用于產生感染性流感病毒的dna轉染系統的制作方法

專利名稱：用于產生感染性流感病毒的dna轉染系統的制作方法
技術領域：
本發明涉及從克隆DNA中產生感染性RNA病毒，優選流感病毒的基于最少質粒的系統的發展。特別是這個多質粒pol I-pol II系統利于重組和重配病毒的產生。在優選實施方案中，本發明包括八質粒polI-pol II系統以產生流感病毒。它在完全從克隆cDNA回收其它RNA病毒中也具有適用性。
背景技術：
RNA病毒生活史RNA病毒基因組有不同的構型，包括單分子的或節段的；(+)或(-)極性單鏈的或雙鏈的。然而，病毒間享有的兩個基本的共同的必要條件是(1)基因組RNA應該可被高效復制為可有效用于裝配成后代病毒顆粒的形式和(2)必須合成可高效翻譯為病毒蛋白的mRNA。通常，RNA病毒(除了逆轉錄病毒)編碼和/或攜帶RNA依賴性RNA聚合酶催化新的基因組RNA(裝配給后代)和mRNA(翻譯為病毒蛋白)的合成。由于真核宿主細胞典型地不含復制RNA模板或由負鏈或雙鏈RNA模板翻譯多肽的裝置，所以在其基因組中含這些核酸的病毒在病毒顆粒中應該攜帶RNA聚合酶蛋白。由于這個原因，負鏈和雙鏈RNA病毒的去蛋白質的RNA分子(缺乏相關的RNA聚合酶)是非感染性的。相比之下，來自正鏈RNA病毒基因組的去蛋白質RNA典型地是感染性的，因為編碼的病毒蛋白可被宿主細胞裝置翻譯。
為了病毒的傳遞，基因組病毒RNA應該被包裝到病毒顆粒中。一些RNA病毒殼體被來自感染的宿主細胞的脂類膜包裹，而其它具有外部病毒蛋白殼不含脂質雙層的膜。不管病毒殼體間的差異，后代病毒顆粒裝配方法和裝配過程中發生的蛋白/蛋白間的相互作用是相似的。病毒蛋白通常分為結構和非結構蛋白。通常，非結構蛋白參與基因組復制、轉錄和包裝的調節。結構蛋白通常執行三種類型的功能，包括(1)結合基因組RNA(即甲型流感病毒的核殼蛋白)，(2)包裝RNA和外部蛋白之間搭橋(即基質蛋白)和(3)建立病毒外層(即表面蛋白如血凝素)。裝配到病毒顆粒中確保RNA基因組從單個宿主內或不同的宿主生物體中的一個宿主細胞傳遞給另一個。
流感病毒甲型流感病毒，正粘病毒科(Orthomyxoviridae)，是基因組節段化的負義RNA病毒。基因組RNA含有與5’和3’末端非編碼序列相連接的一個或多個開放閱讀框架(Desselberger等，Gene 1980，8315)。病毒RNA與病毒粒體和感染細胞中的病毒核蛋白(NP)和聚合酶蛋白(PB1，PB2和PA)結合形成核糖核蛋白(RNP)復合體(Hsu等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1987，848140)。其遺傳成分允許這個病毒通過來自不同菌株的基因節段的重配而進化；該重配產生新的變異體，新轉染的生物體不具有記憶免疫反應。在水生鳥中傳播的15個血凝素(HA)和9個神經氨酸酶(NA)亞型流感中，已知H1N1，H2N2和H3N2三個亞型可引起人類大流行(Webster等，Microbiol.Rev.1992，56152)。有證據表明豬可以作為中間宿主(“混合載體”)產生對人類致病性的新菌株(Scholtissek等，Virology 1985，147287)。1997年香港H5N1甲型流感爆發表明高度致病性的甲型流感病毒也可以從鳥種直接傳播給人(Claas等，Lancet 1998，351472；Suarez等，J.Virol.1998，726678；Subbarao等，Science 1998，279393；Shortridge，Vaccine 1999，17(Suppl.1)S26-S29)。甲型流感病毒從自然儲畜宿主的大量傳播菌株產生新的致病性菌株，表明疾病控制需要監測這些病毒和發展改良的抗病毒治療和疫苗。新菌株發展的速度要求警戒此監測效果，并擴大當前技術能力以產生足夠量的對抗新鑒定的致病性菌株的疫苗來預防流行或大流行。
對于甲型流感病毒，反向遺傳學系統允許病毒基因組的操作(Palese等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1996，9311354；Neumann和Kawaoka；Adv.Virus Res.1999，53265)。與正鏈病毒(即脊髓灰質炎病毒)，甲型流感病毒的負義病毒RNA(vRNAs)是非感染性的。只有四個病毒聚合酶復合體蛋白(PB1，PB2，PA，NP)包殼的vRNA分子能夠啟動病毒復制和轉錄循環。核糖核蛋白(RNPs)穿透細胞核后，有關蛋白開始將(-)vRNA轉錄為mRNAs和正義互補RNAs(+)cRNAs。這些cRNAs作為vRNAs合成的模板。流高病毒A發展的第一個反向遺傳系統是RNA轉染方法(Luytjes等，Cell 1989，591107；Enami等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1990，873802)。T7RNA聚合酶體外轉錄病毒樣vRNA和病毒核糖核蛋白(vRNP)分子重構后，遺傳改變的RNP節段通過轉染被導入真核細胞中。流感輔助病毒的感染導致具有來自克隆cDNA的基因的病毒產生。然而，RNA和DNA轉染方法中輔助病毒的存在嚴格限制了這些方法的實際價值，因為需要強大的選擇系統去除輔助病毒。
RNA聚合酶I(pol I)驅動的vRNA分子的體內合成的建立允許細胞內產生RNA復合體(Neumann和Hobom，Virology 1994，202477)。在這個系統中，病毒樣cDNA插入在pol I啟動子和終止序列之間(Zobel等.，Nucl.Acids Res.1993，213607)。與RNA聚合酶II(pol II)合成的mRNA轉錄物不同，pol I產生的RNAs缺乏5’帽和3’聚(A)尾巴。用輔助病毒感染或編碼PB1，PB2，PA或NP的蛋白表達質粒共轉染可以產生功能性vRNP蛋白(Neumann和Hobom，見上；Flick等，RNA 1996，21046；Pleschka等，J.Virol.1996，704188；Zhou等，Virology 1998，24683)。
近來的研究證明質粒驅動的由pol I啟動子的全部八個vRNAs的表達和聚合酶復合體蛋白的共表達導致感染性甲型流感病毒形成(Neumann等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1999，969345；Fodor等，J.Virol.1999，739679)。因為完全由質粒驅動的甲型流感病毒的產生不需要輔助病毒感染，所以不需要選擇系統；因此，可沒有技術限制地操作所有基因節段。在Neumann等(前述)發展的系統中，八個cDNAs插入在人pol I啟動子序列(407bp)和小鼠終止序列(174bp)之間。人巨細胞病毒啟動子驅動四個RNP-復合體蛋白的表達。12個質粒轉染106293T細胞產生103pfu以上的病毒回收率；17個質粒轉染后，這個效率可以增加到5×107pfu。Fodor等(前述)發展的系統，其中八個cDNAs插入在人pol I啟動子序列(250bp)和δ肝炎病毒的基因組核酶序列之間，確保vRNA的精確3’末端。對于聚合酶復合體基因的表達，使用含腺病毒2型主要晚期啟動子的質粒。12個表達質粒轉染給Vero細胞后，從106個轉染細胞中僅回收到一個或兩個感染性病毒顆粒。
然而，Neumann等(前述)描述的無輔助病毒的系統，它在不同的質粒上含有帶流感病毒cDNAs的pol I和pol II啟動子，需要構建和共轉染至少12個質粒用于回收病毒，和17個質粒用于高效回收病毒。用這種許多數量的質粒轉染細胞可能將這個系統的應用限制于具有高轉染效率的細胞系。為能夠從不同的細胞類型中回收病毒，可以通過增強甲型流感病毒在這些細胞中的復制而增加病毒產量，和增加適合制備疫苗的細胞范圍(Govorkova等，J.Virol.1996，705519)。
因此，本領域需要更有效地產生重組流感病毒。而且，本領域進一步需要有效產生重配病毒用于對新鑒定病毒株發生反應的疫苗的制備。通過提供從一個模板合成病毒基因組負鏈RNA節段(vRNA)和病毒mRNA的系統，由此使病毒產生所需的質粒數量降至最少并允許高效和可預知的重配，本發明滿足了本領域的這些和其它需要。
呼腸孤病毒來自呼腸弧病毒科(Reoviridae)的病毒，包括輪狀病毒屬的病毒，包含雙鏈的和節段化的RNA基因組。人輪狀病毒是美國兒童嚴重腹瀉的最常見病毒物，每年引起大約50,000人住院治療和20至50人死亡，估計每年費用是10億美元。在發展中國家，估計輪狀病毒引起腹瀉相關的全部住院治療的三分之一并引起每年大約850,000人死亡。
存在報道輪狀病毒血清型的雙系統是由于兩種病毒蛋白(VP)，VP7和VP4激發的中和反應。VP7血清型指定為G型，來自VP4的血清型描述為P型。迄今為止，在人類中發現了至少10種G血清型和至少7種P血清型。由于VP4和VP7基因分別分離，所以新的輪狀病毒是重配產生的。在美國，血清型P1至P4和G1至G4是最常見的；在如印度和埃及的國家報道了其它組合。第一個許可的人輪狀病毒疫苗-恒河猴輪狀病毒疫苗，配制產生了對抗四種普通血清型G1至G4的血清型特異性保護。然而，這個疫苗由于疫苗接種和疫苗接受者套疊率增加之間的關聯而被撤回。因此，需要產生不具有不需要的副作用的表現所有G和P亞型的輪狀病毒疫苗。本發明提供了可用于完全從克隆cDNA產生輪狀病毒的載體，(優選質粒)，方法和宿主細胞。
已經確定了十三種初級基因產物。為使混亂降至最少和利于與來自呼腸弧病毒科其它屬的功能相似的蛋白的比較，采用下列命名法根據它們在SDS-PAGE分析中的遷移，從最大的蛋白開始，結構蛋白給予前綴“VP”，非結構蛋白給予前綴“NSP”，在括號中給出每個蛋白的功能。例如，縮寫VP1(Pol)表示在病毒顆粒中最大的蛋白是RNA依賴性RNA聚合酶。七個結構蛋白裝配到病毒顆粒，病毒顆粒包含三層結構(1)含dsRNA基因組的內病毒核具有三個與之結合的蛋白，其中兩個(VP1(pol)和VP3(Cap))與基因組直接結合，而第三個(VP2(T2))構成核殼，(2)病毒粒體的中間蛋白殼是由260個三聚體單位排列成的780個VP6(T13)分子組成的，和(3)VP4和VP7組成外殼。峰蛋白VP4含有對切割成VP5和VP8重要的胰蛋白酶切割位點，這個切割可增強感染性。發現來自不同框內閱讀框架的兩種形式的VP7，VP7(1)和VP7(2)摻入在病毒粒體中。
關于六種非結構蛋白的功能知之甚少。與其它RNA病毒類似，預期非結構蛋白在病毒復制、轉錄、病毒RNAs的翻譯和包裝中起著重要作用。實質上，基于溫度敏感性病毒節段8的分析，假定NSP2(ViP)在病毒復制中有直接作用。認為NSP3結合病毒mRNAs3’末端的保守序列和細胞帽結合蛋白eIF4G，由此特異性上調具有5’帽結構但不含3’聚A尾巴的輪狀病毒mRNA翻譯。NSP1看來不重要，但它可能在細胞培養中輪狀病毒的復制中起活躍作用。認為NSP4參與病毒形態形成。兩種非結構蛋白，NSP5和NSP6由來自節段11的兩個不同的閱讀框架編碼，但不知道它們在病毒生活史中的功能。
復制循環在37℃下10-12小時內完成。當前資料表明病毒可通過受體介導的胞吞進入細胞，但可能有進入細胞的可替換機制。進入宿主細胞后，病毒外殼將轉錄活性雙殼顆粒釋放到感染細胞的細胞質。病毒粒體關聯酶產生5’帶帽無聚腺苷酸的mRNAs，該mRNAs是每個病毒粒體基因組節段負鏈的全長轉錄物。來自每個節段的病毒mRNAs執行兩個功能第一，它們被翻譯產生該節段編碼的病毒蛋白，和第二，病毒mRNAs也是基因組復制的模板。基因組節段裝配由選擇形成precore RI的不同病毒mRNAs而發生。11個mRNAs裝配之后是負鏈合成，它發生在“core-RI”和VP6(T13)-RI，它們存在于感染細胞的細胞質中發現的“病毒胞漿”中。后代病毒粒體形態形成中的后續步驟是輪狀病毒獨特的并包括在涉及NSP4的過程中雙層顆粒出芽到內質網中。這導致顆粒暫時需要被膜，當加入VP4和VP7的病毒粒體外殼時，該被膜在最后成熟步驟中失去。
節段化的基因組，非常有序的基因組結構和復雜的復制循環構成開發反向遺傳系統產生輪狀病毒的挑戰。然而，本發明可用于簡單和方便地產生輪狀病毒。
流感疫苗公共衛生部門當前許可用在美國和歐洲的流感疫苗是滅活流感疫苗。代表流行病學上重要的甲型流感和乙型流感株的病毒在含胚雞卵中生長且病毒顆粒用化學方法隨后純化和滅活。每年WHO選擇最可能會傳播的亞型當前為甲型流感的兩株(H1N1)和(H3N2)，和乙型株。
對于安全和有效的疫苗制備，所選疫苗株與傳播株密切相關是很重要的，由此確保疫苗接種人群中的抗體能夠中和抗原類似的病毒。然而，不是所有發現密切相關的病毒都適合制備疫苗，因為它們在卵中很少生長。因此，最好試圖產生高度生長的重配病毒將實驗株(A/PR/8/34)的病毒產量高(H1N1)與預期致病株的抗原特性結合。不幸的是，用含八個節段的兩個流感病毒共轉染理論上產生28＝256個不同的后代病毒。為了獲得具有所需糖蛋白抗原的高生長病毒，需要選擇方法從親本高生長實驗株中去除相應的基因節段。獲得具有適當糖蛋白的病毒的選擇步驟和基因構象(Constellation)的證實是麻煩和耗時的工作。盡管RNP轉染系統(Luytjes等，Cell 1989，591107)降低了后代病毒的可能數量，仍需要一個好的選擇方法。
鼻內給予減毒活流感病毒疫苗誘導局部、粘膜、細胞介導和體液免疫反應。看來含減毒活流感甲型/Ann Arbor/6/60(H2N2)或乙型/Ann Arbor/1/66的六個內部基因，和同期野生型流感病毒的血凝素(HA)和神經氨酸酶(NA)的冷適應(ca)重配(CR)病毒被可靠減毒。該疫苗看來對兒童和年輕成人有效。然而，它可能過度減毒而不能刺激過中年的人引起理想的免疫反應，在美國每年有20,000-40,000個個體的大群體由于流感感染而死亡。盡管已經報道了ca病毒內部基因的序列，仍未很好確定每個節段對減毒表型的貢獻。只有通過將特定的確定的減毒突變循序導入病毒中才可獲得這個信息。盡管RNP轉染方法允許將突變導入流感的基因組中，但需要選擇系統和體外重建病毒RNPs的技術困難限制了使用內部基因操作。
因此，本領域需要發展重組流感疫苗，它避免使用輔助病毒，在培養物(卵或細胞培養物)中生長良好，可靠地允許發展可增殖用于新疫苗開發的重配病毒，并提供系統突變來發展減毒活病毒株用于鼻內疫苗接種。本發明滿足了本領域的這些和其它需要。
發明概述本發明有利地提供了含RNA聚合酶I(pol I)啟動子和pol I終止子序列的表達質粒，所述序列插在RNA聚合酶II(pol II)啟動子和多腺苷酸化信號之間。表達質粒這里稱作pol I-pol II系統，雙啟動子表達系統或雙啟動子表達質粒。這種質粒最好含有插在pol I啟動子和終止信號之間的RNA病毒基因節段。優選，RNA病毒是流感病毒(如甲型流感或乙型流感病毒)。
本發明包括用于從克隆基因或cDNA產生感染性RNA病毒的基于質粒的兩個系統。在一個系統(雙向系統)中，基因或cDNA位于上游pol II啟動子和下游pol I啟動子之間。從pol II啟動子轉錄基因或cDNA產生帶帽的正義病毒mRNA，從pol I啟動子轉錄產生負義不帶帽的vRNA。在另一系統(單向系統)中，基因或cDNA位于pol I和pol II啟動子的下游。pol II啟動子產生帶帽的正義病毒mRNA，polI啟動子產生不帶帽正義病毒cRNA。
本發明基于最少質粒的系統允許從克隆的病毒cDNA產生感染性RNA病毒。這種系統包括一組質粒，其中每個質粒包含一個RNA病毒的自主(autonomous)病毒基因組節段。在每個質粒中，病毒cDNA，相當于自主病毒基因組節段，被插在RNA聚合酶I(pol I)啟動子和終止子序列之間，由此導致vRNA表達，它反過來又插在RNA聚合酶II(pol II)啟動子和多腺苷酸化信號之間，由此導致病毒mRNA表達。因此，這個系統采用雙向質粒技術，并允許有效重配產生在很好地適應于細胞培養中生長的背景株中或來自減毒株的對應于當前傳播的致病株的RNA病毒(如就流感NA和HA基因而言)，優選病毒是甲型流感病毒或乙型流感病毒。
本發明提供了包含該基于質粒的系統的宿主細胞用于產生感染性病毒粒體，和產生RNA病毒病毒粒體的方法，該方法包括在允許產生病毒蛋白和vRNA的條件下培養該宿主細胞。
該基于質粒的系統，宿主細胞和產生病毒粒體的方法特別適合制備RNA病毒特異性疫苗。這種方法包括純化病毒粒體。純化的病毒粒體能被滅活或可被減毒。本發明的疫苗可用于接種對抗RNA病毒感染。例如，可肌肉內注射給予保護劑量的含滅活病毒粒體的疫苗。可供選擇地，可將保護劑量的含減毒病毒粒體的疫苗鼻內給予受試者。
本發明進一步提供了重配病毒病毒粒體，和含這種病毒粒體(包括滅活和減毒病毒粒體)的疫苗組合物。
在另一個有利實施方案中，本發明提供了產生減毒RNA病毒的方法。這個方法包括使基于質粒的系統中一個或多個病毒基因突變，然后確定該系統制備的感染性RNA病毒是否被減毒。這種減毒可用于開發鼻內疫苗，包括效能增強可在對當前減毒疫苗無反應性的老年人或其它人群中引起保護性免疫的鼻內疫苗。
附圖簡述

圖1pol I-pol II轉錄系統合成vRNA和mRNA的略圖表示。八個流感病毒節段每個的cDNA插在pol I啟動子(PIh)和pol I終止子(tI)之間。這個poI I轉錄單位側翼與人巨細胞病毒的pol II啟動子(PIICMV)和編碼牛生長激素的基因的多腺苷酸化信號(aIIBGH)相連接。八個表達質粒轉染后，合成兩種類型的分子。從人pol I啟動子，細胞內pol I合成了負義vRNA。合成的vRNA在5’和3’末端含有非編碼區。由pol II的轉錄物產生含5’帽結構和3’聚A尾巴的mRNAs；這些mRNAs翻譯為病毒蛋白。病毒cDNA的ATG是pol II轉錄起始位點下游的第一個ATG。
圖2產生甲型流感病毒的八個質粒pol I-pol II系統。含插在人pol I啟動子和pol II啟動子之間的八個病毒cDNAs的八個表達質粒(見圖1)轉染真核細胞。因為每個質粒含有兩種不同的啟動子，細胞的pol I和pol II都會轉錄質粒模板，推測在不同的核隔室內，導致病毒mRNAs和vRNAs合成。合成病毒聚合酶符合蛋白(PB1，PB2，PA，NP)后，病毒復制循環啟動。最終，直接(pol II轉錄)或間接(pol I轉錄和病毒復制)源自細胞轉錄和翻譯裝置的所有病毒分子的裝配導致所有合成的分子(vRNPs和結構蛋白HA，NA，M1，M2，NS2/NEP)間的相互作用而產生感染性甲型流感病毒。
圖3A和圖3B開發用于構建和轉染八個表達質粒以回收A/Teal/HK/W312/97(H6N1)的方法的略圖表示。A.從病毒顆粒中提取病毒RNA。用含節段特異性核苷酸和IIs型限制性核酸內切酶BsmBI或BsaI的序列的引物進行RT-PCR。用BsmBI或BsaI消化八個病毒PCR節段并插入pHW2000(用BsmBI線性化)。這個插入產生八個表達構建體，其中病毒cDNAs與pol I啟動子和終止子(空矩形中的病毒末端序列AGC…ACT表示PB2節段)精確融合。B.含pol I啟動子和pol II啟動子的八個表達質粒含有每個八個節段的病毒cDNAs的一個拷貝。10個病毒蛋白的開放閱讀框架側翼與節段特異性非編碼區(灰框)相連接。因為使用的人pol I啟動子僅在源自人或相關物種的細胞系中表現出高活性，所以人293T細胞與用于甲型流感病毒的標準細胞系(MDCK-細胞)一起共同培養。轉染后293T細胞中產生的病毒可接著感染MDCK細胞和復制。
圖4A和圖4BRT-PCR描述回收病毒的特性。A.MDCK細胞上轉染細胞上清傳代兩次(見表1和2)后，從病毒顆粒中提取RNA。用NS基因節段特異性引物和從病毒粒體中提取的vRNA進行RT-PCR。使用的NS引物不是株特異性的；因此，允許擴增任何甲型流感病毒NS節段。反應產物在2％瓊脂糖凝膠上電泳。為了確保擴增的DNA片段源自vRNA，不是來自從轉染細胞中帶出的質粒DNA，執行一個不加入反轉錄酶(RT)(-)的反應。泳道1和2，重組A/Teal/HK/W312/97(表1)；泳道3和4，M重配(表2)；泳道5和6，NS重配(表2)；泳道7和8，重組A/WSN/33病毒(表1)；泳道9和10，四倍重配(表2)。B.A中所示片段的NcoI消化。也用擴增產物的序列分析證實NS節段的同一(未顯示)。
圖5單向RNA pol I-pol II轉錄系統。在單向pol I-pol II轉錄系統中，病毒cDNA以正義方向插在人pol I啟動子(pIh)和終止子序列(tI)之間。這個完整pol I轉錄單位側翼與pol II啟動子(pIICMV人巨細胞病毒的立早啟動子)和編碼牛生長激素的基因的聚腺苷酸位點(aIIbgh)連接。轉染后，期望合成兩種類型的RNA轉錄物。pol I合成了在其5’末端帶三磷酸基的正義cRNA，pol II合成了帶5’帽結構和在其3’末端帶聚(A)尾巴的正義mRNA。mRNA的兩個元件是有效翻譯所需的。
圖6含串聯排列的pol I和pol II啟動子的克隆載體pHW11。該質粒含有225bp的人RNA pol I啟動子(pIh)和33bp的小鼠終止子(tI)。pol I啟動子和終止子序列側翼與人巨細胞病毒的RNA聚合酶II啟動子和編碼牛生長激素的多腺苷酸化信號(aIIBGH)連接。為了病毒cDNA插入在pol I啟動子和終止子之間，引入兩個BsmBI限制性位點(下劃線表示)。用BsmBI消化載體產生帶有粘性但不是互補突出末端的載體片段。這個載體的設計允許病毒cDNA與pol I啟動子和終止子序列以正義方向精確融合。對于大腸桿菌中的繁殖，質粒具有復制起點(ori)，為了在含氨芐西林的培養基中的選擇，質粒含有β內酰胺酶基因(bla)。
圖7A和7B用于產生感染性RNA病毒的雙啟動子系統。由于RNA病毒功能如同細胞寄生蟲，它們必須優化用宿主細胞表達其遺傳信息的策略。所有RNA病毒必須合成能夠被翻譯為蛋白的mRNAs。通常，復制，轉錄和產生新的后代病毒顆粒需要合成的蛋白。對于基因組RNAs的有效復制，應該制備帶精確5’和3’末端的RNA轉錄物。
本系統包括外部和內部轉錄單位。內部轉錄單位包括啟動子(p(+RNA)或p(-RNA))，優選pol I啟動子。RNA病毒的cDNAs由側翼與非編碼區(NCR)相連的一個或多個開放閱讀框架(ORF)組成。優選，沒有序列插在病毒cDNA和啟動子之間。缺乏插入序列很重要，因為基因組vRNA的5’和3’末端通常含有轉錄和復制所需病毒蛋白識別的序列；額外的非病毒序列典型地防礙病毒蛋白對vRNA的有效識別和復制。缺乏插入序列允許轉錄的(-)鏈RNA(A)或(+)鏈RNA(B)可被病毒聚合酶蛋白有效使用。外部轉錄單位具有啟動子(p(mRNA))，優選指導從cDNA轉錄mRNA的pol II啟動子；mRNA包括翻譯起始和病毒蛋白產生所需的5’序列(如甲基G帽)和3’序列(如聚A尾巴)。由于翻譯過程可以忍受外部轉錄單位的啟動子和病毒cDNA間的額外序列，因此內部轉錄單位的插入序列的存在不顯著妨礙mRNA翻譯。
這個系統可以修改和改善用于除了流感病毒之外的RNA病毒，方式是通過在內部轉錄單位中使用不同的啟動子(如pol II，pol m，T3，SP6，T7或用于DNA依賴性RNA聚合酶的任何其它啟動子)和細胞內合成帶正確5’和3’末端的病毒RNA的終止元件或核酶(在下討論)。可使用錘頭核酶或δ肝炎病毒(HDV)核酶產生帶精確末端的病毒RNA(Schnell等，EMBO J.1994，134195；Pleschka等，J.Virol.1996，704188；Herold，J.等，J.Virol 2000，74(14)6394-400)。
外部轉錄單位可以包含pol I或II啟動子，T7RNA聚合酶啟動子，T3RNA聚合酶啟動子，SP6RNA聚合酶啟動子，或任何其它DNA依賴性RNA聚合酶的啟動子。如果外部轉錄單位中的啟動子指導缺乏甲基G帽的轉錄物的合成，那么內部核糖體進入位點(IRES)可位于cDNA編碼序列的5’末端以利于翻譯起始(在下討論)。
值得注意的是載體pHW2000在CMV啟動子和終止位點之間具有T7啟動子。pol II轉錄物在核內合成，而T7轉錄物在表達T7RNA聚合酶的細胞的細胞質中合成。因此，由外部轉錄單位的一個以上啟動子起始的轉錄物可產生得到不同的mRNAs。因此，源自pHW2000的表達質粒允許快速估計pol II或T7啟動子或二者組合是否是具有內部核糖體進入位點(IRES)的正鏈病毒mRNA合成最佳的。
圖8產生(+)鏈RNA病毒的雙啟動子系統。本發明也可以調整以產生含正鏈、單分子基因組的病毒，如丙型肝炎病毒。在這個實施方案中，含丙型肝炎病毒基因組的cDNA插入允許cDNA在細胞內有效轉錄為mRNA和全長負RNA(雙向方法)或mRNA和全長正RNA(單向方法)的構建體中。cDNA由側翼與非編碼區(NCR)相連的一個開放閱讀框架(ORF)組成。在圖中，顯示了含雙向系統的表達質粒。全長cDNA插在pol I(pI)啟動子和終止序列(tI)之間，轉染后引起全長(-)鏈RNA合成。
內部轉錄單位側翼與具有驅動mRNA合成的啟動子(p(mRNA))的外部轉錄單位連接。優選，這個啟動子是pol II啟動子。然而，如果合成的RNA具有內部核糖體進入位點(IRES)，那么可以用pol I，pol III，SP6，T7或T3啟動子(使用T3或T7啟動子需要T3或T7聚合酶蛋白通過編碼該聚合酶的質粒共轉染或使用表達該聚合酶的穩定細胞系而表達)替換pol II啟動子。在外部轉錄單位的3’末端，多聚A信號或插入的多聚A序列用于提供合成的mRNA的多聚A尾巴。
所得mRNA翻譯為大的多蛋白前體，它被在翻譯同時和翻譯后切割產生各個結構和非結構病毒蛋白。
非結構蛋白NS5a和NS5b，是RNA依賴性RNA聚合酶蛋白，它們使用內部轉錄單位合成的(-)RNA作為模板啟動病毒復制/轉錄循環。因此，產生了用于翻譯為蛋白的(+)RNA/mRNA。最終產生了含(+)RNA和病毒結構蛋白的感染性病毒。
圖9產生人副流感病毒III的pol I-pol II系統。本發明也可用于產生含負鏈單分子RNA基因組的副流感病毒III。病毒cDNA可以按正義或反義方向插入pol I-pol II系統中。圖中顯示了單向系統。polI啟動子指導cRNA合成，pol II啟動子指導mRNA合成。在這個實施方案中，pol II啟動子產生多順反子mRNA，第一個開放閱讀框架由它有效翻譯為核殼(NP)蛋白。這個蛋白是復制所需的。在分開的表達質粒中制備編碼L和P蛋白的質粒并共轉染，該蛋白也是復制和轉錄中重要的(但不能從多順反子mRNA有效翻譯)。與Durbin，A.P.等，Virology 1997，235(2)323-332開發的反向遺傳學系統相比，polI-pol II系統具有幾個優點。通過從同一cDNA表達NP，這個最小的質粒系統僅需要構建和轉染三個而不是四個質粒來完全從克隆cDNA中產生人副流感病毒III。不象反向遺傳系統基于從T7啟動子進行體內轉錄，pol I-pol II系統完全由每個細胞中發現的真核DNA依賴性RNA聚合酶驅動。而且，驅動T7RNA聚合酶表達的痘苗病毒感染需要使用痘苗病毒許可的而不是對人副流感病毒生長最佳的細胞，因此限制了這個方法產生感染性病毒的實用性。痘苗病毒嚴重的細胞病變作用和使用感染性物質所需的安全預防措施是這個系統不期望的特征。使用pol I-pol II系統消除了病毒感染的必要并允許使用LLC-MK2細胞進行人副流感病毒III的轉染和生長，因此提供了更簡單更安全方法產生減毒病毒的技術。
圖10從克隆cDNA產生輪狀病毒的基于質粒的系統。這個系統可用于產生含節段化的雙鏈RNA基因組的病毒(如輪狀病毒)。它可應用于，例如呼腸孤病毒科(Reoviridae)(10，11，12dsRNA節段)或雙RNA病毒科(Birnaviridae)(2dsRNA節段)成員的病毒。迄今為止，對于呼腸孤病毒科的病毒，得不到反向遺傳系統。這幅圖闡明了使用本發明的方法可如何產生具有11個dsRNA節段的輪狀病毒，但對環狀病毒(10dsRNA節段)或正呼腸孤病毒(Orthoreoviruses)(12dsRNA節段)屬成員可采用相似的系統。
下列討論闡明了完全從克隆cDNA產生輪狀病毒A/SA11。已經確定了猿輪狀病毒雙鏈RNA基因組的全部11個節段。基因組中dsRNAs長度從3302bp至663bp，完整基因組的大小是18,550bp。依照PAGE(聚丙烯酰胺凝膠電泳)分析的遷移率增加的順序，將基因組節段編號為1-11。節段完全堿基配對，正義鏈含有5’末端帽結構(m7GpppGmGPy)但在其3’末端附近不含有聚腺苷酸化信號。所有基因組節段共有短的保守性5’和3’末端，在5’末端10個核苷酸一致和在3’末端8個核苷酸一致。緊接在這些末端區內部，在每個基因中，具有節段特異性的至少30-40個核苷酸的第二個保守區。5’非翻譯區(NTRs)長度變化但都少于50個核苷酸，且在所有節段中，NTRs在第一個AUG后都跟著至少一個長的開放閱讀框架。節段9和11編碼兩個蛋白。3’-NTRs長度從17nts(節段1)至182nts(節段10)變化。
將輪狀病毒cDNA克隆至雙啟動子系統，優選pol I-pol II系統。所得質粒轉染到合適的宿主細胞后，產生了病毒RNAs和蛋白，它導致感染性輪狀病毒形成。優選，單向轉錄系統用于產生輪狀病毒。使用這個方法使得細胞內合成在它們的5’末端具有三磷酸的輪狀病毒基因組的11個(+)RNA分子。病毒樣mRNA的表達導致病毒蛋白表達。病毒蛋白VP3(帽)，具有鳥苷酸轉移酶和甲基轉移酶活性，催化5’帽結構添加到全部11個輪狀病毒(+)RNA(Chen D.，等，Virology1999，265120-130)中。事實上，以前已經證明了純化的VP4(帽)，藍舌病毒(BTV)的輪狀病毒VP3(帽)類似物，可在體外將帽結構加到病毒樣(+)RNA中(Ramadevi N.，等Proc Natl Acad Sci U S A.1998，95(23)13537-42)。期望體內cDNA轉錄和細胞內表達VP3(帽)蛋白，導致全部11個輪狀病毒基因組節段的帶帽RNA產生。那些mRNAs翻譯為病毒蛋白或被包裝成precore-RI。VP6(T13)-RI顆粒形成后，正義mRNA用作合成(-)RNA的模板。最終，在形態形成過程中添加VP4和VP7產生感染性后代病毒粒體。
由于復制和形態形成有效起始可能依賴于每個病毒蛋白的最佳濃度，故產生分開的質粒進行RNA合成和蛋白表達可能是有利的。然而，改變宿主細胞中質粒的數量或對mRNA合成使用不同的啟動子可優化蛋白表達水平，所以對于一個節段使用兩個質粒可能對大多數基因不是必需的。由于(+)RNA是從(-)RNA合成的，(-)RNA和蛋白的細胞內表達可能導致復制有效單位產生，它產生病毒mRNA。因此，雙啟動子系統允許建立含質粒數量比當RNA和蛋白表達質粒在分開的質粒上時所需的22個顯著減少的最少質粒系統。可以用用于產生甲型流感病毒的相似方式產生輪狀病毒。
圖11A-DRNA病毒基因組的復制和mRNA合成。
(A)在(-)鏈病毒感染過程中，病毒聚合酶蛋白合成mRNAs節段化RNA病毒的一個和兩個mRNAs或含單分子基因組的病毒的多個mRNAs。抗終止機制導致全長(+)鏈合成，它可復制成(-)基因RNA中。
(B)復制雙義RNA病毒的節段化基因組形成一個mRNA；從互補物合成第二個RNA。
(C)在雙鏈RNA病毒感染的細胞中，首次合成的mRNAs可翻譯為蛋白或用作合成(-)鏈合成的模板，產生雙鏈基因組RNA。
(D)對于(+)鏈病毒，基因組RNA也是mRNA并復制成可拷貝成(+)基因組RNA的(-)鏈RNA。一些(+)RNA病毒的mRNAs不含有多聚A尾巴。在有些家族，產生一個或多個亞基因組RNAs。
發明詳述所有RNA病毒的生活史包括RNA合成和在蛋白合成后病毒顆粒的裝配；這些功能提供了可用于從克隆cDNA產生RNA病毒的本發明反向遺傳學系統的概念框架。本發明通過建立產生負鏈節段化病毒(如甲型流感病毒、乙型流感病毒，Bunyaviridae)、非節段化負鏈RNA病毒(如副粘病毒科(Paramyxoviridae)，Mononegavirales)、雙鏈RNA病毒(如呼腸孤病毒科，雙RNA病毒科(Birnaviridae))和正鏈RNA病毒(如黃病毒科(Flaviviridae)，小RNA病毒科(Picornaviridae)，冠形病毒科(Coronaviridae)，披膜病毒科(Togaviridae))的雙啟動子系統簡化和改善了當前已有反向遺傳學系統。因為本發明的系統使用單一病毒cDNA進行蛋白合成和基因組RNA合成，所以這個系統降低了病毒生產所需質粒的數量并允許快速和廉價地開發疫苗。
如果要使用本發明生產含節段化RNA基因組的病毒，那么將相當于靶基因組中每個基因的病毒cDNA插入本發明的表達質粒中。本發明包括基于雙向質粒的表達系統和基于單向質粒的表達系統，其中病毒cDNA插在RNA聚合酶I(pol I)啟動子和終止子序列(內部轉錄單位)之間。這個完整的pol I轉錄單位側翼與RNA聚合酶II(pol II)啟動子和聚腺苷酸位點(外部轉錄單位)相連。在單向系統中，pol I和pol II啟動子在cDNA上游并產生正義不帶帽cRNA(由pol I啟動子)和正義帶帽mRNA(由pol II啟動子)。單向系統中的pol I啟動子，pol I終止序列，pol II啟動子和多腺苷酸化信號可以稱作含有“上游至下游方向”。在雙向系統中，pol I和pol II啟動子在cDNA的相反兩側，其中上游pol II啟動子產生正義帶帽mRNA，下游pol I啟動子產生負義不帶帽病毒RNA(vRNA)。這些pol I-pol II系統以兩個細胞RNA聚合酶由它們自已的啟動子啟動轉錄而開始，推測在核的不同隔室。雙向系統中的pol I啟動子和pol I終止序列可以稱作包含“下游至上游方向”，雙向系統中的pol II啟動子和多腺苷酸化信號可以稱作包含“上游至下游方向”。
如果靶病毒包含正鏈、節段化RNA基因組，pol I啟動子優選在內部轉錄單位中位于cDNA的上游(單向系統)。在這個實施方案中，產生正鏈RNA直接摻入新的病毒中。然而，其中使用單向系統產生含負鏈、節段化RNA基因組的靶病毒的實施方案在本發明的范圍內。
如果靶病毒包含負鏈、節段化RNA基因組，pol I啟動子優選在內部轉錄單位中位于cDNA的下游(雙向系統)。在這個實施方案中，產生負鏈RNA直接摻入新的病毒中。其中用雙向系統產生含正鏈、節段化RNA基因組的靶病毒在本發明的范圍內。
本發明也可以用于產生含感染性或非感染性非節段化的RNA基因組(單鏈或雙鏈)的病毒。通常，感染性病毒基因組RNA簡單導入宿主細胞足以引起病毒生活史在細胞內啟動和完整病毒的最終產生。例如，微小RNA病毒基因組RNA簡單導入宿主細胞足以引起完整微小RNA病毒產生。含非感染性基因組RNA的病毒生活史的啟動，典型地，需要另外導入通常在病毒顆粒中與基因組一起攜帶的其它病毒蛋白。例如，副流感病毒III攜帶RNA依賴性RNA聚合酶，它的存在是新感染細胞內啟動病毒基因組RNA復制和病毒mRNAs轉錄所需的；在聚合酶缺乏時，副流感病毒III基因組RNA是沒有感染性的。在本發明的其中產生含感染性、非節段化基因組RNAs的病毒的實施方案中，攜帶包括病毒基因組的核酸的本發明的雙表達質粒簡單導入合適的宿主細胞足以引起完整病毒產生。在其中產生含非感染性的非節段化基因組RNA的病毒的實施方案中，可能也不得不將另外的表達質粒與攜帶病毒基因組的雙表達質粒一起導入宿主細胞。另外的質粒應該表達啟動病毒生活史所需的蛋白，它們常常在感染時導入宿主細胞(如RNA依賴性RNA聚合酶)。
在其中產生含感染性、非節段化RNA基因組的微小RNA病毒的實施方案中，含完整病毒基因組的cDNA插入到本發明雙啟動子表達質粒中。外部轉錄單位中的上游啟動子，優選pol II啟動子，指導含完整病毒基因組的正鏈mRNA產生-從mRNA翻譯多蛋白并從多蛋白切割和釋放各個蛋白(如在多蛋白內用蛋白酶)。由于病毒基因組包含正鏈RNA，內部轉錄單位(單向系統)中第二個上游啟動子，優選pol I，指導基因組正鏈拷貝產生。如果病毒基因組包含負鏈RNA，在內部轉錄單位中(雙向系統)的第二個下游啟動子，優選pol I，將指導基因組的負鏈拷貝的產生。其中使用單向系統產生負鏈、非節段RNA病毒的實施方案在本發明的范圍內。類似地，其中使用雙向系統產生了正鏈、非節段化RNA病毒的實施方案在本發明的范圍內。
用本發明也可產生含非感染性、其中不產生多蛋白的非節段化RNA基因組的病毒。例如，本發明可以用于產生彈狀病毒科(rhabdoviridae)病毒或副粘病毒科(paramyxoviridae)病毒，優選副流感病毒III，它的生活史正常包括用病毒來源的RNA依賴性RNA聚合酶從基因組負鏈RNA產生多個單順反子mRNAs；各個蛋白從單順反子mRNAs表達。在這些實施方案中，含啟動子(優選pol II啟動子)的外部轉錄單位指導病毒基因組正鏈、多順反子拷貝產生，通常僅僅第一個基因(NP)從中翻譯。另外，含啟動子優選pol I啟動子的內部轉錄單位指導基因組RNA拷貝表達，以引入新的病毒中。由于副流感病毒III病毒基因組包含負鏈RNA，內部轉錄單位的啟動子優選位于cDNA下游(雙向系統)。如果病毒基因組包含正鏈RNA，那么內部轉錄單位的啟動子優選位于cDNA上游(單向系統)。其中使用雙向系統產生含正鏈RNA基因組的病毒的實施方案和其中使用單向系統產生含負鏈RNA基因組的病毒的實施方案在本發明的范圍內。另外的病毒蛋白(除了從多順反子mRNA表達的蛋白)是病毒轉錄和復制所需的(L和P)，這些蛋白在分開的表達質粒中分別提供。
本發明也包括其中產生含雙鏈、節段化RNA基因組的病毒的實施方案。在這些實施方案中，含靶病毒基因組中每個基因的質粒插入本發明的雙啟動子表達質粒中。質粒可以是單向質粒或雙向質粒。在外部轉錄單位中的啟動子，優選pol II啟動子，指導被翻譯為所編碼蛋白的每個基因的mRNA轉錄物的表達。在內部轉錄單位中的啟動子，優選pol I啟動子，指導正鏈(單向系統)或負鏈(雙向系統)的轉錄。之后，產生的第一條鏈可以作為用病毒RNA聚合酶產生互補鏈的模板。所得雙鏈RNA產物引入新的病毒中。
從基于最少質粒的系統中回收兩個甲型流感病毒-A/WSN/33(H1N1)和A/Teal/HK/W312/97(H6N1)確證了這個系統的實用性。表型不能區分的A/PR/8/34(H1N1)株的回收，它是制備滅活甲型流感病毒疫苗的標準，確證了這個系統用于疫苗開發的有用性。八個表達質粒轉染給共培養的293T和MDCK細胞72小時后，轉染細胞上清中病毒產率在每毫升2×105和2×107個感染性病毒之間。這個八質粒系統也用于產生A/Teal/HK/W312/97(H6N1)和A/WSN/33(H1N1)之間單一和四倍重配病毒，和從串聯定向系統(產生cRNA和mRNA)產生A/WSN/33病毒。
因為pol I-pol II系統利于重組和重配甲型流感病毒的設計和回收，所以它也可適用于完全以克隆cDNA回收其它RNA病毒。盡管優選cDNA用于本發明，如果本發明的主要元件保留，也可以使用編碼待表達的病毒基因的其它類型核酸。例如，可以使用含病毒基因的PCR擴增產物或限制性片段。此外，本發明基于質粒的系統中表達的基因可以與其它基因融合或用其它基因標記，如純化/檢測標記(如谷胱苷肽-S-轉移酶，聚組氨酸，綠色熒光蛋白，myc標記和FLAG標記)。本發明也預期其中部分基因序列用于本系統質粒的實施方案。
下表包括使用本發明可產生的負鏈RNA病毒的非限制性列表。
本發明進一步部分基于雙向轉錄構建體的開發，該構建體含有側翼為用于vRNA合成的RNA聚合酶I(pol I)啟動子和用于病毒mRNA合成的RNA聚合酶II(pol II)啟動子的編碼PB2，PB1，PA，HA，NP，NA，M或NS的病毒cDNA。pol I/pol II啟動子-PB1構建體與剩余七個節段的vRNA-和蛋白-表達構建體一起轉染后產生病毒證實這個方法的實用性。因為這個方法降低病毒產生所需的質粒數量，因此它也降低克隆所需工作，增強病毒產生的效率和將反向遺傳系統的應用擴大到17個質粒不能實現有效共轉染的細胞系。還包括的是含位于病毒cDNA編碼序列上游的pol I和pol II啟動子的單向轉錄構建體。兩個啟動子相對于基因采用共同的上游至下游定位。盡管雙向系統產生甲型流感病毒的效價較高，但單向系統在其它應用中有效(如產生其它負鏈病毒株)。
如果啟動子、終止子或多腺苷酸化信號位于基因起始部位(如第一個密碼子)的近側和基因末端(如終止密碼子)的遠側，則它是該基因的“上游”。如果啟動子、終止子或多腺苷酸化信號位于基因末端的近側和基因起始部位的遠側，則它是該基因的“下游”。本發明質粒中的啟動子，與基因功能關聯的，被定位使得促進基因正義或反義鏈的轉錄。
這里使用的“表達質粒”是含“內部轉錄單位”和“外部轉錄單位”的DNA載體。如上討論，表達質粒可用于產生任何類型的RNA病毒，優選正或負鏈RNA病毒、節段化或非節段化基因組RNA病毒或雙鏈RNA病毒。外部轉錄單位包括啟動子，優選pol II啟動子，它指導從病毒cDNA轉錄可翻譯的mRNA。外部轉錄單位可以包括T7 RNA聚合酶啟動子，T3 RNA聚合酶啟動子，SP6 RNA聚合酶啟動子或能夠驅動可翻譯RNA產物表達的任何啟動子或基因元件的組合。例如，如果待從質粒表達的病毒cDNA被基因工程改造在轉錄RNA的3’末端包括多腺苷酸化信號，外部轉錄單位可以包括pol I或pol II啟動子。這可以通過在cDNA編碼序列3’末端就在終止密碼子之前，插入A核苷酸串來完成。此外，可基因工程改造使病毒cDNA在cDNA 5’末端包括內部核糖體進入位點(IRES)，利于從轉錄RNA啟動翻譯。本發明表達質粒中的“內部轉錄單位”位于外部轉錄單位之內且包括啟動子，優選pol I啟動子，它可指導可被病毒裝置復制并引入新病毒中的病毒cDNA轉錄。優選內部轉錄單位中的啟動子轉錄在5’和3’末端不含過多非病毒的外來序列的RNA，優選通過病毒cDNA與pol I啟動子和終止序列精確融合來實現。然而，本發明包括這樣的實施方案，其中內部轉錄單位包括指導含5’和3’另外非病毒序列的RNA轉錄物產生的啟動子(如pol II啟動子、pol III啟動子、T7 RNA聚合酶啟動子、T3 RNA聚合酶啟動子或SP6 RNA聚合酶啟動子)。在這些實施方案中，在表達質粒中可以包括確保由內部轉錄單位產生的RNA不包括過多非病毒序列的另外序列。例如，可以基因工程改造表達質粒使其在由內部轉錄單位產生的轉錄物末端包括核酶序列，其中轉錄RNA的核酶部分以這樣的方式切割轉錄物，即產生RNAs 5’和3’末端序列如同在病毒RNA中發現的。此外，可以基因工程改造表達質粒使其在病毒cDNA編碼序列末端包括引起轉錄終止的終止子序列，因此防止轉錄RNA的3’末端引入過多不可翻譯序列。優選，“表達質粒”是使用pol I-pol II系統的DNA載體。因此，這種質粒包含RNA聚合酶I(pol I)啟動子和pol I終止子序列，它們插在RNA聚合酶II(pol II)啟動子和多腺苷酸化信號之間。在雙向系統中，RNA聚合酶I啟動子調控插在啟動子和終止子之間“反義”方向的cDNA的基因組負義不帶帽RNA(這里稱作“v RNA”)的表達。RNA聚合酶II啟動子調控信使RNA的表達；“正義”方向插在pol II啟動子和多腺苷酸化信號之間的病毒基因cDNA節段引起正義帶帽病毒mRNA的表達。在單向系統中，病毒cDNA以正義方向插在pol I和pol II啟動子的下游。pol II啟動子驅動正義帶帽病毒mRNA的表達，pol I啟動子驅動正義不帶帽病毒cRNA的表達。
如果存在另一個基本質粒的所有基因和功能性非編碼區，質粒可以包括基本質粒的”基本上全部”。例如，僅僅去除了一部分聚接頭和插入外來基因而構建的質粒包含基本質粒的基本上全部。
“負鏈RNA病毒”是其中病毒基因組包括負鏈RNA的病毒。負鏈RNA與mRNA互補，且通常，應該拷貝為待翻譯蛋白的互補正鏈mRNA。典型地，這些病毒包裝一個RNA依賴性RNA聚合酶用于在宿主細胞轉染時產生mRNA。負鏈RNA病毒科包括但不限于，正粘病毒科，Arenaviridae和Bunyaviridae。優選，病毒基因組來自正粘病毒科的一個成員的病毒，最好具有節段化基因組。正粘病毒科的成員包括但不限于甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒、Thogotovirus、麻疹和流行性腮腺炎病毒(Paramyxovirus)或狂犬病病毒(Rhabdovirus)。
“正鏈RNA病毒”是含正鏈RNA基因組的病毒。正鏈RNA病毒的例子包括脊髓灰質炎病毒(微小RNA病毒)、披膜病毒和黃病毒。這些病毒的基因組RNA與mRNA的意義相同并可充當mRNA。這些病毒可以包括節段化或非節段化的基因組。
“雙鏈RNA病毒”包括雙鏈RNA基因組。呼腸孤病毒是雙鏈RNA病毒。
病毒基因組也可以節段化或非節段化(單分子)。節段化基因組包括每個編碼一個或多個病毒基因的兩個或更多核酸。優選，節段化基因組包括每個病毒基因的分離的核酸。正粘病毒(甲、乙或丙型流感病毒)，Bunyaviruses和沙粒病毒包含節段化RNA基因組。非節段化基因組包括含每個病毒基因的單個核酸。Mononegavirales病毒，彈狀病毒，Flaviviridae(黃病毒科)病毒，小RNA病毒科(Picornaviridae)病毒，Coronaviridea病毒，披膜病毒科(Togaviridae)病毒和副粘病毒包含非節段化的RNA基因組。
雙鏈RNA可以縮寫為“dsRNA”。單鏈RNA可以縮寫為“ssRnA”。單一負鏈RNA可以縮寫為“-ssRNA”。單一正鏈RNA可以縮寫為“+ssRNA”。
“病毒基因節段”優選是相當于來自RNA病毒基因組的基因組RNA分子的克隆cDNA。這個術語也可以包括含源自RNA病毒的基因的任何基因或基因節段(如PCR產物或限制性片段)。
“基于最少質粒的系統”是這樣一個系統，其中具有如上所述的含來自RNA病毒的每個自主病毒基因組節段的表達質粒。因此，含病毒基因組序列的質粒總數量不會超過來自來源RNA病毒的基因節段的總數量。本發明包括這樣的實施方案，其中不含病毒序列的其它質粒也可任選地共轉染宿主細胞。這提供了顯著的優點，限制在宿主細胞中建立系統所需的質粒總數量，消除了輔助病毒的需要，消除了選擇方法的需要，和允許重配病毒的有效產生。
在本發明的基于最少質粒的系統中的某些病毒基因可以來自能很好適應在細胞培養中生長的病毒株，如PR/8/34(H1N1)或WSN/33(H1N1)株，或來自減毒株，如A/Ann Arbor/6/60(H2N2)，或乙型流感病毒/Ann Arbor/1/66。優選，減毒株也能很好適應在細胞培養中生長。特別是，對于甲型流感病毒，在基于質粒的系統中的優選的病毒基因節段編碼病毒聚合酶復合體蛋白，M蛋白，和/或NS蛋白，它們來自能很好適應在細胞培養中生長的病毒株或來自減毒株，或二者皆有。這些蛋白這里術語稱作編毒內部蛋白”或病毒“非糖蛋白”。
甲型流感病毒基因組典型地編碼10個不同的蛋白PB2，據信是轉錄酶；PB1，據信是轉錄酶；據信是轉錄酶的PA；據信是血凝素的HA；NP，據信是RNA結合核蛋白；據信是神經氨酸酶的NA；據信分別是基質蛋白和整合膜蛋白的M1/M2，和據信是可影響RNA加工和轉運的非結構蛋白的NS1/NS2。據信PB1、PB2、NP和PA是流感病毒轉錄聚合酶復合體的一部分。
這里使用的術語“細胞培養”優選是指商業上可接受的增殖用于制備疫苗的病毒的方法，如含胚雞卵，以及體外在宿主細胞中培養(見Furminger，在Nicholson，Webster和May(編)，Textbook ofInfluenza，24章，324-332頁，特別是328-329頁)。
類似地，基于質粒的系統將引入產生保護性免疫反應所需的抗原基因節段。“保護性免疫反應”包括有效清除免疫過的(接種過的)受試者中的病毒粒體和感染細胞的體液(抗體)或細胞成分，或二者皆有。因此，保護性免疫反應可防止或溶解RNA病毒感染，如流感病毒。優選，抗原是“表面抗原”，即在病毒粒體表面或感染細胞的表面表達的。更優選，表面抗原是糖蛋白。對于流感病毒，主要的糖蛋白抗原是血凝素(HA或H)和神經氨酸酶(NA或N)。
這里使用的術語“免疫原性的”是指能夠引起體液或細胞免疫反應，優選二者皆能的多肽。免疫原性實體也是抗原性的。免疫原性組合物是當給予動物時引起免疫或體液反應或二者皆有的組合物。當分子能夠特異性與免疫系統的抗原識別分子如免疫球蛋白(抗體)或T細胞抗原受體相互作用時，分子是“抗原性的”。抗原性多肽含有至少大約五個，和優選至少大約10個氨基酸的表位。多肽的抗原性部位，這里也叫做表位，可以是對抗體或T細胞受體識別的優勢免疫的那部分，或可以是通過將抗原性部分與載體多肽結合進行免疫用于產生針對該分子的抗體的部分。抗原性的分子不需要其本身是免疫原性的，即無載體時能夠引起免疫反應。
這里使用的術語“致病性病毒株”是指能夠引起疾病的任何病毒株；優選該病毒在當前世界衛生組織(WHO)，疾病控制和預防中心(CDC)或其它公共衛生當局的可能傳播病毒列表中。這種病毒可以包括肝炎病毒科、呼腸孤病毒科、正粘病毒科、副粘病毒科、線狀病毒科、bornaviridae科、bunyaviridae科、沙粒病毒科、冠形病毒科(coronaviridae)、脊髓灰質炎病毒科或狂犬病病毒科的成員。本發明有利地便于將來自這種株的主要抗原基因插入基于質粒的系統，其中剩余病毒基因具有期望的培養和/和減毒特性，因此可以制備大量用于制備疫苗的合適抗原背景的病毒。例如，副粘病毒人副流感病毒3基因(核殼基因、磷蛋白基因、基質基因、融合基因、血凝素-神經氨酸酶蛋白基因和大基因)，可方便地位于本發明的質粒中用于副流感病毒3病毒粒體的制備。
因此，本發明優選的“重配病毒”是編碼來自致病性病毒株的抗原蛋白的基因節段與來自適合在培養中生長的病毒(或減毒病毒)的編碼病毒聚合酶復合體的基因節段或其它相似基因(如非糖蛋白基因，包括M基因和NS基因)結合的病毒。重配病毒因此在允許在宿主細胞中有效生產的背景中攜帶期望的抗原特性，如上所述。這種重配病毒是期望的制備病毒粒體生產疫苗的“病毒種子”(見Furminger，前述)。
術語“宿主細胞”是指以任何方式被選擇、修飾、轉化、生長或使用或操作，用于由該細胞產生重組RNA病毒粒體，優選負鏈節段化RNA病毒粒體的任何生物體的任何細胞。示例的宿主細胞包括但不限于，Madin-Darby犬腎(MDCK)細胞，VERO細胞，CV1細胞，COS-1和COS-7細胞，和BHK-1細胞，舉例且不以限制的方式。在具體的實施方案中，優選短暫共培養生產病毒粒體。共培養允許接受細胞如293T細胞的有效轉染以及病毒生長許可的細胞如MDCK細胞隨后感染。
術語“RNA病毒粒體”是指病毒顆粒，從用本發明基于質粒的系統轉染或共轉染的宿主細胞產生，其初次產生時是完全感染性的。這種系統產生vRNA和病毒蛋白(由病毒mRNA翻譯而來)，導致感染性病毒顆粒(病毒粒體)裝配。
這里使用的“RNA病毒特異性疫苗”是當給予受試者時，可引起對RNA病毒的保護性免疫的組合物。術語“疫苗”是指含病毒、滅活病毒、減毒病毒、斷裂病毒(split virus)或病毒蛋白即表面抗原的組合物，可用于引起受體保護性免疫(見Furninger，前述)。應該指出作為有效疫苗，本發明的疫苗可引起部分人群的免疫，因為一些個體可能不能引發強烈或保護性免疫反應，或一些情況下，沒有任何免疫反應。這種無能可能源自個體的遺傳背景或由于免疫缺陷疾病(獲得性或先天性)或免疫抑制(如用免疫抑制藥物治療以預防器官排斥或抑制自身免疫情況)。在動物模型中可確立功效。
疫苗的“保護性劑量”是單獨或與佐劑聯合，有效引起接納受試者的保護性免疫反應的量。保護也可依賴于給藥途徑，如肌肉內(優選對于滅活的疫苗)或鼻內(優選對于減毒疫苗)。
這里使用的術語“受試者”是指支持RNA病毒感染的動物，包括但不限于，水鳥、雞、豬和人。特別是，該術語指人。
“佐劑”是加強對免疫原的免疫反應的分子或組合物。當佐劑是藥物可接受時，它是“可接受用于人的”，如下定義。佐劑的例子下面提供。
這里使用的術語“分離的”是指引用的材料是從其天然環境如細胞中移出的。因此，分離的生物材料可不含一些或全部細胞成分，即天然材料自然存在的細胞的成分(如細胞質或膜成分)。如果材料存在于細胞提取物或上清中，應該認為是分離的。在核酸分子的情況下，分離的核酸包括PCR產物，分離的mRNA，cDNA，或限制性片段。在另一個實施方案中，優選分離的核酸是從可發現它的染色體上切割下來的，更優選不再結合或接近當在染色體中發現時位于分離的核酸分子所含基因的上游或下游的非編碼區(但可能與其天然調控區或其一部分結合)，或其它基因。在另一個實施方案中，分離的核酸缺乏一個或多個內含子。分離的核酸分子包括插入到質粒、粘粒、人工染色體等等中的序列，即，當它形成嵌合重組核酸構建體的一部分時。因此，在具體的實施方案中，重組核酸是分離的核酸。分離的蛋白可以與其在細胞內結合的其它蛋白或核酸，或二者結合，或與細胞膜結合，如果它是膜關聯蛋白。分離的細胞器、細胞或組織是從其在生物體中發現的解剖學部位中移出的。分離的材料可以但不必需是純化的。
這里使用的術語“純化”是指在減少或清除無關材料，即污染物，包括從中獲得該材料的天然材料，存在的條件下已經分離的材料。例如，優選純化的病毒粒體基本不含宿主細胞或培養成分，包括組織培養或卵蛋白，非特異性病原體等等。這里使用的術語“基本不含”在該材料的分析測試中可操作使用。優選，基本不含污染物的純化材料是至少50％純度；更優選，至少90％純度，和仍更優選至少99％純度。可用層析、凝膠電泳、免疫試驗、組成分析、生物試驗和其它本領域已知的方法估計純度。
純化方法是本領域熟知的。病毒顆粒可用超濾或超速離心，優選連續離心(見Furminger，前述)來純化。其它純化方法在這里是可能的和包含的。純化材料可以含有小于大約50％，優選小于大約75％，和最優選小于大約90％的與其最初結合的細胞成分、基質、蛋白或其它不期望的成分或雜質(如上下文所需)。術語“基本純”指使用本領域已知的傳統純化技術可達到的最高純度。
在具體實施方案中，術語“大約”或“近似”是指在給定值或范圍的20％之內，優選10％之內，和更優選5％之內。可供選擇地，對于生物學中使用的對數術語，術語“大約”可指在給定值的數量級之內，和優選在該值的數量級的一半之內。
基于質粒的系統的基因工程根據本發明，可以使用本領域技術范圍內的常規分子生物學、微生物學和重組DNA技術。這種技術在文獻中有充分解釋。見如Sambrook，Fritsch和Maniatis，Molecular CloningA Laboratory Manual(分子克隆實驗室手冊)，第2版(1989)Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，New York(這里稱″Sambrook等，1989″)；DNA CloningA Practical Approach，第I和II卷(D.N.Glover編1985)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait編1984)；Nucleic Acid Hybridization[B.D.Hames和S.J.Higgins編(1985)]；Transcription And Translation[B.D.Hames和S.J.Higgins，編(1984)]；Animal Cell Culture[R.I.Freshney，編(1986)]；Immobilized Cells And Enzymes[IPL Press，(1986)]；B.Perbal，A Practical Guide To Molecular Cloning(1984)；F.M.Ausubel等(編)，Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley & Sons，Inc.(1994)。
這些常規技術用于pol I-pol II質粒系統的制備，病毒基因節段cDNA克隆的分離，將這種DNAs插入質粒，和用本發明的質粒或基于質粒的系統轉染細胞。特別是，定點誘變或基因修飾的常規技術允許修飾RNA病毒，優選負鏈節段化RNA病毒的基因來發展減毒病毒，如下所述；或摻入了新表位的病毒蛋白，如在神經氨酸酶莖中；或來產生缺陷型病毒。
這里使用的DNA“擴增”表示使用聚合酶鏈式反應(PCR)增加DNA序列混合物內特定DNA序列的量。PCR的描述見Saiki等，Science1988，239487。
“核酸分子”是指磷酸酯聚合形式的核糖核苷(腺苷、鳥苷、尿苷或胞苷；“RNA分子”)或脫氧核糖核苷(脫氧腺苷、脫氧鳥苷、脫氧胸苷、或脫氧胞苷；“DNA分子”)，或其任何磷酸酯類似物，如硫代磷酸酯或硫酯，以單鏈形式，或雙鏈螺旋。“重組DNA分子”是經歷了分子生物學操作的DNA分子。
“多核苷酸”或“核苷酸序列”是DNA和RNA中一系列核苷酸堿基(也叫做“核苷酸”)，是指兩條或更多核苷酸的任何鏈。核苷酸序列典型地攜帶遺傳信息，包括細胞裝置制備蛋白使用的信息。
這里，多核苷酸可以側翼與異源序列相連，包括啟動子、內部核糖體進入位點(IRES；Ghattas，等，Mol.Cell.Biol.115848-5859，1991)和其它核供體結合位點序列、增強子、反應元件、抑制子、信號序列、聚腺苷酸序列、內含子、5’和3’非編碼區等等。也可以用本領域已知的許多方法修飾該核酸。這種修飾的非限制性例子包括甲基化，“帽”如5’-7-甲基-G(5’)ppp(5’)N帽，用類似物置換一個或多個天然產生的核苷酸，和核苷酸間的修飾。多核苷酸可以含有一個或多個另外的共價連接部分，例如，蛋白(如核酸酶、毒素、抗體、信號肽、聚L-賴氨酸等)、嵌入劑(如丫啶、補骨脂素等)、螯合劑(如金屬、放射性金屬、鐵、氧化性金屬等)，和烷化劑。多核苷酸可以通過形成磷酸三甲基或乙基酯或氨基磷酸烷基酯鍵而衍生化。此外，這里，也可以用能夠直接或間接提供可檢測信號的標記修飾多核苷酸。示范的標記包括放射性同位素、熒光分子、生物素等等。
“編碼序列”或“編碼”表達產物如多肽的序列，是當被表達，引起那個多肽產生的核苷酸序列，即該核苷酸序列編碼那個多肽的氨基酸序列。蛋白的編碼序列可以包括起始密碼子(通常是ATG)和終止密碼子。
術語“基因”，也稱作“結構基因”，是指DNA序列，其編碼或相當于包含一個或多個多肽的全部或部分的特定氨基酸序列，且可以包括或不包括調控DNA序列，如決定例如基因表達的條件的啟動子序列。
此外，本發明允許使用RNA病毒基因節段，優選負鏈RNA病毒基因節段的各種突變體，序列保守變異體，和功能性保守變異體，只要所有這種變異體保留所需的免疫保護性作用。事實上，本發明有利地允許誘變來以系統模式開發減毒病毒株。
術語“突變體”和“突變”是指遺傳材料，如DNA，的任何可檢測改變，或這種改變的任何過程、機制或結果。這包括基因突變(其中基因的結構(如DNA序列)改變)，任何突變方法產生的任何基因或DNA，和任何修飾的基因或DNA序列表達的表達產物(如蛋白)。術語“變異體”也可以用于代表修飾或改變的基因、DNA序列、酶、細胞等，即任何類型的突變。可用隨機誘變技術，或用定點誘變，包括基于PCR的序列修飾，引入突變。如上指出，和下面詳細討論的，RNA病毒的一個或多個單個基因節段(如負鏈節段化RNA病毒)的誘變允許開發減毒疫苗，以及闡明減毒機制。此外，本發明的基于質粒的系統克服了以前通過誘變開發減毒病毒工作的缺陷，如有效選擇系統的限制(見Bilsel和Kawaoka，在Nicholson，Webster和May(編)，Textbook of Influenza，32章，422-434頁，特別是423-425頁)。
多核苷酸序列的“序列保守變異體”是給定密碼子位置中的一個或多個核苷酸改變不引起在這個位置編碼的氨基酸改變的那些變異體。等位變異體可以是序列保守變異體。
“功能保守變異體”是蛋白或酶中的給定氨基酸殘基已經改變，但整體構象和多肽的功能不改變的變異體，包括但不限于，用具有相似性質(例如，極性、氫鍵勢能、酸性、堿性、疏水性、芳香性等等)的氨基酸取代氨基酸。一些等位變異產生功能保守變異體，使得氨基酸置換不大大影響蛋白功能。類似地，同源蛋白可以是功能保守變異體。本領域熟知具有相似性質的氨基酸。例如，精氨酸、組氨酸和賴氨酸是親水堿性氨基酸并可以互換使用。類似地，異亮氨酸，一種疏水性氨基酸，可以被亮氨酸、甲硫氨酸或纈氨酸取代。期望這種改變對該蛋白或多肽的表觀分子量或等電點影響很小或沒有影響。那些指為保守的之外的氨基酸在蛋白或酶中可以不同，使得功能相似的任何兩個蛋白間的蛋白或氨基酸序列相似度百分比可以變化，且可以是例如，從70％至99％，如根據比對方案如Cluster方法確定，其中相似度基于MEGALIGN算法。“功能保守變異體”也包括BLAST或FASTA算法確定在參照序列的完整長度上具有至少60％氨基酸同一性的多肽或酶，其中BLAST或FASTA算法選擇參數給出被測序列間的最大匹配，所述同一性優選至少75％，最優選至少85％，甚至更優選至少90％，并且其與它所比較的天然或親本蛋白或酶具有相同或基本相似的性質或功能。
這里使用的所有語法形式和拼寫變異的術語“同源”是指具有“共同進化起源”的蛋白間的關系，包括來自超家族(如免疫球蛋白超家族)的蛋白和來自不同物種的同源蛋白(如肌球蛋白輕鏈等)(Reeck，等，Cell 50667，1987)。這種蛋白(及其編碼基因)具有序列同源性，這反映在它們的序列相似度(就相似百分比或存在特定殘基或基元而言)。
相應地，所有語法形式的術語“序列相似度”是指可能具有或不具有共同進化起源的核酸或蛋白的氨基酸序列之間同一或對應的程度(見Reeck等，前述)。然而，在普通用法和本申請中，當用副詞如“高度”修飾時，術語“同源”可指序列相似度且可以或可以不與共同進化起源有關。
在具體實施方案中，當足夠數量的核苷酸在確定長度的DNA序列上匹配，使這些序列和其它序列相區別時，這兩個DNA序列“基本同源”或“基本相似”，如序列比較算法確定的，如BLAST，FASTA，DNAStrider等，其中選擇參數給出所測序列間在完整長度的參照序列上的最大匹配。通過使用標準軟件比較序列數據庫中可獲得的序列，或通過在例如對于特定系統定義的嚴格條件下的Southern雜交試驗，可鑒定基本同源的序列。這種嚴格條件是本領域技術人員已知的且可在Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6中找到。嚴格雜交條件的非限制性例子是在6×氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)大約45℃雜交，隨后用0.2×SSC，0.1％SDS洗滌一次或多次，溫度為50℃，優選55℃，和更優選60℃或65℃。
類似地，在特定實施方案中，當在確定的長度上有足夠多同一或相似(功能等同)的氨基酸以區別這些序列和其它序列時，兩個氨基酸序列“基本同源”或“基本相似”。優選，通過例如使用GCG(GeneticsComputer Group，Program Manual for the GCG Package，第7版，Madison，Wisconsin)pileup程序或任何上述程序(BLAST，FASTA等)進行比對鑒定相似或同源的序列。這里引入下列有關BLAST算法的文獻作為參考BLAST算法Altschul，S.F.，Gish，W.，Miller，W.，Myers，E.W.和Lipman，D.J.，J.Mol.Biol.215403-410，1990；Gish，W.和States，D.J.，Nature Genet.3266-272，1993；Madden，T.L.，Tatusov，R.L.和Zhang，J.，Meth.Enzymol.266131-141，1996；Altschul，S.F.，Madden，T.L.，Schaffer，A.A.，Zhang，J.，Zhang，Z.，Miller，W.和Lipman，D.J.，Nucleic AcidsRes.(核酸研究)253389-3402，1997；Zhang，J.和Madden，T.L.，Genome Res.(基因組研究)7649-656，1997；Wootton，J.C.和Federhen，S.，Comput.Chem.17149-163，1993；Hancock，J.M.和Armstrong，J.S.，Comput.Appl.Biosci.1067-70，1994；比對計分系統Dayhoff，M.O.，Schwartz，R.M.和Orcutt，B.C.(1978)″A model of evolutionary change in proteins.″見″Atlasof Proteih Sequence ayad Structure″，5卷，suppl.3.M.O.Dayhoff(編)，345-352頁，Natl.Biomed.Res.Found.，Washington，DC；Schwartz，R.M.和Dayhoff，M.O.(1978)″Matrices fordetecting distant relationships.″見″Atlas of Protein Sequenceand Structure″，5卷，suppl.3.M.O.Dayhoff(編)，353-358頁，Natl.Biomed.Res.Found.，Washington，DC；Altschul，S.F.，J.Mol.Biol.219555-565，1991；States，D.J.，Gish，W.，Altschul，S.F.，Methods(方法)366-70，1991；Henikoff，S.和Henikoff，J.G.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8910915-10919，1992；Altschul，S.F.，J.Mol.Evol.36290-300，1993；比對統計學Karlin，S.和Altschul，S.F.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 872264-2268，1990；Karlin，S.和Altschul，S.F.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 905873-5877，1993；Dembo，A.，Karlin，S.和Zeitouni，O.，Ann.Prob.222022-2039，1994及Altschul，S.F.(1997)″Evaluating the statisticalsignificance of multiple distinct local alignments.″見″Theoretical and Computational Methods in Genome Research.(基因組研究中的理論和計算方法)″(S.Suhai，編)，1-14頁，Plenum，New York。
“啟動子序列”是能夠結合細胞內RNA聚合酶并啟動序列轉錄的DNA調控區。為了限定本發明，位于cDNA上游的啟動子序列在其3’末端以轉錄啟動位點為界并向上游延伸(5’方向)而包括啟動超過背景的可檢測水平的轉錄所需的最少數量的堿基或元件。位于cDNA下游的啟動子序列(為了表達(-)RNA)在其5’末端以轉錄起始位點為界并向下游(3’方向)延伸而包括啟動超過背景的可檢測水平的轉錄所需的最少數量的堿基或元件。本發明的雙向系統包括上游和下游啟動子；單向系統僅包括上游啟動子。在啟動子序列內將發現轉錄起始位點(例如用核酸酶S1制圖方便地確定)，以及負責結合RNA聚合酶的蛋白結合域(共有序列)。
任何已知的啟動子可以用于本發明，只要保留本發明的主要元件。例如，可以用于調控基因表達的pol II啟動子，包括但不限于巨細胞病毒(CMV)啟動子(美國專利號5,385,839和5,168,062)，SV40早期啟動子區(Benoist和Chambon，Nature(自然)290304-310，1981)，魯斯氏肉瘤病毒的3’長末端重復中含的啟動子(Yamamoto，等，Cell 22787-797，1980)，皰疹胸腺嘧啶核苷激酶啟動子(Wagner，等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.781441-1445，1981)，金屬硫蛋白基因的調控序列(Brinster，等，Nature 29639-42，1982)；T7 RNA聚合酶啟動子；T3 RNA聚合酶啟動子；SP6 RNA聚合酶啟動子和其它在感興趣宿主細胞中有效的啟動子。用于表達不帶帽RNA的Pol I啟動子是所有真核細胞廣泛存在的且包括人RNA聚合酶I(見Molecular Cell Biology，Darnell等編1986，第311，365-6頁)。RNA聚合酶III也可以用于本發明。
當RNA聚合酶將編碼序列轉錄為RNA，如mRNA或vRNA時，細胞中該編碼序列處在轉錄和翻譯調控序列(如pol I或pol II啟動子)的“調控之下”、與其“功能性連接”或可操作地連接”。
術語“表達”是指允許或引起基因或DNA序列中的信息被顯現，例如通過活化參與相應基因或DNA序列轉錄和翻譯的細胞功能而產生RNA(包括cRNA，vRNA和病毒mRNA)或蛋白。DNA序列在細胞中或被細胞表達形成“表達產物”如蛋白。表達產物本身，如所得蛋白也可以描述為被細胞“表達”。
術語“轉染”是指將外來核酸導入細胞，使得宿主細胞會表達被導入的基因或序列而產生期望的由導入的基因或序列編碼的多肽。導入的基因或序列也可以稱作“克隆”或“外來”的基因或序列，可包括調控或控制序列，如起始、終止、啟動子、信號、分泌，或細胞遺傳機構使用的其它序列。該基因或序列也可以包括無功能序列或功能未知的序列。接受和表達導入的DNA或RNA的宿主細胞已經成為“轉化的”和是“轉化體”或“克隆”。導入宿主細胞的DNA或RNA可來自任何來源，包括與宿主細胞相同的屬或種的細胞，或不同屬或種的細胞。
術語“載體”、“克隆載體”和“表達載體”是指通過它DNA或RNA序列(如外來基因)可導入宿主細胞的工具，使得轉化宿主和促進導入序列的表達(如轉錄和翻譯)。質粒是本發明優選的載體。
載體典型地包含可傳遞物質的DNA，其中插入了外來DNA。將一個DNA片段插入另一個DNA片段中的普通方法包括使用在稱作限制性酶切位點的特殊位點(特殊的核苷酸組)切割DNA的稱作限制性酶的酶。“盒”是指編碼可在確定的限制性酶切位點插入載體的編碼表達產物的DNA序列或片段的DNA。該盒限制性酶切位點被設計為確保盒插入正確的閱讀框架。通常，外來DNA插在載體DNA的一個或多個限制性酶切位點，然后與可傳遞載體DNA一起被載體攜帶到宿主細胞。具有插入或添加DNA的DNA片段或序列，如表達載體，也可以稱作“DNA構建體”。普通類型的載體是“質粒”，它通常是雙鏈DNA的自主分子，常常起源于細菌，可容易接受另外(外來)DNA并可容易導入合適的宿主細胞。質粒載體常常含有編碼DNA和啟動子DNA且具有適合插入外來DNA的一個或多個限制性酶切位點。編碼DNA是編碼特定蛋白或酶的特定氨基酸序列的DNA序列。啟動子DNA是啟動、調節或否則介導或控制編碼DNA的表達的DNA序列。啟動子DNA和編碼DNA可以來自相同基因或不同的基因，可以來自相同或不同的生物體。重組編碼載體通常將包括一個或多個用于克隆或表達的復制系統，一個或多個在宿主中選擇的標記，如抗生素抗性，和一個或多個表達盒。
術語“表達系統”是指宿主細胞和在合適條件下相容的載體，如用于該載體攜帶并導入宿主細胞的外來DNA所編碼蛋白的表達。
術語“異源”是指非自然產生的元件的組合。例如，異源DNA是指自然情況下不存在于細胞或細胞中染色體部位的DNA。優選，異源DNA包括對細胞是外來的基因。異源表達調控元件是與它在自然情況下可操作連接基因所不同的基因可操作連接的元件。在本發明的上下文中，編碼多肽的含來自序列文庫的序列的基因與其中插入它進行克隆或表達的載體DNA是異源的，與含這種載體的宿主細胞是異源的，其中它被表達。
如上指出，本發明允許使用異源病毒基因產生重配病毒。除了將病毒抗原的基因引入很好適應在培養中生長的遺傳背景病毒株，本發明還允許產生交叉物種重配，如乙型流感病毒抗原于甲型流感病毒背景中重配。
疫苗如上指出，本發明提供了制備治療或預防RNA病毒感染，優選負鏈RNA病毒感染的疫苗的有效和經濟的策略。本發明基于最少質粒的系統消除了選擇的需要，并提供了重配病毒的緊密控制。為了制備滅活流感疫苗，含來自高產量株(如PR/8/34(H1N1))的非糖蛋白節段(如PB1，PB2，PA，NP，M和NS)的六個質粒可以與含推薦疫苗亞型的HA和NA cDNA的兩個表達質粒共轉染。由于不需要輔助病毒，所產生的病毒是含期望基因構象(constellation)的流感病毒。類似方法可用于產生用在疫苗中的任何類型的滅活重配RNA病毒。含靶病毒的病毒基因節段(如非糖蛋白節段)的表達質粒可以與其它編碼相應于給定感染性病毒亞型(如當前在人群中傳播的病毒亞型)的蛋白的表達質粒共轉染。按照本發明產生的病毒可用于常規或新的疫苗接種方法(見Bilsel和Kawaoka，在Nicholson，Webster和May(編)，Textbook of Influenza，32章，422-434頁)，特別是減毒活疫苗的發展中(在下更詳細討論)。特別是，就開發具有有限的宿主范圍或不可預知的減毒(同上)的重配病毒而言，本發明克服了當前技術的缺陷。
已經在開發流感疫苗中做了很多努力(見Wood和Williams，在Nicholson，Webstern和May(編)，Textbook of Influenza，23章，317-323頁)。盡管這部分大多涉及流感疫苗，本發明的范圍延伸到所有RNA病毒疫苗，優選負鏈節段化RNA病毒疫苗，尤其是正粘病毒科疫苗。
當前可得到三種類型的滅活流感疫苗完整病毒，節段產物和表面抗原疫苗(見Wood，在Nicholson，Webster和May(編)，Textbookof Influenza，25章，333-345頁)。因為本發明允許快速開發具有可接受的培養生長特性的期望重配病毒，它將使疫苗制造商制備足量的疫苗來滿足公共健康需要和確保標準化，這是當前被制備臨床量疫苗的需要減輕的重要需求，常常是8至9個月的時期(Wood，前述，333頁)。
疫苗安全性也是一個考慮的方面(見Wiselka，于Nicholson，Webster和May(編)，Textbook of Influenza，26章，346-357頁)。因為本發明的疫苗允許在規定的細胞培養系統中制備，它們避免了在含胚卵中制備的商業疫苗中可能存在的非特異性病原體、細菌和變應原蛋白。
佐劑已經用于疫苗(如流感病毒疫苗)(Wood和Williams，前述)。術語“佐劑”是指增強對抗原的免疫反應的化合物或混合物。佐劑可起緩慢釋放抗原的組織貯庫的作用，也起著非特異性增強免疫反應的淋巴系統激活劑的作用(Hood，等，Immunology，第2版，1984，Benjamin/CummingsMenlo Park，California，384頁)。通常，在缺乏佐劑時，單獨用抗原初次攻擊，將不能引起體液或細胞免疫反應。佐劑包括但不限于完全弗氏佐劑，不完全弗氏佐劑，皂甙，礦物凝膠如氫氧化鋁，表面活性物質如溶血卵磷脂，多聚醇，聚陰離子，肽，油或碳氫化合物乳劑，和可能有用的人佐劑如BCG(卡介苗)和小棒桿菌。優選的合成佐劑的例子是QS-21。可供選擇地，或此外，免疫刺激性蛋白，如下所述，可提供作為佐劑或增加對疫苗的免疫反應。優選，佐劑是藥物可接受的。
短語“藥物可接受”是指當給予人后，生理學上可容忍的且不典型地產生過敏或類似的不期望的反應，如胃不適、頭暈等等的分子實體和組合物。優選，這里使用的術語“藥物可接受”是指聯邦或州政府的管理機構許可的或美國藥典中列出的或其它藥典通常認可的用于動物，和更特別是用于人的。術語“載體”是指與化合物一起給藥的稀釋劑、佐劑、賦形劑或載體。優選使用無菌水或含水鹽水溶液和葡萄糖水溶液和甘油水溶液作為載體，特別是可注射液。E.W.Martin在“Remington’s Pharmaceutical Sciences”中描述了合適的藥物載體。
免疫刺激分子與疫苗，特別是載體疫苗共同給予可增強疫苗接種的有效性(Salgaller和Lodge，J.Surg.Oncol.1998，68122)，例如免疫刺激劑、免疫強化劑或促炎細胞因子、淋巴因子或趨化劑。例如，可以使用細胞因子或細胞因子基因如白介素IL-1，IL-2，IL-3，IL-4，IL-12，IL-13，粒細胞巨噬細胞(GM)集落刺激因子(CSF)和其它集落刺激因子，巨噬細胞炎性因子，Flt3配體(Lyman，Curr.Opin.Hematol.，5192，1998)，以及一些關鍵共刺激分子或其基因(如B7.1，B7.2)。這些免疫刺激分子可以以蛋白或通過編碼該分子表達的載體的表達而全身或局部遞送。
樹突細胞尋靶.疫苗接種可以通過樹突細胞尋靶而完成(Steinman，J.Lab.Clin.Med.，128531，1996；Steinman，Exp.Hematol.，24859，1996；Taite等，Leukemia(白血病)，13653，1999；Avigan，Blood Rev.，1351，1999；DiNicola等，Cytokines Cell.Mol.Ther.，4265，1998)。樹突細胞在活化T細胞依賴性免疫中起著決定性作用。增殖的樹突細胞可以用于捕獲原位免疫原性形式的蛋白抗原，接著將這些抗原以可被T細胞識別和刺激T細胞的形式呈遞(如見，Steinman，Exper.Hematol.24859-862，1996；Inaba，等，J.Exp.Med.，1882163-73，1998和美國專利號5,851,756)。對于離體刺激，將樹突細胞鋪在培養皿中并接觸(脈沖給予)足量病毒粒體足夠的一段時間以允許病毒抗原結合樹突細胞。然后脈沖的細胞可返回移植給接受治療的受試者，如通過靜脈內注射。優選使用自體的樹突細胞，即從接受治療的受試者得到的樹突細胞，盡管可能可以使用MHC II類匹配樹突細胞，它可以得自類型匹配供體或通過將樹突細胞基因工程改造以表達期望的MHC分子(并優選抑制不期望的MHC分子的表達)而得到。
優選，樹突細胞在體內特異性打靶以攝取病毒或病毒亞單位。通過利用介導抗原呈遞的受體，如DEC-205(Swiggard等，Cell.Immunol.，165302-11，1995；Steinman，Exp.Hematol.，24859，1996)和Fc受體，可利用各種策略進行體內樹突細胞打靶。
滅活疫苗已很好建立了滅活病毒疫苗用于接種對抗RNA病毒感染(如流感病毒)(見Nichol，InNicholson，Webster和May(編)，Textbookof Influenza，27章，358-372頁)。為了制備滅活病毒，轉染的病毒在細胞培養中或在含胚卵中生長。可用甲醛、β-丙酸內酯、醚、含洗滌劑(如Tween-80)的醚、溴化十六烷基三甲銨(CTAB)、和TritonN101，脫氧膽酸鈉和磷酸三(正丁基)酯滅活處理病毒(Funninger，同上；Wood和Williams，前述)。滅活可在尿囊液凈化(卵中生產的病毒)后或前進行；離心分離和純化病毒粒體(Furminger，前述，見326頁)。為了估計疫苗的效能，可使用單一徑向免疫擴散(SRD)測試(Schild等，Bull.World Health Organ.1975，5243-50和223-31；Mostow等，J.Clin.Microbiol.1975，2531)。滿意的免疫反應所需的劑量已經被標準化，是15μg/HA/株/劑。滅活疫苗可肌肉注射給予。
減毒活流感疫苗已經開發了減毒冷適應活RNA病毒疫苗(流感病毒疫苗)(見Keitel和Piedra，InNicholson，Webster和May(編)，Textbookof Influenza，28章，373-390頁；Ghendon，InNicholson，Webster和May(編)，Textbook of Influenza，29章，391-399頁)。完全從八個質粒產生流感病毒的能力允許調整疫苗株的減毒且能夠開發最佳地適合任何靶人群的疫苗株(見Bilsel和Kawaoka，前述)。因為流感病毒株A/Ann Arbor/6/60(H2N2)或流感病毒B/Ann Arbor/1/66當前用于制備減毒活疫苗，人們會將流感病毒內部基因的六個cDNAs中(PB2，PB1，PA，NP，M，NS)每一個插入到質粒如pHW2000中。構建含相關流感病毒株的糖蛋白HA和NA的兩個質粒并與編碼非糖基化流感病毒蛋白的六個主要質粒共轉染。
預期內部基因的編碼或非編碼區的基因修飾除了允許開發減毒病毒外，可提高疫苗的安全性、感染性、免疫原性和保護性功效。
HA基因的操作也可增加疫苗株的安全性。例如，去除在高度致病性鳥甲型流感病毒的H5或H7糖蛋白的連接肽中發現的堿性氨基酸可增加疫苗的安全性。
粘膜接種.粘膜接種對許多致病性病毒特別有效，因為感染常常通過粘膜發生。粘膜停駐著樹突細胞，它是EBNA-1疫苗和免疫治療的重要靶標。因此，滅活和減毒病毒疫苗的粘膜接種策略是預想的。由于局部傳遞的疫苗可對準粘膜，已經使用各種策略將免疫原性蛋白傳遞給粘膜。
在具體的實施方案中，疫苗可在與霍亂毒素，如霍亂毒素B或霍亂毒素A/B嵌合體的混合物中，或作為與它們的綴合物或嵌合融合蛋白而給予(Hajishengallis，J Immunol.，1544322-32，1995；Jobling和Hohles，Infect Immun.，604915-24，1992)。已描述了基于使用霍亂毒素B亞單位的粘膜疫苗(Lebens和Holmgren，DevBiol Stand 82215-27，1994)。在另一個實施方案中，可制備與熱不穩定腸毒素(LT)的混合物用于粘膜接種。
其它粘膜接著策略包括將病毒囊包在微囊中(美國專利號5,075,109，5,820,883，和5,853,763)和使用免疫強化膜載體(WO98/0558)。使用紅細胞(rbc)或rbc血影(美國專利號5,643,577)，或使用藍舌抗原(美國專利號5,690,938)可增強口腔給予免疫原的免疫原性。
實施例參考下列實施例將更好理解本發明，實施例說明本發明而不限制它。
實施例1“雙義”方法產生甲型流感病毒從一個模板合成vRNA和mRNA作為減少質粒數量的第一步，這個實施例報道了在同一質粒上含pol I和pol II啟動子的質粒的構建和轉染并提供了這個系統允許從一個模板表達vRNA和病毒的證據。這個實施例已經公開了(Hoffmann等，Virology(病毒學)2000，267310)。
材料和方法質粒的克隆.根據標準方案實施所有克隆和PCR反應。簡言之，A/WSN/33聚合酶復合體基因的表達質粒源自含人巨細胞病毒(CMV)的立早啟動子和編碼牛生長激素(BGH)的基因的多聚A位點的pcDNA3(Invitrogen)。病毒cDNAs源自質粒pWNP143，pWSNPA3，pWSNPB2-14，pGW-PB1，產生表達構建體pHW25-NP，pHW23-PA，pHW21-PB2，pHW22-PB1。pHW12由將人pol I啟動子和終止序列插在pol II啟動子和多聚A位點之間而產生。質粒pHW52源自pHW12，方式是通過首先插入延伸了位點HindIII和XhoI的含PB1非編碼區的寡核苷酸，然后將pHW22-PB1的PB1編碼區插入這些位點。質粒pHW82-PB1通過刪除CMV啟動子序列源自pHW52-PB1。使用pEGFP-N1(Clontech)作為模板PCR擴增并在SacII/XhoI消化后將cDNA插入含人pol I啟動子和鼠終止子和SacII/XhoI分離的M節段的非編碼區的載體pHW72，然后得到報道構建體pHW72-EGFP中增強綠熒光蛋白(EGFP)的編碼區。用含節段特異性序列和用于插入到BsmBI消化的載體pHH21中的BsmBI位點的引物進行RT-PCR擴增病毒RNA而構建pHW127-M和pHW128-NS(E.Hoffmann，Ph.D.Thesis 1997，Justus Liebiguniversity，Giessen，德國；Neumann等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1999，969345)。質粒pPolI-WSN-PBl；pPolI-WSN-PB2，pPolI-WSN-PA，pPolI-WSN-NP，pPolI-WSN-HA，pPolI-WSN-NA，pEWSN-HA，和pCAGGS-WNA15的構建已經在別處描述(Neumann等，前述)。
細胞培養和轉染.Madin-Darby犬腎(MDCK)細胞保持在含10％胎牛血清(FBS)的改良Eagle培養基(MEM)中，293T人胚腎細胞在含10％FEB的Dulbecco’s改良Eagle培養基(DMEM)中培養。根據制造商的說明使用TransIT LT-1(Panvera，Madison，Wisconsin)轉染1×106個293T細胞。不同量質粒(表1)與TransIT LT-1(每1μg DNA 2μlTransIT LT-1)混合，在室溫培養45分鐘并加入細胞中。六個小時后，用含0.3％牛血清白蛋白(BSA)和0.01％ FBS的Opti-MEM(Gibco/BRL，Gaithersburg，Maryland)替換DNA轉染混合物。轉染后四十八小時，滴定MDCK細胞中含病毒的上清。
RNA分離和RT-PCR.使用RNeasy-Kit(Qiagen，Valencia，California)根據制造商的說明，從病毒顆粒中分離病毒RNA。對于重組流感病毒的特性描述，根據提供的方案使用Access RT-PCR kit(Promega，Madison，Wisconsin)。在RT-PCR實驗中使用下列引物Seq-PBl#15’-AGG ATG GGA TTC CTC AAG G-3’(SEQ ID NO1)；Seq-PBl#25’-GCT ATG GTT TCC AGA GCC CG-3’(SEQ ID NO2)；Bm-PBl-15’-TAT TCG TCT CAG GGA GCG AAA GCA GGC A-3’(SEQ IDNO3)；Bm-PBl-2341R5’-ATA TCG TCT CGT ATT AGT AGA AAC AAGGCA TTT-3’(SEQ ID NO4)。使用PTC-200 DNA engine(MJ Research，Watertown，Massachusetts)進行RT-PCR實驗。擴增程序始于48℃45分鐘1個循環(第一條cDNA鏈合成)，和94℃2分鐘1個循環(滅活AMv逆轉錄酶和cDNA變性)。這些循環后跟40個循環的94℃20秒，52℃30秒和72℃30秒(PCR擴增)；以72℃5分鐘的1個循環結束程序。瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產物并用引物Seq-PBl#1或Seq-PBl#2測序。
流式細胞計數.轉染后四十八小時，用磷酸平衡鹽水(PBS)洗滌293T細胞，沉淀并重懸于加了5％ FBS的PBS中。用FACS Calibur流式細胞計數儀(Becton Dickinson)進行流式細胞計數分析，用CellQuest軟件包分析數據。對于EGFP表達分析，我們使用發射波長530nm(FL1)獲得高敏感性的EGFP介導的熒光檢測。
結果和討論含兩個真核啟動子的克隆載體pHW12的設計和特征.甲型流感病毒是含負義極性RNA分子的節段化病毒。在復制循環過程中，核糖核蛋白復合體蛋白(PB2，PB1，PA，NP)識別八個vRNA節段的5’和3’結構導致流感病毒基因的復制和轉錄。終止序列元件高度保守的事實表明轉錄的人工RNA應該具有與5’和3’末端相同的序列(Luo等，J.Virol.1991，652861；Flick等，RNA 1996，21046)。構建了克隆載體pHW12，使用限制性內切酶BsmBI允許感興趣序列插在pol I啟動子和終止子之間。pol I轉錄單位側翼與來自巨細胞病毒(CMV)的pol II啟動子和編碼牛生長激素的基因的多腺苷酸化信號相連。CMV啟動子、多聚A位點和質粒的主干源自克隆載體pcDNA3.
PB1蛋白在pol I/pol II雙向轉錄系統中表達.為了檢測polI/pol II一個質粒轉錄系統，將A/WSN/33病毒的PB1基因的cDNA插入克隆載體pHW12產生質粒pHW52-PB1。HindIII和XhoI限制性位點插入到這個基因的5’和3’非編碼區。包含這些基因標記是確保產生的重組病毒能夠用RT-PCR鑒定。我們期望用這個質粒轉染的人細胞會產生兩種類型的RNA細胞pol I合成的PB1-vRNA和pol II合成的帶5’帽結構的mRNA。mRNA翻譯應導致PB1蛋白的合成。
為了檢測PB1蛋白是否從這個構建體產生，我們通過構建表達質粒pHW21-PB2，pHW23-PA和pHW25-NP，它們含有在CMV啟動子控制下的編碼A/WSN/33的PB2、PA和NP蛋白的cDNAs，檢測了人工vRNA的復制和轉錄。對于體內合成人工vRNA，我們構建了報道質粒pHW72-EGFP，它含側翼與M節段的非編碼區和人pol I啟動子和小鼠終止序列相連的EGFP cDNA。五個質粒(2μg pHW21-PB2，2μg pHW52-PB1(pol I/pol II啟動子構建體)，2μg pHW23-PA，2μg pHW25-NP，和1μg pHW72-EGFP)轉染293T細胞。轉染后24和48小時，用熒光顯微鏡分析細胞。24小時后觀察到熒光細胞。這個結果表明在24小時內，聚合酶蛋白合成到足以允許流感病毒EGFP-vRNA特異性末端識別的濃度。這些蛋白合成翻譯為EGFP的mRNA。
為了估計這個系統的效率，我們進行流式細胞計數分析來計算熒光細胞的數量。五個質粒轉染后四十八小時，18.72％的細胞群顯示出熒光。當沒有加入pHW52-PB1時，僅觀察到背景水平的熒光細胞(0.06％)；這個發現與報道所有四個RNP復合體蛋白是vRNA擴增必需的早期研究相一致(Huang等，J.Virol.1990，645669)。該結果表明PB1-cDNA轉錄和PB1蛋白連同其它RNP復合體蛋白的所得濃度足以啟動病毒轉錄/復制過程。
重組甲型流感病毒的產生.對于感染性甲型流感病毒的產生，需要質粒pHW52-PB1不但提供PB1 mRNA和蛋白，還要提供足夠量的PB1-vRNA，它可被包裝到后代病毒中。對于剩余的七個vRNAs，我們使用含有側翼與人pol I啟動子和小鼠終止子相連的A/WSN/33病毒全長RNAs的cDNAs的質粒。這些質粒轉染應該引起全部八個病毒RNAs合成，該RNA是由形成新vRNPs的聚合酶蛋白復制和轉錄的。結構蛋白合成后，RNPs會包裝到新病毒顆粒中。
我們用不同量pHW52-PB1質粒(0，2，4μg)連同質粒pPolI-WSN-PB2，pPolI-WSN-PA，pPolI-WSN-HA，pPolI-WSN-NP，pPolI-WSN-NA，pHW127-M，pHW128-NS(每種1μg)轉染293T細胞。蛋白表達質粒pHW21-PB2(1μg)，pHW23-PA(0.1μg)，pHW25-NP(1μg)，pEWSN-HA(1μg)和pCAGGS-WNA15(1μg)共轉染。血凝素(HA)和神經氨酸酶(NA)的表達質粒包括在內來增加轉染病毒的產量。
轉染后四十八小時，最初轉染的293T細胞上清轉移給MDCK細胞。在所有加入pHW52-PB1質粒的轉染試驗中，傳代后24小時，我們觀察到病毒誘導的細胞病變作用。如果在轉染反應中沒有包括表達PB1的質粒，見不到細胞病變作用。在MDCK細胞上滴定感染細胞的上清來確定病毒滴度；發現上清含有2×104-2×105pfu/ml。這個發現表明PB1-pol I/pol II啟動子質粒轉染(與表達質粒一起)后，在人細胞系293T中合成了足以產生感染性甲型流感病毒的水平的PB1 vRNA和PB1蛋白。在用含分開在兩個質粒的PB1-cDNA的質粒(pHW82-PB1和pHW22-PB1)共轉染的實驗中，發現2×104pfu/ml的病毒滴度；使用含野生型PB1序列的質粒(pPol I-WSN-PB1和pHW22-PB1)的類似實驗產生3×106pfu/ml的病毒滴度。
與以前研究使用的帶pol II啟動子的表達構建體(Neumann等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1999，969345)不同，我們使用含來自插入在CMV啟動子和聚腺苷酸位點之間的pol I轉錄單位的序列的質粒pHW52-PB1。EGFP報道基因表達證明這個系統中PB1蛋白的整體表達足以形成EGFP-RNP復合體。盡管pol I啟動子/終止區含有pol I特異性轉錄和終止因子的識別序列(Beckmann等，Science 1995，2701506；Bell等，Science 1988，2411192；Kuhn等，EMBO J.1994，13416)，這些DNA結合蛋白看來不能抑制pol II介導的轉錄。這些發現與pol I特異性DNA結合蛋白在細胞rDNA轉錄發生的隔室－核仁中更豐富的發現相一致(Evers等，EMBO J.1995，141248)。這些結果表明pol I/pol II啟動子構建體轉染細胞后，一些質粒傳遞到核仁，在那里發生pol I介導的轉錄，而一些保留在核中，在那里它們被RNA聚合酶II轉錄。
因為報道構建體pHW52-PB1在起始密碼子前和終止密碼子后的非編碼區中含有另外的非流感病毒序列(限制性位點)，我們感興趣這些序列是否被穩定保留在病毒PB1 RNA節段中。因此，在轉染病毒二次傳代給MDCK細胞后，我們分離了vRNA并進行逆轉錄PCR分析。用PB1特異性引物擴增vRNA導致期望大小的cDNA節段產生。用相同的病毒RNA和引物，但不加入逆轉錄酶，沒有得到擴增產物，表明cDNA起源于病毒RNA不是來自從轉染細胞上清攜帶的質粒DNA。
PCR產物測序揭示RNA分子中存在兩個限制性位點序列。結果表明pol I/pol II轉錄系統允許回收感染性重組病毒且PB1基因非編碼區中含外來基因的病毒是有活力的。該修飾的PB1節段仍可被復制、轉錄和包裝到病毒顆粒中。以前，通過使用RNP轉染系統，改變了甲型流感病毒節段的非編碼區。通過用乙型流感病毒的NS節段的相應序列置換NA基因的非編碼區，得到了轉染流感病毒(Muster等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1991，885177；Bergmann和Muster，J.Gen.Virol.1995，763211)。含嵌合NA節段的這個類型病毒在小鼠和用非致死劑量接種的抗野生型流感病毒感染的保護性小鼠中顯示出減毒表型。這些結果表明RNA節段的非編碼區的基因改變可改變轉染病毒的生物特性。在這里，我們首次報道了甚至非流感病毒序列也可以插入PB1節段的非編碼區中。
用pol I/pol II轉錄系統，現在可能在PB1節段的非編碼區系統地修飾這些基因元件并估計這些基因操作是否引起重組病毒的生物性質改變。事實上，帶突變PB1節段的病毒與野生型病毒相比的產量低表明插入的序列消極影響病毒生長。
盡管近來發展的基于質粒的系統(Neumann等，前述)在產生流感病毒中非常有效，但它包括克隆14-17個質粒。在這個研究中，我們將有效回收流感病毒A/WSN/33株所需的質粒數量降低到13。這個方法達到的質粒數量降低預示可增加除了293T細胞的細胞系的轉染效率，因此允許將基因遞送給有效遞送14個質粒很難達到的細胞系。Fodor等(J.Virol.1999，739679)能夠在轉染12個質粒后回收流感病毒，但是在那個實驗中，病毒產量僅為每106個轉染Vero細胞產生1-2個感染性病毒顆粒。
實施例2從基于最少質粒的系統構建重組甲型流感病毒這個實施例描述了使用基于質粒的轉染系統完全從克隆cDNA中回收甲型流感病毒。與已建立的基于質粒的系統不同，這個產生甲型流感病毒的系統利用僅八個表達質粒的構建和轉染，每個含有一個拷貝的相應病毒基因節段的不同病毒cDNA。這個反向遺傳系統減少了回收甲型流感病毒所需的質粒數量且允許可預知地和有效地產生重配病毒。
材料和方法質粒的克隆.質粒pHW2000(圖3A)源自pHW12(實施例1)。pHW2000克隆載體含有被兩個BsmBI位點隔開的225bp的人pol I啟動子和33bp鼠終止子序列。pol I啟動子和終止子元件側翼與截短的人巨細胞病毒的立早啟動子(開始于pcDNA3中發現的轉錄起始位點上游大約350bp，Invitrogen，Carlsband，California)和編碼牛生長激素的基因的多腺苷酸化信號相連。將質粒pPolI-WSN-PB2，pPolI-WSN-PBl，pPolI-WSN-PA，pPolI-WSN-NP，pPolI-WSN-HA，pPolI-WSN-NA(Neumann等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1999，969345)，pHW127M和pHW128-NS(實施例1)的ApaI-SalI片段(含病毒cDNA和pol I啟動子和終止子序列插入pHW2000的ApaI-SalI載體片段中來構建含病毒A/WSN/33(H1N1)的cDNA的八個質粒(pHW181-PB2，pHW182-PB1，pHW183-PA，pHW184-HA，pHW185-NP，pHW186-NA，pHW187-M和pHW188-NS)。逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)擴增病毒RNA構建含A/Teal/HK/W312/97(H6N1)的cDNA的八個質粒(pHW241-PB2，pHW242-PB1，pHW243-PA，pHW244-HA，pHW245-NP，pHW246-NA，pHW247-M和pHW248-NS)。PCR反應中使用的引物在其3’末端含有節段特異性序列，在其5’末端含有BsmBI或BsaI限制性位點序列。用BsmBI或BsaI消化PCR產物后，該片段克隆到載體pHW2000(圖3A)中。用于擴增A/teal/HK/W312/97(H6N1)基因組的引物序列如下。從左至右相當于5’和3’末端顯示引物。甲型流感病毒特異性核苷酸被下劃線。
· NSBm-NS#1TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGGTG(SEQ ID NO5)Bm-NS#2ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTT(SEQ ID NO6)· MBm-M#1TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGTAG(SEQ ID NO7)Bm-M#2ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGTAGTTTTTT(SEQ ID NO8)·NABm-NAl-1TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGAGTTTAACATG(SEQ ID NO9)Bm-NA-1413RATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGAGTTTTT(SEQ ID NO10)· HABm-H6-1TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGGGAAAATG(SEQ ID NO11)Bm-NS#2ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTT(SEQ ID NO12)(注HA和NS節段在非編碼區的這部分具有等同序列)· NPBa-NP-1TATTGGTCTCAGGGAGCGAAAGCAGGGTA(SEQ ID NO13)Ba-NP1565RATATGGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTATT(SEQ ID NO14)·PABm-PAl-1TATTCGTCTCAGGGAGCGAAAGCAGGTACTGATCC(SEQ ID NO15)
Bm-PAl-2231RATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGTACTTTTT(SEQ IDNO16)·PB1Bm-PBla-1TATTCGTCTCAGGGAGCGAAAGCAGGCAAACC(SEQ ID NO17)Bm-PB1-2341RATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGCATTT(SEQ ID NO18)· PB2Ba-PB2-1TATTGGTCTCAGGGAGCGAAAGCAGGTCAATTATATTC(SEQ IDNO19)Ba-PB2-2341RATATGGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGTCGTTTTT(SEQ IDNO20)用引物5’-AGCAAAAGCAGG-3’(SEQ ID NO21)進行RT反應。為確保表達質粒中源自RT-PCR擴增的病毒cDNAs不具有不想要的突變，測序被插入的cDNAs。
病毒和細胞培養.流感病毒A/WSN/33(H1N1)和A/Teal/HK/W312/97(H6N1)在10日齡的卵中增殖。Madin-Darby犬腎(MDCK)細胞保持在含10％FBS的改良Eagle培養基(MEM)中。293T人胚腎細胞在含5％FBS的Opti-MEM I(Life Technologies，Gaithersburg，Maryland)中培養。對于轉染實驗，使用六孔組織培養板。轉染前的那天，胰蛋白酶消化在75cm2的細頸瓶中匯合293T和MDCK細胞并將每個細胞系的10％混合于18ml OptiMEM I；這種細胞懸液3ml接種在六孔板的一個孔中。培養的MDCK和293T細胞(每孔0.2-1×106個每種細胞)用于轉染實驗。根據制造商指南使用TransIT LT-1(Panyera，Madison，Wisconsin)轉染細胞。簡言之，每1μg DNA 2μl TransIT LT-1混合，室溫培養45分鐘，并加入到細胞中。六個小時后，用Opti-MEM I替換DNA轉染混合物。轉染后三十小時，含TPCK-胰蛋白酶的1mlOpti-MEM I加入細胞中；添加使得細胞上清中TPCK-胰蛋白酶的終濃度是0.5μg/ml。在MDCK細胞上滴定上清確定細胞上清的病毒滴度。
RNA分離和RT-PCR.根據制造商的說明，用Rneasy-Kit(Qiagen，Valencia，California)從病毒顆粒中分離病毒RNA。對于重組流感病毒的特性描述，根據提供的方案使用Access RT-PCR kit(Promega，Madison，Wisconsin)。RT-PCR實驗中使用下列引物Bm-NS#1(5’-TAT TCG TCT CAG GGA GCA AAA GCA GGG TG-3；SEQ ID NO5)和Bm-NS#2(5’-ATA TCG TCT CGT ATT AGT AGA AAC AAG GGT GTT TT-3；SEQ ID NO12)。使用PTC-200 DNA engine(MJ Research，Watertown，Massachusetts)進行RT-PCR實驗。擴增程序開始于48℃45分鐘1個循環和94℃2分鐘1個循環。這些循環后跟40個循環的94℃20秒，52℃30秒和72℃40秒；以72℃5分鐘1個循環結束程序。用瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產物并用引物Bm-NS#1測序。St.Jude兒童研究醫院的生物技術中心使用含AmpliTaq DNA polymerase FS(Perkin-Elmer，Applied Biosystems，Inc.[PE/ABI]，Foster City，CA)和合成寡核苷酸的堿性蕊香紅或d堿性蕊香紅染色的終止循環測序預備反應試劑盒確定模板DNA的序列。樣品接受電泳，檢測和在PE/ABI 373型，373型Stretch或377型DNA測序儀上分析。
結果產生A/VSN/33(H1N1)的pol I-pol II系統的建立.因為甲型流感病毒的基因組含有八個節段，所以在pol I啟動子和pol II啟動子之間插入全部八個甲型流感病毒cDNAs應該導致八個vRNAs，所有病毒mRNA的轉錄和全部10個病毒蛋白合成(圖1)。含結構蛋白的全部病毒核糖核蛋白裝配后，感染性甲型流感病毒應該形成(圖2)。
為了檢測用這個cDNA雙向轉錄系統是否能回收感染性甲型流感病毒，構建了含A/WSN/33(H1N1)的八個cDNAs的八個表達質粒(pHW181-PB2，pHW182-PB1，pHW183-PA，pHW184-HA，pHW185-NP，pHW186-NA，pHW187-M和pHW188-NS)。八個質粒(每個質粒1μg)(表1)共轉染給短暫共培養的293T-MDCK細胞。轉染前的那天兩個細胞系在一個細胞培養孔中共培養，確保甲型流感病毒高效率DNA轉染(293T細胞)和復制效率(MDCK細胞)的條件。48和72小時后，MDCK細胞顯示出病毒誘導的細胞病變作用，但無PB1表達構建體的七個質粒(表1)轉染后，沒有觀察到細胞病變作用。在轉染后的不同時間在MDCK細胞中滴定確定上清的病毒滴度。轉染后二十四小時細胞上清每毫升含1×103個病毒；轉染后72小時每毫升產生了2×107個感染性病毒(表1)。回收的病毒在MDCK細胞中傳代兩次。為了證實產生的病毒是設計的A/WSN病毒，RT-PCR產生NS基因的cDNA(圖4A，泳道8)。用限制性核酸內切酶NcoI消化后，產生兩個片段(圖4B，泳道8)，擴增片段的序列分析證實回收的病毒確實是設計的A/WSN病毒。這些發現表明pol I和pol II驅動的從八個模板合成vRNA和mRNA導致感染性甲型流感病毒產生。
表1.回收A/WSN/33(H1N1)和A/Teal/HK/W312/97(H6N1)病毒使用的質粒組
§數字代表轉染后24h(小時)，48h和72h測定的轉染細胞上清每毫升中的感染性病毒顆粒*觀察到共培養MDCK細胞中的細胞病變作用通過共轉染八個質粒回收A/Teal/HK/W312/97(H6N1).甲型流感病毒/WSN/33(H1N1)，最初源自1918年人流感大流行株(Goto和Kawaoka，Proc.Acad.Sci.USA 1998，9510224；Reid等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1999，961651)，已在小鼠腦中傳代并很好適應在細胞培養中生長。為了估計八個質粒系統從克隆cDNA產生已經不適應在細胞培養中生長的病毒的效率，嘗試單獨從克隆cDNA中產生病毒A/Teal/HK/W312/97(H6N1)。這個H6N1病毒是在1997年香港爆發H5N1期間從死水鴨(teal)中分離的。這個病毒的基因分析揭示它具有與致病性H5N1病毒株有97％以上核苷酸同源性的七個節段。從感染的尿囊液中提取RNA，RT-PCR擴增的cDNAs插入pHW2000；這個插入產生八個表達質粒(圖3)。pHW241-PB2，pHW242-PBl，pHW243-PA，pHW244-HA，pHW245-NP，pHW246-NA，pHW247-M和pHW248-NS(每個1μg)轉染共培養的293T-MDCK細胞后七十二小時，在MDCK細胞中觀察到病毒誘導的細胞病變作用(表1)。轉染細胞上清的病毒產量是每毫升2×105個感染性病毒。如圖4(A和B，泳道2)所示，NS節段的表征證實了回收病毒的同一性。這些結果說明這個質粒系統僅需要克隆八個cDNA到一個質粒載體中，八個表達質粒轉染允許回收具有已不適應在哺乳動物細胞中生長的病毒的抗原性的甲型流感病毒。
重配甲型流感病毒的回收。檢測八個質粒系統產生重配病毒的效用。因為這個DNA轉染系統不需要任何選擇系統，所以重配病毒的回收應該可通過轉染反應中適當組合表達質粒而完成。含A/Teal/HK/W312/97(H6N1)cDNA的七個表達質粒與含A/WSN/33(H1N1)cDNA的一個表達質粒共轉染(表2)。含teal病毒的七個節段和WSN病毒的M節段或NS節段的重配病毒得到了高病毒產量。NA和HA重配病毒得到的病毒產量低(表2)。因為用八個質粒系統拯救單一重配病毒，所以下一步是確定用來自一個病毒的多個節段是否能夠拯救病毒。因此，含H6N1病毒的RNP復合體基因cDNA的四個表達質粒(pHW241-PB2，pHW242-PB1，pHW243-PA和pHW245-NP)與含WSN病毒cDNA的質粒pHW184-HA，pHW186-NA，pHW187-M和pHW188-NS一起轉染(表2)。每毫升細胞上清回收4×106個病毒。如圖4所示(泳道10)，擴增的四重重配病毒的NS節段被NcoI切割；因此，NS節段源自WSN病毒。這些結果表明八個質粒轉染系統允許回收單一和四重重配病毒。
表2.八個質粒共轉染產生A/Teal/HK/W312(H6N1)和A/WSN/33(H1N1)之間的重配甲型流感病毒
*含A/WSN/33(H1N1)cDNA的質粒用粗體顯示§數字代表轉染后72h測定的每毫升轉染細胞上清中感染性病毒顆粒討論含A/Teal/HK/W312/97(H6N1)或A/WSN/33(H1N1)的八個表達質粒轉染后拯救甲型流感病毒的能力證明pol I-pol II轉錄系統提供了形成感染性甲型流感病毒的足夠量的vRNA和病毒蛋白。合成了非編碼區不同的兩種類型mRNAs(圖1)。編碼所有病毒蛋白的mRNA類型被pol II直接轉錄。除了含非編碼區(NCR)的流感病毒序列，這些mRNAs還含有來自pol I啟動子和鼠終止子區的序列。重要的是，開發的polI-pol II表達系統僅含33bp的鼠終止子序列。使用報道基因氯霉素乙酰轉移酶(CAT)和綠色熒光蛋白(GFP)的以前的研究表明174bp的終止子區的序列降低pol II介導的蛋白表達(Hoffmann，E.，Ph.D.Thesis 1997，Justus Liebig University，Giessen，德國)。第二種mRNA類型產生于病毒復制和轉錄過程啟動后(圖2)。這種mRNA是由病毒聚合酶蛋白合成的且在流感病毒非編碼序列前含有通過帽攫取(cap snatching)來自細胞RNAs的5帽結構。從這兩種mRNAs翻譯的結構蛋白與RNP復合體結合形成新的病毒顆粒。轉染病毒出芽之后，產生的病毒顆粒接著可在293T細胞和共培養的MDCK細胞中復制。
與在前述“發明背景”中討論的方法不同，本發明的方法在八個質粒中使用了八個cDNAs，含有225bp的pol I啟動子序列和33bp終止子序列。在pol I-pol II系統中，所有10個病毒蛋白從截短的人巨細胞病毒的立早啟動子表達。17個質粒系統(Neumann等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1999，969345)和8個質粒系統(本研究)的所有結構蛋白表達結果比表達RNP復合蛋白的質粒共轉染(Neumann等，前述；Fodor等，J.Virol.1999，739679)的病毒回收效率高的事實支持轉染后提供HA，NA，M1，M2，和NS2蛋白可增加感染性甲型流感病毒的產生的想法。
病毒復制循環包括病毒蛋白彼此之間和與細胞因子之間復雜的相互作用(Ludwig等，Virol.Immunol.1999，12175)。因此，對于感染性病毒的產生，質粒驅動的病毒分子合成應該提供啟動復制循環和形成病毒樣顆粒的最佳濃度的病毒蛋白。盡管八個質粒系統證明是有效的，還可能進一步增加病毒的產生。已經表明表達RNP復合蛋白的轉染質粒與M1蛋白的表達之間的比率影響轉錄酶的活性(Pleschka等，J.Virol.1996，704188；Perez和Donis，Virology 1998，24952)。形成病毒樣顆粒的效率也依賴于結構病毒蛋白的濃度(Mena等，J.Virol.1996，705016；Gomez-Puertas等，J.Gen.Virol.，1999，801635；Neumann等，J.Virol.2000，74547)。改變轉染反應中使用的質粒濃度或使用含不同pol II啟動子的表達質粒可能因此進一步增加用polI-pol II系統產生感染性病毒的效率。因為細胞因子介導的剪接效率影響流感病毒復制的能力(Lau和Scholtissek，Virology 1995，212225)，所以使用293T以外的細胞系可能增加某些甲型流感病毒株的病毒產量。四重重配的病毒產量高(表2)與HA，NA和M節段介導培養細胞中A/WSN/33(H1N1)快速復制的發現相一致(Goto和Kawaoka，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1998，9510224；Schulman和Palese，J.Virol.1977，24170；Yesuda等，J.Virol.1994，688141)。
鳥H6N1病毒和人H1N1病毒間的有活力重配體的產生表明這個H6N1病毒可從遠緣病毒中獲取基因節段。基因分析表明致病性H5N1病毒是由重配產生的(Xu等，Virology 1999，26115)。在H6N1和H9N2亞型中發現了H5N1樣基因節段(Guan等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1999，969363)，表明這些病毒可能是致病性H5N1病毒前體。可產生新致病性流感病毒的重配事件可能在將來發生。然而，本研究開發的簡化方法產生和操作這些病毒的能力將幫助研究者們更好地理解這些新病毒的生物性能和開發有效的疫苗保護人群對抗它們。新致病性株的出現和制備疫苗之間的時間段的長度在疫苗接種程序的有效性中是決定性的變量。僅克隆八個質粒產生病毒的能力減少了產生有效疫苗候選者所需的時間并通過簡化病毒產生和降低制備疫苗的整體費用而改進了現有的反向遺傳系統。
在pol I啟動子和pol II啟動子之間將病毒cDNA導入真核細胞回收病毒的想法也適用于產生正粘病毒科的其它成員。對于乙型流感病毒疫苗，這個策略將需要構建和共轉染八個病毒；對于丙型流感，七個；對于Thogotovirus，六個。5’帶帽mRNA以及來自相同cDNA模板的vRNA的體內轉錄也可以簡化其它RNA病毒的基于質粒的系統或甚至利于其它科病毒的pol I-pol II系統的建立(如Arenaviridae，Bunyaviridae)。
實施例3完全從克隆cDNA產生乙型流感病毒的RNA pol I/pol II系統甲型和乙型流感病毒均含有負極性單鏈RNA的八個節段(見綜述Lamb和Krug，″OrthomyxoviridaeThe viruses and theirreplication″；Fields(編)，Virology；1353-1395頁)。與甲型流感病毒不同，乙型流感病毒的八個節段編碼11個蛋白。三個最大的基因編碼RNA聚合酶的成分，PB1，PB2和PA；節段4編碼血凝素。節段5編碼核蛋白，與病毒RNA有關的主要結構成分；節段6編碼神經氨酸酶(NA)和NP蛋白。兩種蛋白NB和NA，是從雙順反子mRNA的重疊閱讀框架翻譯的。乙型流感病毒的節段7也編碼兩種蛋白BM1和BM2。最小的節段編碼兩個產物NS1從全長RNA翻譯而來，而NS2從剪接的mRNA翻譯。
含乙型流感病毒cDNA的表達質粒構建包括產生甲型流感病毒A/teal/HK/W312/97(H6N1)所述的相同策略。第一個RNA從感染的尿囊液得到的病毒顆粒如B/Lee/40中分離。基于該非編碼區的保守序列，制備RT-PCR的引物并用于合成cDNA。在那些引物的5’末端含有BsmBI或BsaI限制性內切酶的序列。用BsmBI或BsaI消化PCR產物允許插入用BsmBI線性化的克隆載體pHW2000(或pHW11)中。為了確保質粒中cDNAs不含由于PCR過程中聚合酶造成錯誤的不期望的突變，必須對構建體進行測序。
共培養293T-MDCK細胞(或COS-1-MDCK)細胞的共轉染和添加胰蛋白酶導致感染性乙型流感病毒產生。轉染細胞的上清接著傳代到新的MDCK細胞上。用標準方法可測定所得病毒滴度，如HA試驗和空斑實驗。用每個基因節段的特異性引物進行RT-PCR允許從重組乙型流感病毒擴增RNA。產物測序證實產生的病毒確實是期望的流感病毒。
實施例4甲型流感病毒原株的八個質粒拯救系統為了確定這個基于質粒的系統產生疫苗的商業實用性，我們如實施例2所述完全從克隆cDNAs中產生了原株A/PR/8/34(H1N1)-現在用于制備滅活疫苗。重組病毒傳代給卵后用HA實驗測定的病毒產量與親本野生型病毒的病毒產量一樣高。這些結果證明產生的重組病毒與親本卵生長病毒具有相同的生長性能，表明八個質粒轉染方法具有改善當前使用的制備疫苗病毒的方法的潛力。
材料和方法病毒和轉染.從St.Jude兒童研究醫院的貯藏庫得到流感病毒A/PR/8/34(H1N1)并在10日齡含胚雞卵中增殖。Madin-Darby犬腎(MDCK)細胞在含10％FBS的MEM中維持。293T人胚腎細胞和Vero細胞在含5％胎牛血清(FBS)的Opti-MEM I(Life Technologies，Gaithersburg，MD)中培養。對于轉染實驗，使用六孔組織培養板。共培養MDCK和293T細胞(每孔0.21×106個每種細胞)用于轉染實驗。根據制造商的說明使用TransIT LT-1(Panyera，Madison，WI)用于轉染細胞。簡言之，每1μg DNA 2μl TransIT LT-1混合，室溫培養45分鐘，并加入到細胞中。六個小時后，用Opti-MEM I替換DNA轉染混合物。轉染后二十四小時，含TPCK-胰蛋白酶的1ml Opti-MEM I加入細胞中；添加使得細胞上清中TPCK-胰蛋白酶的終濃度是0.5μg/ml。通過空斑實驗于MDCK細胞上傳代上清確定病毒滴度。
RT-PCR和質粒的構建.用Qiagen Rneasy試劑盒從20μl含病毒的受孕卵尿囊液中提取病毒RNA。利用兩步RT-PCR擴增病毒基因的每個節段。簡言之，根據提供的方案使用AMV逆轉錄酶(RocheDiagnostics，Germany)將RNA轉錄為cDNA，然后使用Expand高保真PCR系統(Roche Diagnostics，Gennany)擴增cDNA。擴增程序開始于94℃2分鐘1個循環；隨后94℃20秒、54℃30秒、72℃3分鐘的30個循環；以72℃5分鐘1個循環結束程序。使用的引物含有BsaI或BsmBI的序列以允許將消化的PCR片段精確插入到克隆載體pHW2000中(見實施例2)。
對于HA，NP，NA，M，NS基因的克隆，用BsmBI或BsaI消化PCR片段并連接到克隆載體pHW2000中。對于P基因的克隆，分離、消化兩個(PB2，PA)或三個(PB1)節段并連接到pHW2000-BsmBI中。為了確保基因不含不期望的突變，測序PCR得到的片段。含A/PR/8/34(H1N1)全長cDNA的八個質粒記做pHW191-PB2，pHW192-PB1，pHW193-PA，pHW194-HA，pHW195-NP，pHW196-NA，pHW197-M和pHW198-NS。St.Jude兒童研究醫院的生物技術中心使用含AmpliTaqDNA聚合酶FS(Perkin-Elmer，Applied Biosystems，Inc.[PE/ABI]，Foster City，CA)和合成寡核苷酸的堿性蕊香紅或d堿性蕊香紅染色的終止循環測序預備反應試劑盒測定模板DNA的序列。樣品接受電泳，檢測和在PE/ABI 373型，373型Stretch或377型DNA測序儀上分析。
結果為了允許細胞內合成病毒樣vRNAs和mRNAs，我們已建立了RNA polI-pol II表達系統(見實施例2)。在這個系統中，病毒cDNA插在人RNA聚合酶I(pol I)啟動子和終止子序列之間。這個完整的pol I轉錄單位側翼與RNA聚合酶II(pol II)啟動子和多聚(A)位點相連。兩個轉錄單位的定位允許從一個病毒cDNA模板合成負義病毒RNA和正義mRNA。這個pol I-pol II系統開始于從其自己的啟動子轉錄兩個細胞RNA聚合酶的啟動，推測在核內不同的隔室(見圖1)。八個質粒轉染到293T細胞導致源自細胞和病毒轉錄核翻譯裝置的所有分子的相互作用，最終產生感染性甲型流感病毒。這個系統證明對于形成A/WSN/33(H1N1)和A/Teal/HK/W312/97(H6N1)流感病毒很有效(實施例2)。
由于當前制備滅活流感病毒疫苗的原株是A/PR/8/34(H1N1)，我們試圖完全從克隆cDNA產生這個病毒。具有八個RNA節段的cDNAs插入載體pHW2000。所得質粒(pHW 191-PB2，pHW 192-PB1，pHW 193-PA，pHW 194-HA，pHW 195-NP，pHW196-NA，pHW197-M和pHW198-NS)轉染到共培養的293T-MDCK或Vero-MDCK細胞。轉染后72小時在MDCK細胞中滴定來測定病毒滴度。每毫升共培養Vero-MDCK細胞上清含有1×104pfu，每毫升共培養293T-MDCK細胞上清含有2×106pfu。293T-MDCK細胞的產量高很可能是由293T細胞與Vero細胞相比，轉染效率高引起的。這些結果表明八個質粒細胞允許從克隆cDNA產生A/PR/8/34(H1N1)。
為了比較野生型病毒和產生的重組病毒的生長，將雞含胚卵接種野生型病毒或重組病毒。感染后48小時收獲尿囊液。HA實驗確定病毒產量。盡管HA滴度在各個卵間不同，我們發現兩種病毒都具有5120和10240血細胞凝集單位間的HA滴度，表明兩種病毒都是高產量分離株。因此，DNA轉染產生的重組病毒具有與親本分離株相同的健康培養表型。
討論本發明的八個質粒系統避免了使用蛋白表達的分開的質粒(見發明背景)，因此簡化了完全從克隆cDNA產生甲型流感病毒的方法。疫苗的制備包括產生用作病毒種子在卵中或細胞培養中制備疫苗的病毒。疫苗接種程序的有效性依賴于選擇與傳播致病株緊密匹配的亞型來刺激接種人群產生高特異性抗體效價，引起有效保護。編碼內部甲型流感病毒基因的六個A/PR/8/34原質粒(pHW191-PB2，pHW192-PB1，pHW193-PA，pHW195-NP，pHW197-M和pHW198-NS)現在可用于與編碼當前傳播株的糖蛋白HA和NA的質粒共轉染。操作每個基因節段的能力也允許我們估計哪個基因節段對卵中或細胞培養中重配病毒的高產生長是重要的。
我們能夠僅用八個質粒共轉染產生兩個實驗室流感病毒株(A/WSN/33(H1N1)和A/PR/8/34(H1N1))和一個野生分離株(A/Teal/HK/W312/97(H6N1))的事實表明這個系統適用于開發減毒活流感疫苗。鼻內給予減毒活流感病毒疫苗誘導局部、粘膜的細胞介導的免疫和體液免疫。含有減毒活流感A/Ann Arbor/6/60(H2N2)的六個內部基因和同期野生型流感病毒的血凝素(HA)和神經氨酸酶(NA)的冷適應(ca)重配(CR)病毒看來被可靠減毒。已經表明這個疫苗對兒童和年輕成人有效(Keitel和Piedra，Textbook of Influenza，Nicholson等編，1998，373-390)。然而，它可能過度減毒而不能刺激過中年的人引起理想的免疫反應，在美國每年有20,000-40,000個個體的大群體由于流感感染而死亡。仍未很好確定每個節段對減毒表型的貢獻(Keitel和Piedra，前述)。只有通過將特定的確定的減毒突變順序導入病毒中才可獲得這個信息。由于詳細的分析需要測試大量的操作病毒，僅八個質粒的構建和轉染簡化了這個工作并減少了達到這個目的的時間和費用。
實施例5用于從八個質粒產生甲型流感病毒的單向RNA聚合酶I-聚合酶II轉錄系統前面的實施例描述了通過共轉染僅八個質粒產生甲型流感病毒的系統，由它表達了負義vRNA和正義mRNA(這個工作隨后發表了；見Hoffmann等，2000，Proceedings of the National Academy ofSciences，USA 97，6108-6113)。這個實施例描述了表達病毒樣RNAs的不同的轉錄系統的建立，允許從一條模板細胞內合成不帶帽正義cRNA和5’帶帽mRNA。含A/WSN/33(H1N1)cDNA的八個RNA pol I-pol II串聯啟動子質粒共轉染導致感染性甲型流感病毒產生，盡管比雙向系統的病毒產量低。我們的由最少質粒組細胞內產生vRNA和mRNA或cRNA和mRNA的方法可用于建立或優化其它RNA病毒的反向遺傳系統。
這個實施例中報道的結果發表了(見Hoffmann和Webster，J.Gen.Virol.2000，812843)。
對于負義RNA病毒的產生，負義vRNA或正義cRNA可作為模板。為了減少病毒回收所需的質粒數量，我們思考或許可能用細胞RNA polI和pol II從一條模板合成cRNA和mRNA。因此，我們嘗試開發單向pol I-pol II轉錄系統(圖5)。病毒cDNA以正義方向插在RNA pol I啟動子和終止子序列之間。整個pol I轉錄單位以正義方向插在RNApol II啟動子和聚腺苷酸位點之間(圖5)。不象在我們的雙向轉錄系統產生的負義vRNA和正義mRNA(圖1)，這里期望合成兩種類型的正義RNAs。從pol II啟動子，帶5’帽結構的mRNA應該在核質中轉錄。這種轉錄應該翻譯為蛋白。在核仁中，期望細胞pol I合成在5’末端具有三磷酸基的全長正義流感病毒cRNA(圖5)。構建了克隆載體pHW11，它可用于插入任意cDNA節段(圖6)。這個質粒含有位于pol I終止子序列和多聚(A)位點上游的pol II啟動子(人巨細胞病毒的立早啟動子)和人pol I啟動子。
為了檢測從單一模板合成cRNA和mRNA是否可產生感染性甲型流感病毒，我們構建了八個質粒。質粒pHW171-PB2，pHW172-PB1，pHW173-PA，pHW174-HA，pHW175-NP，pHW176-NA，pHW177-M和pHW178-NS含有具有甲型流感病毒株A/WSN/33(H1N1)的八個基因節段的cDNAs。所有這些cDNAs相對于pol I和POL II啟動子為正義反向。八個質粒(每個質粒1μg)如實施例2所述轉染給有或沒有MDCK細胞共培養的293T或COS-1細胞。
MDCK細胞上傳代后，用空斑試驗在不同的時間確定轉染細胞上清中的病毒產量。轉染后四十八小時產生了2-5×103個感染性病毒粒體(表3)。轉染后七十二小時，轉染293T后上清含4×104pfu/ml或轉染COS-1細胞后含2×104pfu/ml。293T細胞或COS-1細胞與MDCK細胞共培養，72h后病毒產量可增加(表3)。
病毒的產生證明八個質粒轉染后，RNA pol I合成了八個不帶帽正義cRNAs。與裸露病毒樣cRNAs結合形成cRNPs的細胞RNA pol II合成的轉錄物翻譯為四個病毒聚合酶蛋白。聚合酶單位PB1對識別末端結構和結合病毒樣cRNAs很重要(Gonzalez和Ortin，EMBO J.1999，183767；Gonzalez和Ortin，J.Virol.1999，73631；和1999b；Li等，EMBO J.1998，175844)。與其它聚合酶蛋白的相互作用開始了復制-轉錄循環，導致vRNPs和病毒mRNAs合成(Toyoda等，J.Gen.Virol.1996，772149；Gonzalez等，Nucl.Acids Res.1996，294456)。在pol I-pol II轉錄系統中，合成了兩種不同類型的mRNA。一種由RNA pol II直接從質粒DNA轉錄且在5’末端含有225nt pol I啟動子序列和在3’末端含有pol I終止序列。另一種mRNA由用vRNA作為模板的病毒聚合酶復合蛋白合成。這個mRNA的5，帽結構是帽攫取機制所需的，其中聚合酶亞單位PB2從細胞RNAs取走帽(Ulmanen等，Proc.Natl.Acad.sci.USA 1981，213607)。盡管兩種mRNA類型在其5’和3’非編碼區不同，但它們對所有病毒蛋白含有相同的開放閱讀框架。翻譯的結構蛋白連同vRNPs裝配產生感染性甲型流感病毒。
*含單向轉錄單位的質粒和含雙向轉錄單位的質粒(圖1)含代表A/WSN/33(H1N1)的八個基因節段的cDNAs。
#轉染沒有或有MDCK細胞共培養的293T或COS-1細胞。
由polI或polI合成的RNA轉錄物。
§在轉染后指出的時間(24h，48h，72h)在MDCK細胞上用空斑試驗測定上清的病毒滴度。
盡管證明從八個串聯啟動子質粒轉染的細胞中產生WSN病毒是十分可靠的，但是這個cRNA-mRNA方法的病毒產量低于產生vRNA和mRNA轉錄物的雙向系統(表3)。用含雙向pol I-pol II轉錄系統的八個質粒(圖1；實施例2；見Hoffmann等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2000，976108；pHW181-PB2，pHW182-PB1，pHW183-PA，pHW184-HA，pHW185-NP，pHW186-NA，pHW187-M和pHW188-NS)轉染293T或COS-1細胞后七十二小時，病毒滴度是1×107pfu/ml(表3)。COS-1或293T細胞轉染后二十四小時，上清中發現0.4-1×103pfu/ml。這些數據表明八個質粒雙向系統與需要12或17質粒共轉染的更復雜和麻煩的多質粒系統具有動力學類似的相同病毒產生效率(Neumann等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA1999，969345)。
八個串聯啟動子質粒轉染后24小時沒有發現感染性病毒(表3)。這些結果表明vRNA-mRNA和cRNA-mRNA方法間病毒產量的不同是由于原始pol I轉錄物的極性不同。雙向系統從細胞內合成vRNA開始，是類似自然甲型流感病毒感染的情況，其中vRNPs運輸到核中且vRNAs最初作為mRNA和cRNA合成的模板。在單向系統中，cRNPs是產生的第一個能夠復制的單位。為了產生mRNAs，cRNAs不得不復制為vRNAs，vRNPs最終包裝到后代病毒顆粒中(Hsu等，J.Gen.Virol.1987，772575)。由于從cRNPs產生vRNPs需要另外的反應，單向系統中病毒形成發生的時間晚于雙向系統病毒形成的時間。
兩個系統病毒產量不同的其它可能的原因是cDNA中的序列元件通過終止轉錄降低了轉錄效率，或RNA轉錄物中的序列降低了穩定狀態的pol I或pol II轉錄物的水平。八個病毒樣cRNAs或mRNAs中僅一個的濃度低降低了這個系統的整體效率，因為所有vRNPs和結構蛋白必須在病毒復制和病毒裝配最佳的濃度下合成。
八個質粒系統產生流感病毒A的高效率表明這個系統可應用于其它正粘病毒，如乙型流感病毒、丙型流感病毒和Thogotovirus。本研究的結果表明vRNA-mRNA系統將是從質粒產生這些病毒的最有效的方法。本發明允許建立基于pol I的系統產生正粘病毒科成員以外的RNA病毒，如副粘病毒科，Arenaviridae或Bunyaviridae的成員(Roberts，A.和Rose，J.K.，Virology 1998，2471-6；Bridgen和Elliot，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1996，9315400；Lee等，J.Virol.2000，743470)。與正粘病毒不同，多數RNA病毒在感染細胞的細胞質中復制。在其進化過程中，這些病毒的RNAs沒有經歷在核中發現的選擇壓力，如剪接。通常，非節段化負鏈RNA病毒的反向遺傳系統是基于從T7啟動子進行細胞內轉錄，如Conzelmann和同事開拓的狂犬病病毒的回收(Schnell等，EMBO J.1994，134195)。病毒樣RNAs的表達是由T7RNA聚合酶驅動的，通過用重組痘苗病毒感染或使用組成表達T7RNA聚合酶的細胞系。與在核內發生的pol I轉錄不同，由T7RNA聚合酶的轉錄發生在細胞質中。使用細胞質RNA病毒的pol I轉錄系統將需要RNA轉錄物必須轉運到核外。含內部核糖體進入位點插在其5’非編碼區的pol I轉錄物的細胞中蛋白產生的檢測支持pol I轉錄物確實被轉運到核外(Palmer等，Nucl.Acids.Res.1993，213451)。由于對輸出或保留pol I轉錄物起決定性的序列的信息有限，負義或正義RNAs的合成可能導致核輸出的效率不同。此外，pol II產生的大冠形病毒樣轉錄物(大于30,000nts)從核中輸出(Almazan等，Proc.Natl.Acad Sci.USA 2000，975516)表明特異性RNA序列而不是轉錄物的長度可能對輸出更關鍵。我們發展的pol I-pol II克隆載體和基于使用II型限制性核酸內切酶的有效克隆方法將允許以合理的費用和在合理的時間內在核中合成正和負義RNA來產生細胞質RNA病毒。
***這里描述的具體實施方案不限制本發明的范圍。事實上，除了這里描述的那些，從前面的說明書和隨同的附圖，本發明的各種變型將對本領域技術人員變得很明顯。這種變型意欲落在所附權利要求的范圍內。
應該進一步理解所有值是近似的，提供用于說明。
所有專利、專利申請、出版物和這里引用的其它材料以其完整形式由此引入這里作為參考。
序列表<110>St.Jude Children’s HospitalHoffmann，Erich<120>用于產生感染性流感病毒的DNA轉染系統<130>2427/2G772WO<140>PCT/US01/13656<141>2001-04-27<160>21<170>Patentln version 3.1<210>1<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物(Seq-PB1#1)<400>1aggatgggat tcctcaagg<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物(Seq-PB1#2)<400>2gctatggttt ccagagcccg<210>3<211>28<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物(Bm-PB1-1)<400>3tattcgtctc agggagcgaa agcaggca<210>4<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物(Bm-PB1-2341R)<400>4atatcgtctc gtattagtag aaacaaggca ttt<210>5<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物(Bm-NS#1)<400>5tattcgtctc agggagcaaa agcagggtg<210>6<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物(Bm-NS#2)<400>6atatcgtctc gtattagtag aaacaagggt gttt<210>7<211>29
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物(Bm-M#1)<400>7tattcgtctc agggagcaaa agcaggtag<210>8<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物(Bm-M#2)<400>8atatcgtctc gtattagtag aaacaaggta gtttttt<210>9<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物(Bm-NA1-1)<400>9tattcgtctc agggagcaaa agcaggagtt taacatg<210>10<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物(Bm-NA-1413R)<400>10atatcgtctc gtattagtag aaacaaggag ttttt
<210>11<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物(Bm-H6-1)<400>11tattcgtctc agggagcaaa agcaggggaa aatg<210>12<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物(Bm-NS#2)<400>12atatcgtctc gtattagtag aaacaagggt gttt<210>13<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物(Ba-NP-1)<400>13tattggtctc agggagcgaa agcagggta<210>14<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物(Ba-NP1565R)
<400>14atatggtctc gtattagtag aaacaagggt att<210>15<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物(Bm-PA1-1)<400>15tattcgtctc agggagcgaa agcaggtact gatcc<210>16<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物(Bm-PA1-2231R)<400>16atatcgtctc gtattagtag aaacaaggta cttttt<210>17<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物(Bm-PB1a-1)<400>17tattcgtctc agggagcgaa agcaggcaaa cc<210>18<211>33<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物(Bm-PB1-2341R)<400>18atatcgtctc gtattagtag aaacaaggca ttt<210>19<211>38<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物(Ba-PB2-1)<400>19tattggtctc agggagcgaa agcaggtcaa ttatattc<210>20<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物(Ba-PB2-2341R)<400>20atatggtctc gtattagtag aaacaaggtc gttttt<210>21<211>12<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>21agcaaaagca gg
權利要求
1.表達質粒，含有插在RNA聚合酶II(pol II)啟動子和多腺苷酸化信號之間的RNA聚合酶I(pol I)啟動子和pol I終止子序列。
2.權利要求1的表達質粒，其中pol I啟動子接近多腺苷酸化信號且pol I終止子序列接近pol II啟動子。
3.權利要求1的表達質粒，其中pol I啟動子接近pol II啟動子且pol I終止子序列接近多腺苷酸化信號。
4.權利要求1的表達質粒，其中該質粒對應于具有選自pHW2000，pHW11和pHW12的圖譜的質粒。
5.權利要求1的表達質粒，進一步包含插在pol I啟動子和終止信號之間的負鏈RNA病毒病毒基因節段。
6.權利要求5的表達質粒，其中負鏈RNA病毒是正粘病毒科(Orthomyxoviridae)的成員。
7.權利要求6的表達質粒，其中病毒是甲型流感病毒。
8.權利要求7的表達質粒，其中病毒基因節段編碼選自病毒聚合酶復合蛋白、M蛋白和NS蛋白的基因；其中該基因源自很好地適應在細胞培養中生長的株或減毒株，或二者皆有。
9.權利要求6的表達質粒，其中病毒是乙型流感病毒。
10.權利要求8的表達質粒，其中該質粒具有選自pHW241-PB2，pHW242-PBl，pHW243-PA，pHW245-NP，pHW247-M和pHW248-NS的圖譜。
11.權利要求8的表達質粒，其中該質粒具有選自pHW181-PB2，pHW182-PBl，pHW183-PA，pHW185-NP，pHW187-M和pHW188-NS的圖譜。
12.權利要求7的表達質粒，其中病毒基因節段編碼選自流感血凝素(HA)基因和神經氨酸酶(NA)基因的基因。
13.權利要求12的表達質粒，其中流感基因來自致病性流感病毒株。
14.權利要求12的表達質粒，其中該質粒具有選自pHW244-HA，pHW246-NA，pHW184-HA和pHW186-NA的圖譜。
15.用于從克隆的病毒cDNA產生感染性負鏈RNA病毒的基于最少質粒的系統，包括一組質粒，其中每個質粒包含一個自主的病毒基因組節段，且其中對應于自主病毒基因組節段的病毒cDNA插在RNA聚合酶I(pol I)啟動子和終止子序列之間，由此導致vRNA表達；pol I啟動子和終止子序列又插在RNA聚合酶II(pol II)啟動子和多腺苷酸化信號之間，由此導致病毒mRNA表達。
16.權利要求15的基于最少質粒的系統，其中pol I啟動子接近多腺苷酸化信號且pol I終止子序列接近pol II啟動子。
17.權利要求15的基于最少質粒的系統，其中pol I啟動子接近pol II啟動子且pol I終止子序列接近多腺苷酸化信號。
18.權利要求15的基于最少質粒的系統，其中負鏈RNA病毒是正粘病毒科(Orthomyxoviridae)的成員。
19.權利要求18的基于質粒的系統，其中病毒是甲型流感病毒。
20.權利要求18的基于質粒的系統，其中病毒是乙型流感病毒。
21.權利要求19的基于質粒的系統，其中病毒基因節段編碼選自病毒聚合酶復合蛋白、M蛋白和NS蛋白的蛋白；其中所述基因來自很好地適應在細胞培養中生長的株或來自減毒株，或二者皆有。
22.權利要求19的基于質粒的系統，其中病毒基因組節段包含編碼選自血凝素和神經氨酸酶的蛋白或這兩者的基因；其中所述的基因來自致病性流感病毒。
23.權利要求19的基于質粒的系統，其中所述的系統包含一個或多個具有選自pHW241-PB2，pHW242-PBl，pHW243-PA，pHW244-HA，pHW245-NP，pHW246-NA，pHW247-M和pHW248-NS的圖譜的質粒。
24.權利要求19的基于質粒的系統，其中所述的系統包含一個或多個具有選自pHW181-PB2，pHW182-PBl，pHW183-PA，pHW184-HA，pHW185-NP，pHW186-NA，pHW187-M和pHW188-NS的圖譜的質粒。
25.包含權利要求15的基于質粒的系統的宿主細胞。
26.包含權利要求18的基于質粒的系統的宿主細胞。
27.包含權利要求19的基于質粒的系統的宿主細胞。
28.包含權利要求22的基于質粒的系統的宿主細胞。
29.制備負鏈RNA病毒的病毒粒體的方法，該方法包括在允許病毒蛋白和vRNA或cRNA產生的條件下培養權利要求25的宿主細胞。
30.制備正粘病毒科(Orthomyxoviridae)病毒粒體的方法，該方法包括在允許病毒蛋白和vRNA或cRNA產生的條件下培養權利要求26的宿主細胞。
31.制備流感病毒粒體的方法，該方法包括在允許病毒蛋白和vRNA或cRNA產生的條件下培養權利要求27的宿主細胞。
32.制備致病性流感病毒粒體的方法，該方法包括在允許病毒蛋白和vRNA或cRNA產生的條件下培養權利要求28的宿主細胞。
33.制備負鏈RNA病毒特異性疫苗的方法，該方法包括純化由權利要求29的方法制備的病毒粒體。
34.根據權利要求33的方法，進一步包括滅活該病毒粒體。
35.根據權利要求33的方法，其中負鏈RNA病毒是減毒病毒。
36.給受試者接種疫苗對抗負鏈RNA感染的方法，該方法包括將保護性劑量的權利要求33的疫苗施用給受試者。
37.給受試者接種疫苗對抗負鏈RNA感染的方法，該方法包括給受試者肌肉內注射保護性劑量的權利要求33的疫苗。
38.給受試者接種疫苗對抗負鏈RNA感染的方法，該方法包括將權利要求33的疫苗鼻內施用給受試者。
39.產生減毒負鏈RNA病毒的方法，該方法包括(a)使權利要求15的基于質粒的系統中的一個或多個病毒基因突變；和(b)確定該系統產生的感染性RNA病毒是否被減毒。
40.含負鏈RNA病毒病毒粒體的組合物，其中病毒粒體的病毒內部蛋白來自很好地適應在培養中生長的株或來自減毒株，或二者皆有，而且該病毒粒體的病毒抗原蛋白來自致病性病毒株。
41.含用權利要求29的方法制備的負鏈RNA病毒病毒粒體的組合物。
全文摘要
本發明基于有效細胞內合成病毒RNA的雙啟動子系統(優選RNA polI－pol II系統)的開發。所得基于最少質粒的系統可以用于合成任何RNA病毒，優選含負單鏈RNA基因組的病毒。當該系統的質粒導入合適的宿主細胞時產生該系統的病毒產物。該系統的一個應用是制備減毒的重配流感病毒用作疫苗中的抗原。質粒共轉染產生的重配病毒可以包含編碼來自當前感染人群的流感病毒的表面糖蛋白血凝素和神經氨酸酶的基因和來自減毒流感病毒的內部基因。本發明的優越性能是其多用途；可快速和簡單調整該系統來合成任何RNA病毒的減毒型。本發明產生的減毒或滅活RNA病毒可以通過包括鼻內或肌肉內的幾種途徑中的任何一種給予需要疫苗接種的患者。
文檔編號A61K39/145GK1856575SQ01810173
公開日2006年11月1日 申請日期2001年4月27日 優先權日2000年4月28日
發明者E·霍夫曼 申請人:圣朱德兒童研究醫院