導致或引起包括淋巴瘤細胞在內的細胞殺傷的人多肽的制作方法

專利名稱：導致或引起包括淋巴瘤細胞在內的細胞殺傷的人多肽的制作方法
背景技術：
每一種迄今研究的哺乳動物攜帶一簇基因，編碼所謂的主要組織相容性復合物(MHC)。該緊密連鎖的基因簇編碼表面抗原，它在體液和細胞介導的免疫應答中起到了中心作用。在人類中MHC編碼的產物稱作人淋巴細胞抗原或HLA。MHC-基因組織在編碼三類分子(I-III類)的區域。
I型MHC分子是45kD跨膜糖蛋白，與另一種糖蛋白，12kDβ-2微球蛋白非共價結合(Brown等，1993)。后者不插入細胞膜，編碼在MHC外側。人I型分子是三種不同的同型抗原，稱為HLA-A、-B和-C，在獨立的基因座編碼。I型分子的組織表達是普遍存在并且是共顯性的。MHC I型分子遞呈激活細胞毒性T細胞必需的肽抗原。
II型MHC分子與兩種跨膜糖蛋白，35kDα鏈和28kDβ鏈的異二聚體非共價結合(Brown等，1993)。在人類中，II型分子作為三種不同的同型出現，稱為人淋巴細胞抗原DR(HLA-DR)、HLA-DP和HLA-DQ。DR的多態性限于β鏈，而兩條鏈在DP和DQ同型中都具有多態性。II型分子共顯性表達，但與I型相反，顯示有限的組織分布它們僅存在于免疫系統(例如樹突細胞、巨噬細胞、B淋巴細胞和活化的T淋巴細胞)的細胞表面。它們還在正常腎上腺的網狀帶的人皮質細胞上表達，并在正常卵巢黃體的粒層細胞中表達(Kahoury等，1990)。它們的主要生物學作用是結合抗原肽并將其遞呈到抗原遞呈細胞(APC)表面，讓CD4輔助T(Th)淋巴細胞識別(Babbitt等，1985)。MHC II型分子還可在非免疫系統細胞表面表達。例如在淋巴樣細胞外的器官中的細胞可在病原性炎癥反應中表達MHC II型分子。這些細胞可包括滑膜細胞、內皮細胞、甲狀腺基質細胞和神經膠質細胞。
III型MHC分子也與免疫應答有關，但編碼某種程度上不同的產物。這些包括許多可溶性血清蛋白、酶和蛋白質，例如腫瘤壞死因子或類固醇-21羥化酶。在人中，III型分子有三種不同同型，稱為Ca、C2和Bf(Kuby，1994)。
由于Th細胞活化是幾乎所有免疫應答引發的關鍵事件，并通過II類分子介導，II型MHC本身作為免疫調節的目標(Baxevanis等，1980；Rosenbaum等，1981；Adorini等，1988)。除了肽遞呈，II型分子可轉導各種影響APC生理性質的信號。這些信號是由于多個II型分子與抗體或Th細胞的抗原受體相互作用產生的(Vidovic等，1995a；Vidovic等，1995b)，并且能夠誘導B細胞活化和免疫球蛋白分泌(Cambier等，1991；Palacios等，1983)，單核細胞的細胞因子產生(Palacios，1985)以及上調共刺激(Nabavi等，1992)和細胞粘著分子(Mourad等，1990)。
還有一組觀察結果提示在某些條件下II型連接可導致細胞生長停止或可以是細胞毒性的。在這些條件下的連接是多肽與II型MHC分子相互作用。對于后一種作用和它們可能的機制有很多矛盾。一些作者聲稱B細胞上II型分子復合物的形成導致生長抑制(Vaickus等，1989；Kabelitz等，1989)，而根據其它的報道，II型復合物形成導致細胞死亡(Vidovic等，1995a；Newell等，1993；Truman等，1994；Truman等，1997；Drenou等，1999)。在一些實驗系統中，僅休眠的B細胞觀察到現象(Newell等，1993)，或在其它系統中僅用活化的B細胞(Vidovic等，1995a；Truman等，1994)。
基于這些觀察結果，許多年來已設想用抗-II型單克隆抗體(mAb)作為候選治療劑。事實上，在一系列動物疾病模型中小鼠衍生抗II型mAb的益處支持了該提議(Waldor等，1983；Jonker等，1988；Stevens等，1990；Smith等，1994；Vidovic&Torral，1998；Vidovic & Laus，2000)。
盡管有這些早期的支持性的數據，迄今未描述顯示所需細胞毒性和其它生物性質(可能包括親和力、增殖抑制或細胞因子分泌的減少)的人組合物的抗-MAb II類組合物。事實上，盡管可相對簡單的衍生出小鼠衍生的mAb，但用小鼠衍生mAb的工作證明了獲得具有所需生物性質的抗體的困難。例如，在不同小鼠抗-II型mAb的T細胞抑制能力中觀察到顯著和不能充分理解的差異(Naquet等，1983)。另外，體內使用某些小鼠衍生的mAb與未預期的副作用相聯系，有時引起實驗靈長類的死亡(Billing等，1983；Jonker等，1991)。
普遍認為小鼠衍生的mAb(包括嵌合和所謂的“人源化”mAb)與人mAb(例如Vose等，2000；Kashmiri等，2001)相比，伴有在病人體內產生不良免疫應答的增長的危險(人抗-小鼠抗體HAMA)。當用任何小鼠衍生的mAb治療慢性病，如類風濕性關節炎或多發性硬化時，或需要常規治療，例如當治療一些癌癥時，該危險可能增加；人免疫系統持續接觸非人分子常常導致不良免疫反應。另外，已證明獲得具有對所需抗原具有所需特異性或親和性的小鼠衍生抗體非常難(Pichla等，1997)。這些觀察結果可對小鼠衍生的mAb的療效和優點具有顯著影響，或降低療效和優點。小鼠衍生的mAb的缺點的例子包括下列第一，小鼠衍生的mAb可能受到醫藥條件，或治療它們適合的病況的治療長短的限制。第二，小鼠衍生的mAb的劑量水平可能需要較高，以補償較低的親和力或療效(低親和力或療效與小鼠來源無關，然而人體內的半衰期可能有關，因為小鼠mAb可能更容易從血液中被快速清除，這可能還需要更高的劑量)，因此，使得劑量不僅更重，而且可能免疫原性更強，可能更危險。第三，合適的治療方案和需要高產量的高劑量比中的限制可能更加顯著增加了治療成本，意味著這些小鼠衍生的mAb對于開發作為商品治療劑是不經濟的。最后，即使能鑒定出顯示所需特異性或親和性的小鼠mAb，通常這些理想特征在減少免疫原性的“人源化”或“嵌合”過程中受到有害影響(Slavin-Chiorini等，1997)。一旦小鼠衍生的mAb被人源化或嵌合化，就非常難于優化其特異性或親和性。
許多年來，本領域一直在尋找具有適用于治療人類的藥物組合物的生物性質的人抗-MHC II型mAb復合物。該領域的工作人員已實踐了步驟首先鑒定一種小鼠衍生的mAb，然后在改善該用于人類病人的非人分子的免疫耐受的幫助下修飾該mAb的結構(對于進一步的細節，見Jones等，1986；Riechmann等，1988；Presta，1992)。通常用所謂的“人源化”過程或通過構建人-小鼠嵌合mAb實現該修飾。其它工作人員嘗試了鑒定在人抗體多樣性天然庫中與人抗原結合的人抗體。例如，通過探索孕婦中的胎兒耐受機制(Bonegura等，1987)或通過篩選抗體天然多樣性文庫(Stausbl-Grn等，1996；Winter等，1994)。然而，迄今未描述過顯示所需細胞毒性、特異性、低免疫原性和親和性的生物性質的人復合物MHCII型mAb。
為了治療目的，與許多或至少大部分人II型MHC分子的等位基因形式反應的多肽是理想的-例如能用于多樣化的病人人群中。另外，候選多肽可以對各式各樣的淋巴瘤是細胞毒性的，并且優選是通過對這些腫瘤細胞共有的機制起到細胞毒性作用。為了能用于許多可能的應用，所需的多肽應介導其細胞毒性作用，而不需要免疫系統的其它成分。為了治療目的，許多病人接受例如癌癥標準化療或放療的治療。這些治療大部分使得病人免疫妥協。任何依賴于完整免疫系統的其它的治療因而會失敗。患破壞免疫系統的疾病，例如HIV的人中進一步證實了存在的問題。機會性感染和惡性轉化能逃脫免疫監視，導致進一步的綜合征。
發明簡述本發明一方面提供了一種組合物，包括含有基于人組合物的至少一種抗體的抗原結合域的多肽，所述結合域具有對細胞表面表達的一種抗原的結合特異性，其中用具有兩個或多個所述抗原結合域的多價多肽處理表達抗原的細胞導致或引起非細胞毒性機制或免疫學機制的細胞殺傷。在優選例中，抗原是MHC抗原，優選MHC II型抗原，例如DR/DP/DQ或DR。例如，在一些優選例中，主題組合物包括含有至少一個與人HLA DR以1μM、100nN或甚至1nM或以下的Kd結合的基于抗體的抗原結合域的多肽。
本發明的另一個方面提供了一種組合物，它含有多肽，該多肽含有多個人組合物的基于抗體的抗原結合域，與人HLA DR具有結合特異性。用多價多肽處理表達HLA DR的細胞導致或引起不需要細胞毒性或免疫學機制的細胞殺傷。在一些優選例中，主題組合物包括含有至少一個與人HLA DR以1μM、100nN或甚至1nM或以下的Kd結合的基于抗體的抗原結合域的多肽。在一些優選例中，多價多肽具有100nM、10nm或甚至1nM或以下的EC50，用于殺傷激活的淋巴細胞、轉化的細胞和/或淋巴瘤細胞。
本發明的另一個方面提供了一種含有多肽的組合物，所述多肽含有至少一個基于抗體的抗原結合域，它與人HLA DR以1μM、100nM、10nM或甚至更小的Kd結合，可通過一種方法分離抗原結合域，該方法包括從重組抗體文庫用與人HLA DR至少一個表位結合的能力分離人組合物的VL和VH結構域。用具有兩個或多個抗原結合域的多價多肽處理表達HLA DR的細胞導致或引起以不需要細胞毒性或免疫學機制的方式殺傷細胞。在一些實施例中，分離抗原結合域的方法還包括下列步驟a.產生VL和VH結構域之一或兩者的CDR1、CDR2和CDR3序列中至少一個的變體文庫，和b.用與人MHC II型家族抗原以1μM或以下的Kd結合的能力從變體文庫中分離出VL和VH結構域。
在一些優選例中，本發明的組合物可以確定特征為殺傷轉化的細胞的EC50至少比殺傷正常的細胞的EC50低5倍，甚至比殺傷正常細胞低更優選10倍、100倍，甚至1000倍的多價多肽。
在一些優選例中，本發明的組合物可以確定特征為殺傷活化的細胞的EC50至少比殺傷正常的細胞的EC50低5倍，甚至比殺傷未活化的細胞低更優選10倍、100倍，甚至1000倍的多價多肽。
在一些優選例中，本發明的組合物可以確定特征為殺傷轉化細胞的EC50為50nm或以下，甚至更優選是小于10nM、1nM和甚至0.1nM的EC50。在一些實施例中，主題多價多肽具有殺傷活化的淋巴細胞、轉化的細胞和/或淋巴瘤細胞的100nM、10nM或甚至1nM或以下的EC50。
在一些實施例中，含有多價多肽的主題組合物選擇性殺傷淋巴細胞。例如，可用組合物的一些多價形式殺傷活化的淋巴細胞，這些淋巴細胞是淋巴瘤細胞，代表選自B細胞非霍奇金氏淋巴瘤、B細胞淋巴瘤、B細胞急性淋巴白血病、Burkitt淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、毛細胞白血病、急性骨髓性白血病、T-細胞淋巴瘤、T-細胞非霍奇金氏淋巴瘤、慢性骨髓性白血病、慢性淋巴白血病和多發性骨髓性白血病。可被殺傷的活化的淋巴瘤細胞的例子包括Priess、GRANTA-519、KARPAS-422、KARPAS-299、DOHH-2、SR-786、MHH-CALL-4、MN-60、BJAB、RAJI、L-428、HDLM-2、HD-MY-Z、KM-H2、L1236、BONNA-12、HC-1、NALM-1、L-363、EOL-1、LP-1、RPMI-8226和MHH-PREB-1細胞系。在一些優選例中，組合物具有100nm或以下，優選小于10nM或甚至1nM的殺傷選自KARPAS-422、DOHH-2、SR-7、MHH-CALL-4、MN-60、HD-MY-Z、NALM-1和LP-1的至少一種B細胞淋巴瘤細胞和T細胞淋巴瘤細胞的EC50。在一些情況下，為了有效殺傷細胞，靶細胞可能需要進一步活化或預先活化，例如通過與脂多糖(LPS，10微克/ml)、干擾素-γ(IFN-γ，Roche，40ng/ml)和/或植物凝血素(PHA，5微克/ml)等一起培養。
在一些實施例中，該組合物的多價形式可用于殺死表達MHC II型分子的非淋巴細胞。
在一些實施例中，該組合物的一個或多個抗原結合域與HLA-DR的β-鏈結合，例如抗原結合域與HLA-DRβ鏈的第一結構域結合。
在一些優選例中，該組合物的抗原結合域與一種或多種選自DR1-0101、DR2-15021、DR3-0301、DR4Dw4-0401、DR4Dw10-0402、DR4Dw14-0404、DR6-1302、DR6-1401、DR8-8031、DR9-9012、DRw53-B4*0101和DRw52-B3*0101的HLA-DR型結合。在優選例中，本組合物的抗原結合域提供了廣泛的DR反應性，即給定組合物的抗原結合域與至少5個不同的所述HLA-DR型上的表位結合。在一些實施例中，本組合物的多肽的抗原結合域與多個HLA-DR型結合，例如與至少人群60％，更優選75％，和甚至更優選85％人群的表達HLA DR的細胞結合。
在一些實施例中，本組合物的抗原結合域包括VH結構域與VL結構域的組合，其中所述組合在選自MS-GPC-1、MS-GPC-6、MS-GPC-8、MS-GPC-10、MS-GPC-8-1、MS-GPC-8-6、MS-GPC-8-9、MS-GPC-8-10、MS-GPC-8-17、MS-GPC-8-18、MS-GPC-8-27、MS-GPC-8-6-2、MS-GPC-8-6-19、MS-GPC-8-6-27、MS-GPC-8-6-45、MS-GPC-8-6-13、MS-GPC-8-6-47、MS-GPC-8-10-57、MS-GPC-8-27-7、MS-GPC-8-27-10和MS-GPC-8-27-41的克隆之一中發現。
在一些實施例中，本組合物的抗原結合域包括HuCAL VH2和HuCAL Vλ1的組合，其中VH CDR3、VL CDR1和VL CDR3在MS-GPC-1、MS-GPC-8、MS-GPC-10、MS-GPC-8-1、MS-GPC-8-6、MS-GPC-8-9、MS-GPC-8-10、MS-GPC-8-17、MS-GPC-8-18、MS-GPC-8-27、MS-GPC-8-6-2、MS-GPC-8-6-19、MS-GPC-8-6-27、MS-GPC-8-6-45、MS-GPC-8-6-13、MS-GPC-8-6-47、MS-GPC-8-10-57、MS-GPC-8-27-7、MS-GPC-8-27-10和MS-GPC-8-27-41的克隆之一中發現。
在另一個優選例中，與本發明的親本抗原結合域相比，抗原結合域通過添加、缺失和/或取代氨基酸殘基修飾，同時維持所述親本抗原結合域的本發明的性質，或改進一種或多種所述性質。這可以包括但不限于修飾編碼親本抗原結合域的核酸序列用于克隆，修飾CDR區從而改進或改變抗原結合親和力和/或特異性，包括用來自一種或多種不同抗原結合域的相應的CDR序列交換一種或多種親本抗原結合域的CDR序列，添加肽序列以檢測和/或純化。鑒定給定的抗原結合域中的可能發生添加、缺失和/或取代的位置，以設計和追蹤實現所述添加、缺失和/或取代的方法，并測試或分析是否修飾的抗原結合域維持了親本抗原結合域的性質或顯示一種或多種改進的性質，在本領域普通技術人員的能力范圍內。另外，普通技術人員能設計方法，來設計、構建和篩選修飾的抗原結合域的集合或文庫，來鑒定一種或多種修飾的抗原結合域，它維持親本抗原結合域的性質或顯示更改進的性質。在一個實施例中，本發明的任何抗原結合域中所含的HuCAL Vh結構域的第一個氨基酸殘基(E或Q，視表達構建物而定)分別被Q或E替換。根據本發明，通過設計、構建和篩選修飾的抗原結合域的集合或文庫的優選區域包括CDR區，最優選是Vh和VL的CDR3，VL的CDR1和VH結構域的CDR2。
在某些優選例中，抗原結合域包括HuCAL VH2和HuCAL Vλ1的組合，其中VHCDR3序列取自共有CDR3序列nnnnRGnFDn其中每個n分別代表任何氨基酸殘基；和/或其中VL CDR3選自共有CDR3序列QSYDnnnn其中每個n分別代表任何氨基酸殘基。優選VH CDR3序列是SPRYGAFDY和/或VL CDR3序列是QSYDLIRH或QSYDMNVH。
在某些實施例中，本抗原結合域與包括HuCAL VH2和HuCAL Vλ1組合的抗體競爭抗原結合，其中VH CDR3序列取自共有CDR3序列nnnnRGnFDn其中每個n分別代表任何氨基酸殘基；和/或其中VL CDR3選自共有CDR3序列QSYDnnnn其中每個n分別代表任何氨基酸殘基。例如VH CDR3序列是SPRYGAFDY和/或VL CDR3序列是QSYDLIRH或QSYDMNVH。
在一些優選例中，抗原結合域包括用下列通式代表的VL CDR1序列SGSnnNIGnNYVn其中每個n分別代表任何氨基酸殘基。例如，CDR1序列是SGSESNIGNNYVQ。
在優選例中，本組合物的多價形式的殺傷機制涉及殺傷細胞的天生預編程過程。例如殺傷優選是非凋亡性的。本組合物的殺傷不依賴于天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(caspase)的作用，和/或被zVAD-fmk或zDEVD-fmk抑制的殺傷。
在某些優選例中，基于抗體的抗原結合域是多價多肽的一部分，含有至少一個F(ab′)2抗體片段或小抗體片段。
在某些優選例中，基于抗體的抗原結合域是多價多肽的一部分，含有至少兩個選自Fv、scFv、dsFv和Fab片段的抗體片段，還含有一個或多個交聯部分。
在一些優選例中，基于抗體的抗原結合域是多價多肽的一部分，它含有選自IgG1、2a、2b、3、4、IgA和IgM家族的至少一個完整抗體。
在一些優選例中，基于抗體的抗原結合域是在與所述細胞結合后形成的多價多肽的一部分。
在一些優選例中，抗原結合位點與聚合物交聯。
本發明的另一個方面提供了一種含有抗原結合域，例如上述抗原結合域，或其多價多肽的核酸。例如在一些實施例中，核酸包括多肽的編碼序列，含有人組合物的至少一種基于抗體的抗原結合域，其與人細胞表面表達的抗原具有結合特異性，其中用該多肽的多價形式處理表達抗原的細胞導致或引起所述細胞不需要細胞毒性或免疫學機制的殺傷。在一些實施例中，核酸含有多肽的編碼序列，該多肽含有至少一個與人HLA DR的至少一個表位以1μM、100nM或甚至1nM或以下的Kd結合的基于抗體的抗原結合域。
在一些實施例中，核酸含有多肽的編碼序列，該多肽含有多個人組合物的基于抗體的抗原結合域，與人HLA DR具有結合特異性，其中用該多肽的多價形式處理表達HLA DR的細胞導致或引起所述細胞不需要細胞毒性或免疫學機制的殺傷。在優選例中，抗原結合域單獨與人HLA DR上的表位以1μM、100nM或甚至1nM或以下的Kd結合。
在一些實施例中，核酸含有多價多肽的編碼序列，該多肽含有多種人組合物的基于抗體的抗原結合域，與人HLA DR具有結合特異性，其中用所述多價多肽處理表達HLA DR的細胞導致或引起所述細胞不需要細胞毒性或免疫學機制的殺傷。優選，多價多肽具有100nM、10nM或甚至1nM或以下的EC50，來殺傷活化的淋巴細胞、轉化的細胞和/或活化的淋巴瘤細胞。
本發明的另一個方面提供了一種載體，它含有任何一種上述核酸的編碼序列，和與其可操縱性連接的轉錄調控序列。
本發明的另一個方面提供了攜帶至少一種該核酸或該載體的宿主細胞。本發明的另一個方面提供了產生導致或引起細胞殺傷(不需要細胞毒性或免疫學機制來導致或引起所述殺傷)的多價組合物的方法，其條件是其中核酸表達成含有多個抗原結合域的多肽或含有至少一個充分處理形成多價組合物的抗原結合域的多肽。
本發明的另一個方面提供了配制在藥物學上可接受的載體和/或稀釋劑中的該多肽或核酸組合物的形式。本發明特別考慮使用這些組合物制備用于處理動物，尤其是人的藥物制劑。
可用這些藥物組合物治療涉及不需要的細胞增殖，特別是治療涉及表達MHCII型抗原的轉化細胞。例如，制劑可用于治療選自B細胞非霍奇金氏淋巴瘤、B細胞淋巴瘤、B細胞急性淋巴白血病、Burkitt淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、毛細胞白血病、急性骨髓性白血病、T-細胞淋巴瘤、T-細胞非霍奇金氏淋巴瘤、慢性骨髓性白血病、慢性淋巴白血病和多發性骨髓性白血病的疾病。
可用這些藥物制劑用于治療不需要的免疫細胞活化的疾病，例如治療選自類風濕性關節炎、幼年期關節炎、多發性硬化、Grave氏病、胰島素依賴性糖尿病、發作性睡病、牛皮癬、系統性紅斑狼瘡、強直性脊柱炎、移植排斥，移植物抗宿主病、Hashimoto氏病、重癥肌無力、慢性天皰瘡、腎小球腎炎、甲狀腺炎、胰腺炎、胰島炎、原發性膽汁性肝硬化、刺激性腸病和Sjogren綜合征的疾病。
本發明的另一個方面提供了一種含有本發明的多肽或核酸組合物的診斷組合物。在一些實施例中，該診斷組合物含有多肽組合物和一個或多個交聯部分。
本發明的還有一個方面提供了一種殺傷在所述細胞表面表達抗原的細胞的方法，包括步驟使細胞與本發明的多價多肽組合物接觸。
本發明的另一個方面提供了一種鑒定能用配制在藥物學上可接受的載體和/或稀釋劑中的多價多肽的組合物治療的病人的方法，包括步驟a.從病人分離細胞；b.使所述細胞與組合物接觸；和c.測定所述細胞殺傷或免疫抑制的程度。
本發明還提供了一種試劑盒，用于鑒定能用配制在藥物學上可接受的載體和/或稀釋劑中的多價多肽的組合物治療的病人，試劑盒含有a.多價多肽組合物；和b.用于測定所述細胞殺傷或免疫抑制程度的工具。
在一些實施例中，該試劑盒包括多價多肽組合物和交聯部分。在其它實施例中，該試劑盒含有a.多價多肽組合物，和b.一個或多個可檢測基團，和c.影響和/或檢測(i)與抗原結合的試劑和/或溶液。
本發明的另一個方面提供了一種含有與細胞毒性劑可操縱性連結的多價多肽組合物的細胞毒性組合物。
本發明的另一個方面提供了含有與免疫原性劑可操縱性連結的多價多肽組合物的免疫原性組合物。
本發明的另一個方面提供了一種殺傷細胞的方法，包括使細胞與可操縱性連接的細胞毒性或免疫原性劑的多價多肽組合物接觸。
本發明的另一個方面提供了一種治療人類以降低與表達人HLA DRβ鏈的細胞不良增殖/活化有關的疾病的嚴重程度的方法，包括對病人施用本發明的多價多肽。在一些實施例中，疾病涉及淋巴細胞的不良增殖/活化，例如選自B細胞非霍奇金氏淋巴瘤、B細胞淋巴瘤、B細胞急性淋巴白血病、Burkitt淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、毛細胞白血病、急性骨髓性白血病、T細胞淋巴瘤、T-細胞非霍奇金氏淋巴瘤、慢性骨髓性白血病、慢性淋巴白血病和多發性骨髓性白血病。
本發明的另一個方面提供了用與細胞毒性或免疫原性劑可操縱性連接的多價多肽組合物制備治療動物的藥物組合物。
根據優選例，多肽針對表達MHC II型分子的淋巴細胞或非淋巴細胞。后一種類型的細胞存在于例如炎癥和/或自身免疫疾病的病理性位點，例如滑膜細胞、內皮細胞、甲狀腺基質細胞和神經膠質細胞，或還可以含有能表達MHC II型分子的基因改變的細胞。
優選多肽針對淋巴瘤細胞。更優選是存在于選自B細胞非霍奇金氏淋巴瘤、B細胞淋巴瘤、B細胞急性淋巴白血病、Burkitt淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、毛細胞白血病、急性骨髓性白血病、和B細胞前體白血病的疾病的淋巴瘤細胞。最優選是選自GRANTA-519、PRIESS、KARPAS-422、DOHH-2、MHH-CALL-4、MN-60、BJAB、L-428、BONNA-12、EOL-1、MHH-PREB-1和MHH-CALL-2細胞系的淋巴瘤細胞。
在一些實施例中，多肽與HLA-DR分子的α鏈中至少一個表位結合。在一些實施例中，多肽優選與HLA-DR的α-鏈的第一結構域的至少一個表位結合。第一結構域是鏈的N-末端結構域。例如，可選擇多肽與HLA-DR的α鏈的Glu55-Tyr79的α螺旋內的至少一個表位結合。
在其它實施例中，多肽與HLA-DR分子的β鏈內的至少一個表位結合。優選的多肽與HLA-DR的β鏈的第一結構域的至少一個表位結合，第一結構域是鏈的N-末端結構域。
在一些實施例中，多肽誘導殺死靶細胞的基質涉及所述細胞的天然預編程的過程。優選多肽誘導不是凋亡細胞死亡過程的殺傷機制。
在一個優選例中，多肽誘導依賴于天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶以外的蛋白酶的作用的殺傷機制，例如不依賴于天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶的殺傷機制。
在另一個實施例中，多價組合物含有至少一種選自IgG1、2a、2b、3、4、IgA和IgM類的完整抗體。
在另一個實施例中，多價組合物含有至少一種F(ab′)2抗體片段或小抗體片段。
在優選例中，多價組合物含有至少兩種單價抗體片段，選自Fv、scFv、dsFv和Fab片段，還含有一種或多種交聯部分。
本發明還提供了含有多肽的組合物，含有至少一種基于抗體的抗原結合域，其具有對人HLA DR的結合特異性，其中所述多肽與所述表位的結合導致或引起免疫應答抑制，其中所述抗原結合域誘導VH結構域和VL結構域的聯合，其中所述聯合在選自MS-GPC-1、MS-GPC-6、MS-GPC-8、MS-GPC-10、MS-GPC-8-1、MS-GPC-8-6、MS-GPC-8-9、MS-GPC-8-10、MS-GPC-8-17、MS-GPC-8-18、MS-GPC-8-27、MS-GPC-8-6-2、MS-GPC-8-6-19、MS-GPC-8-6-27、MS-GPC-8-6-45、MS-GPC-8-6-13、MS-GPC-8-6-47、MS-GPC-8-10-57、MS-GPC-8-27-7、MS-GPC-8-27-10和MS-GPC-8-27-41的克隆之一中發現。
本發明的另一種免疫抑制組合物誘導含有至少一種基于抗體的抗原結合域的多肽，該多肽與與人MLC II型抗原具有1μM、100nM或甚至1nM或以下的Kd的結合特異性，其中用多肽處理表達MHC II型抗原的細胞導致或引起免疫應答抑制，例如優選1μM、100nM、10nM或甚至1nM或以下的IC50。
本發明的其它免疫抑制組合物含有多肽，該多肽含有與人MHC II型抗原具有1μM、100nM或甚至1nM或以下的Kd的結合特異性的人組合物的至少一種基于抗體的抗原結合域，抗原結合域通過一種方法分離，該方法包括從重組抗體顯示文庫中通過與人MHC II型抗原結合的能力分離出人VL和VH結構域，其中用所述多肽處理表達MHC II型抗原的細胞導致或引起免疫應答的抑制。
可用分離的抗原結合域用下列步驟產生本免疫抑制組合物a.產生VL和VH結構域的一種或兩種至少一種CDR1、CDR2和CDR3結構域的突變文庫，和b.從變體文庫中通過與人MHC II抗原以1μM或以下的Kd結合的能力分離VL和CH結構域。
在優選例中，免疫抑制組合物的抗原結合域與HLA-DR結合，優選與HLA-DR的β鏈結合，甚至更優選與HLA-DR的β鏈的第一結構域結合。
在一些優選例中，免疫抑制組合物具有1μM、100nM、10nM或甚至1nM或更小的抑制免疫應答的IC50。
在一些優選例中，免疫抑制組合物具有1μM、100nM、10nM或甚至1nM或更小的抑制IL-2分泌的IC50。
在一些優選例中，免疫抑制組合物具有1μM、100nM、10nM或甚至1nM或更小的抑制T細胞增殖的IC50。
在一些優選例中，免疫抑制組合物具有與一種或多種選自DR1-0101、DR2-15021、DR3-0301、DR4Dw4-0401、DR4Dw10-0402、DR4Dw14-0404、DR6-1302、DR6-1401、DR8-8031、DR9-9012、DRw53-B4*0101和DRw52-B3*0101的HLA-DR型表位結合的抗原結合域，在優選例中，抗原結合域與至少5個不同的所述HLa-DR類型結合(例如是pan-DR)。
在某些實施例中，免疫抑制組合物具有包括VH結構域和VL結構域的組合的抗原結合域，其中在選自MS-GPC-1、MS-GPC-6、MS-GPC-8、MS-GPC-10、MS-GPC-8-1、MS-GPC-8-6、MS-GPC-8-9、MS-GPC-8-10、MS-GPC-8-17、MS-GPC-8-18、MS-GPC-8-27、MS-GPC-8-6-2、MS-GPC-8-6-19、MS-GPC-8-6-27、MS-GPC-8-6-45、MS-GPC-8-6-13、MS-GPC-8-6-47、MS-GPC-8-10-57、MS-GPC-8-27-7、MS-GPC-8-27-10和MS-GPC-8-27-41的克隆之一中發現。
在一些實施例中，抗原結合域包括HuCAL VH2和HuCAL Vλ1的組合，其中VHCDR3序列取自共有CDR3序列nnnnRGnFDn其中每個n分別代表任何氨基酸殘基；和/或其中VL CDR3選自共有CDR3序列QSYDnnnn其中每個n分別代表任何氨基酸殘基。優選VH CDR3序列是SPRYGAFDY和/或VL CDR3序列是QSYDLIRH或QSYDMNVH。
在某些實施例中，免疫抑制組合物具有抗原結合域，包括HuCAL VH2和HuCALVλ1的組合，其中VH CDR3序列取自共有CDR3序列nnnnRGnFDn其中每個n分別代表任何氨基酸殘基；和其中VL CDR3選自共有CDR3序列QSYDnnnn其中每個n分別代表任何氨基酸殘基。
例如VH CDR3序列是SPRYGAFDY和/或VL CDR3序列是QSYDLIRH或QSYDMNVH。
在一些實施例中，免疫抑制組合物的抗原結合域與具有下列通式代表的VHCDR3序列的抗體競爭抗原結合nnnnRGnFDn其中每個n分別代表任何氨基酸殘基；和其中VL CDR3選自共有CDR3序列QSYDnnnn其中每個n分別代表任何氨基酸殘基。
在一些實施例中，免疫抑制組合物的抗原結合域包括用下列通式代表的VLCDR1序列SGSnnNIGnNYVn其中每個n分別代表任何氨基酸殘基。例如，CDR1序列是SGSESNIGNNYVQ。
在一些實施例中，該免疫抑制組合物通過一種或多種(a)下調與多肽結合的抗原的表達；或(b)抑制所述細胞和其它細胞之間的相互作用，其中所述相互作用應正常導致免疫應答，來抑制免疫應答。
本發明的另一個方面提供了含有本發明的免疫抑制多肽的編碼序列的核酸。在一些實施例中，可提供作為載體的一部分的核酸，例如含有編碼序列和與其可操縱性連接的轉錄調控序列。本發明的核酸和載體可作為宿主細胞提供，例如可用于產生免疫抑制組合物。
本發明的另一個方面提供了一種抑制淋巴細胞活化和/或增殖的方法，包括使細胞與本發明的免疫抑制多肽接觸。
本發明還提供了藥物制劑，它含有足量的與人MHC II型抗原具有1μM或以下的Kd的結合特異性的基于抗體的抗原結合域，以抑制動物中的免疫應答，動物中的IL-2分泌和/或抑制動物中的T細胞增殖。
本發明的另一個方面涉及用含有與人MHC II型抗原具有1μM或以下的Kd的結合特異性的基于抗體的抗原結合域的多肽制備治療動物的藥物組合物，其中所述動物是人。
本免疫抑制藥物制劑可用于抑制免疫系統的細胞的IL-2分泌。例如，這些制劑可以足量施給病人，來減少病人中的免疫應答。
本發明的其它方面提供了一種方法，用于抑制淋巴細胞的IL-2分泌，包括使細胞與本發明的免疫抑制多肽接觸。
本方法跨膜用于免疫抑制人類，例如通過施給病人足量的本發明的免疫抑制多肽，來減少免疫應答。
本發明還涉及含有至少一種本發明的多肽和/或核酸，可任選的其它試劑，例如緩沖劑的診斷組合物，來進行診斷。
在一個優選例中，診斷組合物含有與至少一個基團交聯的本發明的多肽。這些基團可以是例如識別存在于多肽上的表位，例如FLAG表位(Hopp等，1988；Knappik和Plückthun，1994)或與例如存在于半胱氨酸或賴氨酸(King等，1994)中的親核核酸側鏈的雙功能化合物反應。交聯的多肽的方法對于本領域普通技術人員是熟知的。
還考慮了含有至少一種核酸和/或其變體的診斷組合物。
另外，本發明涉及含有本發明的至少一種多肽和交聯部分的試劑盒。
另外，本發明涉及一種試劑盒，含有(i)本發明的多肽，(ii)一個或多個可檢測的基團，和(iii)影響和/或檢測(i)與抗原的結合的試劑和/或溶液。
本發明還涉及多價組合物，含有至少一條多肽和含有至少兩個抗原結合域。
本發明的另一個方面提供了一種進行一種進行藥物商業活動的方法，包括(i)分離一種或多種與在人細胞表面表達的抗原結合的抗原結合域；(ii)產生含有多個所述抗原結合域的多價組合物，該多價組合物以50nM或以下的EC50殺死轉化或活化的細胞，其中不需要細胞毒性或免疫學機制來導致或引起所述殺傷；(iii)進行多價組合物在動物中效力和毒性的治療測量；(iv)制備描述多價組合物治療增殖疾病的包裝插頁；和(v)出售所述組合物用于治療增殖疾病。
本發明還提供了一種進行一種進行生命科學商業活動的方法，包括(i)分離一種或多種抗原結合域，這些抗原結合域與人細胞表面表達的抗原結合；
(ii)產生含有多種所述抗原結合域的多價組合物，該多價組合物以50nM或以下的EC50殺死轉化或活化的細胞，其中不需要細胞毒性或免疫學機制來導致或引起所述殺傷；(iii)對第三方授權，與第三方共同開發或出售給第三方出售所述多價組合物的權利。
在這些實施例中，可用一種方法分離抗原結合域，其包括a.從重組抗體顯示文庫中用與HLA DR表位結合的能力分離人組合物的VL和VH結構域，b.產生VL和VH結構域之一或兩者的CDR1、CDR2和CDR3序列至少一個的變體文庫，和c.從變體文庫用與HLA DR表位以1μM或以下的Kd結合的能力分離VL和VH結構域。
本發明的另一種商業活動的方法，包括(i)分離一種或多種與在人細胞表面表達的MHC II型以1μM或以下的Kd結合的抗原結合域；(ii)產生含有所述抗原結合域的組合物，該組合物以1000nM或以下的IC50免疫抑制；(iii)進行多價組合物在動物中效力和毒性的治療測量；(iv)制備描述多價組合物用于免疫抑制治療的包裝插頁；和(v)出售所述組合物用作免疫抑制劑。
本發明還提供了一種進行一種進行生命科學商業活動的方法，包括(i)分離一種或多種抗原結合域，這些抗原結合域與人細胞表面表達的MHC II型以1μM或以下的Kd結合；(ii)產生含有所述抗原結合域的組合物，該組合物以100nM或以下的IC50免疫抑制；(iii)對第三方授權，與第三方共同開發或出售給第三方出售所述多價組合物的權利。
本文所用的術語“肽”涉及含有多個，即兩個或多個通過肽鍵連結的氨基酸的一條或多條鏈。
術語“蛋白質”指肽，其中至少一部分肽具有或能夠通過在肽鏈內和/或在肽鏈之間形成二級、三級或四級結構，獲得確定的立體排列。該定義包括天然存在或至少部分人工的蛋白質，以及全蛋白的片段或結構域，只要這些片段或結構域能獲得如上所述的確定立體排列。
術語“多肽”互換的指肽和/或蛋白質。另外，術語“多肽”和“蛋白質”只要上下文允許，包括多鏈蛋白質復合物，例如具有重鏈和輕鏈的免疫球蛋白多肽。
在此，“含有至少一個基于抗體的抗原結合域的多肽”指免疫球蛋白(或抗體)或其功能性片段。關于抗體結構域等的術語“片段”指免疫球蛋白的片段，其維持免疫球蛋白的抗原結合部分。本發明的功能性免疫球蛋白片段可以是Fv(Skerra和Plückthun，1988)、scFv(Bird等，1988；Huston等，1988)、二硫鍵連結的Fv(Glockshuber等，1992；Blinkmann等，1993)、Fab、F(ab′)2片段或其它本領域實踐者熟知的片段，其包含免疫球蛋白的可變結構域或功能性免疫球蛋白片段。
含有一條鏈的多肽的例子是單鏈Fv抗體片段，含有多條鏈的多肽的例子是Fab抗體片段。
本文所用的術語“抗體”，除非另外說明，廣泛用于同時指抗體分子和各種抗體衍生分子。該抗體衍生分子含有至少一個可變區(重鏈或輕鏈可變區)并含有上述片段，以及獨立的抗體輕鏈、獨立的抗體重鏈、抗體鏈和其它分子之間的嵌合融合蛋白等。
免疫球蛋白分子的“抗原結合位點”指與抗原特異性結合必需的分子部分。抗原結合位點優選以1μM或以下，優選小于100nM、10nM或甚至在某些情況下1nM的Kd與抗原結合。與抗原特異性結合應包括與抗原的結合比與任何其它抗原的結合具有顯著高的親和力。
重(“H”)和輕(“L”)鏈N-末端可變(“V”)區的氨基酸殘基形成抗原結合位點。在重鏈和輕鏈的V區內的高度多樣的三段稱為“超變區”，位于更保守的稱作“框架區”或“FR”的旁側區之間。因此術語“FR”指天然存在于免疫球蛋白的超變區之間和附近的氨基酸序列。在一個抗體分子中，輕鏈的三個超變區和重鏈的三個超變區在立體空間相對排列，形成抗原結合表面。抗原結合表面與結合抗原的立體表面互補，各重鏈和輕鏈的三個超變區稱為“互補決定區”或“CDR”。
為了本申請的目的，“價”指本多肽擁有的抗原結合位點數。因此，二價多肽指具有兩個結合位點的多肽。術語“多價多肽”包含多肽的二價、三價、四價等形式。
本文所用的“多價組合物”意味著一種組合物，其含有具有至少兩個所述抗原結合域的多肽，例如多價多肽。優選所述至少兩個抗原結合域緊密相鄰，構成完整的免疫球蛋白分子。多價組合物的例子是完整的免疫球蛋白分子(例如IgG、IgA或IgM分子)或其多價片段(例如F(ab′)2)。另外可從兩種或多種多價組合物(例如兩種或多種完整的免疫球蛋白分子)通過例如交聯形成更高價的多價組合物。然而多價組合物可以從兩種或多種單價免疫球蛋白片段通過作為小抗體自連接，或通過交聯形成。
因此，“基于抗體的抗原結合域”指一種或多種多肽，其形成保留抗體的至少一些結構特征，例如至少一個CDR序列的抗原結合位點。在某些優選例中，基于抗體的抗原結合域包括足夠視為可變區的結構，例如三個CDR區和間隔的框架區。基于抗體的抗原結合域可由一條對應于VH或VL序列的多肽鏈，或由VH和VL序列的分子間或分子間聯系形成。
術語“重組抗體文庫”描述了抗原結合域的混合文庫。例如術語包括展示包裝，如生物學顆粒的集合，它們各具有(a)在顆粒表面上的至少一個抗原結合域表達的遺傳信息，和(b)提供使顆粒能復制的遺傳信息。例如，包裝能顯示含有抗原結合域的融合蛋白。融合蛋白的抗原結合域由顯示包裝代表，條件是允許抗原結合域與顯示包裝接觸的靶表位結合。顯示包裝通常衍生自能夠采集非常多樣的抗體文庫的系統。顯示包裝可以衍生自例如植物細菌細胞、細菌孢子和細菌病毒。
在本發明的一個示范性實施例中，顯示包裝是噬菌體顆粒，其含有含測試抗原結合域的氨基酸序列的肽融合包裹蛋白。因此，產生了編碼肽融合包裹蛋白文庫的可復制噬菌體載體，尤其是噬菌粒(如本文定義)的文庫，用于轉化合適的宿主細胞。根據與特定噬菌體顆粒結合的抗原結合位點特異性結合靶表位的能力，通過親和篩選分離嵌合蛋白形成的噬菌體顆粒。在一個優選例中，文庫的各獨立噬菌體顆粒包括顯示在包裝表面的編碼肽融合包裹蛋白的拷貝。產生本多樣化肽文庫的示范性噬菌體包括M13、f1、fd、lf1、lke、Xf、Pf1、Pf3、λ、T4、P2、P4、φX-174、MS2和f2。
術語“產生CDR1、CDR2和CDR3至少一種的變體文庫”指產生變體抗原結合位點文庫的方法，其中文庫成員的差異是CDR序列，例如非FR序列中的一個或多個改變。這些文庫可通過從所選的抗原結合位點的一個或多個CDR序列隨機或半隨機誘變產生。
本文所用的“人組合物的基于抗體的抗原結合域”優選意味著含有至少一個抗體VH結構域和抗體VL結構域的肽，其中在含有免疫球蛋白序列的蛋白質序列數據庫中的同源性檢索得到人起源的免疫球蛋白結構域中VH和VL結構域都以最高的序列相同性程度命中。這樣的同源性檢索可以是BLAST檢索，例如通過登錄國家生物信息中心的序列數據庫，用“blastp”例行程序進行“BasicBLAST”檢索。另見Altschul等(1990)J Mol Biol 215403-410。優選當施給人受體時，這樣的組合物不導致對其的不良免疫應答。在某些優選例中，本人組合物的抗原結合域包括天然人免疫球蛋白的框架區，并可從激活的人B細胞克隆，雖然不需要天然人抗體的所有CDR。
本文所用的術語“小抗體片段”指含有至少兩個通過與所述結構域分別自我結合的抗原結合域的多價抗體(Pack等，1994)，例如，含有兩條scFv片段的二聚體，分別與自我結合的二聚結構域融合。特別優選的二聚結構域包括衍生自亮氨酸拉鏈(Pack和Plückthun，1992)或螺旋-轉彎-螺旋基序(Pack等，1993)。
本文所用的“活化的細胞”指一群感興趣的細胞，它們不在休眠。活化可以由抗原、有絲分裂原(例如脂多糖、植物血凝素)或細胞因子(如干擾素γ)引起。優選所述活化在腫瘤轉化(例如通過EB病毒或“自發”)中發生。優選活化的細胞的特征是在細胞表面表達MHC II型分子和一種或多種其它特征，包括細胞尺寸變大，細胞分化，DNA復制，CD45或CD11表達和產生/分泌免疫球蛋白。
本文所用的“非活化細胞”意味著一群感興趣的細胞，處于休眠和不分化狀態。所述非活化的細胞可包括從健康人血液純化的休眠B細胞。這些細胞優選的特征是在細胞表面表達的MHC II型分子缺乏或水平低，和一種或多種其它特征，包括細胞尺寸變大，細胞分化，DNA復制，CD45或CD11表達和產生/分泌免疫球蛋白的缺乏或水平減弱。
本文所用的術語“EC50”意味著產生其最大應答或效果，例如細胞殺傷的50％的本組合物的多價形式濃度。
“至少低5倍的EC50”意味著殺死50％的活化細胞所需的由本發明的至少一種多肽組成的多價組合物的濃度比殺死未活化細胞所需的多價組合物的濃度低5倍。優選殺死50％未活化細胞的濃度不能用多價組合物的治療合適的濃度實現。最優選EC50指是在下面補充實施例中所述的試驗中確定的。
術語“免疫抑制”指通過干擾或施用抗代謝藥物、抗淋巴細胞血清或特異性抗體防止或減弱免疫應答。
術語“免疫應答”指任何免疫系統或形成免疫系統部分的細胞(淋巴細胞、粒細胞、巨噬細胞等)對抗原性刺激的反應，包括但不限于抗體產生，細胞介導的免疫力和免疫耐受。
本文所用的關于免疫抑制的術語“IC50”指產生50％最大應答或效果，例如抑制免疫應答，如可由T細胞活化(細胞應答)或B-細胞活化(體液應答)體現的該組合物的濃度。
詞組“細胞毒性機制”指一種細胞殺傷方式，指補體依賴性機制。類似的詞組“免疫學機制”指細胞殺傷方式，指巨噬細胞依賴性和/或嗜中性粒細胞依賴性的細胞殺傷。
當用于細胞系或細胞時，“淋巴細胞”意味著該細胞系或細胞衍生自淋巴品系。“淋巴細胞”包括B和T淋巴細胞品系和巨噬細胞品系。
“非淋巴細胞和表達MHC II型”細胞意味著除了淋巴細胞以外的例如在病理性炎癥反應中表達MHC II型分子的細胞。例如所述細胞包括滑膜細胞、內皮細胞、甲狀腺細胞和神經膠質細胞，還可以含有基因改變的能表達MHC II型分子的細胞。
術語“凋亡”和“凋亡活性”指哺乳動物中的細胞死亡形式，其特征是伴有一種或多種形態和生物化學特征，包括核與胞質縮合，染色質聚集，細胞膜微絨毛喪失，胞質和核分解到含有核糖體、形態完整的線粒體和核物質的膜結合小泡(凋亡體)中，染色體DNA的降解或喪失線粒體功能。凋亡遵循非常嚴格的時間過程，并由天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶執行，它是非常專一的一組蛋白酶。可通過細胞存活率試驗，膜聯蛋白V染色或天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶抑制試驗確定或測定凋亡活性。可用交聯抗體，例如抗CD95如實施例H中所述誘導凋亡。
本文所用的術語“HLA-DRα鏈的第一結構域”意味著α-鏈的N-末端結構域。
本文所用的術語“HLA-DRβ鏈的第一結構域”意味著β-鏈的N-末端結構域。
術語“天然預編程過程”指一個一旦開始就沿自動的級聯機制在細胞內進行的過程，它不需要從所述細胞的環境中獲得任何其它輔助支持來完成該過程。
本文所用的術語“HuCAL”指Knappik等(2000)所述的完全合成的人組合抗體文庫。
本文所用的關于免疫球蛋白分子的術語“可變區”具有本來由免疫學領域的普通技術人員對術語確定的普通意義。抗體的重鏈和抗體輕鏈都分成“可變區”和“恒定區”。可變區和重鏈區之間的分界點可輕易的由本領域普通技術人員根據描述抗體結構的標準文獻確定，例如Kabat等“免疫學感興趣的蛋白質序列第五版”，美國健康和人類服務部，美國政府出版署(1991)。
本文所用的術語“CDR3”指抗體的VH和VL結構域的第三互補決定區或其片段，其中VH CDR3覆蓋位置95-102(可能在位置100后的插入列為100a-100z)，VLCDR3位置89-96(可能在Vλ中95位后的插入列為95a-95c)(見Knappik等，2000)。
本文所用的術語“在嚴格條件下雜交”要描述雜交和洗滌條件，在該條件下至少60％彼此同源的核苷酸通常維持彼此雜交。優選條件是至少65％，更優選至少70％，甚至更優選75％彼此同源的序列維持彼此雜交。這種嚴格條件是本領域技術人員已知的，可在Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，New York(1999)，6.3.1-6.3.6中發現。優選的嚴格雜交條件的非限制性例子是在約45℃下在6x氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中雜交，然后用0.2x SSC、0.1％SDS在50-65℃洗滌一次或多次。
“蛋白質編碼序列”或“編碼”特定多肽或肽的序列是一種在體外或體內當置于合適調控序列控制下時轉錄(就DNA而言)并翻譯(就mRNA而言)成多肽的核酸序列。編碼序列的邊界由5’(氨基)端的起始密碼子和3’(羧基)端的翻譯終止密碼子確定。編碼序列可包括但不限于來自原核或真核mRNA的cDNA，來自原核或真核DNA的基因組DNA序列，和甚至合成的DNA序列。轉錄終止序列通常位于編碼序列的3’。
類似的，不論從其上下文是否明顯，“編碼”將意味著包括編碼多肽的DNA序列，如該術語通常使用的，也包括轉錄成抑制性反義分子的DNA序列。
本文所用的術語“轉染”意味著在受體細胞中通過核酸介導的基因轉移引入異源核酸，例如表達載體。“瞬時轉染”指外源DNA不整合入轉染細胞的基因組的情況，例如附加體DNA轉錄成mRNA，翻譯成蛋白質。當核酸構建體能由子代細胞繼承時，細胞被核酸構建物“穩定轉染”。
“表達載體”指用于表達DNA的可復制DNA構建物，該DNA表達所需蛋白質并含有轉錄單元，該單元含有集合，包括(1)具有基因表達調控作用的因子，例如啟動子、操縱子或增強子，可操縱性連結到(2)編碼所需蛋白質(例如本發明的多肽)的DNA序列，其轉錄成mRNA并翻譯成蛋白質，和(3)合適的轉錄和翻譯元件起始和終止序列。啟動子和其它調控元件的選擇通常根據所需的宿主細胞變化。一般在重組DNA技術中所用的表達載體常常是“質粒”形式，指環狀雙鏈DNA環，它們在載體形式下不與染色體結合。在本說明書中，“質粒”和“載體”可互換使用，因為質粒是最常用的載體形式。然而，本發明應包括其它起到相等功能，并在下文中提到的本領域已知的表達載體形式。
在表達載體中，控制轉錄或翻譯的調控元件通常可衍生自哺乳動物、微生物、病毒或昆蟲基因。可另外摻入在宿主中復制的能力，例如由復制起始點賦予的，和促使轉化子識別的選擇基因。可以使用衍生自病毒，例如反轉錄病毒、腺病毒等的載體。
“轉錄調控序列”是整篇文獻中使用的術語，指DNA序列，例如起始信號、增強子和啟動子等，其誘導或控制與其可操縱連結的蛋白質編碼序列的轉錄。應理解重組基因可以在轉錄調控元件的控制下，該元件可以與與控制基因天然存在形式的轉錄的序列(如存在)相同或不同。
當描述兩個DNA區域之間的關系時，“可操縱性連接”簡單意味著它們在功能上彼此相關。例如，如果啟動子或其它轉錄調控序列控制編碼序列的轉錄，它與編碼序列可操縱性連接。
本文所用的術語“融合蛋白”是領域內已知的，指一種嵌合蛋白，其至少最初表達成含有衍生自兩種或多種不同蛋白質的氨基酸序列，例如融合蛋白是融合基因的基因產物。
本文所用的“增殖”指經歷有絲分裂的細胞。
細胞的“生長速率”指細胞增殖的速率和細胞分化的狀態。
術語“細胞增殖性疾病”是指惡性和非惡性的轉化的細胞群，其中形態通常與周圍組織不同。
術語“轉化的細胞”指自發轉化成不受限制的生長的細胞，即它們獲得了能在培養物中通過無限數量的分裂生長的能力。轉化的細胞的特征可以是術語腫瘤的、退化發育的和/或增生的，以及喪失生長控制。
本文所用的術語“不死化的細胞”指通過化學和/或重組方法改變的細胞，從而該細胞具有在培養物中通過無限次數的分裂生長的能力。
本文所用的術語“動物”指哺乳動物，優選人等哺乳動物。類似的，要用本發明的方法治療的“病人”或“個體”可以意味著人或非人動物。
根據本發明的方法，可以藥物學可接受的組合物施用肽。一般單克隆抗體、抗體片段和肽的藥物學可接受的載體是本領域一般技術人員熟知的。本文所用的術語“藥物學可接受的載體”包括任何和所有溶劑、分散介質、糖衣、抗菌劑和抗真菌劑、等滲和吸收延遲劑等。在優選例中，施用不影響活性成分的生物活性作用和在給藥濃度下對宿主沒有過度毒性的載體介質。給藥可以用任何合適技術進行，包括皮下和胃腸外給藥，優選胃腸外。胃腸外包括靜脈內、動脈內、肌肉內和腹膜內，其中靜脈內是優選的。
適合注射用的藥物形式包括無菌水溶液或分散劑和用于當場制備無菌注射溶液或分散劑的無菌粉末。就所有情況而言，形式必須是無菌的，而且必須是達到能夠方便用鎮痛注射的液體。它必須在制造和儲藏條件下穩定，必須保護免受微生物，例如細菌和真菌的污染作用。載體可以是溶劑或分散介質，含有例如水、乙醇、聚醇(例如甘油、丙二醇和液態聚乙二醇等)及其合適的混合物和植物油。可通過使用糖衣，例如卵磷脂，通過在分散體的情況下維持所需粒徑并使用表面活性劑來維持合適的流動性。可用各種抗菌劑和抗真菌劑，例如對羥苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等防止微生物的作用。在許多情況下，優選含有等滲劑，例如糖或氯化鈉。延長注射組合物的吸收可通過混合吸收劑組合物，例如一硬脂酸鋁和明膠實現。
通過在合適溶劑中摻入所需量的活性化合物，例如主題多肽以及各種其它如需要的上述成分過濾消毒制備無菌注射溶液。一般通過將各種滅菌的活性成分摻入無菌載體，其含有基礎分散介質和所需的其它上述成分，制備分散劑。就制備無菌注射溶液的無菌粉末而言，制備的優選方法是真空干燥和凍干技術，得到活性成分加上任何其它所需的來自先前無菌過濾的溶液的成分的粉末。
為了口腔給藥，本發明的多肽可與賦形劑一起摻入，并以非吞服的漱口液和牙粉形式使用。漱口液可以通過將活性成分以所需量摻入合適的溶劑，如硼酸鈉溶液(Dobell溶液)制備。活性成分還可以分散在牙粉中，包括凝膠、軟膏、粉末和漿液。活性成分可以以治療有效量加到膏狀牙粉中，它可以含有水、粘合劑、摩擦劑、調味劑、發泡劑和濕潤劑。
本發明的組合物可以配制成中性或鹽形式。藥物學上可接受的鹽包括酸加成鹽(由蛋白質的游離氨基形成)和無機酸，例如鹽酸或磷酸形成的，或有機酸，例如乙酸、草酸形成的，從無機堿，例如氫氧化鈉、鉀、銨、鈣或鐵衍生的，和有機堿，例如異丙胺、三甲胺、組胺、普魯卡因等衍生的。
對于在水溶液中胃腸外給藥，例如該溶液如需要必須是合適緩沖的，而液態稀釋劑首先用足量鹽水或葡萄糖變成等滲。這些特定水溶液尤其適合靜脈內、肌肉內、皮下和腹膜內給藥。因此，可以使用的無菌水相介質是本領域技術人員根據本公開已知的。例如，一劑量能夠溶于1毫升等滲NaCl溶液，并加到1000ml皮下灌注液中或注射到指定的輸液位點(見例如“Remington’s PharmaceuticalSciences”15版，1035-1038頁和1570-1580)。劑量中的一些變化必須根據要治療的個體的病況而定。負責給藥的人將在任何事件中確定對于各病人的合適劑量。另外，對于人類給藥，制備必須符合無菌、致熱性、FDA局生物學標準的一般安全和純度標準。
配制后，溶液可以用與制劑相容的方式施用，其量是治療有效的。制劑可輕易的以各種劑型施用，例如可注射溶液、藥物釋放膠囊等。
本文所用的術語“預防性或治療性”處理指施給醫學情況的宿主。如果在接觸該條件前施用，處理是預防性的(即它保護宿主抵抗腫瘤形成)，而如果在感染或疾病開始后給藥，處理是治療性的(即它與存在的腫瘤戰斗)。
本發明的至少一種多肽的多價組合物能導致活化的細胞，優選淋巴瘤細胞死亡，而不需要任何其它手段，例如化療，并對治療的病人具有有限的免疫學副作用。另外，含有本發明的多肽的多價組合物具有與靶抗原上的至少一種表位結合的能力，然而幾種表位結合位點可以合并在一個分子中。優選含有本發明的多肽的多價組合物顯示與非活化細胞相比，針對活化細胞高至少5倍，或更優選10倍的殺傷作用。活化的細胞上該更高的活性可表示成對活化的細胞相對與非活化細胞至少低5倍的EC50值，或表示成當用相同濃度的蛋白質時，活化的細胞對未活化的細胞殺傷百分數更高。在后一種情況下，含有本發明的多肽的多價組合物在給定的多肽濃度下殺死至少50％，優選至少80％活化的細胞，而相同濃度的含本發明多肽的多價組合物在同樣的孵育條件下殺死15％以下，優選10％以下的非活化細胞。該確定EC50和殺傷活性百分數的試驗條件如下所述。
附圖簡述

圖1a.抗-HLA-DR抗體片段的特異性MS-GPC-8-27-7、MS-GPC-8-27-10、MS-GPC-8-27-41、MS-GPC-8-6-47、MS-GPC-8-10-57、MS-GPC-8-6-27、MS-GPC-8和MS-GPC-8-6與HLA-DR蛋白、陰性對照蛋白(BSA、睪丸酮-BSA、溶菌酶和人脫輔轉鐵蛋白)，和空微量滴定板孔(塑料)的結合。用標準ELISA法評估特異性。
b.抗-HLA-DR抗體片段的特異性從HuCAL文庫分離到的MS-GPC-1、6、8和10與HLA-DR蛋白、小鼠-人嵌合HLA蛋白和陰性對照蛋白(溶菌酶、轉鐵蛋白、BSA和人β-珠蛋白)的結合。用標準ELISA法評估特異性。用非相關抗體片段(irr.scFv)作為對照。
圖2抗-HLA-DR抗體片段(MS-GPC-1、6、8和10)，以及MS-GPC-8、MS-GPC-8-10-57、MS-GPC-8-27-41和MS-GPC-8-6-17的IgG形式與各種表達MHC II型分子的細胞系的反應性。“+”代表用標準免疫熒光法檢測的強反應性。“+/-”代表弱反應性，“-”代表抗-HLA-DR抗體片段或IgG與特定細胞系無檢測到的反應性。
圖3腫瘤細胞在單價和交聯抗-HLA-DR抗體片段存在下用臺盼藍染色評估的存活率。在與抗-HLA-DR抗體片段(MS-GPC-1、6、8和10)與和不與抗-FLAG M2 mAb作為交聯劑培養4小時后評估的GRANTA-519細胞是存活率。
圖4表5數據的分散繪圖和擬合對數曲線，顯示本發明人抗體片段的IgG形式的50nM溶液與200nM小鼠抗體溶液治療相比，殺傷效力提高。空心圓代表用小鼠抗體L243和8D1治療的細胞系，實心圓代表人抗體MS-GPC-8、MS-GPC-8-27-41、MS-GPC-8-10-57和MS-GPC-8-6-13。人(實線)和小鼠(虛線)mAb殺傷數據的擬合對數曲線顯示用50nM人mAb治療比小鼠mAb總體上要好，盡管后者最終治療濃度是200nM。
圖5活化對非活化細胞的殺傷。用脂多糖。干擾素-γ和植物血凝素活化MHH-PREB-1細胞，然后與0.07-3300nM抗HLA-DR抗體片段MS-GPC-8-10-57和MS-GPC-8-27-41的IgG形式一起保溫。在對照的非活化MHH-PREB-1細胞中未見存活率下降。
圖6對照(無抗體、非反應性小鼠IgG；淡灰色)和抗-HLA-DR抗體片段的人(MS-GPC-8、MS-GPC-8-10-57和MS-GPC-8-27-41；暗灰色)IgG形式針對從病人分離出的CLL細胞的殺傷效力。左側，培養4小時(h4)和24小時(h24)后10個病人的休眠細胞培養物針對抗體的存活率數據的條狀圖表示。右側，培養4小時(h4)和24小時(h24)后6個病人的活化細胞培養物針對抗體的存活率數據的條狀圖表示。
圖7本發明某些抗-HLA-DR抗體的濃度依賴性細胞存活率。豎線表示對各抗體片段獲得的重復數據對數非線性回歸估計的EC50值。a)交聯二價抗-HLA-DR抗體F(ab)片段二聚物MS-GPC-10(圓圈和實線)、MS-GPC-8(三角和虛線)和MS-GPC-1(十字和點劃線)的殺傷曲線。b)交聯二價抗-HLA-DR抗體(Fab)片段二聚物MS-GPC-8-17(圓圈和實線)、小鼠IgGs 8D1(三角和虛線)和L243(十字和點劃線)的殺傷曲線。c)交聯二價抗-HLA-DR抗體(Fab)片段二聚物GPC-8-6-2(三角和劃線)、小鼠IgGs8D1(圓圈和實線)和L243(十字和虛線)的殺傷曲線。d)人抗-HLA-DR抗體片段MS-GPC-8-10-57(十字和虛線)、MS-GPC-8-27-41(大叉和點劃線)、小鼠IgGs 8D1(圓圈和實線)和L243(三角和劃線)的殺傷曲線。所有濃度以二價制劑(IgG或交聯(Fab)二聚物)的nM給出。
圖8a.Priess細胞與抗-HLA-DR抗體片段MS-GPC-8(用抗-FLAG M2 mAb交聯)一起培養，顯示比用抗-CD95 mAb誘導的Priess細胞凋亡培養物更迅速的殺傷。Annexin V/PI染色技術用Annexin V陽性和PI陽性染色鑒定出壞死細胞。
b.Priess細胞與抗-HLA-DR抗體片段MS-GPC-8(用抗-FLAG M2 mAb交聯)一起培養，與用抗-CD95 mAb誘導的Priess細胞凋亡培養物相比顯示幾乎沒有凋亡機制的證據。Annexin V/PI染色技術用Annexin V陽性和PI陰性染色鑒定出凋亡細胞。
圖9a.用實驗確定抗-HLA-DR抗體片段MS-GPC-8-10-57、MS-GPC-8-27-41和MS-GPC-8-6-13的IgG形式抑制T-雜交瘤細胞的IL-2分泌的免疫抑制性質。
b.用實驗確定抗-HLA-DR抗體片段MS-GPC-8-27-41、MS-和MS-GPC-8-6-19的單價Fab形式抑制T-雜交瘤細胞的IL-2分泌的免疫抑制性質。
圖10在確定T細胞增殖抑制的實驗中抗HLA-DR抗體片段MS-GPC-8-10-57和MS-GPC-8-27-41的IgG形式的免疫抑制性質。
圖11scFv的載體作圖和序列顯示載體pMORPH13 scFv載體pMORPH13_scFv是噬菌粒載體，含有編碼絲狀噬菌體的基因III蛋白C-末端結構域和HuCAL scFV的融合蛋白的基因。在圖11中，顯示了含有模式scFv基因(VH1A和Vλ3(Knappik等，2000))的載體。
原始HuCAL主宰基因(Knappik等(2000)見其中的圖3)是用其真實N-末端VH1A、VH1B、VH2、VH4和VH6構建的，其中Q(＝CAG)是第一個氨基酸。VH3和VH5，其中E(＝GAA)是第一個氨基酸。載體pMORPH13-scFv含有與VH鏈融合的短FLAG肽序列(DYKD)，因此該載體中的，和所有衍生自該載體的HuCAL VH鏈在第一個位置具有E(＝GAA)(例如在pMx7_FS載體中，見圖12)。
圖12scFv表達載體pMx7_FS_5D2的載體圖和序列當VH-CH1與FLAG標記(Hopp等，1988；Knappik和Plückthun，1994)和STREP標記II(WSHPQFEK)(IBA GmbH，Gttingen，Germany；見Schmidt和Skerra，1993；Schmidt和Skerra，1994；Schmidt等，1996；Voss和Skerra，1997)融合時，表達載體pMx7_FS_5D2導致HuCAL scFv片段的表達(在圖12中，載體含有稱為“5D2”的編碼“啞”抗體片段的基因)。
圖13Fab表達載體pMx9_Fab_GPC8當VH-CH1與FLAG標記(Hopp等，1988；Knappik和Plückthun，1994)和STREP標記II(WSHPQFEK)(IBA GmbH，Gttingen，Germany；見Schmidt和Skerra，1993；Schmidt和Skerra，1994；Schmidt等，1996；Voss和Skerra，1997)的組合融合時，表達載體pMx9_FS_GPC8導致HuCAL Fab片段的表達(在圖13中，載體含有Fab片段MS-FPC8)。
在pMx9_Fab載體中，克隆自scFv片段的HuCAL Fab片段(見圖11的圖片捕獲)不具有與VH鏈融合的短FLAG肽序列，該載體中的和直接衍生自該載體的HuCALVH鏈在第一個位置具有Q(＝CAG)。
圖14Fab噬菌體的載體圖和序列顯示載體pMORPH18_Fab_GPC8載體pMORPH18的衍生物是噬菌粒載體，含有編碼絲狀噬菌體的基因III蛋白C-末端結構域和HuCAL VH-CH1鏈之間的融合蛋白的基因。另外，載體含有單獨編碼的VL-CL鏈。在圖14中，顯示了含有Fab片段MS-GPC-8的載體。
在pMORPH18載體中，克隆自scFv片段的HuCAL Fab片段(見圖11的圖片捕獲)不具有與VH鏈融合的短FLAG肽序列(DYKD)，該載體中的和直接衍生自該載體的HuCAL VH鏈在第一個位置具有Q(＝CAG)。
圖15MS-GPC-1、MS-GPC-6、MS-GPC-8、MS-GPC-10、MS-GPC-8-6、MS-GPC-8-10、MS-GPC-8-17、MS-GPC-8-27、MS-GPC-8-6-13、MS-GPC-8-10-57和MS-GPC-8-27-41的VH和VL結構域的氨基酸序列。
圖15中的序列顯示原始HuCAL主宰基因中的VH的氨基酸1(Knappik等(2000)；見其中的圖3)。在scFv構建物中，如該申請中所述，VH的氨基酸1總是E(見圖11的圖像捕獲)，在本申請的Fab構建物中，VH的氨基酸1總是Q(見圖13的圖像捕獲)。
發明詳述下列實施例說明了本發明。
實施例所有不另外指出的緩沖液、溶液或方法可以在標準教科書，例如CurrentProtocols of Immunology(1997和1999)或Sambrook等，1989。除非另外說明，所有材料購自sigma，Deisenhofen，DE或Merck，Darmstadt，DE或引用的文獻中給出了來源。從LGC參考材料，Middlesex，UK中獲得雜交瘤細胞系LB3.1和L243；抗體8D1的數據由Dr.Matyas Sandor，University of Michigan，Madison，WI，USA慷慨提供。
1.人抗原的制備為了證明我們能鑒定人組合物的細胞毒性抗原結合域，我們首先如下制備了人抗原的純化形式，來自PRIESS細胞(Gorga等，1984；Gorga等，1986；Gorga等，1987；Stern等，1992)的人MHC II型DR蛋白(DRA*0101/DRB*0401)。
首先，在RPMI和10％胎牛血清(FCS)中用標準條件培養PRIESS細胞(ECACC，Salisbury UK)，在含有1％ NP-40(BDH，Poole，UK)、25mM碘代乙酰胺、1mM苯甲基磺酰氟(PMSF)和10mg/l的各種蛋白質抑制劑胰凝乳蛋白酶抑制劑、antipain、胃蛋白酶抑制劑A、大豆胰蛋白酶抑制劑和亮抑肽酶的200毫升磷酸緩沖鹽(PBS)(pH7.5)中裂解1010細胞。10.000g(30分鐘，4℃)離心裂解物10分鐘，在得到的上清液中補充含有5％脫氧膽酸鈉、5mM碘代乙酰胺和10mg/l的各種蛋白質抑制劑胰凝乳蛋白酶抑制劑的40毫升水溶液，100,000g離心2小時(4℃)。為了除去非特異性結合和內源的抗體，用PMSF將上清液稀釋成0.2mM，并過夜(4℃)通過家兔血清affigel-10柱(5毫升；為了制備，家兔血清(Charles River，Wilmington，MA，USA)與Affigel 10(BioRad，Munich，DE)以3∶1的體積比培養，根據廠商指示洗滌)，然后用0.2ml/min的流速通過Protein G Sepharose Fast Flow柱(2毫升；Pharmacia)。
第二，用溫和混合，將預處理的裂解液與5毫升Protein G Sepharose FastFlow珠一起4℃保溫過夜，該珠與小鼠抗-HLA-DR抗體LB3.1(Protein G-Sepharose FF(Pharmacia)親核層析雜交瘤細胞系LB3.1的上清液)偶聯，然后轉移到小柱中，再用三種溶液充分洗滌(1)100毫升溶液，含有50mMTris/HCl(pH8.0)，150mM NaCl，0.5％NP-40，0.5％脫氧膽酸鈉，10％甘油和0.03％疊氮化鈉，流速為0.6ml/min。(2)25毫升溶液，含有50mM Tris/HCl(pH9.0)、0.5MNaCl、0.5％NP-40、0.5％脫氧膽酸鈉、10％甘油和0.03％疊氮化鈉，流速為0.9ml/min；(3)25毫升溶液，含有2mM Tris/HCl(pH8.0)、1％辛烷基-β-D-葡糖吡喃糖苷、10％甘油和0.03％疊氮化鈉，流速為0.9ml/min。
第三，用15毫升含有50mM二乙胺/HCl(pH11.5)、150mM NaCl、1mM EDTA、1mM EGTA、1％辛烷基-β-D-葡糖吡喃糖苷(Alexis Corp.，Lausen，CH)、10％甘油、10mM碘代乙酰胺和0.03％疊氮化鈉的溶液洗脫MHC II型DR蛋白(DRA*0101/DRB*0401)，流速為0.4ml/min。立即用100微升Tris/HCl(pH6.8)、150mMNaCl和1％辛烷基-β-D-葡糖吡喃糖苷中和800微升組分。重復孵育裂解液和LB3.1Protein G Sepharose Fast Flow珠，直到裂解液中沒有MHC蛋白。合并MHCII型DR蛋白的純化洗脫組分(如SDS-PAGE分析)，用Vivaspin濃縮機濃縮到1.0-1.3g/l(Greiner，Solingen，DE)和30kDa分子量截留。用相同的Vivaspin濃縮機含有1％辛烷基-β-D-葡糖吡喃糖苷的PBS重新緩沖約1毫克MHC II型DR制劑，使得蛋白質與BIAcore CM5芯片直接偶聯。
2.HuCAL的篩選2.1.介紹我們鑒定了某些來自基于最新產生的概念(Knappik等，2000)的人抗體文庫中針對人抗原(DRA*0101/DRB1*0401)的人組合物(MS-GPC-1、MS-GPC-6、MS-GPC-8、和MS-GPC-10)的抗原結合性抗體片段。在此得到總共49個不同框架的共有共有框架代表用于人免疫應答的VH-和VL-亞類。設計這些主宰基因考慮并估計促使蛋白質聚集的不良殘基和建立導致基因分子逐乘的獨特限制性位點。在HuCAL-scFv中，隨機排列編碼49個主宰基因區域的VH-和CL-CDR3。
2.2.噬菌粒拯救，噬菌體擴增和純化大腸桿菌TG-1中克隆入基于噬菌粒噬菌體顯示載體pMORPH13_scFv的HuCAL-scFv(Knappik等，2000)在含有34微克/毫升氯霉素和1％葡萄糖的2x TY培養基(2xTV-CG)中擴增。在約0.5 OD60037℃輔助噬菌體感染(VCSM13)，離心并重懸浮在2x TY/34微克/毫升氯霉素/50微克/毫升卡那霉素/0.1mM IPTG中后，細胞在30℃生長過夜。從上清液中PEG-沉淀噬菌體(Ausubel等，1998)，重新懸浮在PBS/20％甘油中，儲藏在-80℃。兩次淘洗循環之間的噬菌體擴增如下進行用洗脫噬菌體感染對數期中期的噬菌體TG1-細胞，接種到補充了1％葡萄糖和34微克/毫升的氯霉素的LB-瓊脂糖中。30℃過夜培養后，刮下菌落，調節到0.5的OD600，如上加入噬菌體輔助噬菌體。
2.3.手工固相淘洗用溶于PBS的MHC II型DRA*0101/DRB1*0401(如上制備)包裹MaxiSorpTM微量滴定板(Nunc，Roskikde，DK)的孔(2微克/孔)。用5％脫脂干燥牛奶在PBS中封閉后，在1小時內，20℃下加入1-5×1012如上純化的HuCAL-scFv噬菌體。幾次洗滌步驟后，用100mM三乙胺pH-洗脫結合的噬菌體，隨后用1M TRIS-Cl，pH7.0中和。如上所述在各輪之間通過噬菌體擴增進行三輪淘洗。
2.4.混合的固相/全細胞淘洗如2.3和2.2中所述進行三輪淘洗和噬菌體擴增，除了在第二輪，10毫升Falcon管中使用1毫升PBS/10％FCS的1×107到5×107pRIESS細胞，以進行全細胞淘洗。20℃與噬菌體制備物培養1小時后，離心細胞懸液(2000rpm3分鐘)除去非結合的噬菌體，用10毫升PBS洗滌細胞三次，每次后如所述進行離心。用100mMHCl通過pH-洗脫洗脫出與細胞特異性結合的噬菌體。另外，可以直接在三乙胺處理(100mM)和隨后中和后在懸液中加入大腸桿菌擴增結合的噬菌體。
2.5.HLA-DR結合性scFv片段的鑒定用FACS分析在PRIWSS細胞上篩選在三輪固相淘洗(2.3)或混合固相/全細胞淘洗(2.4)后獲得的克隆與細胞表面HLA-DR的結合。為了表達，通過XbaI/EcoRI將scFv克隆到作為表達載體的pMX7_FS中(見圖12)。在下文實施例3.2中顯示了表達條件。
在4℃將106Priess細胞等分轉移到96孔微量滴定板中。60分鐘加入scFv的封閉緩沖液(PBS/5％FCS)溶液，用抗-FLAG M2抗體(Kodak)(1∶5000稀釋)，然后用多克隆山羊抗小鼠IgG抗體-R-藻紅素復合物(Jackson ImmunoResearch，WestGrove，PA，USA，目錄號115-116-146，F(ab′)2片段)(1∶200稀釋液)檢測。將細胞固定在聚甲醛中，4℃儲藏。每個試驗在FACS-Calibur(BD ImmunocytometrySystems，San Jose，CA，USA)上收集104個事件。超過500個推定結合物中僅15個被鑒定為與PRiess細胞特定結合。如下所述進一步分析這些克隆的免疫調節能力及其殺傷能力。表1包含由此鑒定的克隆MS-GPC-1、MS-GPC-6、MS-GPC-8和MS-GPC-10。列出的VH和VL家族以及CDR3指所述的基于HuCAL共有的抗體基因(Knappik等，2000)；VH和VL CDR的序列如表1所示，VH和VL結構域的全序列如圖15所示。
3.Fab片段的產生3.1.scFv轉化為Fab從相應的scFv片段如下產生了Fab-片段抗原結合多肽MS-GPC-1-Fab、MS-GPC-6-Fab、MS-GPC-10-Fab。將scFv片段的重鏈和輕鏈可變區克隆入pMx9_Fab(圖13)，重鏈可變區作為MfeI/StyI片段，κ輕鏈的可變區作為EcoRV/BsiWI片段。λ鏈首先從相應的作為模板的pMORPH13-scFv載體用PCR引物CRT(5’引物)和CRT6(3’引物)擴增出來，其中CRT6引入獨特的DraIII限制性內切酶位點。
CRT55’GTGGTGGTTCCGATATC3’CRT65’AGCGTCACATCGGTGCGGCTTTCGGCTGGCCAAGAACGGGTTA3’用EcoRV/DraIII切割PCR產物，克隆入pMx9_Fab(見圖13)。可用多克隆山羊抗人IgG抗體-R-藻紅素復合物(Jackson ImmnoResearch，West Grove，PA，USA，目錄號109-116-088，F(ab′)2片段)(1∶2000稀釋)檢測Fab輕鏈。
3.2.HuCAL-抗體片段在大腸桿菌中的表達和純化在補充有34微克/毫升氯霉素的1升2x TY-培養基中分別在大腸桿菌細胞(JM83)中從pMX7_FS或pMx9_Fab表達scFv和Fab片段。用0.5mM IPTG(scFv)或0.1mM IPTG(Fab)誘導后，在22℃培養細胞12小時。在弗式壓碎器(ThermoSpectronic，Rochester，NY，USA)中在20mM磷酸鈉、0.5M NaCl和10mM咪唑(pH7.4)中裂解細胞沉淀。離心除去細胞碎片，用Streptactin基質進行STREP標記純化前，使澄清上清液通過0.2微米孔，純化條件根據供應商(IBA GmbH，Gttingen，Germany)。尺寸排阻層析(SEC)純化如Rheinnecker等進行(1996)。通過SEC用校準用標準確定表觀分子量，在某些情況下用偶聯液相層析-質譜肯定(TopLab GmbH.Matinsried，Germany)。
4.抗體片段的優化為了優化HLA-DR結合性抗體片段的某些生物學特征，用MS-GPC-8-Fab通過用來自HuCAL文庫的CDR3中隨機氮化所有λ鏈替換親本VLλ1，構建Fab抗體文庫(Knippak等，2000)。
通過XbaI/EcoRI從pMx9_Fab_GPC-8將Fab片段MS-GPC-8-Fab克隆入pMORPH18_Fab，Fab片段噬菌體顯示的基于噬菌粒的載體，來產生pMORPH18_Fab_GPC-8(見圖14)。含有獨特DraIII限制性內切酶位點(Knappik等，2000)的λ鏈庫被克隆入用NsiI和DraIII切割的pMORPH18_fab_GPC-8(見圖14中pMORPH18_Fab_GPC-8的載體圖)。
用兩輪針對MHC II型DRA*0101/DRB1*0401(如上制備)如2.3中所述的的淘洗篩選得到的Fab優化文庫，除了在第二輪中包裹的抗原濃度降到12納克/孔。FACS如2.5中所述鑒定出優化的克隆。這些克隆中7個MS-GPC-8-1、MS-GPC-8-6、MS-GPC-8-9、MS-GPC-8-10、MS-GPC-8-17、MS-GPC-8-18和MS-GPC-8-27進一步確定特征，并顯示如起始片段MS-GPC-8發現的細胞殺傷作用。表1含有GPC-8-1、MS-GPC-8-6、MS-GPC-8-9、MS-GPC-8-10、MS-GPC-8-17、MS-GPC-8-18和MS-GPC-8-27的序列特征。列出的VH和VL家族和CDR3指所述的HuCAL基于共有的抗體基因(Knappik等，2000)，圖15顯示了MS-GPC-8-6、MS-GPC-8-10、MS-GPC-8-17和MS-GPC-8-27的VH和VL結構域的全序列。
抗-HLA-DR抗體片段MS-GPC-8-6和MS-GPC-8-17的優化Fab形式顯示對于起始MS-GPC-8改善的特征。例如，優化抗體的EC50是15-20和5-20nM(與MS-GPC-8的20-40nM比較，其中濃度以二價交聯Fab二聚物的濃度給出)，對于MS-GPC-8-6和MS-GPC-8-17殺死MHH-Call 4細胞的最大能力確定分別為76％和78％(與MS-GPC-8的65％比較)。
為了進一步優化，通過盒式誘變用三核苷酸定向的誘變(Virnek等，1994)優化衍生自MS-GPC-8(包括MS-GPC-8-10和MS-GPC-8-27)的一組抗-HLA-DR抗體片段的VL CDR1區域。簡單說，合成了一個VI1 CDR1文庫盒，它含有個隨機的位點(總可變性7.43×106)，克隆入VI1框架。用EcoRV和BbsI消化CDR1文庫，含有CDR1文庫的片段連接入pMORPH18_Fab中MS-GPC-8衍生的Fab抗體的λ輕鏈中(如上所述)，用EcoRV和BbsI消化。如上所述篩選得到的文庫。通過與HLADR(MS-GPC-8-6-2、MS-GPC-8-6-19、MS-GPC-8-6-27、MS-GPC-8-6-45、MS-GPC-8-6-13、MS-GPC-8-6-47、MS-GPC-8-10-57、MS-GPC-8-27-7、MS-GPC-8-27-10和MS-GPC-8-27-41)特異性結合鑒定了10個克隆，顯示起始片段MS-GPC-8、MS-GPC-8-10和MS-GPC-8-27所發現的細胞殺傷活性。表1包含MS-GPC-8-6-2、MS-GPC-8-6-19、MS-GPC-8-6-27、MS-GPC-8-6-45、MS-GPC-8-6-13、MS-GPC-8-6-47、MS-GPC-8-10-57、MS-GPC-8-27-7、MS-GPC-8-27-10和MS-GPC-8-27-41的序列特征。列出的VH和VL家族和CDR3指所述的HuCAL基于共有的抗體基因(Knappik等，2000)，圖15顯示了MS-GPC-8-6-13、MS-GPC-8-10-57、和MS-GPC-8-27-41的VH和VL結構域的全序列。
從10個克隆中，如實施例10中所述的顯著提高的細胞殺傷EC50所證明的，選出4個Fab片段(MS-GPC-8-6-2、MS-GPC-8-6-13、MS-GPC-8-10-57和MS-GPC-8-27-41)。表1顯示在CDR1區域優化的克隆的序列。
優化過程不僅提高了優化過程產生的抗-HLA-DR抗體片段的生物效力，還顯著改善了物理特征-MS-GPC-8及其優化子代的Fab形式的親和力。例如，用表面等離子共振儀器(Biacore，Upsala Sweden)根據實施例7測量了MS-GPC-8的Fab形式及其優化的子代的親和力。MS-GPC-8親本Fab的親和力在VLCDR3優化后提高了100倍，從346nM到約60nM，VLCDR3+1優化后進一步改進成一位納摩爾親和力(范圍3-9nM)(表2)。
5.IgG的產生5.1 HuCAL-免疫球蛋白表達載體的構建如下克隆重鏈。除去pcDNA3.1+(Invitrogen)的多克隆位點，插入用于HuCAL設計的與限制性位點相容的填充片段，用于連接前導序列(NheI/EcpRI)、VH-結構域(EcoRI/BlpI)和免疫球蛋白恒定區(BlpI/ApaI)。前導序列(EMBL M83133)具有Kozak序列(Kozak，1987)。人IgG1恒定區(PIR J00228)、IgG4(EMBL K01316)和血清IgA1(EMBL J00220)分隔成長約70個堿基的重疊寡核苷酸。引入沉默突變除去與HuCAL設計不相容的限制性位點。用重疊延伸-PCR剪接寡核苷酸。
如下克隆輕鏈。用兩種不同的填充片段替換pcDNA3.1/Zeo+(Invitrogen)的多重克隆位點。κ-填充片段提供插入κ-前導(NheI/EcoRV)、HuCAL-scFv Vκ-結構域(EcoRY/BsiWI)和κ-鏈恒定區(BsiWI/ApaI)的限制性位點。λ-填充片段中的相應限制性位點是NheI/EcoRV(λ-前導)、EcoRV/HpaI(Vλ-結構域)和HpaI/ApaI(λ鏈恒定區)。κ-前導(EMBL Z00022)和λ-前導(EMBL L27692)都具有Kozak序列。人κ-(EMBL J00241)和λ-鏈(EMBL M18645)中的恒定區通過上述重疊延伸-PCR裝配。
5.2表達IgG的CHO細胞的產生所有細胞維持在37℃，含有5％CO2的濕潤大氣中供應商推薦的培養基中。CHO-K1(CRL-9618)來自ATCC，用等摩爾的IgG重鏈和輕鏈表達載體混合物共轉染。用600微克/毫升G418和300微克/毫升Zeocin(Invitrogen)選擇雙抗性的轉染子，然后極限稀釋。用捕獲-ELISA評估單克隆上清液的IgG表達。陽性克隆在補充有10％超低IgG-FCS的RPMI-1640培養基(Life Technologies)中擴大。將上清液pH調節到8.0和無菌過濾后，溶液進行標準蛋白質A柱層析(Poros 20A，PEBiosystems)。
抗-HLA-DR結合域的IgG形式顯示對抗體片段改進的特征，這些改進的特征包括親和力(實施例7)和殺傷效力(實施例9、10和14)。
6.HLA-DR特異性實驗和表位作圖為了證明選自HuCAL文庫的抗原結合性結構域的與人MHC II受體N-末端結構域的結合位點特異性結合，該受體在等位基因之間是大部分保守的，迄今在細胞殺傷領域中通過受體交聯是未知的，我們對其結合特異性進行了評估，嘗試確定結合表位的特征。
Fab抗體片段MS-GPC-8-27-7、MS-GPC-8-27-10、MS-GPC-8-6-13、MS-GPC-8-27-41、MS-GPC-8-6-47、MS-GPC-8-10-57、MS-GPC-8-6-27、MS-GPC-8和MS-GPC-8-6顯示與HLA-DR蛋白質的結合特異性，但沒有與非HLA-DR蛋白的特異性。用下列抗原測試了選自HuCAL文庫的Fab片段的反應性HLA-DR蛋白(DRA*0101/DRB1*0401實施例1中制備，和一組無關的非-HLA-DR蛋白質，包括BSA、睪丸酮-BSA、溶菌酶和人轉鐵蛋白)。用空孔(塑料的)作為陰性對照。以1微克/孔PBS(Nunc-MaxiSorpTM)包裹抗原MHCII過夜，而對于其它抗原(BSA、睪丸酮-BSA、溶菌酶、轉鐵蛋白)用10微克/孔。翌日用5％脫脂牛奶封閉孔1小時，然后與各抗體以100納克/孔孵育(抗-MHCII-Fab和無關Fab(Mac1-8A))1小時。在PBS中洗滌后，在各孔中加入抗人-IgG F(ab′)2-過氧化物酶-偶聯物(1∶10000在TBS(補充了5％w/v脫脂干燥牛奶/0.05％v/v Tween 20)中的稀釋度)。加入底物POD(Roche)后，最終洗滌在PBS中進行。用ELISA閱讀儀在370nM閱讀顯色。
所有抗-HLA-DR抗體片段MS-GPC-8-27-7、MS-GPC-8-27-10、MS-GPC-8-6-13、MS-GPC-8-27-41、MS-GPC-8-6-47、MS-GPC-8-10-57、MS-GPC-8-6-27、MS-GPC-8和MS-GPC-8-6顯示對HLA-DR的高度特異性，如同將這些抗體片段與HLA-DR衍生的抗原與對照比較得到更高的平均熒光強度證明的(圖1a)。在類似的實驗中，發現Fab片段MS-GPC-1、MS-GPC-6、MS-GPC-8和MS-GPC-10同時與DRA*0101/DRB1*0401(如上制備)和含有DRA*0101和DRB1*0401的N-末端，剩余的分子衍生自小鼠II型同源物IEd(Ito等，1996)的嵌合DR-IE結合(圖1b)。
為了證明抗-HLA-DR抗體片段和本發明的IgG的廣泛DR反應性，測試了MS-GPC-1、6、8和10的scFv形式，測試了MS-GPC-8、MS-GPC-8-10-57、MS-GPC-8-27-51和MS-GPC-8-6-13的IgG形式的針對從ECACC獲得的一類愛潑斯坦-巴爾病毒轉化的B細胞系(Salisbury UK)的反應性，各同源物是人群中最常見的DR等位基因之一(圖2顯示了細胞系和等位基因的表)還測試了抗體片段針對一系列轉染表達人MHC II型同型抗原(除了分別表達分子DRB3*0101、DRB4*0101、DP0103/0402、DP0202/0201和DQ0201、0602的DRB1L105.1、L257.6、L25.4、L256.12和L21.3(Klohe等，1988))的L細胞的反應性。
用例如Otten等(1997)所述的免疫熒光法證明了抗原結合片段與一類表達各種MHC-II型分子的細胞系的反應性。染色在2×105個細胞上用抗-FLAG M2抗體作為針對各抗-HLA-DR抗體片段攜帶的M2標記的第二試劑和熒光素標記的山羊抗小鼠Ig(BD Pharmingen，Torrey Pine，CA，USA)作為染色劑進行染色。細胞在4℃與200nM抗-HLA-DR抗體片段孵育60分鐘，然后與廠商確定濃度的二抗和三抗一起孵育。對于IgG形式，省略二抗，用FITC標記的小鼠抗人IgG4(Serotec，Oxford，UK)檢測IgG。在孵育步驟之間洗滌細胞。最后洗滌細胞并用FACS Calibur(BDImmunocytometry Systems，San Jose，CA，USA)分析。
圖2顯示scFv片段MS-GPC-1、6、8和10，以及MS-GPC-8、MS-GPC-8-10-57、MS-GPC-8-27-51和MS-GPC-8-6-13的IgG形式與所有測試的DRB1同型抗原反應，而MS-GPC-3和4與3種DRB1同型抗原反應。該觀察結果以及所有HLA-DR抗體片段與嵌合DR-IE反應的觀察結果合起來，提示所有所選的抗-HLA-DR抗體片段識別單形DRα鏈的胞外第一個結構域或DRβ鏈胞外第一個結構域上的單形表位。
然后我們嘗試進一步通過檢測與小鼠抗體的競爭性結合定位MS-GPC-8-10-57和MS-GPC-8-27-41的結合域，其中HLA-DR上的結構域是已知的。已知小鼠抗體L243和LB3.1與α1結構域結合，1-1C4和8D1與β1結構域結合，10F12與β2結構域結合(Vidovic等，1995b)。為此，開發了一種實驗，其中首先將表達DT的細胞系(LG-2)與MS-GPC-8-10-57或MS-GPC-8-27-41的IgG4形式，MS-GPC-8-10-57的Fab形式或GPC 8的Fab形式以及不相關的對照抗體一起孵育。如果MS-GPC-8-10-57或MS-GPC-8-27-41的結合位點與小鼠抗體的結合重疊，那么預期小鼠抗體的檢測結果下降。
GPC-8-27-41和MS-GPC-8-10-57的IgG4形式和MS-GPC-8-10-57的Fab形式的結合基本上抑制(平均熒光強度降低＞90％)1-1C4和8D1的結合，而L243、LB3.1和10F12和對照僅稍有影響。MS-GPC-8的Fab形式減少了1-1C4約50％的結合(平均熒光從244降到118)，終止8D1結合，僅稍微影響L243、LB3.1和10F12或對照的結合。無關的對照抗體不影響結合。因此，MS-GPC-8-10-57和MS-GPC-8-27-41看來識別等位HLA-DR分子中高度保守的β1結構域表位。
在冰上進行全染色過程。預先在含有2％ FCS和35微克/毫升豚鼠IgG的PBS(“FACS-緩沖液”)中預封閉1×107個人B-淋巴幼細胞系LG-2。這些細胞分成3等份A、B和C，各約3.3×106個細胞，其中加入A)35微克MS-GPC-8-10-57或MS-GPC-8-27-41 IgG4，B)35微克MS-GPC-8-10-57Fab或MS-GPC-8Fab，C)35微克不相關的IgG4作為陰性對照，孵育90分鐘。然后將A、B、C各分成6等份，每份含有5.5×106個細胞，將下列各2微克小鼠抗體加到指管中，孵育30分鐘1.)純化的mIgG；2.)L243；3.)LB3.1；4.)1-1 C4；5.)8D1；6.)10F12。然后，在各指管中加入4毫升PBS，指管300g離心8分鐘，細胞沉淀重懸浮在50微升含有稀釋25倍的山羊-抗-小鼠Ig-FITC復合物(最終濃度20微克/毫升)(BDPharmingen，Torrey Pines，CA，USA)的FACS緩沖液中。然后，用4毫升PBS洗滌細胞，如上離心，重新懸浮在500微升PBS中，用于流式細胞計數分析(FACSCalibur，BD Immunocytometry Systems，San Jose，CA，USA)。
用PepSpot技術(US 6040423；Heiskanen等，1999)進一步鑒定MS-GPC 8-10-57的結合表位。簡單說，在纖維素膜上用固相肽合成點樣法(WO 00/12757)合成73條重疊15聚肽陣列。這些肽序列分別衍生自HLA-DR4Dw14、HLA-DRA1*0101(殘基1-81)和HLA-DRB1*0401(殘基2-92)的α1和β1結構域，有2個氨基酸的重疊。第二，將該陣列浸沒在0.1％ Tween-20/PBS(PBS-T)中，用5％BSA在PBS-T中室溫封閉3小時，然后用PBS-T洗滌3次。第三，制備的陣列在室溫下和50毫升5mg/lGPC-8-10-57的IgG形式的1％BSA/PBS-T溶液孵育90分鐘。第四，結合后，用PBS-T洗滌膜三次，隨后在室溫下與偶聯了辣根過氧化物酶的山羊抗人輕鏈抗體(在1％BSA/PBS-T中稀釋5000倍)孵育1小時。最后，用PBS-T洗滌膜3次，用化學熒光檢測在X光膠片上確定任何結合。對于山羊抗人輕鏈抗體非特異性結合的對照，用下列獨立洗滌步驟剝離肽陣列，各在室溫下進行30分鐘PBS-T(2次)，水，DMF，水，含有8M脲的水溶液，1％SDS，0.5％DTT，50％乙醇，10％乙酸的水溶液(各3次)，最后甲醇(2次)。再次封閉膜，洗滌，與偶聯有辣根過氧化物酶的山羊抗人輕鏈抗體一起孵育，如上所述顯色。
7.抗HLA-DR抗體和抗體片段的親和力為了證明本發明抗HLA抗體片段的卓越結合性能，我們用標準設備，使用等離子體共振原理測量了它們與人MHC II形DR蛋白(DRA*0101/DRB1*0401)的親和力。令人驚奇的是，我們在本發明一些抗HLA-DR抗體片段IgG形式亞納摩爾水平實現了親和力。例如。分別對于0.3、0.5和0.6nM測量MS-GPC-8-27-41、MS-GPC-8-6-13和MS-GPC-8-10-57的IgG形式的親和力(表3a)。另外，我們觀察到Fab片段親和力在2-8nM范圍內的高親和力在CDR1和CDR3輕鏈區成熟(表3b)。僅在CDR3輕鏈區成熟的Fab片段親和力顯示40-100nM范圍內的親和力(表3c)，甚至未優化的HuCAL抗原結合域的Fab片段也顯示在亞微摩爾范圍內的親和力(表3d)。觀察到CDR3優化后Kon僅略微增加(2倍)(Kon在抗體優化過程中在1×105M-1s-1的數量級中是恒定的)，而Koff的顯著下降是優化過程的特征-對于未優化的Fab，CDR3優化的Fab，CDR3/CDR1優化的Fab和抗HLA-DR抗體的IgG形式是亞100s-1、亞10s-1、亞1s-1和亞0.1s-1。
如下測量本發明抗HLA抗體片段的親和力。所有測量在HBS緩沖液(20mMHEPES、150mM NaCl，pH7.4)中進行。MHC II型DR蛋白(在實施例1中制備)稀釋在100mMpH4.5的乙酸鈉中，至濃度50-100mg/ml，與CM5芯片(Biacore AB)用標準EDC-NHS偶聯化學偶聯，然后如廠商指示用乙醇胺處理。MHCII的包裹密度調節到500-4000RU之間。注射5個不同濃度的不同抗體，用Biacore Instrument的標準軟件測量親和力。用10mM甘氨酸pH2.3和7.5mM NaOH再生偶聯的表面。
8.抗HLA-DR抗體和抗體片段的多價殺傷作用為了證明價對細胞殺傷的效果，用單價、二價和多價的本發明針對GRANTA-519細胞的抗HLA-DR抗體片段組合物進行細胞殺傷試驗。來自HuCAL文庫的抗-HLA-DR抗體片段當與抗-FLAG M2 mAb共同孵育，交聯形成二價組合物時，與單價形式(抗體片段濃度200nM時5-30％殺傷)比較，顯示更高的細胞殺傷活性(抗體片段濃度200nM時60-90％殺傷)(圖3)。單獨或僅在抗-FLAG M2 mAb存在下，不和抗-HLA-DR抗體片段共同孵育細胞，不引起用細胞存活率測量的細胞毒性。如上處理細胞，但使用50nM抗體片段MS-GPC-8、MS-GPC-8-6-13、MS-GPC-8-10-57和MS-GPC-8-27-41的IgG4形式(天然二價)，而不加入抗FLAG M2 mAb，在孵育4小時后顯示76％、78％、78％和73％的殺傷效力。
另外，我們觀察到抗-HLA-DR抗體片段的更高價進一步顯著降低細胞存活率。在含有抗-HLA-DR抗體片段的IgG形式的孵育復合物中加入蛋白質G后，形成的多價復合物與抗HLA-DR抗體片段僅與二價IgG形式孵育后形成的二價組合物比較，進一步降低細胞存活率。
在HLA-DR陽性腫瘤細胞系GRANTA-519(DSMZ，Germany)上測試選自HuCAL文庫的抗HLA-DR抗體片段的殺傷效力。37℃在6％CO2下，2×105個細胞與200nM抗HLA-DR抗體片段在補充有2.5％熱滅活FBS(Biowhittaker Europe，BE)、2mML-谷氨酰胺、1％非必需氨基酸、1mM丙酮酸鈉和0.1mg/ml卡那霉素的RPMI 1640(PAA，Germany)中孵育4小時。測試各抗HLA-DR抗體片段作為單價抗HLA-DR抗體片段或通過加入100nM二價交聯抗-FLAG M2 mAb，作為二價組合物殺傷活化腫瘤細胞的作用。37℃在6％CO2下孵育4小時后，用臺盼藍染色，隨后對剩余存活細胞進行計數(Current Protocols in Immunology，1997)，確定細胞存活率。
用針對與系列稀釋的細菌蛋白質蛋白G預先孵育，制備的MS-GPC-8-10-57和MS-GPC-8-27-4的IgG形式的多價形式的KARPAS-422細胞重復上述實驗。蛋白G具有IgG抗體的高親和力和兩個結合位點，有效將其交聯得到高結合價4。在單獨使用IgG，而沒有與蛋白質G的預孵育的對照中，約殺死了55％的細胞，而用與蛋白質G預孵育的IgG的細胞殺傷在IgG抗體/蛋白質G摩爾比為約6(基于蛋白質G分子量28.5kD)時達到最大的75％左右。更高或更低的IgG抗體/蛋白質G摩爾比達到純IgG抗體的細胞殺傷效力。
9.抗-HLA-DR抗體片段的殺傷效力。
類似實施例8進行抗HLA-DR交聯抗體片段針對其它表達HLA-DR分子的腫瘤細胞系的殺傷效力的實驗。在4小時孵育后，腫瘤細胞顯示細胞殺傷比MS-GPC-8的交聯Fab形式大50％的細胞殺傷，這些腫瘤細胞包括MHH-CALL4、MN60、BJAB、BONNA-12，共分別代表疾病B細胞急性淋巴細胞性白血病、Burkitt淋巴瘤和毛發細胞淋巴瘤。當用交聯抗-FLAG M2 mAb如下形成了用抗HLA-DR抗體片段MS-GPC-1、6和10的交聯Fab形式還顯示對于上述腫瘤細胞系類似的細胞毒性。
用實施例8中的方法確定針對Priess細胞的各交聯二價抗HLA-DR抗體片段的最大殺傷能力。測定MS-GPC-1、MS-GPC-6、MS-GPC-8和MS-GPC-10的最大殺傷能力分別是83％、88％、84％和88％。根據實施例4產生的抗體片段當用上述抗FLAGM2交聯時，也顯示針對GRANTA和Priess細胞的殺傷作用改善(表4)。
10.人組合物抗HLa-DR IgG抗體的殺傷效力與對應的小鼠抗體(Vidovic等，1995b；Nagy和Vidovic，1996；Vidovic和Toral，1998)比較，我們驚奇的發現觀察到本發明的某些抗-HLa-DR抗體片段的IgG形式的殺傷效力顯著改善(表5)。根據實施例8和9所述的方法，但用50nM，重復測定本發明某些抗體片段的IgG形式(3-5次重復實驗，其中細胞數每次實驗一式兩份計數)。當以最終濃度僅50nM提供時，MS-GPC-8、MS-GPC-8-6-13、MS-GPC-8-10-57和MS-GPC-8-27-41殺死了來自24個人腫瘤細胞系的16、22、19和20個。這些細胞系以高于實施例11所測定的10個熒光單位的水平表達HLA-DR抗原。用兩種小鼠抗-HLA-DR抗體L243(Vidovic等，1995b)和8D1(Vidovic和Toral；1988)以顯著高的mAb最終濃度(200nM)處理細胞，分別在24個表達HLA-DR的細胞系中僅13和12個中將細胞存活率降低到50％存活細胞以下。單獨挑出細胞系MHH-PREB-1，不算作24個細胞系組內，盡管它以高于10個熒光單位的水平表達HLA-DR抗原，但是任何上述抗體都不能誘導任何細胞存活率的顯著下降。在實施例12中進一步解釋了該現象。
事實上，即使在顯著提高的濃度下，200nM處理的兩種小鼠抗體與本發明的抗-HLA-DR抗體片段比較，顯示顯著有效的殺傷。不僅本發明人抗-HLA-DR抗體片段的IgG形式與小鼠抗體比較，顯示細胞殺傷在較低濃度下整體提高，而且它們顯示在不同的細胞系之間殺傷效率少有變動。該實施例中殺傷人抗體的變動系數是32％(指％殺傷＝68+/-22％(SD))，與小鼠抗體的62％(指％殺傷＝49+/-31％(SD))相比。通過將平均殺傷百分數對log(平均HLA DR表達)擬合成對數回歸模型，統計學控制HLA表達對殺傷效力的影響，支持該觀察結果(圖4)。不僅小鼠抗體的擬合曲線比人通常低，而且與人抗體數據(16％)的殘數相比，在小鼠抗體數據(SD＝28％)的殘數中有更大的變動。
11.活化對非活化細胞針對人抗原的抗原結合域的殺傷選擇性用人周圍B細胞證明人抗-HLA-DR mAb-介導的細胞殺傷依賴于細胞活化。從HLA-DR型健康捐獻者取出50毫升肝素化的靜脈血，用Ficoll-Hypaque梯度離心(Histopaque-1077；Sigma)如Current Protocols in Immunology(John Wiley &Sons，Inc.，1999)中所述分離新鮮外周血單核細胞(PBMC)。用B-細胞分離試劑盒和MACS LS+/VS+柱(Miltenyi Biotec，Germany)根據廠商說明書從約5×107PBMC中獲得純化的B細胞(約5％外周血淋巴細胞)。用FACS分析等份的分離的B細胞(HLA-DR陽性和CD19陽性)證實了非B細胞的成功耗竭。用市售的抗體(DBImmunocytometry Systems，San jose，CA，USA)用在Current Protocols inImmunology(John Wiley & Sons，Inc.，1999)中所舉例的標準方法進行雙染色和分析。用在補充了10％FCS(Biowhittaker Europe，BE)、2mM L-谷氨酰胺、1％非必需氨基酸、1mM丙酮酸鈉和0.1mg/ml卡那霉素的RPMI 1640(PAA，Germany)中1∶25稀釋的商陸分裂原(Gibco BRL，目錄號15360-019)，在6％ CO2下孵育3天，測試等份的分離的B細胞通過刺激活化細胞的能力。通過FACS分析細胞表面上的HLA-DR表達證實了成功活化(Current Protocols in Immunology(John Wiley &Sons，Inc.，1999))。
通過在上述培養液，除了補充2.5％熱滅活的FCS，而不是10％或單獨與培養液，分別孵育如上所述活化的1×106/毫升B細胞，未活化細胞和50nM MS-GPC-8-10-57、MS-GPC-8-27-41或小鼠IgG 10F12，作比較，證實了活化的細胞對未活化細胞殺傷的選擇性(Vidovic等，1995b)。在6％CO2下，37℃孵育1或4小時后，用二乙酸熒光素染色(FDA)活細胞和碘化丙錠染色(PI)死細胞，隨后用熒光顯微鏡(Leica，Germany)用標準程序(Current Protocols in Immunology，1997)計數綠色(FDA)和紅色(PI)熒光細胞，確定細胞存活率。
顯示B細胞活化是細胞殺傷必需的。在未活化細胞中，與抗HLA-DR抗體孵育1小時后，對于MS-GPC-8-10-57(IgG)、MS-GPC-8-27-41(IgG)、10F12和單獨用培養液，培養液中的活細胞數分別對應于預孵育細胞密度的81％、117％、126％和96％。相反對于MS-GPC-8-10-57(IgG)、MS-GPC-8-27-41(IgG)、10F12和單獨用培養液，培養液中的活的活化的B細胞數在孵育1小時后分別對應于預孵育細胞密度的23％、42％、83％和66％。在孵育4小時后，對于MS-GPC-8-10-57(IgG)、MS-GPC-8-27-41(IgG)、10F12和單獨用培養液，發現在未活化細胞中有預孵育細胞密度的78％、83％、95％和97％是活的，而在活化細胞中對于MS-GPC-8-10-57(IgG)、MS-GPC-8-27-41(IgG)、10F12和單獨用培養液，細胞密度下降到了23％、24％、53％和67％。
12.抗-HLA抗體片段針對細胞系MHH PreB1的殺傷活性如表5證明的，我們觀察到我們的交聯抗-HLA-DR抗體片段或igG不輕易在顯著水平殺傷表達HLA-DR的特定腫瘤細胞系。我們猜想雖然已建立成穩定的細胞系，該培養物中的細胞未充分活化。因此，我進行了實驗，如下用HLA-DR分子作為活化標記提高的細胞表面表達來刺激MHH preB1細胞系的活性。
非附著生長的MHH preB1細胞在含有下列添加劑的RPMI培養液中培養(全部來自Gibco BRL和Bio Whittaker)10％FCs、2mM L-谷氨酰胺、1％非必需氨基酸、1mM丙酮酸鈉和1×卡那霉素。通過與脂多糖(LPS，10微克/ml)、干擾素-γ(IFN-γ，Roche，40ng/ml)和植物凝血素(PHA，5微克/ml)孵育1天活化等份，來提高HLA-DR分子的表達。通過流式細胞計數，用FITC偶聯的mAb L243(BD ImmunocytometrySystems，San Jose，CA，USA)監測HLA-DR分子的細胞表面表達。在LPS、IFN-γ和PHA的存在下孵育MHH preB1 1天，導致HLA-DR表面密度2倍增加(平均熒光漂移從190-390)。在上述培養基(但含有降低的FCS濃度(2.5％))中進行細胞殺傷4小時。使用MS-GPC-8-27-41和MS-GPC-8-10-57的IgG形式的濃度系列，各等份的非活化和活化的細胞上含有最終抗體濃度為3300、550、92、15、2.5、0.42和0.07nm。用顯微鏡鏡檢活細胞排除臺盼藍。雖然未活化的細胞存活率在達到最大抗體濃度下也保持不受抗體影響，但在活化的MHH preB1細胞中，細胞存活率隨著抗體濃度顯著下降(圖5)。
13.人組合物的抗-HLA-DR對體外慢性淋巴細胞性白血病細胞的殺傷效率用從10個患有慢性淋巴細胞性白血病(CLL)的病人分離和純化的B細胞，我們用體外試驗證明了本發明的抗-HLA-DR抗體片段的IgG形式顯示臨床相關細胞的殺傷效率。從10個無關的患CLL的病人中根據標準方法(Buhmann等(1999))分離和純化B-細胞(樣品由Prof Hallek，Ludwig maximillian university，Munich慷慨提供)。用100nM抗HLA-DR抗體片段MS-GPC-8、MS-GPc-8-10-57或MS-GPC-8-27-41的IgG形式處理2×105個細胞，類似實施例8和9孵育4或24小時。建立了復制的細胞培養物組，通過在用抗體處理3天前與在其表面表達CD40配體的HeLa細胞一起孵育活化(Buhmann等，1999)。作為對照，使用小鼠IgG10F12(Vidovic等，1995b)或不用抗體。如實施例12中所述測定各實驗的細胞存活率。
驚人的是，本發明抗-HLA-DR抗體片段的IgG形式顯示了高度有效和單一的殺傷-甚至跨越病人材料的多樣組。在處理僅4小時后，所有三種人IgG使得細胞存活率與對照相比顯著下降，在24小時后僅有33％細胞仍然活著(圖6)。我們發現在根據Buhmann等(1999)進一步刺激體外細胞時，殺傷速率加快，因此僅在與人抗體培養4小時后，在本發明的所有人樣品和抗體片段中僅剩余24％細胞存活。
14.測定抗-HLA-DR抗體片段的EC50我們證明細胞殺傷試驗中選自HuCAL庫的一些抗-HLA-DR抗體片段形式，與細胞毒性小鼠抗-HLA-DR抗體相比，有很高的的50％有效的有效濃度(EC50)(表6)。
用HLA-DR陽性細胞系PRIESS或LG2(ECACC，Salisbury，UK)估計選自HuCAL的抗-HLA-DR抗體的EC50。2×105個細胞在6％ CO2下37℃，在補充了2.5％熱滅活FBS(Biowhittaker Europe，BE)、2mML-谷氨酰胺、1％非必需氨基酸、1mM丙酮酸鈉和0.1mg/ml卡那霉素和系列稀釋的抗-HLA-DR抗體片段的RPMI 1640(PAA，Germany)中孵育4小時。對于Fab抗體片段的稀釋系列，預先混合，來產生抗-HLA-DR抗體片段的二價組合物。陳述的濃度指二價組合物的濃度，因此可比較IgG和FabEC50值。
在與二價抗體片段37％在6％ CO2下保溫4小時后，用二乙酸熒光素染色，隨后計算剩余活細胞數測定細胞存活率(Current Protocols in Immunology，1997)。用標準統計學軟件、非線性對數回歸曲線擬合重復數據點，對于各抗體估計EC50。
當用抗-FLAG-M2抗體交聯時，選自HuCAL文庫(實施例4)的Fab片段MS-GPC-1、MS-GPC-8和MS-GPC-10顯示小于120nM的EC50，如用單價片段的濃度表達的，對應于二價交聯的(Fab)二聚-抗-Flag M2偶聯物的60nM EC50(圖7a)。當用抗-FLAG M2抗體的交聯抗體時，優化了CDR3區域內的親和力(實施例4)的抗-HLA-DR抗體片段顯示進一步改進的EC50小于50nM，或對于二價交聯抗體為25nM(圖7b)，在CDR1區中額外優化親和力的那些抗體片段顯示小于30nM的EC50(對于二價片段是15nM)。在比較中，同一試驗內細胞毒性小鼠抗-HLa-DR抗體8D1(Vidovic&Toral；1988)和L243(Vidovic等，1995b)的EC50顯示分別大于30和40nM的EC50(圖7c)。
令人驚奇的是，本發明的一些抗體片段的IgG形式顯示與小鼠抗體相比，EC50約增加了1.5個數量級(圖7d)。例如，MS-GPC-8-10-57和MS-GPC-8-27-41的IgG形式顯示分別為1.2和1.2nM的EC50。另外，盡管未對于親和力優化，MS-GPC-8的IgG形式顯示小于10nM的EC50。
如實施例11和12所示，殺死未活化細胞(分別是正常外周B和MHH PreB細胞)的效力很小。在用50nM MS-GPC-8-10-57和MS-GPC-8-27-41的IgG形式處理時，分別在4小時后有78％和83％正常的外周B細胞存活。另外，在僅50nM濃度或IgG，見到幾乎100％的MHH PreB1細胞存活率。事實上，用這些未活化的細胞，使用合理的濃度范圍(0.1-300nm)的本發明的抗-HLA DR抗體片段的IgG或二價交聯的Fab形式，不能實現存活率水平下降到50％以下。因此，這些未活化細胞類型的EC50可以估計成至少比對于未優化的Fab形式所示的高5倍(對于交聯的二價片段EC50約60nM)，比VHCDR3優化的Fab和MS-GPC-8-10-57(約1.2nM)與MS-GPC-8-27-41(約1.2nM)的IgG形式的EC50高分別高至少10倍和100倍(對于交聯的二價片段高約25nM)。
15.細胞殺傷機制上述實施例顯示細胞死亡發生-僅需要一些多價抗-HLA-DR抗體片段導致殺死活化的細胞。不需要進一步的細胞毒性或免疫學機制來導致細胞死亡，因此證明細胞死亡是通過活化細胞的天然的程序化機制介導的。壞死的機制是預先程序化死亡的受到廣泛理解的過程。令我們驚奇的是我們觀察到一些細胞殺傷的特征提示，當與我們的人抗-HLA-DR抗體片段接觸時，活化細胞殺傷的機制不是本領域通常理解的“凋亡”。例如，觀察到的細胞殺傷的速率似乎比凋亡報道的明顯高得多(約10-15小時；Truman等，1994)。進行了兩根實驗，來證明細胞殺傷機制不是凋亡機制。
首先，我們用膜聯蛋白-V-FITC和碘化丙錠(PI)染色技術來辨別凋亡和非凋亡細胞死亡-經歷凋亡的細胞“凋亡細胞”(膜聯蛋白-V陽性/PI陰性)可以與壞死的(“死亡的”)細胞(膜聯蛋白-V陽性/PI陽性)和完全功能性的細胞(膜聯蛋白-V陰性/PI陰性)區分開。用膜聯蛋白V和PI試驗的廠商推薦的方法，在6％ CO2下37℃用或不用200nM抗-HLa-DR抗體片段MS-GPC-8，以及100nM交聯抗-FLAG M2 mAb在補充了2.5％熱滅活的FCS(Biowhittaker Europe，BE)、2mM L-谷氨酰胺、1％非必需氨基酸、1mM丙酮酸鈉和0.1mg/ml卡那霉素的RPMI 1640(PAA，DE)中培養1×106/ml Priess細胞。為了提供作為對照的凋亡細胞，通過在上述培養液中在6％CO2下，37℃，用50微克/ml的與10微克/ml蛋白質-G交聯的凋亡誘導性抗-CD95mAb DX2(BD Pharmingen，Torrey Pine，Ca，USA)誘導1×106/ml Priess細胞進入凋亡。在各孵育時間(1，15和60分鐘，3和5小時)，收集200微升樣品，洗滌2次并用膜聯蛋白-V-FITC(BD Pharmingen，Torrey Pine，Ca，USA)和PI，用膜聯蛋白-V結合緩沖液根據廠商的方法染色。用FACS Calibur(BD ImmunocytometrySystems，San Jose，Ca，USA)分析膜聯蛋白-V-FITC和PI對于每組細胞染色的量。
通過交聯的抗-HLA-DR抗體片段誘導的細胞死亡顯示，與抗-CD95凋亡誘導性抗體或單獨與抗-FLAG M2 mAb孵育的細胞培養物顯著不同的細胞死亡模式。抗-HLA-DR抗體片段/抗-FLAG M2 mAb處理過的細胞的死亡細胞(用膜聯蛋白-V陽性/PI陽性染色測定的)的百分數比抗-CD95或對照細胞增加迅速得多(圖8a)。相反，凋亡細胞(用膜聯蛋白-V陽性/PI陰性染色測定的)百分數對于抗-CD95處理的細胞比交聯抗-HLA-DR片段或對照細胞增加快速得多(圖8b)。
第二，我們用zDEVD-fmk，一種不可逆Caspase-3抑制劑和zVAD-fmk，一種廣譜天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶抑制劑(都來自BioRad，Munich，DE)抑制天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶活性。凋亡的機制的特征是天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶的活性，我們假設如果天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶不是抗-HLA-DR介導的細胞死亡必需的，我們在這些天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶抑制劑存在下應該觀察不到與不存在比較，經歷細胞死亡的細胞存活率的改變。將2×105Priess細胞在37℃，6％ CO2下與系列稀釋的兩種天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶抑制劑(范圍是180μM-10μM)在補充有2.5％熱滅活FBS(Biowhittaker Europe，BE)、2mML-谷氨酰胺、1％非必需氨基酸、1mM丙酮酸鈉和0.1mg/ml卡那霉素的RPMI1640(PAA，DE)中預培養3小時。通過加入200nM人抗-HLA-DR抗體片段MS-GPC-8和100nm交聯的抗-M2 mAb誘導HLA-DR介導的細胞死亡。抗-CD95誘導的凋亡細胞培養物作為抑制劑活性的對照(Drenou等，1999)。在進一步在37℃，6％CO2下孵育后，4和24小時后用臺盼藍染色隨后對未染色細胞進行計數測定細胞存活率。如我們所料，抗-HLA-DR處理的細胞培養物不受天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶抑制劑存在的顯著影響，而通過抗CD-95處理誘導的細胞死亡由于細胞培養物與天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶抑制劑預培養顯著下降。該觀察結果支持我們的猜想，即HLA-DR介導的細胞死亡通過非凋亡機制作用，不依賴于可被zDEVD-fm或zVAD-fmk抑制的天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶。
16.用HLA-DR特異性抗體體內治療癌癥我們證明人組合物的抗原結合域可成功的用作癌癥治療的治療劑。用感興趣的DR+人淋巴瘤或白血病細胞系接種免疫妥協的小鼠，例如scid、裸鼠或Rag-1敲除的小鼠。對于各腫瘤建立腫瘤細胞劑量通常是1×106-1×107/小鼠，測試和皮下(s.c.)或靜脈內(i.v.)給藥。用抗-HLA-DR抗體片段MS-GPC-8、MS-GPC-8-10-57、MS-GPC-8-27-41的IgG形式或其它本發明如上制備的，用1-25mg/kg的劑量經5天靜脈內或皮下處理小鼠。在持續處理后監測抗-HLa-DR處理或對照未處理的小鼠存活達8周。另外通過測量腫瘤表面積定量測定在皮下接種的小鼠中的腫瘤進程。在實驗中觀察到抗-HLa-DR處理的小鼠的存活率達80％，顯著延長，在實驗終點有達50％的小鼠存活。在皮下接種和未處理的小鼠中，腫瘤達到表面積2-3平方厘米，而抗-HLa-DR處理的動物腫瘤表面積明顯小得多。
17.用在IL-2分泌中減少的抗-HLA-DR抗體片段免疫抑制我們驚奇的觀察到本發明的抗-HLa-DR抗體片段在測量不死化的T-細胞IL-2分泌的試驗中顯示充分的免疫調節性質。該抗體片段MS-GPC-8-6-13、MS-GPC-8-10-57和MS-GPc-8-27-41的IgG形式在該試驗中顯示非常強的免疫抑制性質，和亞納摩爾的IC50值，和事實上100％最大抑制(圖9a)。特別令人驚奇的是，甚至本發明的抗體片段單價組合物能強烈抑制該相同試驗中的IL-2分泌。例如VHCDR3選擇的和VLCDR3/VLCDR1優化的抗體片段的Fab形式顯示低一位的nM的IC50，和幾乎100％最大抑制(圖9b)。本發明的其它單價抗-HLA DR抗體片段在該試驗中與對照IgG和Fab片段相比顯示顯著的免疫抑制性(表7)。
通過在半-最大抗原刺激條件下，測定用DR-轉基因抗原遞呈細胞(APC)刺激的雜交瘤細胞系T-Hyb 1的Il-2分泌，調查抗-HLA DR抗體片段的免疫調節性質。用Pharmingen(Torre Pine，CA，USA)的OptiEIA小鼠IL-2試劑盒提供的標準ELISA方法監測和測定IL-2分泌。從未免疫的嵌合0401-IE轉基因小鼠的脾臟中根據標準方法分離APC(Ito等，1996)。在96孔板的含有下列添加劑(全部來自Gibco BRL和PAA)10％FCS、2mM L-谷氨酰胺、1％非必需氨基酸、1mM丙酮酸鈉和0.1g/l卡那霉素的RPMI培養基中加入0.2ml/孔的1.5×105APC。加入最終體積為100微升上述培養液中的200微克/ml最終濃度的雞蛋卵清蛋白，細胞與該抗原在6％ CO2下在37℃培育30分鐘。在各孔中以各種濃度(通常為0.1-200nM)加入抗-HLA DR抗體片段，平板在37℃/6％ CO2下孵育1小時，加入2×105T-Hyb 1細胞，在上述培養基中最終體積為200微升。在孵育24小時后，將100微升上清液轉移到先前用IL-2捕獲抗體(BD Pharmingen，Torrey Pine，Ca，USA)包裹的ELISA平板(Nunc-Immuno Plate MaxiSorp表面，Nunc，Roskilde，DK)上，根據廠商指示，用OptiEIA小鼠IL-2試劑盒定量IL-2量，并用Victor V讀數儀(Wallac，Finland)閱讀平板。用試劑盒提供的IL-2標準將分泌的IL-2標定為pg/ml。
通過將胸腺瘤BW 5147(ATCC)的T-細胞受體陰性變體和來自先前用雞蛋卵清蛋白(Ito等，1996)接種的嵌合體0401-IL轉基因小鼠的淋巴結細胞融合，建立T-細胞雜交瘤系T-Hyb1。選擇克隆T-Hyb1進行試驗，因為它響應抗原特異性刺激，具有高IL-2分泌。
18.用T-細胞增殖測定的HLA-DR特異性抗體免疫抑制在測定T-細胞增殖的第二個試驗中也見到抗-HLA DR抗體片段的免疫調節性質。MS-GPC-8-10-57和MS-GPC-8-27-41的IgG形式抑制T細胞增殖的IC50值分別是11和20nM(圖10)。如下測試抗-HLA-DR抗體片段，來抑制增殖的T細胞對攜帶嵌合的小鼠-人II類轉基因和RA-結合肽結合位點，并缺乏小鼠II型分子的小鼠的抗原引發的淋巴結細胞(Muller等，1990；Woods等，1994；Current Protocolsin Immunology，卷2，7.21；Ito等，1996)。在此，免疫在體內發生，但是抑制和讀數在體外進行。先前產生了表達MHC II型分子和RA聯合分子結合位點的轉基因小鼠，DRB1*0401(Ito等，1996)。這些小鼠缺乏小鼠MHC II型，因此所有Th應答通過一個人RA-關聯的MHC II型分子溝通(Ito等，1996)。這些轉基因小鼠代表了測試人II型拮抗劑的模型。
用嵌合T-細胞和從用標準方法先前接種了雞蛋卵清蛋白(Ito等，1996)嵌合的0401-IE轉基因小鼠(Taconic，USA)的淋巴結分離的抗原遞呈細胞測量的T-細胞增殖，測試抗-HLA-DR抗體片段及其IgG形式的抑制效果。在卵清蛋白(30微克/孔-半最大刺激濃度)和系列稀釋的抗-HLA-DR抗體片段或IgG形式存在下，在含有2mM L-谷氨酰胺和0.1g/l卡那霉素的無血清HL-1培養液中測試，在96孔組織培養板的0.2毫升孔中培養1.5×105細胞3天。在培養的最后16個小時，用3H-甲基-胸腺嘧啶(1μCi/孔)摻入測定抗原特異性增殖(Falcioni等，1999)。收集細胞，用閃爍計數器(TopCount，Wallac，Finland)測定3H摻入。比較含有抗原的對照孔，可以觀察用抗-HLA-DR抗體片段及其IgG形式處理T-細胞的增殖。
19.選擇有用的多肽用于治療癌癥為了選擇最合適的蛋白質/多肽，以進入其它實驗，并評估其用于治療癌癥的治療組合物的適用性，收集其它數據。這些針對抗-HLA抗原抗體片段的IgG形式的數據可以包括結合親和力，用EC50測定的體外殺傷效力，和跨越一套腫瘤細胞系的細胞毒性，體外估計的最大細胞殺傷百分數，和來自體內動物模型的腫瘤減少的數據和小鼠存活數據。
可選擇顯示最高親和力和最低殺傷的EC50，最大百分數細胞殺傷和跨越各種腫瘤細胞系最廣泛，最佳腫瘤減少數據和/或最佳小鼠存活數據的抗HLA-抗原抗體片段的IgG形式進入進一步的實驗。這些實驗可包括例如動物中的治療方案和毒物學和對人的I期臨床試驗。
20.選擇有用的多肽用于治療免疫系統疾病為了選擇最合適的蛋白/多肽進而進一步實驗，和評估其用于治療免疫系統疾病的治療組合物的適合性，收集了其它數據。對于抗-HLA抗原抗體片段的各種單價抗體片段或IgG形式的這些數據可包括親和力、反應性、特異性、IC50-值，用于抑制IL-2分泌和T-細胞增殖，或體外殺傷效力，如體外用EC50和最大百分數細胞殺傷估計的，和移植排斥和移植物抗宿主疾病的DR-轉基因模型。
可選擇顯示最低EC50，最高親和力，最佳特異性和/或最大抑制T-細胞增殖或IL-2分泌，和在合適模型中的抑制移植排斥和/或移植物對宿主疾病的高效力的抗HLA-抗原抗體片段的IgG形式進入進一步的實驗。這些實驗可包括例如動物中的治療方案和毒物學和對人的I期臨床試驗。
表1HLA-DR-特異性多肽的VH和VL家族、VL CDR1和VH/VL CDR3序列
表2
a)MS-GPC-8的親和力數據是基于8種不同的Fab制備物，在4種不同的芯片上測定(2×500，1000，4000RU)b)顯示了對于MS-GPC-8-6，3種不同芯片上3種不同制備物的平均和標準偏差(500，4000，3000RU)。
c)將3000RU MHCII固定在CM5芯片上。對于每次測定，在表面注射1μM-16nM的7種不同濃度。分離時間15秒、用6微升10mM的甘氨酸，pH2.3，然后用8微升7.5mM NaOH實現再生。顯示4種對于MS-GPC-8-6-19平均和標準偏差，而對于其它顯示3種不同的制備物的平均和標準偏差。
d)在3種不同芯片上測定了一種蛋白制備物(3000，2800和6500RU)。
e)成熟的MHCII結合物在4000RU密度的芯片上的親和力測定；一次測定。
分子量在尺寸排阻層析后測定，發現100％單體具有45-48kDa之間的正確分子量。
表3a從Fab選擇的IgG4單克隆抗體的親和力。誤差代表標準偏差。
表3bCDR3重鏈優化后通過CDR1輕鏈優化的親和力成熟獲得的結合物親和力。誤差代表標準偏差。
表3cGPC8通過CDR3輕鏈優化親和力成熟獲得的結合物
芯片密度4000RU MHCIIa)對于MS-GPC-8，顯示了3種不同芯片(500，4000，3000RU)上3種不同制備物的平均和標準偏差。
表3d在scFv形式及其轉化的Fab中HuCAL獲得的結合物。
芯片密度500RU MHCIIa)MS-GPC-8的親和力數據基于8種不同Fab制備物，它們在4種不同芯片(2×500，4000，3000RU)上測定，與標準偏差一起顯示。
表4細胞與交聯抗-HLA-DR抗體片段孵育4小時后的殺傷效力，以及孵育24小時后的最大殺傷。
表5人組合物的抗-HLA-DR IgG抗體與小鼠抗-HLA-DR抗體針對一組淋巴瘤腫瘤細胞系的殺傷效率。
％殺傷用200nM小鼠或50nM人mAb37℃處理4小時后的100-％存活細胞。
表6本發明的一些抗-HLA-DR抗體片段在針對淋巴瘤細胞的細胞殺傷試驗中的EC50值。所有EC50指交聯的Fab和IgG形式可比較的二價因子(IgG或交聯Fab)的納摩爾濃度。
表7在測定T-Hyb1細胞的抗原特異性刺激后IL-2分泌的試驗中，本發明的一些抗-HLA-DR抗體片段的IC50值。IgG形式(二價)的IC50表示成摩爾濃度，而為了提供方便的比較，Fab形式(單價)的IC50表示成Fab濃度的一半，使得能直接與IgG形式比較。
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權利要求
1.一種含有多肽的組合物，其特征在于，該多肽含有基于抗體的人組合物的抗原結合域，具有對細胞表面上表達的一種抗原的結合特異性，其中用具有兩種或多種所述抗原結合域的多價多肽處理表達所述抗原的細胞，導致或引起所述細胞殺傷，所述殺傷不需要細胞毒性或免疫學機制。
2.一種含有多肽的組合物，其特征在于，該多肽含有基于抗體的與人HLA DR抗原以1μM或以下的Kd結合的抗原結合域，其中用具有兩種或多種所述抗原結合域的多價多肽處理表達所述抗原的細胞，導致或引起所述細胞殺傷，所述殺傷不需要細胞毒性或免疫學機制。
3.一種含有多價多肽的組合物，其特征在于，該多價多肽含有多個基于抗體的對人HLA DR具有結合特異性的抗原結合域，其中用所述多價多肽處理表達HLA DR的細胞，導致或引起所述細胞殺傷，所述殺傷不需要細胞毒性或免疫學機制，其中所述抗原結合域單獨以1μM或以下的Kd與人HLA DR結合。
4.一種含有多肽的組合物，其特征在于，該多肽含有多個基于抗體的對人HLADR具有結合特異性的抗原結合域，其中用所述多價多肽處理表達HLA DR的細胞，導致或引起所述細胞殺傷，所述殺傷不需要細胞毒性或免疫學機制，其中所述多價多肽以100nm或以下的EC50殺傷活化的淋巴細胞。
5.一種含有多價多肽的組合物，其特征在于，該多肽含有至少一個基于抗體的與人HLA DR抗原以1μM或以下的Kd結合的抗原結合域，所述抗原結合域是通過包括從重組抗體文庫用與人HLA DR至少一個表位結合的能力分離出VL和VH結構域的方法分離的，其中用具有兩個或多個所述抗原結合域的多價多肽處理表達HLA DR的細胞，導致或引起所述細胞殺傷，所述殺傷不需要細胞毒性或免疫學機制。
6.如權利要求5所述的組合物，其特征在于，分離抗原結合域的方法還包括步驟a.產生VL和VH結構域之一或兩者的CDR1、CDR2和CDR3序列中至少一個的變體文庫，和b.用與人HLA DR以1μM或以下的Kd結合的能力從變體文庫中分離出VL和VH結構域。
7.如權利要求1-6任一所述的組合物，其特征在于，所述多價多肽殺傷轉化細胞的EC50比殺傷正常細胞的EC50低至少5倍。
8.如權利要求1-6任一所述的組合物，其特征在于，所述多價多肽殺傷活化的細胞的EC50比殺傷未活化的細胞的EC50低至少5倍。
9.如權利要求1-6任一所述的組合物，其特征在于，所述多價多肽以50nM或以下的EC50殺傷轉化的細胞。
10.如權利要求1-6任一所述的組合物，其特征在于，所述多價多肽以10nM或以下的EC50殺傷淋巴瘤細胞。
11.如權利要求1-6或8任一所述的組合物，其特征在于，所述多價多肽殺傷活化的淋巴細胞。
12.如權利要求11所述的組合物，其特征在于，所述活化的淋巴細胞是淋巴瘤細胞，代表選自B細胞非霍奇金氏淋巴瘤、B細胞淋巴瘤、B細胞急性淋巴白血病、Burkitt淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、毛細胞白血病、急性骨髓性白血病、T-細胞淋巴瘤、T-細胞非霍奇金氏淋巴瘤、慢性骨髓性白血病、慢性淋巴白血病和多發性骨髓性白血病的疾病。
13.如權利要求11所述的組合物，其特征在于，所述活化的淋巴細胞是選自Priess、GRANTA-519、KARPAS-422、KARPAS-299、DOHH-2、SR-786、MHH-CALL-4、MN-60、BJAB、RAJI、L-428、HDLM-2、HD-MY-Z、KM-H2、L1236、BONNA-12、HC-1、NALM-1、L-363、EOL-1、LP-1、RPMI-8226和MHH-PREB-1細胞系的細胞系。
14.如權利要求1-6任一所述的組合物，其特征在于，所述多價多肽以100nM或以下的EC50殺死選自KARPAS-422、DOHH-2、SR-7、MHH-CALL-4、MN-60、HD-MY-Z、NALM-1和LP-1的至少一種淋巴瘤細胞系的細胞。
15.如權利要求1-6任一所述的組合物，其特征在于，所述多價多肽以50nM或以下的EC50殺死選自KARPAS-422、DOHH-2、MN-60、NALM-1和LP-1的至少一種淋巴瘤細胞系的細胞。
16.如權利要求1-6任一所述的組合物，其特征在于，所述多價多肽以50nM或以下的EC50殺死選自LG2和PRIESS的至少一種B細胞淋巴母細胞細胞系的細胞。
17.如權利要求1-6任一所述的組合物，其特征在于，所述細胞是表達MHC II型分子的非淋巴細胞。
18.如權利要求1-6任一所述的組合物，其特征在于，所述抗原結合域與HLA-DR的β鏈結合。
19.如權利要求18所述的組合物，其特征在于，所述抗原結合域與HLA-DR的β鏈的第一個結構域結合。
20.如權利要求1-6任一所述的組合物，其特征在于，所述抗原結合域與一種或多種選自DR1-0101、DR2-15021、DR3-0301、DR4Dw4-0401、DR4Dw10-0402、DR4Dw14-0404、DR6-1302、DR6-1401、DR8-8031、DR9-9012、DRw53-B4*0101和DRw52-B3*0101的HLA-DR型結合。
21.如權利要求20所述的組合物，其特征在于，所述抗原結合域與至少5種不同的所述HLA DR類型結合。
22.如權利要求1-6任一所述的組合物，其特征在于，所述抗原結合域包括VH和VL結構域的組合，其中所述組合可在MS-GPC-1、MS-GPC-6、MS-GPC-8、MS-GPC-10、MS-GPC-8-1、MS-GPC-8-6、MS-GPC-8-9、MS-GPC-8-10、MS-GPC-8-17、MS-GPC-8-18、MS-GPC-8-27、MS-GPC-8-6-2、MS-GPC-8-6-19、MS-GPC-8-6-27、MS-GPC-8-6-45、MS-GPC-8-6-13、MS-GPC-8-6-47、MS-GPC-8-10-57、MS-GPC-8-27-7、MS-GPC-8-27-10和MS-GPC-8-27-41的克隆之一中找到。
23.如權利要求1-6任一所述的組合物，其特征在于，所述抗原結合域包括HuCAL VH2和HuCAL Vλ1的組合，其中VH CR3、VL CDR1和VL CDR3在MS-GPC-1、MS-GPC-8、MS-GPC-10、MS-GPC-8-1、MS-GPC-8-6、MS-GPC-8-9、MS-GPC-8-10、MS-GPC-8-17、MS-GPC-8-18、MS-GPC-8-27、MS-GPC-8-6-2、MS-GPC-8-6-19、MS-GPC-8-6-27、MS-GPC-8-6-45、MS-GPC-8-6-13、MS-GPC-8-6-47、MS-GPC-8-10-57、MS-GPC-8-27-7、MS-GPC-8-27-10和MS-GPC-8-27-41的克隆之一中找到。
24.如權利要求1-23任一所述的組合物，其特征在于，所述抗原結合域包括HuCAL VH2和HuCAL Vλ1的組合，其中VH CDR3序列選自共有CDR3序列nnnnRGnFDn其中每個n分別代表任何氨基酸殘基；和/或其中VL CDR3選自共有CDR3序列QSYDnnnn其中每個n分別代表任何氨基酸殘基。
25.如權利要求24所述的組合物，其特征在于，所述VH CDR3序列是SPRYGAFDY和/或VL CDR3序列是QSYDLIRH或QSYDMNVH。
26.如權利要求1-23任一所述的組合物，其特征在于，所述抗原結合域與包括HuCAL VH2和HuCAL Vλ1組合的抗體競爭抗原結合，其中VH CDR3序列選自共有CDR3序列nnnnRGnFDn每個n分別代表任何氨基酸殘基；和/或VL CDR3選自共有CDR3序列QSYDnnnn每個n分別代表任何氨基酸殘基。
27.如權利要求21所述的組合物，其特征在于，VH CDR3序列是SPRYGAFDY和/或VL CDR3序列是QSYDLIRH或QSYDMNVH。
28.如權利要求1-27任一所述的組合物，其特征在于，所述基于抗體的抗原結合域包括用下列通式代表的VL CDR1序列SGSnnNIGnNYVn其中每個n分別代表任何氨基酸殘基。
29.如權利要求28所述的組合物，其特征在于，所述CDR1序列是SGSESNIGNNYVQ。
30.如權利要求1-29任一所述的組合物，其特征在于，所述殺傷是由所述細胞的天然的預編程的過程介導的。
31.如權利要求30所述的組合物，其特征在于，所述殺傷是非凋亡性的。
32.如權利要求30所述的組合物，其特征在于，所述殺傷依賴于天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶，和/或其中所述殺傷不被zVAD-fmk或zDEVD-fmk抑制。
33.如權利要求1-32任一所述的組合物，其特征在于，所述基于抗體的抗原結合域是含有至少一個F(ab′)2抗體片段或小抗體片段的多價多肽的部分。
34.如權利要求1-32任一所述的組合物，其特征在于，所述基于抗體的抗原結合域是含有選自Fv、scFv、dsFv、Fab片段的至少兩個單價抗體片段的多價多肽的部分，還含有一個或多個交聯部分。
35.如權利要求1-32任一所述的組合物，其特征在于，所述基于抗體的抗原結合域是含有選自IgG1、2a、2b、3、4、IgA和IgM家族的抗體的至少一種完整抗體的多價多肽的部分。
36.如權利要求1-32任一所述的組合物，其特征在于，所述基于抗體的抗原結合域是在與細胞結合前形成的多價多肽的部分。
37.如權利要求1-32任一所述的組合物，其特征在于，所述基于抗體的抗原結合域是在與細胞結合后形成的多價多肽的部分。
38.如權利要求3或4所述的組合物，其特征在于，所述抗原結合位點與聚合物交聯。
39.一種核酸，其特征在于，該核酸是權利要求1-32中任一所包含的抗原結合域或其多價多肽的蛋白質編碼序列。
40.一種載體，其含有權利要求39所述的核酸和與其可操縱性連接的轉錄調節序列。
41.一種攜帶權利要求39所述的核酸或權利要求40所述的載體中的至少一個的宿主細胞。
42.一種產生含有導致或引起細胞殺傷，所述殺傷不需要細胞毒性或免疫學機制的組合物的方法，其特征在于，該方法包括在核酸表達成多價多肽或含有至少一個抗原結合域，所述抗原結合域隨后被加工形成多價多肽組合物的多肽的條件下，培養權利要求41所述的細胞。
43.如權利要求1-38任一所述的組合物，其特征在于，該組合物配制在藥物可接受的載體和/或稀釋劑中。
44.權利要求1-38任一所述的組合物用于制備治療動物的藥物制劑的用途。
45.權利要求39所述的核酸用于制備治療動物的藥物制劑的用途。
46.權利要求41所述的宿主細胞用于制備治療動物的藥物制劑的用途。
47.權利要求42所述方法用于制備治療動物的藥物制劑的用途。
48.如權利要求44-47所述的用途，其特征在于，所述動物是人。
49.如權利要求44-48所述的用途，其特征在于，用于治療細胞增殖性疾病，其中所述基于抗體的抗原結合域是多價多肽的部分。
50.如權利要求49所述的用途，其特征在于，所述治療是治療與表達MHC II型抗原的轉化的細胞有關的疾病。
51.如權利要求49或50所述的用途，其特征在于，所述治療是治療選自B細胞非霍奇金氏淋巴瘤、B細胞淋巴瘤、B細胞急性淋巴白血病、Burkitt淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、毛細胞白血病、急性骨髓性白血病、T-細胞淋巴瘤、T-細胞非霍奇金氏淋巴瘤、慢性骨髓性白血病、慢性淋巴白血病和多發性骨髓性白血病的疾病。
52.如權利要求44-48任一所述的用途，其特征在于，所述治療是治療與不良活化免疫系統的細胞，例如表達MHC II型的淋巴細胞有關的疾病。
53.如權利要求44-48任一所述的用途，其特征在于，所述治療是治療選自類風濕性關節炎、幼年期關節炎、多發性硬化、Grave氏病、胰島素依賴性糖尿病、發作性睡病、牛皮癬、系統性紅斑狼瘡、強直性脊柱炎、移植排斥，移植物抗宿主病、Hashimoto氏病、重癥肌無力、慢性天皰瘡、腎小球腎炎、甲狀腺炎、胰腺炎、胰島炎、原發性膽汁性肝硬化、刺激性腸病和Sjogren綜合征的疾病。
54.如權利要求44-48任一所述的用途，其特征在于，所述疾病選自重癥肌無力、類風濕性關節炎、多發性硬化、移植排斥和移植物抗宿主病。
55.一種含有權利要求1-38任一所述的組合物的診斷組合物。
56.一種含有權利要求1-38任一所述的組合物和一種或多種交聯部分的診斷組合物。
57.一種殺死在所述細胞表面表達抗原的細胞的方法，其特征在于，該方法包括步驟用多個權利要求1-38任一所述的抗原結合域處理細胞，其中所述基于抗體的抗原結合域是多價多肽的部分，其中不需要細胞毒性或免疫學機制導致或引起所述殺傷。
58.一種鑒定能用配制在藥物學上可接受的載體和/或稀釋劑中的權利要求1-38任一所述的組合物治療的病人的方法，其特征在于，該方法包括步驟a.從病人分離細胞；b.使所述細胞與權利要求1-38任一所述的組合物接觸；和c.測定所述細胞殺傷或免疫抑制的程度。
59.一種鑒定可用配制在藥物學上可接受的載體和/或稀釋劑的權利要求1-38任一所述的組合物治療的病人的試劑盒，其特征在于，該試劑盒含有a.權利要求1-38任一所述的組合物；和b.測定所述細胞殺傷或免疫抑制的程度的工具。
60.一種試劑盒，其特征在于，該試劑盒含有a.權利要求1-38任一所述的組合物，和b.一種交聯部分。
61.一種試劑盒，其特征在于，該試劑盒含有a.權利要求1-38任一所述的組合物，和b.一種或多種可檢測分子，和c.影響和/或檢測(i)與抗原的結合的試劑和/或溶液。
62.一種細胞毒性組合物，其特征在于，該組合物含有與細胞毒性劑可操縱性連接的權利要求1-38任一所述的組合物。
63.一種免疫學組合物，其特征在于，該組合物含有與免疫原性劑可操縱性連接的權利要求1-38任一所述的組合物。
64.一種殺傷細胞的方法，其特征在于，該方法包括使所述細胞接觸與細胞毒性或免疫原性劑可操縱性連接的權利要求1-38任一所述的組合物。
65.與細胞毒性或免疫原性劑可操縱性連接的權利要求1-38任一所述的組合物用于制備治療動物的藥物制劑的用途。
66.一種含有多肽的組合物，其特征在于，該多肽含有至少一個基于抗體的的抗原結合域，所述抗原結合域具有與人MHC II型抗原1μM或以下的Kd結合的結合特異性，其中用所述多肽處理表達所述抗原的細胞，導致或引起免疫應答的抑制。
67.一種組合物，其含有多肽，該多肽是基于至少一種抗體的對人HLA DR抗原具有結合特異性的抗原結合域，其中用所述多肽處理表達HLA DR的細胞導致或引起免疫應答的抑制，其中所述抗原結合域包括VH結構域和VL結構域的組合，其中所述組合可在選自MS-GPC-1、MS-GPC-6、MS-GPC-8、MS-GPC-10、MS-GPC-8-1、MS-GPC-8-6、MS-GPC-8-9、MS-GPC-8-10、MS-GPC-8-17、MS-GPC-8-18、MS-GPC-8-27、MS-GPC-8-6-2、MS-GPC-8-6-19、MS-GPC-8-6-27、MS-GPC-8-6-45、MS-GPC-8-6-13、MS-GPC-8-6-47、MS-GPC-8-10-57、MS-GPC-8-27-7、MS-GPC-8-27-10和MS-GPC-8-27-41的克隆之一中找到。
68.一種含有多肽的組合物，其特征在于，該多肽含有至少一個基于抗體的抗原結合域，所述抗原結合域具有與人MHC II型抗原以1μM或以下的Kd結合的結合特異性，所述抗原結合域是通過包括從重組抗體文庫用與人MHC II型抗原的至少一個表位結合的能力分離出VL和VH結構域的方法分離的，其中用所述多肽處理表達MHC II型抗原的細胞，導致或引起免疫應答的抑制。
69.如權利要求68所述的組合物，其特征在于，分離抗原結合域的方法還包括步驟a.產生VL和VH結合域之一或兩者的CDR1、CDR2和CDR3序列中至少一個的變體文庫，和b.用與人MHC II型家族抗原以1μM或以下的Kd結合的能力從變體文庫中分離出VL和VH結構域；c.可任選的，用至少一種另外的CDR1、CDR2和CDR3序列重復步驟(a)和(b)。
70.如權利要求67、68和69任一所述的組合物，其特征在于，所述抗原結合域與HLA-DR結合。
71.如權利要求66或70任一所述的組合物，其特征在于，所述抗原結合域與HLA-DR的β鏈結合。
72.如權利要求71所述的組合物，其特征在于，所述抗原結合域與HLA-DR的β鏈的第一個結構域的表位結合。
73.如權利要求66-72任一所述的組合物，其特征在于，所述細胞是淋巴細胞。
74.如權利要求66-72任一所述的組合物，其特征在于，所述細胞是非淋巴細胞，并表達MHCII型抗原。
75.如權利要求66-74任一所述的組合物，其特征在于，該組合物具有1μM或以下的抑制免疫應答的IC50。
76.如權利要求66-74任一所述的組合物，其特征在于，該組合物具有1μM或以下的抑制IL-2分泌的IC50。
77.如權利要求66-74任一所述的組合物，其特征在于，該組合物具有1μM或以下的抑制免T細胞增殖的IC50。
78.如權利要求66-77任一所述的組合物，其特征在于，所述抗原結合域與一種或多種選自DR1-0101、DR2-15021、DR3-0301、DR4Dw4-0401、DR4Dw10-0402、DR4Dw14-0404、DR6-1302、DR6-1401、DR8-8031、DR9-9012、DRw53-B4*0101和DRw52-B3*0101的HLA-DR型結合。
79.如權利要求78所述的組合物，其特征在于，所述抗原結合域與至少5種不同的所述HLA-DR類型結合。
80.如權利要求66-79任一所述的組合物，其特征在于，所述抗原結合域包括VH結構域和VL結構域的組合，其中所述組合可在MS-GPC-1、MS-GPC-6、MS-GPC-8、MS-GPC-10、MS-GPC-8-1、MS-GPC-8-6、MS-GPC-8-9、MS-GPC-8-10、MS-GPC-8-17、MS-GPC-8-18、MS-GPC-8-27、MS-GPC-8-6-2、MS-GPC-8-6-19、MS-GPC-8-6-27、MS-GPC-8-6-45、MS-GPC-8-6-13、MS-GPC-8-6-47、MS-GPC-8-10-57、MS-GPC-8-27-7、MS-GPC-8-27-10和MS-GPC-8-27-41的克隆之一中找到。
81.如權利要求66-77任一所述的組合物，其特征在于，所述抗原結合域包括HuCAL VH2和HuCAL Vλ1的組合，其中VH CDR3、VL CDR1和VL CDR3在選自MS-GPC-1、MS-GPC-6、MS-GPC-8、MS-GPC-10、MS-GPC-8-1、MS-GPC-8-6、MS-GPC-8-9、MS-GPC-8-10、MS-GPC-8-17、MS-GPC-8-18、MS-GPC-8-27、MS-GPC-8-6-2、MS-GPC-8-6-19、MS-GPC-8-6-27、MS-GPC-8-6-45、MS-GPC-8-6-13、MS-GPC-8-6-47、MS-GPC-8-10-57、MS-GPC-8-27-7、MS-GPC-8-27-10和MS-GPC-8-27-41的克隆之一中找到。
82.如權利要求66-77任一所述的組合物，其特征在于，所述抗原結合域包括HuCAL VH2和HuCAL Vλ1的組合，其中VH CDR3序列選自共有CDR3序列nnnnRGnFDn其中每個n分別代表任何氨基酸殘基；和/或其中VL CDR3選自共有CDR3序列QSYDnnnn其中每個n分別代表任何氨基酸殘基。
83.如權利要求82所述的組合物，其特征在于，所述VH CDR3序列是SPRYGAFDY和/或VL CDR3序列是QSYDLIRH或QSYDMNVH。
84.如權利要求66-77任一所述的組合物，其特征在于，所述抗原結合域與包括HuCAL VH2和HuCAL Vλ1組合的抗體競爭抗原結合，其中VH CDR3序列選自共有CDR3序列nnnnRGnFDn每個n分別代表任何氨基酸殘基；和/或VL CDR3選自共有CDR3序列QSYDnnnn每個n分別代表任何氨基酸殘基。
85.如權利要求84所述的組合物，其特征在于，VH CDR3序列是SPRYGAFDY和/或VL CDR3序列是QSYDLIRH或QSYDMNVH。
86.如權利要求66-85任一所述的組合物，其特征在于，所述抗原結合域包括用下列通式代表的VL CDR1序列SGSnnNIGnNYVn其中每個n分別代表任何氨基酸殘基。
87.如權利要求86所述的組合物，其特征在于，所述CDR1序列是SGSESNIGNNYVQ。
88.如權利要求66-85任一所述的組合物，其特征在于，所述免疫應答的抑制是由在所述細胞表面表達的所述抗原表達的下調引起或表現的。
89.如權利要求66-85任一所述的組合物，其特征在于，所述免疫應答的抑制是由抑制所述細胞和其它細胞之間的作用引起或表現，其中所述作用通常導致免疫應答。
90.如權利要求66-85任一所述的組合物，其特征在于，所述免疫應答的抑制是由殺傷所述細胞引起或表現的。
91.如權利要求90所述的組合物，其特征在于，所述殺傷是通過多種抗原結合域的結合介導的，其中所述基于抗體的抗原結合域是多價多肽的部分，其中，不需要細胞毒性物質或免疫學機制來導致或引起所述殺傷。
92.如權利要求66-91任一所述的組合物，其特征在于，該組合物配制在藥物可接受的載體和/或稀釋劑中。
93.一種藥物制劑，其含有量足夠抑制動物中的免疫應答的權利要求75所述的組合物。
94.一種藥物制劑，其含有量足夠抑制動物中IL-2分泌的權利要求76所述的組合物。
95.一種藥物制劑，其含有量足夠抑制動物中T細胞增殖的權利要求76所述的組合物。
96.權利要求66-91任一所述的組合物用于制備治療動物的藥物制劑的用途，其中所述動物是人。
97.一種核酸，其含有權利要求66-91任一所述的組合物的多肽的蛋白質編碼序列。
98.一種載體，其含有權利要求97所述的核酸和與其可操縱性連接的轉錄調節序列。
99.一種攜帶權利要求97所述的核酸或權利要求98所述的載體的宿主細胞。
100.一種產生免疫抑制組合物的方法，該方法包括在表達核酸的條件下培養權利要求99所述的細胞。
101.一種抑制例如表達HLA DR的免疫系統的細胞活化的方法，其包括用權利要求66-92任一所述的組合物處理細胞。
102.一種抑制例如表達HLA DR的免疫系統的細胞增殖的方法，其包括用權利要求66-92任一所述的組合物處理細胞。
103.一種抑制例如表達HLA DR的免疫系統的細胞分泌IL-2的方法，其包括用權利要求66-92任一所述的組合物處理細胞。
104.一種免疫抑制病人的方法，其包括對病人施用權利要求66-92任一所述的有效量的組合物，來降低病人的免疫應答水平。
105.一種殺死在所述細胞表面表達抗原的細胞的方法，其包括步驟用權利要求66-87任一所述的多種抗原結合域處理細胞，其中所述基于抗體的抗原結合域是多價多肽的部分，其中不需要細胞毒性物質或免疫學機制導致或引起所述殺傷，所述抗原是HLA DR。
106.如權利要求96所述的用途，其特征在于，所述治療是治療選自類風濕性關節炎、幼年期關節炎、多發性硬化、Grave氏病、胰島素依賴性糖尿病、發作性睡病、牛皮癬、系統性紅斑狼瘡、強直性脊柱炎、移植排斥，移植物抗宿主病、Hashimoto氏病、重癥肌無力、慢性天皰瘡、腎小球腎炎、甲狀腺炎、胰腺炎、胰島炎、原發性膽汁性肝硬化、刺激性腸病和Sjogren綜合征的疾病。
107.如權利要求96所述的用途，其特征在于，所述治療是治療選自重癥肌無力、類風濕性關節炎、多發性硬化、移植排斥和移植物抗宿主病的疾病。
108.一種抑制免疫系統的細胞和另一種細胞相互作用的方法，其包括使細胞接觸權利要求66-92任一所述的組合物。
109.一種進行藥物商業活動的方法，其特征在于，該方法包括(i)分離一種或多種抗原結合域，這些抗原結合域與人細胞表面表達的抗原結合；(ii)產生多價組合物，例如多價多肽，它含有多個所述抗原結合域，其中多價組合物以50nM或以下的EC50殺傷表達所述抗原的轉化或活化的細胞，其中不需要細胞毒性或免疫學機制來導致或引起所述殺傷；(iii)進行多價組合物在動物中效力和毒性的測量；(iv)制備描述所述組合物免疫抑制治療用途的包裝插頁；和(v)出售所述多價組合物用于治療增殖疾病。
110.一種進行生命科學商業活動的方法，其包括(i)分離一種或多種抗原結合域，這些抗原結合域與人細胞表面的抗原結合；(ii)產生含有多種所述抗原結合域的多價組合物，例如多價多肽，產生多價組合物，例如多價多肽，它含有多種所述多價多肽，其中多價組合物以50nM或以下的EC50殺傷表達所述抗原的轉化或活化的細胞，所述殺傷不需要細胞毒性或免疫學機制；(iii)對第三方授權，與第三方共同開發或出售給第三方出售所述組合物的權利。
111.如權利要求109或110所述的方法，其特征在于，用一種方法分離抗原結合域，包括a.從重組抗體文庫用與HLA DR結合的能力分離人組合物的VL和VH結構域，b.產生VL和VH結構域之一或兩者的CDR1、CDR2和CDR3序列中至少一個的變體文庫，和c.從變體文庫用與HLA DR以1μM或以下的Kd結合的能力分離VL和VH結構域。
112.一種進行藥物商業活動的方法，其特征在于(i)分離一種或多種抗原結合域，這些抗原結合域與人細胞表面表達的MHC II型以1μM或以下的Kd結合；(ii)產生含有所述抗原結合域的組合物，該組合物是具有100nM或以下的IC50的免疫抑制劑；(iii)進行所述組合物在動物中效力和毒性的測量；(iv)制備描述所述組合物免疫抑制治療用途的包裝插頁；和(v)出售所述組合物用作免疫調節劑。
113.一種進行生命科學商業活動的方法，其包括(i)分離一種或多種抗原結合域，這些抗原結合域以1μM或以下的Kd與人細胞表面的MHC II型結合；(ii)產生含有所述抗原結合域的組合物，組合物是具有100nM或以下的IC50的免疫抑制劑；(iii)對第三方授權，與第三方共同開發或出售給第三方出售所述組合物的權利。
114.如權利要求112或113所述的方法，其特征在于，用一種方法分離基于抗體的抗原結合域，包括a.從重組抗體文庫用與HLA DR結合的能力分離人組合物的VL和VH結構域，b.產生VL和VH結構域之一或兩者的CDR1、CDR2和CDR3序列至少一個的變體文庫，和c.從變體文庫用與HLA DR以1μM或以下的Kd結合的能力分離VL和VH結構域。
115.如權利要求109-114任一所述的方法，其特征在于，所述抗原結合域包括VH和VL結構域的組合，其中所述組合可在MS-GPC-1、MS-GPC-6、MS-GPC-8、MS-GPC-10、MS-GPC-8-1、MS-GPC-8-6、MS-GPC-8-9、MS-GPC-8-10、MS-GPC-8-17、MS-GPC-8-18、MS-GPC-8-27、MS-GPC-8-6-2、MS-GPC-8-6-19、MS-GPC-8-6-27、MS-GPC-8-6-45、MS-GPC-8-6-13、MS-GPC-8-6-47、MS-GPC-8-10-57、MS-GPC-8-27-7、MS-GPC-8-27-10和MS-GPC-8-27-41的克隆之一中找到。
全文摘要
本發明涉及與細胞表面表位結合，和以多價形式導致或引起細胞(包括淋巴瘤細胞)殺傷的多肽組合物，和在單價形式下，導致免疫抑制或移植淋巴細胞活化的多肽組合物。本發明還涉及編碼該多肽的核酸，產生多肽的方法，殺傷細胞的方法，免疫抑制病人的方法，含有多肽的藥物、診斷和多價組合物和試劑盒以及多肽的用途。
文檔編號A61P25/00GK1607959SQ01809346
公開日2005年4月20日 申請日期2001年5月14日 優先權日2000年5月12日
發明者Z·納吉, C·布魯納, M·特薩日, E·托馬森-沃爾夫 申請人:Gpc生物技術股份公司, 莫弗西斯股份公司