表面抗體，并且該綴合物缺乏能夠激活所述個體T細(xì)胞的T細(xì)胞表位。
本發(fā)明還提供了藥學(xué)上可接受的組合物，其包含如本文所公開的綴合物和藥學(xué)上可接受的載體。
本發(fā)明的進(jìn)一方面是在需要接受治療的個體中治療抗體介導(dǎo)的疾病或其他病癥的方法，該方法包括對該個體給以有效量的綴合物，其中，任選地，該綴合物可特異性結(jié)合與抗體介導(dǎo)的疾病有關(guān)的抗體。
本發(fā)明的另一方面是在個體中誘導(dǎo)對免疫原無反應(yīng)性的特異性B細(xì)胞的方法，該方法包括對該個體給以有效量的綴合物。
本發(fā)明的另一方面是在個體中治療抗體介導(dǎo)的病變的方法，其中，在病變中產(chǎn)生響應(yīng)于免疫原的不需要的抗體，該方法包括對該個體給以有效量的綴合物。
在一種實(shí)施方式中，優(yōu)選綴合物的總分子量不大于例如約200,000道爾頓，以便綴合物能有效充當(dāng)功能性耐受原而不充當(dāng)T細(xì)胞不依賴的免疫原。
本發(fā)明還提供了組合物和它們的使用方法，其中該組合物包含含有高分子量聚環(huán)氧乙烷基團(tuán)的化合價平臺分子，其中組合物中化合價平臺分子中聚環(huán)氧乙烷基團(tuán)的平均分子量為例如大于約18,000、大于約20,000、大于約22,000、大于約30,000、大于約40,000、大于約50,000或大于約100,000道爾頓。
本發(fā)明還提供了化學(xué)上確定的化合價平臺分子，其包含聯(lián)合具有高分子量的聚環(huán)氧乙烷基團(tuán)。還提供了組合物和它們的使用方法，其中該組合物包含含有聯(lián)合具有高分子量的聚環(huán)氧乙烷基團(tuán)的化合價平臺分子，組合物中化合價平臺分子上聯(lián)合聚環(huán)氧乙烷基團(tuán)的平均分子量為例如大于約18,000、大于約20,000或例如大于約22,000道爾頓。
還提供了包含化合價平臺分子的組合物和它們的使用方法，其中該化合價平臺分子包含至少一個高分子量聚環(huán)氧乙烷基團(tuán)；其中該分子的多分散性小于約1.2；其中該組合物中高分子量聚環(huán)氧乙烷基團(tuán)的平均分子量至少是約18,000。
還提供了化學(xué)上確定的化合價平臺分子與包含β2GPI結(jié)構(gòu)域1多肽之多肽的綴合物，其中該綴合物包含至少一個高分子量聚環(huán)氧乙烷基團(tuán)。高分子量聚環(huán)氧乙烷基團(tuán)的分子量為例如大于22,000道爾頓。在一種實(shí)施方式中，多肽可特異性地結(jié)合β2GPI依賴性抗磷脂抗體，并且可任選地缺乏能夠激活具有β2GPI依賴性抗磷脂抗體的個體T細(xì)胞的T細(xì)胞表位。
在綴合物中，β2GPI結(jié)構(gòu)域1多肽包含例如

圖19(SEQ ID NO2)的至少五個相鄰氨基酸或圖19(SEQ ID NO2)的氨基酸Nos.2-63。綴合物是例如圖7所示的化合物200、202、203或205，或圖16所示的化合物300，其中所述結(jié)構(gòu)中的D1是例如由SEQ ID No2的氨基酸No.2-63組成的多肽。
本發(fā)明的進(jìn)一方面是用于制備上述綴合物的方法，包括使生物學(xué)活性分子與化學(xué)上確定的化合價平臺分子共價結(jié)合，生成綴合物。
在一種實(shí)施方式中，提供了如本文所公開的綴合物，其中該綴合物適合于在患有抗體介導(dǎo)的病變的個體中誘導(dǎo)對與所述病變有關(guān)的T細(xì)胞依賴性免疫原無反應(yīng)性的特異性B細(xì)胞，該綴合物包含優(yōu)選無免疫原性的本文所述化合價平臺分子和免疫原的至少兩個相似分子，其中(a)相似分子可特異性結(jié)合B細(xì)胞上與T細(xì)胞依賴性免疫原特異性結(jié)合的表面抗體，(b)綴合物缺乏能夠激活所述個體中T細(xì)胞的T細(xì)胞表位。相似分子可以是例如肽、多肽、蛋白質(zhì)、糖蛋白、脂蛋白、糖、脂質(zhì)或脂多糖。
在另一種實(shí)施方式中，提供了包含化合價平臺分子的組合物，該化合價平臺分子包含高分子量聚環(huán)氧乙烷基團(tuán)，其中該聚環(huán)氧乙烷基團(tuán)的平均分子量大于約18,000、大于約20,000或大于約22,000。
附圖的簡要說明圖1是顯示化合物8合成的反應(yīng)流程。
圖2是顯示化合物11合成的反應(yīng)流程。
圖3是顯示化合物17合成的反應(yīng)流程。
圖4是顯示化合物23合成的反應(yīng)流程。
圖5顯示包含高分子量聚環(huán)氧乙烷基團(tuán)的示例性化合價平臺分子綴合物。
圖6顯示包含高分子量聚環(huán)氧乙烷基團(tuán)的示例性化合價平臺分子綴合物。
圖7顯示包含聚環(huán)氧乙烷基團(tuán)的示例性化合價平臺分子綴合物。
圖8顯示包含氨基氧基和聚環(huán)氧乙烷基團(tuán)的化合價平臺分子的結(jié)構(gòu)式。
圖9顯示包含不同分子量的聚環(huán)氧乙烷基團(tuán)的多價平臺分子的合成流程。
圖10顯示包含聚環(huán)氧乙烷基團(tuán)和臂的多價平臺分子的合成流程。
圖11顯示化合物132的合成流程。
圖12顯示化合物136的合成流程。
圖13顯示化合物143的合成流程。
圖14顯示示例性八聚bPEG平臺的合成，其中n例如是113或以上，例如500或以上。
圖15顯示包含兩個聚環(huán)氧乙烷基團(tuán)的化合價平臺分子的合成，其中n例如是500或以上。
圖16顯示示例性綴合物300的結(jié)構(gòu)。
圖17是化合物303和306的合成流程。
圖18顯示一些示例性綴合物309和310的結(jié)構(gòu)。
圖19描繪β2GPI結(jié)構(gòu)域1的核苷酸(SEQ ID NO1)和氨基酸(SEQID NO2)序列。橫線下的數(shù)字表示氨基酸的位置。
圖20是顯示合成轉(zhuǎn)氨基多肽的流程。
實(shí)施發(fā)明的方式本發(fā)明提供了包含高分子量聚環(huán)氧乙烷基團(tuán)的化合價平臺分子和其與生物學(xué)活性分子的綴合物以及它們的合成與使用方法。還提供了藥學(xué)上可接受的組合物，該組合物包含如本文所公開的綴合物，且該綴合物任選地存在于藥學(xué)上可接受的載體中。
在包含高分子量聚環(huán)氧乙烷基團(tuán)與生物學(xué)活性分子的化合價平臺分子復(fù)合物中，在優(yōu)選的實(shí)施方式中有利的是，聚環(huán)氧乙烷基團(tuán)沒有直接結(jié)合在生物學(xué)活性分子例如多肽上。有利的是，聚環(huán)氧乙烷基團(tuán)直接結(jié)合在平臺而非蛋白質(zhì)或其他試劑上，從而潛在地減少干擾結(jié)合的可能。選定分子量或分子量范圍的聚環(huán)氧乙烷與平臺的結(jié)合是十分確定的，從而生物學(xué)活性分子與包含高分子量聚環(huán)氧乙烷基團(tuán)的化合價平臺分子的綴合物也是均一和十分確定的。
本文所公開的化合價平臺分子包含一個或多個高分子量聚環(huán)氧烷基團(tuán)。化合價平臺分子上聚環(huán)氧烷基團(tuán)的存在也能夠有利地延長血清半衰期，提高與之綴合的生物學(xué)活性分子的活性。在本文所述的實(shí)施方式中使用了術(shù)語聚環(huán)氧乙烷，但在本發(fā)明范圍內(nèi)還包括其他聚環(huán)氧烷，例如聚環(huán)氧丙烷。
藥學(xué)上可接受的組合物本發(fā)明提供了包含高分子量聚環(huán)氧乙烷的藥學(xué)上可接受的化合價平臺分子和其與生物學(xué)活性分子的綴合物以及它們的合成與使用方法。還提供了藥學(xué)上可接受的組合物，該組合物包含如本文所公開的分子和綴合物，且該分子和綴合物任選地存在于藥學(xué)上可接受的載體中。
本領(lǐng)域描述過用于不同給藥途徑、包括口服、靜脈內(nèi)和氣霧劑給藥的載體，例如＂RemingtonThe Science and Practice of Pharmacy＂(藥學(xué)科學(xué)與實(shí)踐)Mack Publishing Company，Pennsylvania，1995，其公開的內(nèi)容結(jié)合在此作為參考。載體可以包括例如水、糖、多糖、緩沖劑、賦形劑和生物可降解的聚合物，例如聚酯、聚酐、聚氨基酸和脂質(zhì)體。
藥學(xué)上可接受的組合物是適合于對個體給藥形式的組合物，例如以單元劑型、無菌的腸胃外溶液或懸液、無菌的非腸胃外溶液或口服溶液或懸液、水包油型或油包水型乳劑等對個體全身或局部給藥。
聚環(huán)氧乙烷在一種實(shí)施方式中，化合價平臺分子包含一個或多個聚環(huán)氧乙烷基團(tuán)，其分子量例如大于約5,000、大于約10,000、大于約15,000或大于約20,000。聚環(huán)氧乙烷基團(tuán)的分子量可以是例如約5,000至10,000、約8,000至20,000、約10,000至20,000或約15,000至20,000。
在包含化合價平臺分子的組合物中，化合價平臺分子中聚環(huán)氧乙烷基團(tuán)的分子量可以是聚環(huán)氧乙烷基團(tuán)的平均分子量，因為可以存在分子量的分布。優(yōu)選分子量的分布窄。本文所公開的分子量在一種實(shí)施方式中指包含化合價平臺分子的組合物的平均分子量。
在優(yōu)選的實(shí)施方式中，化合價平臺分子包含至少一個高分子量聚環(huán)氧乙烷基團(tuán)?；蟽r平臺分子還可以包含多個高分子量聚環(huán)氧乙烷基團(tuán)，例如2個、3個或更多。或者，高分子量聚環(huán)氧乙烷可以以大量不同的聚環(huán)氧乙烷基團(tuán)的形式存在于平臺上的不同位置，它們聯(lián)合具有高分子量。聯(lián)合的高分子量可以是例如大于約18,000、大于約20,000或者大于例如約22,000。
本文所用的術(shù)語“高分子量聚環(huán)氧乙烷”基團(tuán)指分子量大于約18,000、大于約20,000或者例如大于約22,000道爾頓的聚環(huán)氧乙烷基團(tuán)。分子量可以是例如約20,000-22,000或約18,000-22,000。
例如，高分子量聚環(huán)氧乙烷可以是具有下式的基團(tuán)-(CH2CH2O)n-其中n例如大于約400、大于約450、大于約500或大于約550。例如，n是約400-550、520-600、550-700、600-800、600-900或600-1000或以上。在另一種實(shí)施方式中，n是至少約600、至少約700、至少約800、至少約900或至少約1000。
高分子量聚環(huán)氧乙烷基團(tuán)的分子量例如可以大于約25,000、大于約30,000或大于約40,000道爾頓。高分子量聚環(huán)氧乙烷基團(tuán)的分子量進(jìn)一步可以大于約50,000，例如約50,000至100,000或以上，例如約50,000至100,000。
在某些實(shí)施方式中，化合價平臺分子包括核心基團(tuán)和大量從核心延伸出的臂，其中所述的臂包含一個末端。例如參見圖14-16。任選地，臂還可以分支，以增加末端的數(shù)量。高分子量聚環(huán)氧乙烷基團(tuán)可以存在于核心或者一條或多條臂中，或者可以結(jié)合于化合價平臺分子上。例如，化合價平臺分子可以具有下式Rc[G1AG2]y式20其中Rc代表核心，A代表兩條或更多條臂，其中Rc和A相互獨(dú)立地是有機(jī)部分，并且Rc和A至少有一個包含高分子量聚環(huán)氧乙烷；G1如果存在的話，是有機(jī)部分；G2如果存在的話，是有機(jī)部分，例如包含反應(yīng)性綴合基團(tuán)；且y是2或以上，例如3、4、5、6、7、8、16或以上。
因此，化合價平臺分子的核心基團(tuán)或其中的一條臂可以包含聚環(huán)氧乙烷基團(tuán)，或者聚環(huán)氧乙烷基團(tuán)可以任選地結(jié)合于化合價平臺分子上的選定位置，例如核心或一條或更多條臂上。優(yōu)選地，臂上含有用于結(jié)合生物學(xué)活性分子的末端?；蟽r平臺分子還可以包含分支基團(tuán)以增加臂的數(shù)量，并因此增加平臺分子末端的數(shù)量。
分子量為例如約10,000至40,000道爾頓的聚環(huán)氧乙烷基團(tuán)可以用于適當(dāng)延長血漿半衰期。
化合價平臺可以合成各種本領(lǐng)域已知的化合價平臺分子，以包括如本文所公開的高分子量聚環(huán)氧乙烷基團(tuán)。用于制備化合價平臺分子的方法描述在例如美國專利號5,162,515、5,391,785、5,276,013、5,786,512、5,726,329、5,268,454、5,552,391、5,606,047、5,663,395和5,874,409以及U.S.系列號60/111,641和PCT US97/10075中。一般而言，這些平臺含有核心基團(tuán)或分支的核心基團(tuán)，它們可以終止于例如羥基、硫醇、羧基、氨基、醛、酮、烷基鹵化物或氨基氧基，其任選地可以進(jìn)一步被修飾，以提供預(yù)選的反應(yīng)性綴合基團(tuán)，以便選定的分子進(jìn)一步與之結(jié)合。優(yōu)選地，化合價平臺分子包含至少三個反應(yīng)性綴合基團(tuán)。反應(yīng)性綴合基團(tuán)的實(shí)例包括羥基、硫醇、異氰酸酯、異硫氰酸酯、胺、烷基鹵化物、烷基汞鹵化物、醛、酮、羧酸鹵化物、α-鹵代羰基、α，β-不飽和羰基、鹵代甲酸酯、羧酸、羧酸酯、羧酸酐、O-酰基異脲、酰肼、馬來酰亞胺、亞氨酸酯、磺酸酯、磺酰鹵、α，β-不飽和砜、氨基氧基、氨基脲和β-氨基硫醇。
化合價平臺是從含有所需化合價的核心基團(tuán)制備的，或者可以通過用帶有分支的部分衍生末端官能團(tuán)來增加核心基團(tuán)的化合價。
本領(lǐng)域已知用于制備化合價平臺分子的方法包括例如增殖法或分段法?？梢允褂眠m當(dāng)?shù)脑噭┬揎椷@些方法，可以提供所需的化合價。
本發(fā)明一方面提供了基本上單分散的化合價平臺分子?；蟽r平臺分子有利地具有窄的分子量分布?；蟽r平臺分子樣本的分子量分布寬度的量度是樣本的多分散性。多分散性用作聚合物樣本的分子量均一性或非均一性的量度。多分散性是這樣計算的用重均分子量(Mw)除以數(shù)均分子量(Mn)。對于極佳的單分散聚合物，Mw/Mn的值是一致的。多分散性(Mw/Mn)可用本領(lǐng)域已知的方法例如凝膠滲透色譜法測得。化合價平臺分子樣本的多分散性(Mw/Mn)優(yōu)選小于2，更優(yōu)選小于1.5，或小于1.2、小于1.07、小于1.02，或者例如約1.05至1.5或約1.05至1.2。典型的聚合物一般具有2-5的多分散性，或者在有些情況下為20或以上?；蟽r平臺分子的低多分散性的優(yōu)點(diǎn)包括生物相容性和生物利用度提高了，因為分子基本上是大小均勻的，由分子量的廣泛差異引起的生物活性差異也最小化了。低多分散性分子從而在藥學(xué)上最適合配制，容易分析。此外還控制了樣本中分子群體的化合價。
在包含包含高分子量聚環(huán)氧乙烷基團(tuán)的化合價平臺分子的組合物中，組合物中化合價平臺分子上聚環(huán)氧乙烷基團(tuán)的平均分子量為例如大于約18,000、大于約20,000或者例如大于約22,000道爾頓。
在包含包含聯(lián)合具有高分子量的聚環(huán)氧乙烷基團(tuán)的化合價平臺分子的組合物中，組合物中化合價平臺分子上聚環(huán)氧乙烷基團(tuán)的聯(lián)合平均分子量為例如大于約18,000、大于約20,000或者例如大于約22,000道爾頓。
在某些實(shí)施方式中，由于連續(xù)分支點(diǎn)的存在，化合價平臺分子可能被描述為“樹狀的”。樹狀化合價平臺分子具有多個末端，通常為4個或更多末端，例如8個末端或16個末端。
請注意本文所公開的結(jié)構(gòu)式打算涵蓋對稱的和不對稱的化合價平臺。參見例如圖14中的對稱分子M和圖16中的不對稱分子300。
利用下列詳細(xì)說明和實(shí)施例所述方法，使用適當(dāng)?shù)脑虾驮噭梢匀菀椎叵蚧蟽r平臺內(nèi)摻入高分子量聚環(huán)氧乙烷基團(tuán)，以便使聚環(huán)氧乙烷單位在分子內(nèi)部，例如在核心中或者在一個或多個從核心延伸出的臂中，或者經(jīng)由分子上的反應(yīng)性基團(tuán)結(jié)合于化合價平臺分子。
示例性化學(xué)上確定的化合價平臺分子可以使用根據(jù)它們的化學(xué)結(jié)構(gòu)、化合價、均一性和定義的化學(xué)性質(zhì)而定義的化合價平臺分子，所述化學(xué)性質(zhì)適于和適當(dāng)?shù)纳锖?或化學(xué)分子有效的結(jié)合。
適合用于本發(fā)明的化學(xué)上確定的非聚合化合價平臺分子包括但不限于如下結(jié)構(gòu)式的生物學(xué)相容的無免疫原性含碳化合物G[1]{T[1]}n[1]式1aG[2]{L[2]-J[2]-Z[2](T[2])p[2]}n[2]式2a其中G[1]和G[2](如果存在的話)彼此獨(dú)立地是直鏈、支鏈或多分支的鏈，包含1-2000或10,000或更多選自C、N、O、Si、P和S的鏈原子；更優(yōu)選地，G[2](如果存在的話)是從多元醇、聚胺或聚乙二醇衍生的原子團(tuán)；例如，G[2]選自-(CH2)q-，其中q＝0至20；-CH2(CH2OCH2)rCH2-，其中r＝0至300和C(CH2OCH2CH2-)s(OH)4-s，其中s＝1至4，更優(yōu)選地s＝3至4；n[1]個T[1]所示部分中的每一個和p[2]×n[2]個T[2]所示部分中的每一個分別獨(dú)立地選自NHRSUB(胺)、C(＝O)NHNHRSUB(酰肼)、NHNHRSUB(肼)、C(＝O)OH(羧酸)、C(＝O)OR酯(活化的酯)、C(＝O)OC(＝O)RB(酸酐)、C(＝O)X(酰鹵)、S(＝O)2X(磺酰鹵)、C(＝NRSUB)ORSUB(亞氨酸酯)、NCO(異氰酸酯)、NCS(異硫氰酸酯)、OC(＝O)X(鹵代甲酸酯)、C(＝O)OC(＝NRSUB)NHRSUB(碳二亞胺加合物)、C(＝O)H(醛)、C(＝O)RB(酮)、SH(巰基或硫醇)、OH(醇)、C(＝O)CH2X(鹵代乙?；?、RALKX(烷基鹵化物)、S(＝O)2ORALKX(烷基磺酸酯)、NR1R2，其中R1R2是-C(＝O)CH＝CHC(＝O)-(馬來酰亞胺)、C(＝O)CRB＝CRB2(α，β-不飽和羰基)、RALK-Hg-X(烷基汞)和S(＝O)CRB＝CRB2(α，β-不飽和砜)；在一種實(shí)施方式中，n[1]個T[1]所示部分中的每一個和p[2]×n[2]個T[2]所示部分中的每一個分別獨(dú)立地選自NHRSUB(胺)、C(＝O)CH2X(鹵代乙?；?、RALKX(烷基鹵化物)、S(＝O)2ORALKX(烷基磺酸酯)、NR1R2，其中R1R2是-C(＝O)CH＝CHC(＝O)-(馬來酰亞胺)、C(＝O)CRB＝CRB2(α，β-不飽和羰基)、RALK-Hg-X(烷基汞)和S(＝O)CRB＝CRB2(α，β-不飽和砜)；例如，n[1]個T[1]所示部分中的每一個和p[2]×n[2]個T[2]所示部分中的每一個分別獨(dú)立地選自NHRSUB(胺)、C(＝O)CH2X(鹵代乙?；?、NR1R2，其中R1R2是-C(＝O)CH＝CHC(＝O)-(馬來酰亞胺)和C(＝O)CRB＝CRB2(α，β-不飽和羰基)；在一種實(shí)施方式中，所有n[1]個T[1]所示部分和所有p[2]×n[2]個T[2]所示部分均是相同的；其中每個X獨(dú)立地是原子數(shù)大于16且小于54的鹵原子或其他良好的離去基團(tuán)(也就是弱堿，例如烷基或烷基-取代的磺酸酯或硫酸酯等、芳基或芳基-取代的磺酸酯或硫酸酯等，它們在這種情況下起到類似于鹵素的作用)；每個RALK獨(dú)立地是直鏈、支鏈或環(huán)狀的烷基(1-20C)；每個RSUB獨(dú)立地是H、直鏈、支鏈或環(huán)狀的烷基(1-20C)、芳基(6-20C)或芳烷基(7-30C)；每個R酯獨(dú)立地是N-琥珀酰亞氨基、對-硝基苯基、五氟苯基、四氟苯基、五氯苯基、2，4，5-三氯苯基、2，4-二硝基苯基、氰基甲基等，或其他活化基團(tuán)，例如5-氯、8-喹諾酮、1-哌啶、N-苯并三唑等；每個RB獨(dú)立地是包含1-50個選自C、H、N、O、Si、P和S的原子的原子團(tuán)；n[2]個L[2]所示部分中的每一個(如果存在的話)獨(dú)立地選自O(shè)、NRSUB和S；
n[2]個J[2]所示部分中的每一個(如果存在的話)獨(dú)立地選自C(＝O)和C(＝S)；n[1]＝1至32，更優(yōu)選地，n[1]＝2至16，進(jìn)而更優(yōu)選地，n[1]＝2至8，最優(yōu)選地，n[1]＝2至4；n[2]＝1至32，更優(yōu)選地，n[2]＝1至16，進(jìn)而更優(yōu)選地，n[2]＝1至8，仍更加優(yōu)選地，n[2]＝1至4，最優(yōu)選地，n[2]＝1至2；p[2]＝1至8，更優(yōu)選地，p[2]＝1至4，最優(yōu)選地，p[2]＝1至2；其條件是乘積n[2]×p[2]大于1且小于33；n[2]個Z[2]所示部分中的每一個獨(dú)立地是包含1-200個選自C、H、N、O、Si、P和S的原子的原子團(tuán)，并且在烷基、鏈烯基或芳族碳原子上含有至少p[2]個官能團(tuán)的結(jié)合位點(diǎn)；在一種實(shí)施方式中，所有n[2]個Z[2]所示的部分是相同的；在一種實(shí)施方式中，n[2]個Z[2]所示部分中的每一個分別獨(dú)立地如選自下組的結(jié)構(gòu)式所述Z[2]是W[3]-Y[3](結(jié)合位點(diǎn))p[2]式3aZ[2]是W[4]-N{Y[4](結(jié)合位點(diǎn))p[2]/2}2式4aZ[2]是W[5]-CH{Y[5](結(jié)合位點(diǎn))p[2]/2}2式5a其中n[2]個如W[3]、W[4]或W[5]所示的部分中的每一個(如果存在的話)分別獨(dú)立地是包含1-100個選自C、H、N、O、Si、P和S的原子的原子團(tuán)；n[2]個如Y[3]所示部分中的每一個、2×n[2]個如Y[4]所示部分中的每一個以及2×n[2]個如Y[5]所示部分中的每一個分別獨(dú)立地是包含1-100個選自C、H、N、O、Si、P和S的原子的原子團(tuán)，并且在烷基、鏈烯基或芳族碳原子上含有至少p[2]個(對于Y[3]而言)或p[2]/2個(對于Y[4]和Y[5]而言，其中p[2]/2是整數(shù))官能團(tuán)的結(jié)合位點(diǎn)；在一種實(shí)施方式中，n[2]個如W[3]所示的部分中的每一個(如果存在的話)分別獨(dú)立地選自(CH2)r、(CH2CH2O)r、NRSUB(CH2CH2O)rCH2CH2和NRSUB(CH2)rNRSUBC(＝O)，其中r＝1至10；
在一種實(shí)施方式中，n[2]個如Y[3]所示的部分中的每一個分別獨(dú)立地是直鏈、支鏈或環(huán)狀的烷基(1-20C)、芳基(6-20C)或芳烷基(7-30C)；最優(yōu)選地，n[2]個如Y[3]所示的部分中的每一個分別獨(dú)立地選自C6H4(苯基-1，4-二基)、C6H3(苯基-1，3，5-三基)和(CH2)r，其中r＝1至10；例如，n[2]個如W[4]所示的部分中的每一個(如果存在的話)分別獨(dú)立地選自(CH2)rC(＝O)和(CH2)rNRSUBC(＝O)，其中r＝1至10；例如，2×n[2]個如Y[4]所示的部分中的每一個分別獨(dú)立地選自(CH2)r、(CH2)rNRSUBC(＝O)(CH2)q、(CH2)rC(＝O)NRSUB(CH2)q、(CH2)rNRSUBC(＝O)(CH2)qNRSUBC(＝O)(CH2)r、(CH2)rC(＝O)NRSUB(CH2)qNRSUBC(＝O)(CH2)r、(CH2)rNRSUBC(＝O)(CH2CH2O)qCH2CH2和(CH2)rC(＝O)NRSUB(CH2CH2O)qCH2CH2，其中r＝1至10，更優(yōu)選地，r＝2至6，q＝1至10，更優(yōu)選地，q＝1至3；在一種實(shí)施方式中，n[2]個如W[5]所示的部分中的每一個(如果存在的話)分別獨(dú)立地選自(CH2)rC(＝O)NRSUB和(CH2)rNRSUBC(＝O)NRSUB，其中r＝1至10；在一種實(shí)施方式中，2×n[2]個如Y[5]所示的部分中的每一個分別獨(dú)立地選自(CH2)r和(CH2)rC(＝O)NRSUB(CH2)q，其中r＝1至10，q＝1至10。
在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，提供了包含化學(xué)上確定的非聚合化合價平臺分子和生物學(xué)活性分子的綴合物。生物學(xué)活性分子在與化合價平臺分子偶聯(lián)之前可以與連接分子偶聯(lián)。
適合的連接分子的實(shí)例是6碳硫醇，例如HAD(一種巰基-6碳鏈磷酸酯)和HADpS(一種巰基-6碳鏈硫代磷酸酯)。化學(xué)上確定的化合價平臺分子是這樣形成的，例如，使氨基修飾的PEG與3，5-雙-(碘代乙酰氨基)苯甲酰氯(以下稱為“DABA”)、3-羧基丙酰胺-N，N-二-[(6’-N’-芐酯基氨基-己基)乙酰胺]4”-硝基苯基酯(以下稱為“BAHA”)、3-羧基丙酰胺-N，N-二-[(8’-N’-芐酯基氨基-3’，6’-二氧雜辛基)乙酰胺]4”-硝基苯基酯(以下稱為“BAHAOX”)反應(yīng)，或者使PEG-雙-氯甲酸酯與N，N-二(2-[6’-N’-芐酯基氨基-己酰氨基]乙基)胺(以下稱為“AHAB”)反應(yīng)，生成化學(xué)上確定的化合價平臺分子。
還提供了如下結(jié)構(gòu)式的化學(xué)上確定的非聚合化合價平臺分子G[6]{O-C(＝O)-NRSUB-Q[6](T[6])p[6]}n6式6aG[7]{O-C(＝O)-N(Q[7](T[7])p[7]/2)2}n[7]式7a其中G[6]和G[7](如果存在的話)分別獨(dú)立地是直鏈、支鏈或多分支的鏈，包含1-2000或10,000或更多選自C、N、O、Si、P和S的鏈原子；更優(yōu)選地，G[6]和G[7]分別是從多元醇、聚胺或聚乙二醇衍生的原子團(tuán)；最優(yōu)選地，G[6]和G[7]分別選自-(CH2)q-，其中q＝0至20；-CH2(CH2OCH2)rCH2-，其中r＝0至300和C(CH2OCH2CH2-)s(OH)4-s，其中s＝1至4，更優(yōu)選s＝3至4；n[6]×p[6]個T[6]所示部分中的每一個和n[7]×p[7]個T[7]所示部分中的每一個分別獨(dú)立地選自NHRSUB(胺)、C(＝O)NHNHRSUB(酰肼)、NHNHRSUB(肼)、C(＝O)OH(羧酸)、C(＝O)OR酯(活化的酯)、C(＝O)OC(＝O)RB(酸酐)、C(＝O)X(酰鹵)、S(＝O)2X(磺酰鹵)、C(＝NRSUB)ORSUB(亞氨酸酯)、NCO(異氰酸酯)、NCS(異硫氰酸酯)、OC(＝O)X(鹵代甲酸酯)、C(＝O)OC(＝NRSUB)NHRSUB(碳二亞胺加合物)、C(＝O)H(醛)、C(＝O)RB(酮)、SH(巰基或硫醇)、OH(醇)、C(＝O)CH2X(鹵代乙?；?、RALKX(烷基鹵化物)、S(＝O)2ORALKX(烷基磺酸酯)、NR1R2，其中R1R2是-C(＝O)CH＝CHC(＝O)-(馬來酰亞胺)、C(＝O)CRB＝CRB2(α，β-不飽和羰基)、RALK-Hg-X(烷基汞)和S(＝O)CRB＝CRB2(α，β-不飽和砜)；更優(yōu)選地，n[6]×p[6]個T[6]所示部分中的每一個和n[7]×p[7]個T[7]所示部分中的每一個分別獨(dú)立地選自NHRSUB(胺)、C(＝O)CH2X(鹵代乙酰基)、RALKX(烷基鹵化物)、S(＝O)2ORALKX(烷基磺酸酯)、NR1R2，其中 R1R2是-C(＝O)CH＝CHC(＝O)-(馬來酰亞胺)、C(＝O)CRB＝CRB2(α，β-不飽和羰基)、RALK-Hg-X(烷基汞)和S(＝O)CRB＝CRB2(α，β-不飽和砜)；
進(jìn)而更優(yōu)選地，n[6]×p[6]個T[6]所示部分中的每一個和n[7]×p[7]個T[7]所示部分中的每一個分別獨(dú)立地選自NHRSUB(胺)、C(＝O)CH2X(鹵代乙?；?、NR1R2，其中R1R2是-C(＝O)CH＝CHC(＝O)-(馬來酰亞胺)和C(＝O)CRB＝CRB2(α，β-不飽和羰基)；最優(yōu)選地，所有n[6]×p[6]個T[6]所示部分和所有n[7]×p[7]個T[7]所示部分均是相同的；其中每個X獨(dú)立地是原子數(shù)大于16且小于54的鹵原子或其他良好的離去基團(tuán)；每個RALK獨(dú)立地是直鏈、支鏈或環(huán)狀的烷基(1-20C)；每個RSUB獨(dú)立地是H、直鏈、支鏈或環(huán)狀的烷基(1-20C)、芳基(1-20C)或烷芳基(1-30C)；每個R酯獨(dú)立地是N-羥基琥珀酰亞氨基、對-硝基苯氧基、五氟苯氧基或其他活化基團(tuán)；每個RB獨(dú)立地是包含1-50個選自C、H、N、O、Si、P和S的原子的原子團(tuán)；n[6]＝1至32，更優(yōu)選地，n[6]＝1至16，進(jìn)而更優(yōu)選地，n[6]＝1至8，更加優(yōu)選地，n[6]＝1至4，最優(yōu)選地，n[6]＝1至2；p[6]＝1至8，更優(yōu)選地，p[6]＝1至4，最優(yōu)選地，p[6]＝1至2；其條件是乘積n[6]×p[6]大于1且小于33；n[7]＝1至32，更優(yōu)選地，n[7]＝1至16，進(jìn)而更優(yōu)選地，n[7]＝1至8，更加優(yōu)選地，n[7]＝1至4，最優(yōu)選地，n[7]＝1至2；p[7]＝1至8，更優(yōu)選地，p[7]＝1至4，最優(yōu)選地，p[7]＝1至2；其條件是乘積n[7]×p[7]大于1且小于33；n[6]個Q[6]所示部分中的每一個和2×n[7]個Q[7]所示部分中的每一個分別獨(dú)立地是包含1-100個選自C、H、N、O、Si、P和S的原子的原子團(tuán)，并且在烷基、鏈烯基或芳族碳原子上含有至少p[6]個(對于Q[6]而言)或p[7]/2個(對于Q[7]而言，其中p[7]/2是整數(shù))官能團(tuán)的結(jié)合位點(diǎn)；
更優(yōu)選地，所有n[6]個Q[6]所示的部分均是相同的；更優(yōu)選地，所有2×n[7]個Q[7]所示的部分均是相同的；更優(yōu)選地，n[6]個Q[6]所示部分中的每一個分別獨(dú)立地選自CH[(CH2)r(結(jié)合位點(diǎn))]2和CH[(CH2)rC(＝O)NRSUB(CH2)q(結(jié)合位點(diǎn))]2，其中r＝1至10，q＝1至10；更優(yōu)選地，2×n[7]個Q[7]所示部分中的每一個分別獨(dú)立地選自(CH2)r、(CH2)rNRSUBC(＝O)(CH2)q、(CH2)rC(＝O)NRSUB(CH2)q、(CH2)rNRSUBC(＝O)(CH2)qNRSUBC(＝O)(CH2)r、(CH2)rC(＝O)NRSUB(CH2)qNRSUBC(＝O)(CH2)r、(CH2)rNRSUBC(＝O)(CH2CH2O)qCH2CH2和(CH2)rC(＝O)NRSUB(CH2CH2O)qCH2CH2，其中r＝1至10，更優(yōu)選地，r＝2至6，q＝1至10，更優(yōu)選地，q＝1至3。
如美國專利號5,552,391所述的這些化學(xué)上確定的平臺分子可以進(jìn)一步如本文所述被修飾，以包含高分子量聚環(huán)氧乙烷基團(tuán)。
氨基氧基化合價平臺分子在一種實(shí)施方式中，化合價平臺分子包含一個或多個高分子量聚環(huán)氧乙烷基團(tuán)以及氨基氧基，例如1至100個、例如1-50、2-16、4-16個、或者例如2、3、4、8、16、32個或更多個氨基氧基。在一種實(shí)施方式中，化合價平臺分子具有至少2、3、4、5個或更多個氨基氧基。氨基氧基化合價平臺分子描述在1999年6月8日提交的美國臨時專利申請?zhí)?0/138,260中。
還提供了含有其他分子、例如生物學(xué)活性分子的綴合物和它們的合成方法。氨基氧基為其他分子的共價結(jié)合提供結(jié)合位點(diǎn)。分子例如可以包含至少3個氨基氧基，或者4、5個或更多氨基氧基。
在一種實(shí)施方式中，提供了具有下式的化合價平臺分子R-(ONH2)m式1b其中在一種實(shí)施方式中m是1-50或以上，例如3-50；
R是包含1-10,000個或更多原子的有機(jī)部分，所述原子選自H、C、N、O、P、Si和S原子；其中化合價平臺分子包含至少一個例如具有式-(CH2CH2O)n-的高分子量聚環(huán)氧乙烷基團(tuán)，其中n大于500，例如500至700，或600至800，或1000或以上。
在另一種實(shí)施方式中，提供了具有下式的化合價平臺分子Rc[G1(ONH2)n]y式2b其中在一種實(shí)施方式中y是1至16；n是1至32；其中在一種實(shí)施方式中，y*n(y乘以n)的乘積至少是3；Rc和每個G1獨(dú)立地是有機(jī)部分；其中化合價平臺分子包含至少一個例如具有式-(CH2CH2O)n-的高分子量聚環(huán)氧乙烷基團(tuán)，其中n大于500，例如500至700，或600至800，或1000或以上。
在一種實(shí)施方式中，Rc和每個G1相互獨(dú)立地是含有選自H、C、N、O、P、Si和S原子的原子的有機(jī)部分。例如可以在多分散性小于1.2的組合物中提供這些分子。
在另一種實(shí)施方式中，提供了具有下式的化合價平臺分子，選自下組Rc[O-C(＝O)-NR1-G2-(ONH2)n]y式3b；Rc[C(＝O)-NR1-G2-(ONH2)n]y式4b；Rc[NR1-C(＝O)-G2-(ONH2)n]y式5b；Rc[NR1-C(＝O)-O-G2-(ONH2)n]y式6b；Rc[R1C＝N-O-G2-(ONH2)n]y式7b；和Rc[S-G2-(ONH2)n]y式8b其中，例如y是1至16；n是1至32；
其中在一種實(shí)施方式中，y*n(y乘以n)的乘積至少是3；R1是H、烷基、雜烷基、芳基、雜芳基或G2-(ONH2)n；Rc和每個G2獨(dú)立地是含有選自H、C、N、O、P、Si和S原子的原子的有機(jī)部分；其中化合價平臺分子包含至少一個例如具有式-(CH2CH2O)n-的高分子量聚環(huán)氧乙烷基團(tuán)，其中n大于500，例如500至700，或600至800，或1000或以上。
在一種實(shí)施方式中，Rc和每個G2獨(dú)立地選自下組僅由H和C原子組成的烴基，具有1至5,000個或1至200個碳原子；僅由碳、氧和氫原子組成的有機(jī)基團(tuán)，具有1至5,000個或1至200個碳原子；僅由碳、氧、氮和氫原子組成的有機(jī)基團(tuán)，具有1至5,000個或1至200個碳原子；僅由碳、氧、硫和氫原子組成的有機(jī)基團(tuán)，具有1至5,000個或1至200個碳原子；僅由碳、氧、硫、氮和氫原子組成的有機(jī)基團(tuán)，具有1至5,000個或1至200個碳原子。
在化合價平臺分子的一種實(shí)施方式中，Rc選自C1-200烴部分、C1-200烷氧基部分和包含芳族基團(tuán)的C1-200烴部分。
Rc可任選地可以包含氧化烯部分，例如氧化乙烯部分(-CH2CH2O-)。在一種實(shí)施方式中，Rc包含氧化乙烯單元-(CH2CH2O)n-其中n是1-500，例如1-200、1-100或1-20。可任選地，n大于500，例如500-700或600-800或1000或以上。
本文所用的“氧化乙烯、氧化丙烯和氧化烯”可與“環(huán)氧乙烷、環(huán)氧丙烷和環(huán)氧烷”互換使用。
在一種實(shí)施方式中，每個G2獨(dú)立地包含一種選自烷基、雜烷基、芳基和雜芳基的官能團(tuán)。
在另一種實(shí)施方式中，每個G2獨(dú)立地包含一種選自C1-200烴部分、C1-200烷氧基部分和包含芳族基團(tuán)的C1-200烴部分的官能團(tuán)。
每個G2可以獨(dú)立地包含氧化烯部分，例如氧化乙烯部分(-CH2CH2O-)。在一種實(shí)施方式中，每個G2獨(dú)立地包含氧化乙烯單元-(CH2CH2O)n-其中n是1-500，例如1-200、1-100或1-20。可任選地，n大于500，例如500-700或600-800或1000或以上。
在化合價平臺分子的一種實(shí)施方式中，每個G2獨(dú)立地包含這樣一種選自胺、酰胺、酯、醚、酮、醛、氨基甲酸酯、硫醚、哌嗪基、哌啶基、醇、聚胺、聚醚、酰肼、肼、羧酸、酸酐、鹵素、磺?；⒒撬狨ァ㈨?、氰酸酯、異氰酸酯、異硫氰酸酯、甲酸酯、碳二亞胺、硫醇、肟、亞胺、氨基氧基和馬來酰亞胺的官能團(tuán)。
在另一種實(shí)施方式中，提供了圖8所示的式9-13的化合物。式9-13中，在一種實(shí)施方式中，Rc和G2定義同上，n是約1-500，例如1-200、1-100或1-50?？扇芜x地，n大于500，例如500-700或600-800或1000或以上。
在一種實(shí)施方式中，在式3b-8b和9-13中，Rc和G2至少有一個包含至少一個例如具有式-(CH2CH2O)n-的高分子量聚環(huán)氧乙烷基團(tuán)，其中n大于500，例如500-700或600-800或1000或以上。
包含氨基甲酸酯鍵的化合價平臺分子在另一種實(shí)施方式中，可以修飾如PCT US99/29338和1999年12月8日提交的U.S.系列號09/47,607所述的包含氨基甲酸酯鍵的化合價平臺分子，以包含高分子量聚環(huán)氧乙烷。
在一種實(shí)施方式中，化合價平臺化合物包含氨基甲酸酯鍵，例如具有式Ic、IIc、IIIc、IVc、Vc和VIc所示結(jié)構(gòu)，其中化合價平臺化合物進(jìn)一步包含至少一個高分子量聚環(huán)氧乙烷基團(tuán)式Ic 式IIc 式IIIc 其中n是從1至10的正整數(shù)；y1、y2和y3獨(dú)立地是1或2；J獨(dú)立地表示氧原子或共價鍵；Rc選自具有1至20個碳原子的烴基；僅由碳、氧和氫原子組成的具有1至20個碳原子的有機(jī)基團(tuán)；僅由碳、氧、氮和氫原子組成的具有1至20個碳原子的有機(jī)基團(tuán)；僅由碳、氧、硫和氫原子組成的具有1至20個碳原子的有機(jī)基團(tuán)；各G1、G2和G3獨(dú)立地選自具有1至20個碳原子的烴基；
僅由碳、氧和氫原子組成的具有1至20個碳原子的有機(jī)基團(tuán)；僅由碳、氧、氮和氫原子組成的具有1至20個碳原子的有機(jī)基團(tuán)；各RN獨(dú)立地選自氫；具有1至15個碳原子的直鏈或支鏈烷基；具有1至15個碳原子的包含脂環(huán)族結(jié)構(gòu)的烷基；具有6至20個碳原子的芳族基團(tuán)；具有3至20個碳原子的雜芳族基團(tuán)；各Z獨(dú)立地選自-H-C(＝O)ORCARB-C(＝O)R酯-C(＝O)NRARB其中每個RCARB是含有1至約20個碳原子的有機(jī)基團(tuán)；每個R酯是含有1至約20個碳原子的有機(jī)基團(tuán)；每個基團(tuán)-NRARB獨(dú)立地選自-NH2-NHRA-NRARB-NRAB其中每個一價RA與RB和每個二價RAB獨(dú)立地是包含1至20個碳原子的有機(jī)基團(tuán)，并且還包含反應(yīng)性結(jié)合官能團(tuán)；其中該化合價平臺分子包含至少一個例如具有式-(CH2CH2O)n-的高分子量聚環(huán)氧乙烷基團(tuán)，其中n大于500，例如500-700或600-800或1000或以上。
在一種實(shí)施方式中，所述化合物具有式Ic的結(jié)構(gòu)。在一種實(shí)施方式中，所述化合物具有式Iic的結(jié)構(gòu)。在一種實(shí)施方式中，所述化合物具有式IIIc的結(jié)構(gòu)。在一種實(shí)施方式中，所述化合物具有式Ivc的結(jié)構(gòu)。在一種實(shí)施方式中，n是從2至4的正整數(shù)。在一種實(shí)施方式中，y1、y2和y3各自是2。在一種實(shí)施方式中，J是氧原子。在一種實(shí)施方式中，J是共價鍵。在一種實(shí)施方式中，Rc選自具有1至20個碳原子的烴基。在一種實(shí)施方式中，Rc選自下組-CH2-；-CH2CH2-；-CH2CH2CH2-； 和 在一種實(shí)施方式中，Rc選自僅由碳、氧和氫原子組成的具有1至20個碳原子的有機(jī)基團(tuán)。在一種實(shí)施方式中，Rc是 其中p是從2至20的正整數(shù)。在一種實(shí)施方式中，每個G1、G2和G3獨(dú)立地選自具有1至20個碳原子的烴基。在一種實(shí)施方式中，每個G1、G2和G3是-(CH2)q-，其中q是從1至20的正整數(shù)。在一種實(shí)施方式中，每個G1、G2和G3獨(dú)立地選自僅由碳、氧和氫原子組成的具有1至20個碳原子的有機(jī)基團(tuán)。在一種實(shí)施方式中，每個G1、G2和G3是 其中p是從2至20的正整數(shù)。在一種實(shí)施方式中，RN獨(dú)立地選自-H、-CH3和-CH2CH3。在一種實(shí)施方式中，每個基團(tuán)-NRARB獨(dú)立地選自 和 本發(fā)明的另一方面涉及化合價平臺化合物，其具有下式之一的結(jié)構(gòu)式IVc 式Vc 式VIc 其中n是從1至10的正整數(shù)；y1、y2和y3獨(dú)立地是從1至10的正整數(shù)；J獨(dú)立地表示氧原子或共價鍵；Rc選自下組具有1至20個碳原子的烴基；僅由碳、氧和氫原子組成的具有1至20個碳原子的有機(jī)基團(tuán)；僅由碳、氧、氮和氫原子組成的具有1至20個碳原子的有機(jī)基團(tuán)；僅由碳、氧、硫和氫原子組成的具有1至20個碳原子的有機(jī)基團(tuán)；各G1、G2和G3獨(dú)立地選自具有1至20個碳原子的烴基；僅由碳、氧和氫原子組成的具有1至20個碳原子的有機(jī)基團(tuán)；僅由碳、氧、氮和氫原子組成的具有1至20個碳原子的有機(jī)基團(tuán)；各RN獨(dú)立地選自氫；具有1至15個碳原子的直鏈或支鏈烷基；具有1至15個碳原子的包含脂環(huán)族結(jié)構(gòu)的烷基；具有6至20個碳原子的芳族基團(tuán)；具有3至20個碳原子的雜芳族基團(tuán)；各Z獨(dú)立地選自-H-C(＝O)ORCARB-C(＝O)R酯
-C(＝O)NRARB其中每個RCARB是含有1至約20個碳原子的有機(jī)基團(tuán)；每個R酯是含有1至約20個碳原子的有機(jī)基團(tuán)；每個基團(tuán)-NRARB獨(dú)立地選自-NH2-NHRA-NRARB-NRAB其中每個一價RA與RB和每個二價RAB獨(dú)立地是包含1至20個碳原子的有機(jī)基團(tuán)，并且還包含反應(yīng)性結(jié)合官能團(tuán)；其中該化合價平臺分子包含至少一個例如具有式-(CH2CH2O)n-的高分子量聚環(huán)氧乙烷基團(tuán)，其中n大于500，例如500-700或600-800或1000或以上。
在一種實(shí)施方式中，所述化合物具有式Ivc的結(jié)構(gòu)。在一種實(shí)施方式中，所述化合物具有式Vc結(jié)構(gòu)。在一種實(shí)施方式中，所述化合物具有式VIc結(jié)構(gòu)。在一種實(shí)施方式中，n是從2至4的正整數(shù)。在一種實(shí)施方式中，y1、y2和y3各自是2。在一種實(shí)施方式中，J是氧原子。在一種實(shí)施方式中，J是共價鍵。在一種實(shí)施方式中，Rc選自具有1至20個碳原子的烴基。在一種實(shí)施方式中，Rc選自下組-CH2-；-CH2CH2-；-CH2CH2CH2-； 和
在一種實(shí)施方式中，Rc選自僅由碳、氧和氫原子組成的具有1至20個碳原子的有機(jī)基團(tuán)。在一種實(shí)施方式中，Rc是 其中p是從2至20的正整數(shù)。在一種實(shí)施方式中，每個G1、G2和G3獨(dú)立地選自具有1至20個碳原子的烴基。在一種實(shí)施方式中，每個G1、G2和G3選自下組 和 在一種實(shí)施方式中，每個G1、G2和G3獨(dú)立地選自僅由碳、氧和氫原子組成的具有1至20個碳原子的有機(jī)基團(tuán)。在一種實(shí)施方式中，每個RN獨(dú)立地選自-H、-CH3和-CH2CH3。在一種實(shí)施方式中，每個基團(tuán)-NRARB獨(dú)立地選自下組 式Ic、IIc、IIIc、IVc、Vc和VIc中，在一種實(shí)施方式中，Rc、G1、G2和G3中至少有一個包含至少一個例如具有式-(CH2CH2O)n-的高分子量聚環(huán)氧乙烷基團(tuán)，其中n大于500，例如500-700或600-800或1000或以上。
化合價平臺分子的制備可以對本領(lǐng)域已知的制備化合價平臺分子的方法進(jìn)行修飾，以便在分子中摻入高分子量聚環(huán)氧乙烷。用于制備化合價平臺分子的方法例如描述在美國專利號5,162,515；5,391,785；5,276,013；5,786,512；5,726,329；5,268,454；5,552,391；5,606,047；5,663,395和5,874,409；以及U.S.系列號60/111,641；U.S.系列號09/457,607；PCT WO 00/34231；PCTUS97/10075；U.S.系列號09/590,592和PCT/US/00/15968中。
本領(lǐng)域已知用于制備化合價平臺分子的方法包括例如增殖法或分段法。可以使用適當(dāng)?shù)脑噭┬揎椷@些方法，以在所得分子上提供聚環(huán)氧乙烷基團(tuán)。文中的實(shí)施例描述了示例性的方法。
化合價平臺可以從分段法制備，在該方法中，獨(dú)立地合成各片段然后將其結(jié)合于核心基團(tuán)。核心增殖法的替代選擇是復(fù)接法(iterativeprocess)，它可用于生成樹狀結(jié)構(gòu)。
核心化合物的實(shí)例包括含醇的核心化合物甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇，和甲氧基聚乙二醇、單羥基胺、乙二醇、二甘醇、三甘醇、四甘醇、五甘醇、六甘醇、1，4-雙-(羥甲基)苯和聚乙二醇HO(CH2CH2O)nH，其中例如n是約1-200，例如1-10或1-5，或具有兩個羥基的伯胺或仲胺。核心化合物還可以是如本文所公開的高分子量聚環(huán)氧乙烷分子。
下面是化合價平臺分子的示例性合成，包括高分子量聚環(huán)氧乙烷基團(tuán)和其綴合物。這些實(shí)例涉及以氨基為末端的含有聚環(huán)氧乙烷的平臺中間體的制備。這些氨基用適合與生物學(xué)活性分子結(jié)合的反應(yīng)性基團(tuán)衍生。
圖1顯示如何合成末端氨基被Cbz保護(hù)、核心中的氨基被Fmoc保護(hù)的四聚平臺?；衔?按照美國專利號5,552,391的描述制得。除去Fmoc基團(tuán)，用甲氧基-PEG鏈代替。除去Cbz基團(tuán)，得到游離的四胺，即化合物6，使其轉(zhuǎn)化為四氯乙?；苌?。化合物7可以與任意含有巰基的分子反應(yīng)，生成四價結(jié)合物化合物8。圖1中，n是例如大于500，例如500-800或500-1000。
圖2顯示如何用絲氨酸修飾四胺6，得到化合物9。絲氨酸化合物9經(jīng)歷高碘酸鹽的氧化性裂解，得到末端醛基，它可以與含有氨基氧基或其他可生成穩(wěn)定亞胺的基團(tuán)(酰肼、氨基脲、卡巴肼等)的生物學(xué)活性分子反應(yīng)，生成11所示的肟綴合物。圖2中，n是例如大于500，例如500-800或500-1000。
圖3描述了如何制備PEG置于內(nèi)部作為平臺核心的一部分的高分子量PEG平臺。在這種實(shí)施方式中，將2當(dāng)量化合物13(如美國專利號5,552,391所述制備)與1當(dāng)量化合物12(PEG20K-雙-BTC，ShearwaterPolymers)反應(yīng)制得化合物14。通過氫化或酸解作用除去Cbz保護(hù)基團(tuán)，得到四胺(化合物15)。用氯乙酸酐進(jìn)行氯乙?；玫铰纫阴；钠脚_(化合物16)。將化合物16用含有巰基的生物學(xué)活性分子處理，得到17，即生物學(xué)活性分子的四價平臺綴合物。圖3中，n是例如大于500，例如500-800或500-1000。
圖4描述了如何制備PEG置于平臺臂內(nèi)部的高分子量PEG平臺。在提到環(huán)氧乙烷的聚合物時，“PEG”或“聚乙二醇”或“聚環(huán)氧乙烷”在本文中可互換使用。用TFA除去化合物20中的Boc保護(hù)基團(tuán)，將所得四胺(化合物21)用氯乙酸酐氯乙?；玫铰纫阴；钠脚_(化合物22)。將化合物22用含有巰基的生物學(xué)活性分子處理，得到23，即生物學(xué)活性分子的四價平臺綴合物。圖4中，n是例如大于500，例如500-800或500-1000。
如圖14所示，通過這樣一種過程合成bPEG八聚平臺M，其中使八聚PNP碳酸酯(化合物50a)與化合物133反應(yīng)，生成化合物K。除去化合物K中的Boc保護(hù)基團(tuán)，將所得八胺用化合物106處理，生成化合物L(fēng)。除去化合物L(fēng)中的Boc保護(hù)基團(tuán)，生成化合物M。
如圖15所示，從已經(jīng)結(jié)合有兩條PEG鏈的中間體122合成結(jié)合有兩條PEG鏈的四價氨基氧基平臺。因此使化合物122與NHS酯O(Shearwater Polymers)反應(yīng)生成平臺P。
綴合物、其制備方法和用途術(shù)語“生物學(xué)活性分子”在本文中用于表示優(yōu)選具有體內(nèi)生物活性的分子。例如，生物活性包括與靶結(jié)合。在一種實(shí)施方式中，生物學(xué)活性分子是特異性相互作用于受體蛋白質(zhì)者。在另一種實(shí)施方式中，生物學(xué)活性分子與抗體結(jié)合，如果是體內(nèi)使用的話，抗體可以是循環(huán)中的或者是位于細(xì)胞表面上，例如B細(xì)胞表面。生物學(xué)活性分子包括一種或多種任意長度的核酸(多核苷酸)，包括寡核苷酸；肽；多肽；蛋白質(zhì)；任意類型(例如單克隆、多克隆和抗獨(dú)特型)的抗體，包括其片段；糖；多糖；表位；模擬表位；酶(包括其結(jié)構(gòu)域)；激素；藥物；脂質(zhì)；脂肪酸；和它們的混合物。
根據(jù)平臺的化合價，平臺分子綴合物例如可以包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12個或更多生物學(xué)活性分子，或者例如16、18、32、36個或更多。
生物學(xué)活性分子與包含高分子量聚環(huán)氧乙烷的化合價平臺分子的綴合物可以用作耐受原(它導(dǎo)致對免疫原的免疫應(yīng)答程度的減輕和/或穩(wěn)定化)，可以用于各種關(guān)于降低與疾病有關(guān)的抗體水平的應(yīng)用，因此可用于治療抗體介導(dǎo)的疾病?？捎米鰾細(xì)胞耐受原的用于治療狼瘡的綴合物實(shí)例如圖5所示。在這些實(shí)施方式中，生物學(xué)活性分子一般包含特異性結(jié)合抗雙鏈DNA抗體的核酸，例如美國專利號5,552,391所述?？捎米鰾細(xì)胞耐受原的用于異種移植的綴合物實(shí)例如圖6和PCT WO00/34296所示?；蛘?，本文所公開的綴合物可以包括其他生物學(xué)活性分子，例如活性結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽序列。
本文所用的“治療有效量”表示足以緩和、改善、穩(wěn)定化、逆轉(zhuǎn)、延緩或推遲病癥、例如疾病狀態(tài)的進(jìn)展的量。
在一種實(shí)施方式中，生物學(xué)活性分子包含β2GPI的結(jié)構(gòu)域1多肽或其類似物，例如U.S.系列號60/103,088、1999年6月8日提交的U.S.系列號09/328,199和PCT WO 99/64595所述。綴合物的示例性結(jié)構(gòu)如圖7所示。在一種實(shí)施方式中，多肽不包括β2GPI的結(jié)構(gòu)域4。
結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽含有圖19(SEQ ID NO2)中的至少五個(或更多)相鄰氨基酸，該圖描繪了結(jié)構(gòu)域1。在一種實(shí)施方式中，結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽由(或者在有些實(shí)施方式中，本質(zhì)上由)圖19所示氨基酸序列(SEQ ID NO2)組成，它代表結(jié)構(gòu)域1。
結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽優(yōu)選可特異性結(jié)合β2GPI依賴性抗磷脂抗體。在某些實(shí)施方式中，多肽包含結(jié)構(gòu)域1的片段。在其他實(shí)施方式中，多肽包含構(gòu)象表位。在其他實(shí)施方式中，多肽由結(jié)構(gòu)域1組成。還提供了包含結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽的多肽，其中該多肽缺乏(可檢測的)能夠激活具有β2GPI依賴性抗磷脂抗體的個體T細(xì)胞的T細(xì)胞表位。
結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽可以例如(a)從約第一半胱氨酸至約第四半胱氨酸(當(dāng)從N-末端開始測定時)；(b)從約N-末端至約第五半胱氨酸(更準(zhǔn)確地，第五半胱氨酸之前的最后一個氨基酸)；(c)從約第一半胱氨酸至約第五半胱氨酸。在有些實(shí)施方式中，可以在任意適合的位置加入另外的半胱氨酸，以充當(dāng)綴合的反應(yīng)性基團(tuán)。因此，可以在任意位置包含另外的半胱氨酸(在有些實(shí)施方式中它是β2GPI的第五半胱氨酸)，特別是在C-末端或N-末端或其附近。結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽還可以包含任意下列(或者由其組成，或者本質(zhì)上由其組成)(a)SEQ ID NO2的氨基酸1至氨基酸59；(b)SEQ ID NO2的氨基酸2至氨基酸60；(c)SEQ ID NO2的氨基酸2至氨基酸63；(d)SEQ ID NO2的約氨基酸1至約氨基酸60；(e)SEQ ID NO2的氨基酸1至氨基酸61；和(f)SEQ IDNO2的氨基酸1至氨基酸62。含有第五半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽特別適合于綴合作用。
結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽可特異性地結(jié)合β2GPI依賴性抗磷脂抗體。結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽僅需結(jié)合一個β2GPI依賴性抗磷脂抗體，不過也可能(例如在檢測背景下)結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽結(jié)合一個以上β2GPI依賴性抗磷脂抗體。
結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽的大小可以各不相同，只要滿足必要的官能團(tuán)(基于與β2GPI依賴性抗磷脂抗體的特異性結(jié)合)即可。例如，足以特異性結(jié)合β2GPI依賴性抗磷脂抗體的長度例如可能小至5聚氨基酸序列。在有些實(shí)施方式中，結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽的長度小于約350個氨基酸、長度小于約250個氨基酸、長度小于約150個氨基酸、長度小于約100個氨基酸、長度小于約50個氨基酸、長度小于約25個氨基酸、長度小于約15個氨基酸或長度小于約10個氨基酸。
還可以理解的是，可以向結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽引入某些序列變化，這可以保持或增強(qiáng)其反應(yīng)性。這些變異的和經(jīng)過修飾的序列統(tǒng)稱“功能等價變體”，其在與另一種結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽相比時可以具有相等的、增強(qiáng)的或減弱的結(jié)合性，之所以稱為“等價”是因為它們保留了特異性結(jié)合β2GPI依賴性抗磷脂抗體的能力。
結(jié)構(gòu)域1綴合物可以用在檢測樣本β2GPI依賴性抗磷脂抗體(或特異性結(jié)合結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽的抗體)的方法中，該方法包括，使樣本中的抗體與綴合物在允許穩(wěn)定的抗原-抗體復(fù)合體生成的條件下接觸；檢測所生成的穩(wěn)定復(fù)合體(如果有的話)。綴合物還可以用在誘導(dǎo)個體耐受性的方法中，該方法包括對個體給以有效量的綴合物，特別是包含缺乏T細(xì)胞表位的結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽的綴合物，其中有效量是足以誘導(dǎo)耐受性的量。組合物可以用于例如治療抗體介導(dǎo)的血栓形成。
在另一種實(shí)施方式中，提供了化合價平臺分子與至少一個特異性結(jié)合抗αGal抗體的αGal表位或其類似物的綴合物。在另一方面，提供了減少個體抗αGal抗體的循環(huán)水平的方法，包括對個體給以有效量的綴合物，其中有效量是足以減少抗αGal抗體的循環(huán)水平或者中和抗αGal抗體的循環(huán)水平的量。在另一方面，提供了誘導(dǎo)免疫耐受性(一般對異種移植抗原而言，更具體為αGal)的方法，該方法包括給以有效量的包含αGal表位或其類似物的綴合物。綴合物還可以用于檢測生物樣本中抗αGal抗體的有無和/或含量。還提供了進(jìn)行個體異種移植的方法，包括對個體給以綴合物，再向個體引入異種組織。在另一方面，提供了抑制所移植組織的排斥作用的方法，包括對個體給以綴合物，給藥量足以抑制排斥作用。這些方法一般性地描述在PCT US99/29338中。
綴合物還可以用于狼瘡的免疫耐受性治療，可任選地基于個體最初抗體(也就是與狼瘡有關(guān)的抗體，即抗雙鏈DNA抗體)親和性的評估，并用作選擇治療個體的基礎(chǔ)，或者用在基于評估抗體親和性的鑒別適合(或不適合)治療的個體的方法中。治療個體系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)的方法包括對個體給以綴合物，所述綴合物包含(a)無免疫原性化合價平臺分子，和(b)兩個或多個多核苷酸或其類似物，它們特異性結(jié)合來自個體的特異性結(jié)合雙鏈DNA的抗體。這些方法一般性地描述在PCTUS99/29336中。
因此，化合價平臺可以共價連接一個或多個生物學(xué)活性分子而形成綴合物。生物學(xué)活性分子包括一種或多種任意長度的核酸(多核苷酸)，包括寡核苷酸；肽；多肽；蛋白質(zhì)；任意類型(例如單克隆、多克隆和抗獨(dú)特型)的抗體，包括其片段；糖；多糖；表位；模擬表位；酶(包括其結(jié)構(gòu)域)；激素；藥物；脂質(zhì)；脂肪酸；和它們的混合物。
術(shù)語“蛋白質(zhì)”、“多肽”和“肽”在本文中可互換使用，表示任意長度的氨基酸的聚合物。聚合物可以是直鏈或支鏈的，它可以包含經(jīng)過修飾的氨基酸，并且可以被非氨基酸中斷。它還可以被天然或人工修飾；例如二硫鍵形成、糖基化、肉豆蔻基化、乙?；⑼榛?、磷酸化或脫磷酸化。在該定義內(nèi)還包括含有一個或多個氨基酸類似物(包括例如非天然氨基酸)以及本領(lǐng)域已知的其他修飾的多肽。
化合價平臺綴合物的一個優(yōu)點(diǎn)是增強(qiáng)所結(jié)合的生物學(xué)活性分子對其結(jié)合配體的親和性的能力，例如當(dāng)結(jié)合配體參與聚簇時。大量生物分子與化合價平臺分子的共價結(jié)合提高生物分子的局部濃度，因為它們一起締合在平臺分子上?；蟽r平臺的另一個優(yōu)點(diǎn)是促進(jìn)多個配體結(jié)合的能力，這在B細(xì)胞耐受性中是有用的。例如，綴合物可以用作現(xiàn)有多價表位的耐受原，以誘導(dǎo)B細(xì)胞表面上的簇群。因此，對于作為耐受原的用途，優(yōu)選的是綴合物包含兩個或更多生物學(xué)活性分子或表位?；蟽r平臺的另一個優(yōu)點(diǎn)是在“核心”上包含官能團(tuán)的能力，使核心能夠被獨(dú)立地進(jìn)行修飾以制備能夠適應(yīng)特定目的的綴合物。
為了形成綴合物，一般使包含反應(yīng)性基團(tuán)、例如氨基氧基的分子與第二個包含反應(yīng)性基團(tuán)、例如羰基的分子、例如醛或酮反應(yīng)，生成例如肟綴合物。
在一種實(shí)施方式中，提供了制備天然多肽或蛋白質(zhì)與包含氨基氧基的多價的優(yōu)選無免疫原性化合價平臺分子的化學(xué)上確定的多價綴合物的方法，其中如果需要的話，對多肽進(jìn)行選擇性地修飾，在多肽上的特定位置生成醛或酮部分。多肽然后與含有氨基氧基的多價化合價平臺分子反應(yīng)，在平臺與多肽之間生成一條或更多的肟鍵。事實(shí)上任意多肽或其他分子的胺、例如N-末端的胺都可以通過本領(lǐng)域已知的氨基轉(zhuǎn)移反應(yīng)轉(zhuǎn)化為醛或酮。
另一種在N-末端生成乙醛?；姆椒ㄊ怯酶叩馑徕c氧化N-末端絲氨酸或蘇氨酸。這種氧化作用裂解N-末端絲氨酸或蘇氨酸的羥基與氨基之間的碳-碳鍵，得到乙醛?；?。因此在一種實(shí)施方式中，通過在N-末端生成酮或醛，可以位點(diǎn)特異性地修飾多肽。可以類似地修飾合成多肽和其他藥物或生物學(xué)活性分子，以包括可以用于生成肟鍵的醛或酮。
含有氨基氧基反應(yīng)性基團(tuán)的多價平臺允許經(jīng)過選擇性修飾的多肽共價結(jié)合在平臺上。氨基氧基例如可以是氨基氧基乙?；虬被趸榛?。在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，平臺分子中的氨基氧基是氨基氧基烷基，例如-CH2CH2ONH2。
具有醛或酮官能團(tuán)的生物分子經(jīng)由肟鍵形成而與氨基氧基平臺結(jié)合是可以實(shí)現(xiàn)的。轉(zhuǎn)氨基多肽或者用醛或酮基團(tuán)修飾的多肽可以與氨基氧基平臺反應(yīng)。在一種實(shí)施方式中，將四價平臺用乙醛酰-多肽的酸性水溶液處理，使氨基轉(zhuǎn)移的結(jié)構(gòu)域1結(jié)合于平臺。優(yōu)選的酸性條件是100mMpH4.6的乙酸鈉。在制備四價結(jié)構(gòu)域1綴合物的情況下，使用超過四當(dāng)量、例如六當(dāng)量的氨基轉(zhuǎn)移的結(jié)構(gòu)域1。
圖5的綴合物是按照關(guān)于美國專利號5,552,391圖6B中化合物20-II的描述制備的。將適當(dāng)鹵乙酰化的平臺7、17或23用具有5’-末端硫醇接頭的寡核苷酸(HS(CH2)6OPO3-(CA)10)處理，后者如美國專利號5,552,391實(shí)施例5所述制備。所得寡核苷酸綴合物用互補(bǔ)鏈((TG)10)退火，得到相應(yīng)的四聚雙鏈寡核苷酸綴合物。圖5中，n是例如大于500，例如500-800或500-1000。
圖6的綴合物按照圖5的綴合物所述制備，使用2-[2-(2-硫代乙氧基)乙氧基]乙基3-O-(α-D-吡喃半乳糖基)-β-D-吡喃半乳糖(如PCTUS99/29338所述)代替具有5’-末端硫醇接頭的寡核苷酸。因此，將適當(dāng)鹵乙酰化的平臺7、17或23用2-[2-(2-硫代乙氧基)乙氧基]乙基3-O-(α-D-吡喃半乳糖基)-β-D-吡喃半乳糖處理，得到相應(yīng)的α-1，3-digal綴合物。圖6中，n是例如大于500，例如500-800或500-1000。
本文所引用的所有出版物、專利、專利申請和已公布的專利申請的公開內(nèi)容全文結(jié)合在此作為參考。
借助下列非限制性實(shí)施例可以進(jìn)一步理解本發(fā)明。
實(shí)施例下列實(shí)施例中，使用下列縮寫DCC，1，3-二環(huán)己基碳二亞胺；DIC，1，3-二異丙基碳二亞胺；DBU，1，8-二氮雜二環(huán)并[5.4.0]十一碳-7-烯；NHS，N-羥基琥珀酰亞胺；HOBt，1-羥基苯并三唑；DMF，二甲基甲酰胺。
實(shí)施例1-結(jié)構(gòu)域1多肽的氨基轉(zhuǎn)移作用氨基轉(zhuǎn)移的結(jié)構(gòu)域1(TA/D1)的合成合成如圖20所示。向水和乙酸鈉緩沖液噴以氦，備用。使用具有圖19所示SEQ ID NO2的氨基酸1至63序列的結(jié)構(gòu)域1β2GPI多肽，它描述在1998年6月9日提交的美國臨時申請系列號60/103,088、1999年6月8日提交的U.S.系列號09/328,199和PCT WO 99/64595中。結(jié)構(gòu)域1具有N-末端甘氨酸。在聚丙烯試管內(nèi)將結(jié)構(gòu)域1多肽(10.55mg，1.49μmol)溶于0.5ml H2O，加入4.0ml 2MpH 5.5 NaOAc緩沖液。向混合物加入3.73mg(14.9μmol)CuSO4的0.5ml H2O溶液，然后加入2.75mg(29.9μmol)水合乙醛酸在0.5ml 2M pH5.5 NaOAc緩沖液中的溶液。將混合物保持在氮?dú)夥障拢p微攪拌18小時，此時分析型HPLC顯示反應(yīng)完全，所述分析型HPLC使用4.6mm×250mm，300埃，5μm二苯基柱(Vydac，Hesperia，CA)，在280nm下檢測(1ml/分鐘；梯度25％-45％B，0-20分鐘，A＝0.1％TFA/H2O，B＝0.1％TFA/CH3CN)。大約的保留時間如下D1，13.2分鐘；TA/D1，13.7分鐘；氧化的TA/D1，13.4分鐘。將混合物用H2O稀釋至體積為20ml，過濾，經(jīng)過HPLC純化(22.4mm×250mm，300埃，10μm，二苯基柱(Vydac)；12ml/分鐘；梯度25％-40％B，0-40分鐘，A＝0.1％TFA/H2O，B＝0.1％TFA/CH3CN)。收集由分析型HPLC證實(shí)含有純TA/D1的部分，冷凍干燥，得到5.0mg(48％)TA/D1。該反應(yīng)轉(zhuǎn)化TA/D1中的N-末端甘氨酸為N-末端乙醛酰，因此D1部分具有SEQ ID NO2氨基酸2至63的序列(見圖20)。
實(shí)施例2-化合物125的合成化合物115向8.00g(13.4mmol)化合物13(如美國專利號5,552,391所述制備)的80ml無水DMF溶液中加入4.00g(16.1mmol)N-(芐氧羰基氧基)琥珀酰亞胺(Aldrich Chemical Co.)。將混合物在氮?dú)夂褪覝叵聰嚢?小時，此時將其倒入600ml冰水中，用四份100ml CH2Cl2萃取。合并CH2Cl2層，用100ml H2O洗滌，干燥(Na2SO4)，過濾，濃縮。從庚烷中濃縮有助于使粗產(chǎn)物固化。用EtOAc重結(jié)晶，得到化合物115，為白色固體1H NMR(CDCl3)δ1.26(m，4H)，1.43-1.62(m，8H)，2.05(m，4H)，3.16(q，4H)，3.40(brd s，8H)，4.98(s，2H)，與5.08(s，4H)和5.11(s，2H)重疊，6.31(s，1H)，6.44(s，1H)，7.26-7.38(m，15H)。
三胺化合物116的合成向9.0g(12.3mmol)化合物115的18ml環(huán)己烷與36ml無水乙醇溶液中通入N2氣，使其脫氧。向溶液中加入1.80g10％Pd/C，將混合物在回流下加熱3小時。冷卻后，將混合物通過Celite鹽過濾，用MeOH沖洗。濃縮濾液，使?jié)饪s物從CH2Cl2中濃縮，得到4.20g(87％)化合物116，為灰白色固體。
化合物117的合成向5.39g(21.8mmol)化合物105的10ml無水乙腈溶液中加入3.02g(23.9mmol)CDI(羰基二咪唑)，將混合物在氮?dú)夥障聰嚢?.5小時。將所得溶液中加入到4.20g(10.7mmol)化合物116的15ml無水DMF溶液中，將混合物攪拌2小時，然后倒入500ml冰水中。所得混合物用四份100ml CH2Cl2萃取。合并CH2Cl2層，用100mlH2O洗滌，干燥(Na2SO4)，過濾，濃縮。所得半固體殘余物從10％異丙醇/EtOAc中結(jié)晶，得到4.0g(44％)117，為白色固體1H NMR CDCl3(δ)1.35(m，4H)，1.42(m，4H)，1.49(s，18H)，1.63(m，16H)，2.01(brd s，1H)，2.20(t，4H)，3.23(m，4H)，3.34(m，4H)，3.85(t，4H)，6.34(t，2H)，6.70(t，2H)，7.98(brd s，1H)。
化合物119向3.65g(14.11mmol)9-芴基甲基氯甲酸酯(Fmoc-Cl)的15ml二噁烷溶液中加入3.00g(15.5mmol)化合物118(Bondunov等，J.Org.Chem.(有機(jī)化學(xué)雜志)1995，60卷，6097-6102頁)的15ml二噁烷溶液，然后加入1.95g(14.11mmol)碳酸鉀的30ml H2O溶液。將混合物在室溫下攪拌18小時然后濃縮。使所得的油在50ml 1N NaOH溶液與三份150ml CH2Cl2之間分配。合并CH2Cl2層，干燥(MgSO4)，過濾，濃縮至黃色的油。經(jīng)過硅膠色譜純化(步驟梯度；90/10 EtOAc/AcOH至90/10/1 EtOAc/AcOH/MeOH)，得到3.85g(66％)119，為粘性的油1HNMR CDCl3(δ)3.26(m，4H)，3.39(m，2H)，3.49(m，2H)，3.59(m，2H)，3.65(m，4H)，3.69(m，2H)，4.25(t，1H)，4.60(d，2H)，7.35(t，2H)，7.41(t，2H)，7.59(d，2H)，7.78(d，2H)。
化合物120在0℃下，向3.77g(9.08mmol)化合物119與7.32g(36.3mmol)4-硝基苯基氯甲酸酯的50ml CH2Cl2溶液中加入5.88ml(5.75g，72.6mmol)吡啶。將混合物在室溫和氮?dú)夥障聰嚢?2小時，使混合物在200ml CH2Cl2與四份100ml 10％碳酸氫鈉水溶液之間分配。將CH2Cl2層依次用100ml H2O、100ml 1N HCl和100ml鹽水洗滌。將溶液干燥(MgSO4)，過濾，濃縮，得到橙色的油。經(jīng)過硅膠色譜純化(15/50/35/1 EtOAc/CH2Cl2/己烷/AcOH)，得到2.67g(39％)化合物120，為黃色膠狀物1H NMR(CDCl3)δ3.32(m，4H)，3.52(m，2H)，3.60(m，4H)，3.74(m，2H)，4.23(t，1H)，4.38(m，2H)，4.41(m，2H)，4.57(d，2H)，7.37(m，8H)，7.59(d，2H)，7.78(d，2H)，8.26(重疊的d，4H)；質(zhì)譜(ESI)(M+H)C37H36N3O14的計算值746。實(shí)測值746。
化合物121向482mg(0.612mmol)化合物117的5ml CH2Cl2溶液中加入182mg(0.245mmol)化合物120，然后加入171μl(124mg，1.22mmol)Et3N和26mg(0.490mmol)HOBt。將混合物在室溫下攪拌，直至根據(jù)TLC的判斷(1/9 MeOH/CH2Cl2)反應(yīng)完全。使混合物在300mlCH2Cl2與三份50ml 1N HCl之間分配。將CH2Cl2層用鹽水洗滌，干燥(MgSO4)，過濾，濃縮至黃色的油。經(jīng)過硅膠色譜純化(多步梯度；5/1/94至10/1/89至15/1/84至20/1/79 MeOH/HOAc/CH2Cl2)，得到317mg(63％)化合物121，為粘性白色固體1H NMR(CD3OD)δ1.34(m，16H)，1.43(m，8H)，1.48(s，36H)，1.64(m，24H)，2.20(m，16H)，3.19(m，12H)，3.25-3.52(m，18H)，3.55(m，2H)，3.79(t，8H)，4.16(m，4H)，4.28(t，1H)，4.59(d，2H)，7.33(t，2H)，7.41(t，2H)，7.60(d，2H)，7.84(d，2H)；13C NMR(CD3OD)δ14.6，23.8，26.7，26.7，26.9，27.7，28.8，28.9，30.3，37.1，38.8，39.1，40.3，65.8，66.0，68.1，70.2，70.3，77.3，82.0，121.2，126.0，128.4，129.0，142.9，145.6，157.9，158.2，159.2，176.1，176.3；質(zhì)譜(ESI)(M+2Na)/2 C101H171Na2N15O28的計算值1044。實(shí)測值1044。
化合物122向163mg(79.8mmol)化合物121的2.4ml DMF溶液中加入600μl二乙胺。將混合物攪拌3小時，濃縮。經(jīng)過硅膠色譜純化(多步梯度；10/1/89至12.5/6/86.5至15/1/84 MeOH/濃NH4OH/CH2Cl2)，得到127mg(81％)化合物122，為玻璃狀膠1H NMR(CD3OD)δ1.38(m，16H)，1.48(m，44H)，1.65(m，24H)，2.20(t，16H)，2.83(t，4H)，3.17(t，8H)，3.38(m，16H)，3.63(t，4H)，3.69(t，4H)，3.78(t，4H)，4.21(m，4H)；13C NMR(CD3OD)δ26.7，27.0，27.8，28.8，28.9，30.3，37.1，38.8，39.1，40.3，49.9，66.0，70.4，70.9，77.3，82.0，158.2，159.2，176.1，176.3；質(zhì)譜(ESI)(M+H)C86H162N15O26的計算值1821。實(shí)測值1821。
化合物124b向20mg(11.0μmol)化合物122的5ml DMF溶液中加入103mg(8.8μmol)分子量為11,690g/mol的甲氧基聚乙二醇苯并三唑基碳酸酯(mPEG12K-BTC，化合物123b，Shearwater Polymers)，然后加入5μl(3.6mg，35.9μmol)Et3N。將混合物在室溫下攪拌18小時，濃縮。殘余物經(jīng)過硅膠色譜純化(多步梯度；5/95至15/85至20/80MeOH/CH2Cl2)，得到109mg化合物124b，為蠟狀灰白色固體1H NMR(CDCl3)δ1.37(m，16H)，1.49(m，44H)，1.65(m，24H)，2.20(t，16H)，3.20(q，8H)，3.36(m，16H)，3.61(m，4H)，3.68(m，約1056H)，3.84(t，8H)，3.91(m，4H)，4.23(m，4H)。
化合物124a使用本質(zhì)上與制備化合物124b相同的方法制備該化合物；不過使用分子量為5,215g/mol的甲氧基聚乙二醇苯并三唑基碳酸酯(mPEG5K-BTC，化合物123a，Shearwater Polymers)1H NMR(4∶1CDCl3/CD3OD)δ1.37(m，16H)，1.49(m，44H)，1.65(m，24H)，2.20(t，16H)，3.20(q，8H)，3.36(m，16H)，3.61(m，4H)，3.68(m，約468H)，3.84(t，8H)，3.91(m，4H)，4.23(m，4H)。
化合物124c使用本質(zhì)上與制備化合物124b相同的方法制備該化合物；不過使用分子量為22,334g/mol的甲氧基聚乙二醇苯并三唑基碳酸酯(mPEG20K-BTC，化合物123c，Shearwater Polymers)1H NMR(5∶1CDCl3/CD3OD)δ1.37(m，16H)，1.49(m，44H)，1.65(m，24H)，2.20(t，16H)，3.20(q，8H)，3.36(m，16H)，3.61(m，4H)，3.68(m，約2024H)，3.84(t，8H)，3.91(m，4H)，4.23(m，4H)。
類似地，可以利用所需分子量，例如23,000、25,000、40,000或以上的mPEG-BTC進(jìn)行合成。因此在圖9中，n可任選地大于500，例如為550、600、800或以上。
化合物125b按照本質(zhì)上類似于制備化合物16所述的方式除去化合物124a-c中的B0c保護(hù)基團(tuán)，得到化合物125a-c。
反應(yīng)流程如圖9所示。
實(shí)施例3-化合物129的合成化合物126向14mg(18.6μmol)化合物120與29mg(186.3μmol)HOBT的5ml無水DMF溶液中加入56μl(38mg，373μmol)Et3N。將混合物攪拌1小時，加入85mg(46.6μmol)化合物122的1ml DMF溶液。將混合物在室溫下攪拌5小時，在150ml CH2Cl2與50ml 1N HCl之間分配。將CH2Cl2層用鹽水洗滌，干燥(MgSO4)，過濾，濃縮。經(jīng)過硅膠色譜純化，得到34mg(44％)化合物126，為蠟狀白色固體1H NMR(CD3OD)δ1.37(m，32H)，1.49(m，與在1.48的單峰重疊，88H)1.62(m，48H)，2.20(t，32H)，3.18(t，16H)，3.36(m，32H)，3.50(m，12H)，3.64(m，24H)，3.79(t，16H)4.17(m，12H)，4.29(t，1H)，4.60(d，2H)，7.37(t，2H)，7.43 (t，2H)，7.65 (d，2H)，7.84 (d，2H)；質(zhì)譜(ESI)(M+3Na)/3C197H347Na3N31O601393。實(shí)測值1393。
化合物126的另一種合成方法將吡啶(5ml)加入到裝有136mg(74.7μmol)化合物122、22.3mg(29.9μmol)化合物120與18.3mg(119.5μmol)羥基苯并三唑一水合物(HOBt)的燒瓶內(nèi)。將所得溶液攪拌18小時，在真空下通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去吡啶。經(jīng)過硅膠色譜純化(梯度1/13/86至1/20/79 AcOH/MeOH/CH2Cl2)，得到104mg(85％)化合物126，為白色固體。
化合物127向34mg(8.27μmol)化合物126的1.6ml DMF溶液中加入400μl二乙胺。將混合物在室溫下攪拌4小時，濃縮。濃縮物經(jīng)過硅膠色譜純化(1/10/89濃NH4OH/MeOH/CH2Cl2)，得到13mg(40％)化合物1271H NMR(CD3OD)δ1.35(m，32H)，1.49(m，與在1.48的單峰重疊，88H)，1.63(m，48H)，2.19(t，32H)，3.08(brd t，4H)3.17(t，16H)，3.38(m，36H)，3.52(m，8H)，3.63(t，8H)，3.70(m，12H)，3.78(t，16H)，4.21(m，12H)；質(zhì)譜(ESI)(M+3Na)/3 C182H337Na3N31O581319。實(shí)測值1319。
化合物128向13mg(3.34μmol)化合物127的5ml吡啶溶液中加入60mg(2.68μmol)分子量為22,334g/mol的甲氧基聚乙二醇苯并三唑基碳酸酯(mPEG20K-BTC，Shearwater Polymers)，然后加入5μl(3.6mg，35.9μmol)Et3N。將混合物在室溫下攪拌18小時，濃縮。殘余物經(jīng)過硅膠色譜純化(多步梯度；10/90至15/85至20/80 MeOH/CH2Cl2)，得到45mg化合物128，為蠟狀固體1H NMR(CDCl3)δ1.30(m，32H)，1.50(m，與在1.48的單峰重疊，88H)，1.67(m，48H)，2.24(t，32H)，3.23(m，16H)，3.41(m，32H)，3.65(m，約2024H)，3.70(t，24H)，3.89(m，16H)，4.21(m，12H)。
類似地，可以利用所需分子量，例如23,000、25,000、40,000或以上的mPEG-BTC進(jìn)行合成。因此在圖10中，n可任選地大于500，例如為550、600、800或以上。
化合物129按照本質(zhì)上類似于制備化合物16所述的方式除去化合物128中的Boc保護(hù)基團(tuán)，得到化合物129，如圖10所示。
實(shí)施例4-化合物132的合成化合物131向22mg(27.3μmol)化合物117的5ml吡啶溶液中加入236mg(10.9μmol)分子量為21,529g/mol的聚乙二醇雙苯并三唑基碳酸酯(PEG20K-雙BTC，化合物130，Shearwater Polymers)，然后加入8μl(5.8mg，57.4μmol)Et3N。將混合物在室溫下攪拌18小時，濃縮。殘余物經(jīng)過硅膠色譜純化(多步梯度；5/95至10/90至15/85至20/80MeOH/CH2Cl2)，得到242mg(96％)化合物131，為白色固體1H NMR(CDCl3)δ1.35(m，16H)，1.48(m，44H)，1.61(m，24H)，2.20(m，16H)，3.22(m，8H)，3.52-3.96(m，約2000H)，4.23(m，4H)。
類似地，可以利用所需分子量，例如23,000、25,000、40,000或以上的PEG-雙-BTC進(jìn)行合成。因此在圖11中，n可任選地大于500，例如為550、600、800或以上。
化合物132按照本質(zhì)上類似于制備化合物16所述的方式除去化合物131中的Boc保護(hù)基團(tuán)，得到化合物132。
反應(yīng)流程如圖11所示。
實(shí)施例5-化合物136的合成化合物134向3.87mg(4.85μmol)季戊四醇四-(4-硝基苯基碳酸酯)(通過季戊四醇與對硝基苯基氯甲酸酯的反應(yīng)制備，得到四對-硝基苯基碳酸酯化合物)的5ml吡啶溶液中加入124mg(24.2μmol)分子量為5094g/mol的單-Boc-保護(hù)的二氨基聚乙二醇(化合物133，BocNH-PEG(5K)-NH2，Shearwater)和5μl(3.63mg，35.9μmol)Et3N。將混合物攪拌18小時，濃縮。殘余物經(jīng)過硅膠色譜純化(步驟梯度；5/95至15/85 MeOH/CH2Cl2)，得到77mg(77％)化合物134，為白色固體1HNMR(CDCl3)δ1.48(s，36H)，3.32(m，16H)，3.52-3.96(m，約1818H)，4.10(m，8H)。
類似地，可以利用所需分子量，例如23,000、25,000、40,000或以上的BocNH-PEG-NH2進(jìn)行合成。因此在圖12中，n可任選地大于500，例如為550、600、800或以上。
化合物106的合成向磁攪拌的5.2g(20.2mmol，1.1當(dāng)量)二琥珀酰亞氨基碳酸酯的200ml乙腈溶液中加入4.54g(18.3mmol，1.0當(dāng)量)化合物105的100ml乙腈溶液。加入吡啶(2.67ml，2.61g，33.03mmol，1.8當(dāng)量)，將混合物攪拌過夜。濃縮混合物，將殘余物溶于20ml二氯甲烷。有機(jī)層用兩份20ml 1N HCl和20ml飽和NaCl水溶液洗滌。將有機(jī)層干燥(MgSO4)，過濾，濃縮，得到5.7g黃色的油。將一部分該物質(zhì)(2.732g)進(jìn)一步經(jīng)過硅膠色譜純化(15/85丙酮/甲苯)，得到4.38g(68％)化合物106，為無色的油。1H NMR CDCl3(δ)1.48(s，9H)，1.51(m，2H)，1.68(p，2H)，1.79(p，2H)，2.63(t，2H)，2.84(br.s，4H)，3.87(t，2H)，7.18(br.s，1H)；13C NMR CDCl3(δ)24.32，25.07，25.53，27.42，28.16，30.77，76.13，81.51，156.89，168.45，169.15。
化合物135將化合物134(77mg，3.73μmol)溶于5ml三氟乙酸，將混合物放置3小時。在N2氣流下除去TFA，將殘余物溶于5ml CH2Cl2。向所得溶液中加入7.72mg(22.4μmol)化合物106的5ml CH2Cl2溶液，然后加入35μl(25.4mg，251μmol)Et3N(注意應(yīng)當(dāng)檢查混合物的pH，相應(yīng)地用Et3N調(diào)節(jié)之，以確定它是堿性的)。將混合物在氮?dú)庀聰嚢?8小時。使混合物在50ml CH2Cl2與三份25ml 1N HCl之間分配。將CH2Cl2層用鹽水洗滌，干燥(MgSO4)，過濾，濃縮。經(jīng)過硅膠色譜純化(步驟梯度；5/95至10/90 MeOH/CH2Cl2)，得到42mg(53％)化合物135，為蠟狀固體1H NMR(CDCl3)δ1.40(m，8H)，1.48(s，36H)，1.66(m，16H)，2.18(t，8H)，3.32(m，16H)，3.38-3.89(m，約1818H)，4.10(m，8H)，4.97(t，4H)，6.43(t，4H)，7.47(s，4H)。
化合物136按照本質(zhì)上類似于制備化合物16所述的方式除去化合物135中的Boc保護(hù)基團(tuán)，得到化合物136，如圖12所示。
實(shí)施例6-化合物143的合成化合物137在氮?dú)夥障?，?℃的200mg(1.11mmol)3，5-二氨基苯甲酸乙酯的5ml CH2Cl2溶液中加入928μl(674mg，6.66mmol)Et3N。向混合物中滴加510μl(710mg，3.33mmol)6-溴己酰氯的5ml CH2Cl2溶液。將混合物在室溫下攪拌1.5小時，在50ml 1N HCl與兩份50mlCH2Cl2之間分配。將CH2Cl2層用飽和碳酸氫鈉溶液洗滌，干燥(MgSO4)，過濾，濃縮。產(chǎn)物經(jīng)過硅膠色譜純化(6/4己烷/EtOAc)，得到554mg(93％)油狀的化合物137，為油1H NMR(CDCl3)δ1.39(t，3H)，1.52(m，4H)，1.75(m，，4H)，1.90(m，4H)，2.40(t，4H)，3.42(t，4H)，4.36(q，2H)，7.60(s，2H)，7.88(s，2H)，8.17(s，1H)。
化合物138將DBU(612μl，623mg，4.01mmol)加入到547mg(1.02mmol)化合物137與272mg(2.05mmol)N-(叔丁氧羰基)羥胺(Aldrich Chemical Co.)的溶液中。將混合物在室溫下攪拌18小時，在50ml 1N HCl與三份50ml CH2Cl2之間分配。合并CH2Cl2層，干燥(MgSO4)，過濾，濃縮。產(chǎn)物經(jīng)過硅膠色譜純化(1/1己烷/EtOAc)，得到216mg(33％)化合物138，為白色固體，mp 55-60℃1H NMR(CDCl3)δ1.38(t，3H)，1.48(s，18H；掩蓋的m，4H)，1.60(m，4H)，1.73(m，4H)，2.40(m，4H)，3.86(t，4H)，4.36(q，2H)，7.41(s，2H)，7.90(s，2H)，8.06(s，2H)，8.11(s，1H)；質(zhì)譜(ESI)(M+Na)C31H50NaN4O10的計算值661。實(shí)測值661。
化合物139向205mg(0.32mmol)化合物138的1/1丙酮/EtOH溶液中加入256μl(2.56mmol)10N NaOH，將混合物加熱至60℃達(dá)4小時。冷卻后，使混合物在50ml 1N HCl與四份50ml 4/1 CH2Cl2/MeOH之間分配。合并有機(jī)層，干燥(MgSO4)，過濾，濃縮。產(chǎn)物經(jīng)過硅膠色譜純化(3/97/1 MeOH/CH2Cl2/HOAc)，得到184mg(94％)化合物139，為粘性的油1H NMR(CDCl3)δ1.38(m，4H)，1.42(s，18H)，1.60(m，4H)，1.70(m，4H)，2.38(m，4H)，3.80(t，4H)，7.77(s，2H)，8.00(s，2H)，8.11(s，1H)，8.91(s，2H)；質(zhì)譜(ESI)(M+Na)C29H46NaN4O10的計算值633。實(shí)測值633。
化合物140向0℃的164mg(0.268mmol)化合物139的2.0ml無水THF溶液中加入31mg(0.268mmol)N-羥基琥珀酰亞胺，然后加入83mg(0.403mmol)DCC。使混合物恢復(fù)至室溫，在氮?dú)夥障聰嚢?8小時，加入200μl HOAc。將混合物繼續(xù)攪拌一小時，用大約5ml的EtOAc稀釋，放置一小時。過濾除去形成的沉淀，濃縮濾液。經(jīng)過硅膠色譜純化(3/97MeOH/CH2Cl2)，得到129mg(68％)化合物140，為白色固體1H NMR(CDCl3)δ1.40(m，4H)，1.43(s，18H)，1.65(m，4H)，1.80(m，4H)，2.34(m，4H)，2.93(s，4H)，3.85(t，4H)，7.68(s，2H)，7.87(s，2H)，8.36(s，1H)，8.61(s，2H)。
化合物142向60mg(0.85mmol)化合物140的0.5ml CH2Cl2溶液中加入14μl(13.3mg，0.168mmol)吡啶。將混合物冷卻至0℃，加入71mg(0.021mmol)二氨基-PEG(化合物141)的0.5ml CH2Cl2溶液。將混合物在氮?dú)夥蘸褪覝叵聰嚢?8小時，然后在10ml 1N HCl與三份10ml CH2Cl2之間分配。合并CH2Cl2層，干燥(MgSO4)，過濾，濃縮。經(jīng)過硅膠色譜純化(步驟梯度；5/95 MeOH/CH2Cl2至10/90 MeOH/CH2Cl2)，得到66mg(69％)化合物142，為粘性的油1H NMR(CDCl3)δ1.45(s，36H)，1.60-1.80(m，24H)，2.39(t，8H)，3.39(m，8H)，3.50-3.80(brd s，約318H)，3.87(t，8H)，4.22(t，4H)，7.50(brd s，2H)，7.63(s，4H)，7.77(s，2H)，8.08(s，2H)，8.60(s，2H)；質(zhì)譜(MALDI)(M+H)C207H389N12O93的計算值4535。實(shí)測值分布中心位于大約4324。
類似地，可以利用所需分子量的化合物141進(jìn)行合成，例如n可任選地大于500，例如為550、600、800或以上，如圖13所示。
化合物143按照本質(zhì)上類似于制備化合物16所述的方式除去化合物142中的Boc保護(hù)基團(tuán)，得到化合物143，如圖13所示。
化合物302的合成向209mg(9.36μmol)化合物123c與8.84mg(11.2μmol)化合物117的5ml無水吡啶溶液中加入3.26μl(2.36mg，23.4μmol)三乙胺。將混合物在N2氣氛下攪拌18小時，在真空下通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去吡啶，殘余物通過制備型HPLC在22mm×250mm氨基丙基二氧化硅柱上純化(梯度，10％A至30％B，歷經(jīng)60分鐘；A＝H2O，B＝CH3CN)，得到200mg(93％)化合物302。
化合物303的合成按照本質(zhì)上類似于制備化合物16所述的方式除去化合物302中的Boc保護(hù)基團(tuán)，得到化合物303。
化合物304的合成向4.43ml(4.48g，30.2mmol)2，2’-(亞乙二氧基)雙(乙胺)(Aldrich Chemical Co.)的50ml EtOAc溶液中加入1.04g(3.0mmol)化合物106的溶液。過濾除去所生成的沉淀。濃縮濾液，將殘余物溶于100ml CH2Cl2，與50ml 1N NaOH一起搖動。含水層用四份50ml CH2Cl2萃取，合并所有CH2Cl2萃取液，濃縮至黃色的油。經(jīng)過硅膠色譜純化(1.25/13.75/85濃NH4OH/MeOH/CH2Cl2)，得到520mg(46％)化合物304，為淡黃色油。
化合物305的合成向500mg(23.2μmol)化合物130的9ml無水吡啶溶液中加入21.9mg(58.1μmol)化合物304的1ml吡啶溶液，然后加入26μl(18.8mg，186μmol)三乙胺，將混合物在氮?dú)夥障聰嚢?8小時。在真空下通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去吡啶，殘余物通過制備型HPLC在22mm×250mm氨基丙基二氧化硅柱上純化(梯度，13％A至33％B，歷經(jīng)60分鐘；A＝H2O，B＝CH3CN)，得到428mg(84％)化合物305。
化合物306的合成按照本質(zhì)上類似于制備化合物16所述的方式除去化合物305中的Boc保護(hù)基團(tuán)，得到化合物306(圖17)。
實(shí)施例7-綴合物的制備方法綴合物200、201、202、203、204和205(圖7)按照如下描述制備。
化合物200向68.8mg(9.74μmol，6當(dāng)量)TA/D1在10ml噴以氦的0.1M，pH 4.6乙酸鈉緩沖液中的溶液中加入36.8mg(1.62μmol)化合物125c在6.15ml 1/1乙腈/0.1M，pH8.0 TRIS乙酸鹽緩沖液中的溶液。小心地保持混合物在氮?dú)夥障拢瑫r在室溫下攪拌18小時。當(dāng)反應(yīng)完全時，直接經(jīng)過陽離子交換色譜使用由PolyLC Inc.制造的PolyCat AWCX柱純化(梯度，10％B至25％B，A＝10mM磷酸鈉pH7的1/9乙腈/H2O溶液)，得到57mg(40％)化合物200。
化合物201按照本質(zhì)上與化合物200相似的方式制備化合物201。因此，向6當(dāng)量TA/D1在噴以氦的0.1M pH4.6乙酸鈉緩沖液中的大約1mM溶液中加入1當(dāng)量化合物125a，后者是在1/1乙腈/0.1M，pH8.0TRIS乙酸鹽緩沖液中的0.25至10mM溶液。小心地保持混合物在氮?dú)夥障?，同時在室溫下攪拌18小時。當(dāng)反應(yīng)完全時，直接經(jīng)過陽離子交換色譜純化，得到化合物201。
化合物202按照本質(zhì)上與化合物200相似的方式制備化合物202。因此，向6當(dāng)量TA/D1在噴以氦的0.1M pH4.6乙酸鈉緩沖液中的大約1mM溶液中加入1當(dāng)量化合物132，后者是在1/1乙腈/0.1M，pH8.0TRIS乙酸鹽緩沖液中的0.25至10mM溶液。小心地保持混合物在氮?dú)夥障?，同時在室溫下攪拌18小時。當(dāng)反應(yīng)完全時，直接經(jīng)過陽離子交換色譜純化，得到化合物202。
還分離出了兩種低價的少量雜質(zhì)。分離到由聚丙烯酰胺凝膠電泳和質(zhì)譜證明結(jié)合有三個結(jié)構(gòu)域1多肽的化合物，稱之為202三聚物。還分離到由聚丙烯酰胺凝膠電泳和質(zhì)譜證明結(jié)合有兩個結(jié)構(gòu)域1多肽的化合物，稱之為202二聚物。
化合物203按照本質(zhì)上與化合物200相似的方式制備化合物203。因此，向6當(dāng)量TA/D1在噴以氦的0.1M pH4.6乙酸鈉緩沖液中的大約1mM溶液中加入1當(dāng)量化合物136，后者是在1/1乙腈/0.1M，pH8.0TRIS乙酸鹽緩沖液中的0.25至10mM溶液。小心地保持混合物在氮?dú)夥障拢瑫r在室溫下攪拌18小時。當(dāng)反應(yīng)完全時，直接經(jīng)過陽離子交換色譜純化，得到化合物203。
化合物204按照本質(zhì)上與化合物200相似的方式制備化合物204。因此，向6當(dāng)量TA/D1在噴以氦的0.1M pH4.6乙酸鈉緩沖液中的大約1mM溶液中加入1當(dāng)量化合物143，后者是在1/1乙腈/0.1M，pH8.0TRIS乙酸鹽緩沖液中的0.25至10mM溶液。小心地保持混合物在氮?dú)夥障拢瑫r在室溫下攪拌18小時。當(dāng)反應(yīng)完全時，直接經(jīng)過陽離子交換色譜純化，得到化合物204。
化合物205按照本質(zhì)上與化合物200相似的方式制備化合物205。因此，向6當(dāng)量TA/D1在噴以氦的0.1M pH4.6乙酸鈉緩沖液中的大約1mM溶液中加入1當(dāng)量化合物125b，后者是在1/1乙腈/0.1M，pH8.0TRIS乙酸鹽緩沖液中的0.25至10mM溶液。小心地保持混合物在氮?dú)夥障?，同時在室溫下攪拌18小時。當(dāng)反應(yīng)完全時，直接經(jīng)過陽離子交換色譜純化，得到化合物205。
化合物300按照本質(zhì)上與化合物200相似的方式制備化合物300。因此，向12當(dāng)量TA/D1在噴以氦的0.1M pH4.6乙酸鈉緩沖液中的大約1mM溶液中加入1當(dāng)量化合物129，后者是在1/1乙腈/0.1M，pH8.0TRIS乙酸鹽緩沖液中的0.25至10mM溶液。小心地保持混合物在氮?dú)夥障?，同時在室溫下攪拌18小時。當(dāng)反應(yīng)完全時，直接經(jīng)過陽離子交換色譜純化，得到化合物300(圖16)。
化合物309按照本質(zhì)上與化合物200相似的方式制備化合物309。因此，向3當(dāng)量TA/D1在噴以氦的0.1M pH4.6乙酸鈉緩沖液中的大約1mM溶液中加入1當(dāng)量化合物303，后者是在1/1乙腈/0.1M，pH8.0TRIS乙酸鹽緩沖液中的0.25至10mM溶液。小心地保持混合物在氮?dú)夥障?，同時在室溫下攪拌18小時。當(dāng)反應(yīng)完全時，直接經(jīng)過陽離子交換色譜純化，得到化合物303。
化合物310按照本質(zhì)上與化合物200相似的方式制備化合物310。因此，向3當(dāng)量TA/D1在噴以氦的0.1M pH4.6乙酸鈉緩沖液中的大約1mM溶液中加入1當(dāng)量化合物306，后者是在1/1乙腈/0.1M，pH8.0TRIS乙酸鹽緩沖液中的0.25至10mM溶液。小心地保持混合物在氮?dú)夥障?，同時在室溫下攪拌18小時。當(dāng)反應(yīng)完全時，直接經(jīng)過陽離子交換色譜純化，得到化合物310(圖18)。
實(shí)施例8-耐受原效力和血清半衰期的評價制備結(jié)構(gòu)域1-匙孔血藍(lán)蛋白綴合物(D1 CYS-KLH)用于動物免疫。利用桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)，在昆蟲細(xì)胞內(nèi)將具有第五半胱氨酸的重組結(jié)構(gòu)域1表達(dá)為與谷胱甘肽混和的二硫化物。結(jié)構(gòu)組成為存在于天然的人β2-糖蛋白I中的前66個氨基-末端氨基酸，繼之為C-末端leu-(his)5表達(dá)標(biāo)簽。位于C-末端上的多聚組氨酸表達(dá)標(biāo)簽是鎳親和色譜純化步驟的基礎(chǔ)。Iverson等(1998)Proc.Nat′l.Acad.Sci.(美國國家科學(xué)院院報)9515542-15546。
用馬來酰亞氨基-KLH烷基化所得到的具有游離巰基的結(jié)構(gòu)域1(D1 CYS-SH)。按照廠商的指導(dǎo)，將馬來酰亞氨基-活化的KLH(PierceChemical Co.；Rockford，IL)按10mg/ml溶于水。立即向D1 CYS-SH加入KLH，每mg D1-SH加入1.27mg。通過在室溫下旋轉(zhuǎn)試管2小時，使KLH與D1 CYS混和。培育結(jié)束時，利用＞25,000MW截留膜在4℃下將內(nèi)容物對冷的PBS進(jìn)行透析以除去未綴合的D1 CYS。取經(jīng)過透析的樣本，用來自患者的親和純化的抗磷脂抗體(aPL)通過ELISA法檢測免疫反應(yīng)性D1的存在。
利用致免疫的大鼠模型測定耐受原效力。i.p.給以含有百日咳佐劑的在明礬中的10μg D1 CYS-KLH，使Lewis大鼠(Harlan Sprague Dawley，Indianapolis，IN)致免疫。接觸抗原后三周，每四只動物為一組，i.v.給以耐受原或PBS對照。處理后五天，i.p.給以10μgD1 CYS-KLH進(jìn)行加強(qiáng)，加強(qiáng)后七天，采集血清樣本。
利用ELISA法檢測大鼠血清中的抗結(jié)構(gòu)域1抗體。在4℃下，將Nunc Maxisorp Immunoplates(Nalge Nunc International，Rochester，NY)用50μl 5μg/ml重組人β2-GPI的碳酸鹽緩沖溶液(Sigma，St.Louis，MO)，pH 9.6包被過夜。隨后的步驟是在室溫下進(jìn)行的。將平板用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗滌3次，然后用250μl 2％脫脂奶粉(Carnation，Solon，OH)的PBS溶液封閉1小時。洗滌后，將小孔用50μl在PBS中連續(xù)稀釋的每種血清樣本培育1小時，一式三份。使用未免疫的血清作為對照，使用從致免疫的動物采集的混合血清生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。洗滌后，將小孔用50μl在PBS/0.1％BSA中按1∶2000稀釋的與堿性磷酸酶綴合的山羊抗大鼠IgG(Jackson ImmunoResearch，West Grove，PA)培育1小時。將小孔用dIH2O洗滌3次，用PPMP溶液(10mg酚酞單磷酸鹽(Sigma，St.Louis MO)、97.4ml 2-氨基-2-甲基-1-丙醇(Sigma)、9.62ml dIH2O、21mlHCl)顯色20分鐘。用50μl 0.2M Na2HPO4終止顯色，在Bio-TekInstruments PowerWave 340微孔板分光光度計(Winooski，VT)上讀取OD550。將標(biāo)定的抗體單位指定給標(biāo)準(zhǔn)的混合血清，從標(biāo)準(zhǔn)曲線推導(dǎo)供試血清中抗結(jié)構(gòu)域1抗體的濃度(單位/ml)。用綴合物200、201、202和203處理，并與PBS處理的對照相比，計算多價平臺綴合物對抗結(jié)構(gòu)域1抗體的抑制百分率。結(jié)果如下表1所示。
表1致免疫大鼠中抗結(jié)構(gòu)域1抗體的抑制百分率

在小鼠、大鼠和獼猴中測量化合物的血漿藥動學(xué)。利用一氯化碘法將化合物用125I進(jìn)行放射性標(biāo)記。Contreras等，1983，Methods inEnzymology(酶學(xué)方法)92277-292。將經(jīng)過標(biāo)記的化合物i.v.注射給雌性Balb/c小鼠、雄性Sprague-Dawley大鼠和雌性Cynomologous獼猴。在小鼠中經(jīng)過1小時、在大鼠和獼猴中經(jīng)過24小時采集血漿樣本。利用Packard Instruments Cobra Gamma計數(shù)器(Dowers Grove，Ill.)檢測放射性標(biāo)記的藥物的量。利用Pharsight WinNonLin軟件(MountainView，Ca.)計算藥動學(xué)參數(shù)。利用式t1/2＝ln2(AUC/0.5*Cmax)計算總血漿半衰期。所有三種動物的清除率(CL，ml/小時)和半衰期(t1/2，小時)如下表2所示。
表2小鼠、大鼠和獼猴中的藥動學(xué)參數(shù)

權(quán)利要求
1.化學(xué)上確定的化合價平臺分子，其包含至少一個高分子量聚環(huán)氧乙烷基團(tuán)。
2.權(quán)利要求1的化合價平臺分子，其包含至少2個高分子量聚環(huán)氧乙烷基團(tuán)。
3.權(quán)利要求1的化合價平臺分子，其中該高分子量聚環(huán)氧乙烷基團(tuán)的分子量大于22,000道爾頓。
4.權(quán)利要求1的化合價平臺分子，其中該高分子量聚環(huán)氧乙烷基團(tuán)的分子量至少為40,000道爾頓。
5.權(quán)利要求1的化合價平臺分子，其中該高分子量聚環(huán)氧乙烷基團(tuán)具有下式-(CH2CH2O)n-其中n大于500。
6.權(quán)利要求5的化合物平臺分子，其中n大于600。
7.權(quán)利要求5的化合物平臺分子，其中n大于700。
8.權(quán)利要求5的化合物平臺分子，其中n大于800。
9.權(quán)利要求1的化合價平臺分子，其中該化合價平臺分子包含一個核心基團(tuán)和至少三條臂，其中每條臂包含一個末端。
10.權(quán)利要求9的化合價平臺分子，其中的核心基團(tuán)包含高分子量聚環(huán)氧乙烷基團(tuán)。
11.權(quán)利要求9的化合價平臺分子，其中至少一條所述的臂包含高分子量聚環(huán)氧乙烷基團(tuán)。
12.權(quán)利要求9的化合價平臺分子，其中的高分子量聚環(huán)氧乙烷基團(tuán)結(jié)合于核心或臂上。
13.組合物，其包含權(quán)利要求1的化合價平臺分子，其中該分子的多分散性小于1.2；其中該組合物中該高分子量聚環(huán)氧乙烷基團(tuán)的平均分子量至少是18,000。
14.權(quán)利要求1的化合價平臺分子，其包含至少三個反應(yīng)性綴合基團(tuán)，所述基團(tuán)選自羥基、硫醇、異氰酸酯、異硫氰酸酯、胺、烷基鹵化物、烷基汞鹵化物、醛、酮、羧酸鹵化物、α-鹵代羰基、α，β-不飽和羰基、鹵代甲酸酯、羧酸、羧酸酯、羧酸酐、O-酰基異脲、酰肼、馬來酰亞胺、亞氨酸酯、磺酸酯、磺酰鹵、α，β-不飽和砜、氨基氧基、氨基脲和β-氨基硫醇。
15.權(quán)利要求1的化合價平臺分子，其包含至少3個氨基氧基。
16.權(quán)利要求1的化合價平臺分子，其包含至少3個氨基甲酸酯基團(tuán)。
17.權(quán)利要求1的化合價平臺分子與生物學(xué)活性分子的綴合物。
18.權(quán)利要求17的綴合物，其中的生物學(xué)活性分子選自多(糖)、多(氨基酸)、核酸和脂質(zhì)。
19.權(quán)利要求17的綴合物，其中的綴合物是B細(xì)胞耐受原。
20.權(quán)利要求18的綴合物，其中的生物學(xué)活性分子包含可特異性結(jié)合抗雙鏈DNA抗體的核酸或其類似物。
21.權(quán)利要求19的綴合物，其中的生物學(xué)活性分子是β2GPI結(jié)構(gòu)域1多肽或其類似物。
22.權(quán)利要求21的綴合物，其中的綴合物對于抗體介導(dǎo)的血栓形成的治療是有效的。
23.權(quán)利要求18的綴合物，其中的生物學(xué)活性分子是特異性結(jié)合抗αGal抗體的αGal表位或其類似物。
24.藥學(xué)上可接受的組合物，其包含權(quán)利要求17的綴合物和藥學(xué)上可接受的載體。
25.化學(xué)上確定的化合價平臺分子與包含β2GPI結(jié)構(gòu)域1多肽的多肽的綴合物，其中的綴合物包含至少一個高分子量聚環(huán)氧乙烷基團(tuán)。
26.權(quán)利要求25的綴合物，其中該化合價平臺分子包含至少3個氨基氧基。
27.權(quán)利要求25的綴合物，其中的化合價平臺分子包含至少3個氨基甲酸酯基團(tuán)。
28.權(quán)利要求25的綴合物，其中的高分子量聚環(huán)氧乙烷基團(tuán)的分子量大于22,000道爾頓。
29.權(quán)利要求25的綴合物，其中的化合價平臺分子包含一個核心基團(tuán)和至少三條臂，其中每條臂包含一個末端。
30.權(quán)利要求25的綴合物，其中的多肽可特異性結(jié)合β2GPI依賴性抗磷脂抗體。
31.權(quán)利要求30的綴合物，其中的多肽缺乏能夠激活具有β2GPI依賴性抗磷脂抗體之個體的T細(xì)胞的T細(xì)胞表位。
32.權(quán)利要求25的綴合物，其中的β2GPI結(jié)構(gòu)域1多肽包含至少五個圖19的相鄰氨基酸(SEQ ID NO2)。
33.權(quán)利要求25的綴合物，其中的β2GPI結(jié)構(gòu)域1多肽包含SEQID NO2的氨基酸No.2-63。
34.權(quán)利要求25的綴合物，其中該綴合物選自圖7所示的化合物200、202、203和205和圖16所示的化合物300，其中在所述結(jié)構(gòu)中的D1是由SEQ ID NO2的氨基酸No.2-63組成的多肽。
全文摘要
本發(fā)明提供了包含高分子量聚環(huán)氧乙烷基團(tuán)的化合價平臺分子及其與生物學(xué)活性分子的綴合物以及它們的制備方法。高分子量聚環(huán)氧乙烷基團(tuán)的分子量為例如大于22,000道爾頓，例如至少40,000道爾頓。在一種實(shí)施方式中，提供了包含化合價平臺分子的組合物，其中該分子的多分散性小于約1.2。還提供了化合價平臺分子與生物學(xué)活性分子的綴合物，所述生物學(xué)活性分子是例如糖、多(糖)、氨基酸、多(氨基酸)、核酸或脂質(zhì)。還提供了包含如本文所公開的綴合物和藥學(xué)上可接受的載體的藥學(xué)上可接受的組合物以及制備和使用這些綴合物和組合物的方法。
文檔編號A61K48/00GK1434726SQ01810807
公開日2003年8月6日 申請日期2001年6月7日 優(yōu)先權(quán)日2000年6月8日
發(fā)明者D·S·瓊斯 申請人:拉卓拉藥物公司