專利名稱：調節細胞增生的新化合物的制作方法
技術領域：
本發明涉及可用于治療各種細胞增生性疾病如惡性腫瘤的新化合物。
背景技術：
大量生長因子可以調節細胞的增殖和分化。有害細胞的產生是由于包括生長因子或其信號通道成分不規則表達逐步發展的結果。由受體、胞質激酶和核激酶所激發的并且由磷酸酯酶所調節的酪氨酸磷酸化是這些過程的中心。蛋白質酪氨酸激酶的突變、超活化、易位和過量表達都是與腫瘤發生有關的。除了增加增殖速率和無限增殖細胞外，酪氨酸激酶的過量表達會造成形態上的轉化并引起貼壁不依賴，它對遷移能力和轉移的可能性誘發起促進作用。
一些具有基于ATP或磷酸酪氨酸相似結構的化合物已顯示出是有效的激酶抑制劑。這些基于磷酸酪氨酸的化合物已被證實是更為特異性的酪氨酸激酶抑制劑。由于這些化合物抑制酪氨酸磷酸化作用的能力，所以它們可以改變細胞對生長因子或其他由酪氨酸激酶活性所驅動的其他過程的反應，這些過程包括由于酪氨酸激酶過量表達、突變或易位造成的不規則生長。對在增殖信號通道或在調節細胞骨架結構的通道中起主要作用的酪氨酸激酶的抑制足以將癌細胞從增殖循環中轉換到程序性細胞死亡或細胞凋亡。由編程性細胞死亡引起的死亡經常可以在用酪氨酸激酶抑制劑有效治療中觀察到。
對特定酪氨酸激酶的選擇性抑制提供了一種具有高度特異性的和對正常生長細胞和組織毒性最小的靶向癌細胞生長的方法。這樣，酪氨酸激酶的特異性抑制劑在臨床抗癌治療中具有巨大潛力。現在已經鑒別出許多起酪氨酸激酶抑制劑作用的小分子。例如一些苯基丙烯腈化合物已被公開作有效抑制細胞增殖的酪氨酸激酶抑制劑(例如參見US5,891,917，US5,217,999，US5,773,476，US5,935,993，US5,656,655，US5,677,329和US5,789,427)。
對酪氨酸激酶的抑制提供了一種抑制細胞增殖的機理。本領域普通技術人員會想到其他抑制機理也可以包括其中。
本領域存在一種鑒別可抑制細胞增殖的化合物的需求。
發明內容
現在已經鑒別出可抑制異常細胞增殖如癌細胞生長的許多新化合物。這些化合物不抑制正常細胞的生長。
所以，本發明包括通式I的化合物及其鹽、溶劑化物和水合物 其中R1和R2獨立地選自H、OH、C1-6烷基、C1-6烷氧基、NH2、NH-C1-6烷基、N(C1-6烷基)(C1-6烷基)、SH、S-C1-6烷基、O-Si(C1-6烷基)(C1-6烷基)(C1-6烷基)、NO2、CF3、OCF3和鹵素；R3選自H、OH、C1-6烷基、C1-6烷氧基、NH2、NH-C1-6烷基、N(C1-6烷基)(C1-6烷基)、SH、S-C1-6烷基、O-Si(C1-6烷基)(C1-6烷基)(C1-6烷基)、NO2、鹵素和CH2-S-(CH2)nAr；R4選自C(X)R5、SO3Ar、NH2、NH-C1-6烷基、N(C1-6烷基)(C1-6烷基)、P(O)(OH)2、P(O)(OC1-6烷基)2和C(NH2)＝C(CN)2；X選自于O、S、NH和N-C1-6烷基；R5選自NH2、OH、NH(CH2)pAr、NH(CH2)pOH、(CH2)pOC1-6烷基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、NHNH2、NHC(O)NH2、NHC(O)C1-6烷氧基、N-嗎啉基和N-吡咯烷基；并且Ar是用1-4個取代基取代的或沒有被取代的芳基或雜芳基，其中取代基獨立地選自OH、C1-6烷基、C1-6烷氧基、NH2、NH-C1-6烷基、N(C1-6烷基)(C1-6烷基)、SH、S-C1-6烷基、NO2、CF3、OCF3和鹵素；
n是0到4；并且p是1-4。
本發明還包括通式II的化合物及其鹽、溶劑化鹽和水合物 其中R1和R2獨立地選自H、OH、C1-6烷基、C1-6烷氧基、NH2、NH-C1-6烷基、N(C1-6烷基)(C1-6烷基)、SH、S-C1-6烷基、O-Si(C1-6烷基)(C1-6烷基)(C1-6烷基)、NO2、CF3、OCF3和鹵素；R3選自H、OH、C1-6烷基、C1-6烷氧基、NH2、NH-C1-6烷基、N(C1-6烷基)(C1-6烷基)、SH、S-C1-6烷基、O-Si(C1-6烷基)(C1-6烷基)(C1-6烷基)、NO2、鹵素和CH2-S-(CH2)nAr；Ar是用1-4個取代基取代的或沒有被取代的芳基或雜芳基，其中1-4個取代基獨立地選自OH、C1-6烷基、C1-6烷氧基、NH2、NH-C1- 6烷基、N(C1-6烷基)(C1-6烷基)、SH、S-C1-6烷基、NO2、CF3、OCF3和鹵素；R6是選自于由Ar、OH和OC1-6烷基組成的組中；X選自于O和S；n是0到4；并且p是1-4。
本發明還提供了通式III的化合物及其鹽、溶劑化物和水合物 其中
R1和R2獨立地選自H、OH、C1-6烷基、C1-6烷氧基、NH2、NH-C1-6烷基、N(C1-6烷基)(C1-6烷基)、SH、S-C1-6烷基、O-Si(C1-6烷基)(C1-6烷基)(C1-6烷基)、NO2、CF3、OCF3和鹵素；R3選自H、OH、C1-6烷基、C1-6烷氧基、NH2、NH-C1-6烷基、N(C1-6烷基)(C1-6烷基)、SH、S-C1-6烷基、O-Si(C1-6烷基)(C1-6烷基)(C1-6烷基)、NO2、鹵素和CH2-S-(CH2)nAr；Ar是用1-4個取代基取代的或沒有被取代的芳基或雜芳基，其中1-4個取代基獨立地選自OH、C1-6烷基、C1-6烷氧基、NH2、NH-C1- 6烷基、N(C1-6烷基)(C1-6烷基)、SH、S-C1-6烷基、NO2、CF3、OCF3和鹵素；R7選自OH、NH2和O-C1-6烷基；X選自于O和S；并且n是0到4。
按照本發明的另外方面，提供了一種含有本發明化合物和藥學上可接受的載體或稀釋劑的藥物組合物。
按照本發明的又一方面，提供了一種調節細胞增殖優選抑制細胞增殖的方法，它包括給予需要治療的細胞或動物有效量的本發明化合物。本發明還包括了本發明化合物調節細胞增殖優選抑制細胞增殖的用途。本發明也包括本發明化合物制備可調節細胞增殖優選抑制細胞增殖的藥物方面的用途。
在本發明優選的實施方案中提供了一種抑制癌細胞增殖的方法，它包括給予需要治療的細胞或動物有效量的本發明化合物。所治療的癌細胞可以是任易類型的癌細胞包括白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、轉移瘤、肉瘤或任何其他惡性轉化或任何其他惡性腫瘤。本發明還包括了本發明化合物調節癌細胞增殖優選抑制癌細胞增殖的用途。本發明也包括本發明化合物用于制備可調節癌細胞增殖優選抑制癌細胞增殖的藥物的用途。
在另一方面，本發明提供了一種通過給予有效量的本發明化合物調節細胞中酪氨酸激酶活性的方法。在又一方面，本發明提供了一種通過給予有效量的本發明化合物抑制細胞中酪氨酸激酶活性的方法。本發明還提供了本發明化合物調節，優選抑制酪氨酸激酶活性的用途。本發明也提供了本發明化合物制備可調節酪氨酸激酶活性優選抑制酪氨酸激酶活性的藥物的用途。可以想到本發明化合物對細胞生長的抑制可以通過其他機理起作用。
本發明的其他特征和優點將從下列詳細的說明逐漸清楚。盡管如此，可以理解在顯示本發明優選的實施方案時只以詳細說明的方式給出詳盡的說明和具體實施例，因為各種在本發明本質和范圍內的變化和改進對本領域普通技術人員來說都可以從詳盡的說明書中得出。
現在用相關的附圖來描述本發明，這些附圖中圖1是一幅顯示CR4在作用于培養基中正常骨髓分化的條形圖。
圖2是一幅顯示低劑量的CR4在培養基中殺傷費城陽性急性淋巴母細胞白血病的條形圖。
圖3是一幅顯示低劑量的CR4在培養基中殺傷費城陽性Z119急性淋巴母細胞白血病細胞的條形圖。
圖4是一幅顯示低劑量的CR4在培養基中殺傷AML-3急性骨髓白血病細胞的條形圖。
圖5是一幅顯示低劑量的CR4在培養基中殺傷Ly-MN淋巴瘤細胞的條形圖。
圖6是一幅顯示CR4在培養基中殺傷初始幼期骨髓單核細胞白血病細胞的條形圖。
圖7是一幅顯示低劑量的CR4在培養基中殺傷OCI-LY2淋巴瘤細胞的條形圖。
圖8是一幅顯示CR17和CR21在培養基中殺傷費城陽性ALL細胞的條形圖。
圖9是一幅顯示CR17和CR21在培養基中殺傷費城陽性ALL細胞的條形圖。
圖10是一幅顯示CR24在培養基中殺傷費城陽性AIL細胞的條形圖。
圖11是一幅顯示CR19在培養基中殺傷費城陽性ALL細胞的條形圖。
圖12是一幅顯示CR19在培養基中作用于正常骨髓分化的條形圖。
圖13是一幅顯示CR24、CR17和CR21作用于正常骨髓分化的條形圖。
圖14是一幅顯示CR4體外清除正常骨髓作用的條形圖。
圖15是一幅顯示CR4體外清除Z119急性淋巴母細胞白血病作用的條形圖。
圖16是一幅顯示CR4體外清除OCI-Ly2淋巴瘤細胞作用的條形圖。
圖17是一幅顯示CR4體外清除OCI-AML-3急性骨髓白血病細胞作用的條形圖。
圖18是一幅顯示CR4體外清除Ramos B細胞Burkitt淋巴瘤細胞作用的條形圖。
圖19是一幅顯示低劑量的CR4在培養基中殺傷HuNS1多發性骨髓瘤細胞的條形圖。
圖20A和B是顯示在NOD-SCID小鼠體內治療費城陽性急性淋巴母細胞白血病后的細胞染色圖。
圖21是一幅顯示CR11體外清除正常骨髓作用的條形圖。
圖22是一幅顯示CR11體外清除費城陽性急性淋巴母細胞白血病作用的條形圖。
圖23是一幅顯示用Bcr-Abl抗體免疫沉淀的Philadelphi(Ph+)ALL系Z119和Z181(5×106個細胞/點)的放射自顯影圖。
圖24是一幅顯示用Jak2抗體免疫沉淀的費城(Ph+)ALL系Z119(5×106個細胞/點)的放射自顯影圖。
優選實施方案的詳細描述1.定義本文所用的術語“C1-6-烷基”除非另有說明是指含有1到6個碳原子的直鏈和/或支鏈烷基，包括甲基、乙基、丙基、異丙基、叔丁基等。
本文所用的術語“C1-6-烷氧基”除非另有說明是指含有1到6個碳原子的直鏈和/或支鏈烷氧基，包括甲氧基、乙氧基、丙氧基、異丙氧基、叔丁氧基等。
本文所用的術語“C1-4-烷基”除非另有說明是指含有1到4個碳原子的直鏈和/或支鏈烷基，包括甲基、乙基、丙基、異丙基、叔丁基等。
本文所用的術語“C1-4-烷氧基”除非另有說明是指含有1到4個碳原子的直鏈和/或支鏈烷氧基，包括甲氧基、乙氧基、丙氧基、異丙氧基、叔丁氧基等。
本文所用的術語“Ar”是指沒有被取代的或被取代的芳基和/或雜芳基，當雜芳基時，可以包括至多兩個雜原子，其中取代基獨立地選自于OH、C1-6烷基、C1-6烷氧基、NH2、NH-C1-6烷基、N(C1-6烷基)(C1-6烷基)、SH、S-C1-6烷基、NO2、CF3、OCF3和鹵素，包括沒有被取代的或被取代的苯基、呋喃基、噻吩基、吲哚基、萘基、喹啉基等。
本文所用的術語“鹵素”是指鹵原子，包括氯、氟、溴、碘等。
術語“藥學上可接受的鹽”是指適合于或適應于治療患者的酸加成鹽或堿加成鹽。
本文所用的術語“本發明的化合物”包括本文所定義的通式I、II或III的任何一種化合物(包括它們所有的鹽、溶劑化物或水合物)以及本文所命名為CR1、CR2、CR3、CR4、CR5、CR6、CR7、CR8、CR9、CR11、CR12、CR13、CR14、CR15、CR16、CR17、CR18、CR19、CR20、CR21、CR24、CR27、CR28和CR29的特殊化合物(包括它們所有的鹽、溶劑化物或水合物)。
本文所用的術語“藥學上可接受的酸加成鹽”是指通式I、II和/或III所表示的任何堿性化合物或其中間體的無毒性的有機酸或無機酸的鹽。可形成適當鹽的說明性的無機酸包括氫氯酸、氫溴酸、硫酸和磷酸，以及金屬鹽如磷酸氫二鈉和硫酸氫鉀。可形成適當鹽的有機酸的例子包括單-、雙-和三羧酸如羥基乙酸、乳酸、丙酮酸、丙二酸、琥珀酸、戊二酸、富馬酸、蘋果酸、酒石酸、檸檬酸、抗壞血酸、馬來酸、苯甲酸、苯乙酸、肉桂酸和水楊酸，以及磺酸類如對甲苯磺酸和甲磺酸。或者可以形成單或雙酸鹽，并且這類鹽可以或者氫化、溶劑化或幾乎是酸酐形式存在。一般，通式I、II和/或III的化合物的酸加成鹽更易溶于水和各種親水性有機溶劑，證實通常比其游離堿的形式有更高的熔點。選擇適當的鹽對本領域技術人員是公知的。例如在分離通式I、II和/或III的化合物用于實驗室使用或隨后轉化成藥學上可接受的酸加成鹽時可以使用其他非藥學上可接受的鹽如草酸鹽。
本文所用的術語“藥學上可接受的堿加成鹽”是指用通式I、II和/或III表示的任何酸性化合物或其中間體的任何無毒性有機或無機堿的加成鹽。可形成適當鹽的無機堿的例子包括氫氧化鋰、氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化鈣、氫氧化鎂或氫氧化鈀。可形成適當鹽的有機堿的例子包括脂族有機胺、脂環族有機胺或芳香族有機胺如甲基胺、三甲基胺和甲基吡啶或氨。適當鹽的選擇對本領域普通技術人員來說是公知的。
本文所用的術語“溶劑化物”是指通式I、II和/或III的化合物或者它們的藥學上可接受的鹽，其中適當溶劑的分子可以摻雜在晶體晶格中。適當溶劑在給予劑量上是生理上可耐受的。適當溶劑的例子包括乙醇、水等。當水是溶劑時，分子稱作為“水合物”。
本文所用的術語“有效量”或“足夠量”的試劑是指足以起到有益或理想結果包括臨床結果的用量，并且“有效量”本身取決于所用的內容物。例如，在內容是給予可抑制癌細胞增殖的藥劑時，藥劑的有效量是足以達到癌細胞增值相對于沒有給予藥劑所達到的反應更低的用量。
正如本文所用的并且正如本領域所熟知的，“治療”是一種獲得有益的或理想的效果(包括臨床效果)的方法。有益的或理想的效果包括但不限于緩解或改善一種或多種癥狀或病情、減輕病情、穩定(即沒有惡化)病情、預防疾病的傳播、延遲或減緩疾病的進展、改善或緩和病情以及緩解(不論部分還是全部)，不論可檢測的還是無法檢測的。“治療”也可以指相對于沒有治療所預期的存活來說延長生命。
“緩和”疾病或失調是指相對于沒有治療來說失調或疾病狀況的程度和/或不希望的臨床癥狀被減少和/或發展的時間被延緩或延長。
本文所用的術語“調節”包括抑制或減弱功能或活性(如細胞增殖)以及提高功能或活性。
“抑制”或“減弱”功能或活性，例如癌細胞增殖是指相對于其他相同條件除了所研究的條件或參數外或者相對于其他條件降低了功能或活性。
本文所用的術語“動物”包括人在內的動物王國的所有成員。
本文所用的術語“細胞”包括多種細胞。對細胞給予化合物包括體內、活體外和體外治療。
本文所用的術語“癌細胞”包括所有形式的惡性腫瘤或腫瘤疾病。
II.本發明的化合物制備可用于調節細胞增殖的新化合物。該化合物可用于治療細胞增殖性疾病如惡性腫瘤。
所以，本發明提供了通式I化合物及其鹽、溶劑化物或水合物
其中R1和R2獨立地選自H、OH、C1-6烷基、C1-6烷氧基、NH2、NH-C1-6烷基、N(C1-6烷基)(C1-6烷基)、SH、S-C1-6烷基、O-Si(C1-6烷基)(C1-6烷基)(C1-6烷基)、NO2、CF3、OCF3和鹵素；R3選自H、OH、C1-6烷基、C1-6烷氧基、NH2、NH-C1-6烷基、N(C1-6烷基)(C1-6烷基)、SH、S-C1-6烷基、O-Si(C1-6烷基)(C1-6烷基)(C1-6烷基)、NO2、鹵素和CH2-S-(CH2)nAr；R4選自C(X)R5、SO3Ar、NH2、NH-C1-6烷基、N(C1-6烷基)(C1-6烷基)、P(O)(OH)2、P(O)(OC1-6烷基)2和C(NH2)＝C(CN)2；X選自于O、S、NH和N-C1-6烷基；R5選自NH2、OH、NH(CH2)pAr、NH(CH2)pOH、(CH2)pOC1-6烷基、C1- 6烷基、C1-6烷氧基、NHNH2、NHC(O)NH2、NHC(O)C1-6烷氧基、N-嗎啉基和N-吡咯烷基；并且Ar是用1-4個取代基取代的或沒有被取代的芳基或雜芳基，其中取代基獨立地選自OH、C1-6烷基、C1-6烷氧基、NH2、NH-C1-6烷基、N(C1-6烷基)(C1-6烷基)、SH、S-C1-6烷基、NO2、CF3、OCF3和鹵素；n是0到4；并且m是1到4；并且p是1-4。
在本發明的實施方案中，通式I的化合物是其中R1和R2獨立地選自H、OH、C1-6烷基、C1-6烷氧基、NH2、NH-C1-6烷基、N(C1-6烷基)(C1-6烷基)、SH、S-C1-6烷基、O-Si(C1-6烷基)(C1-6烷基)(C1-6烷基)、NO2、CF3、OCF3和鹵素。在優選的實施方案中，R1和R2獨立地選自H、OH、C1-4烷基、C1-4烷氧基、NH2、NH-C1-4烷基、SH、S-C1-4烷基、O-Si(C1-4烷基)(C1-4烷基)(C1-4烷基)、NO2、CF3、OCF3和鹵素。在更優選的實施方案中，R1和R2獨立地選自H、OH、OCH3、O-Si(CH3)2(tBu)、S-Me、SH和NO2。在本發明最優選的實施方案中，R1和R2都是OH或OCH3或R1是OCH3而R2是OH。
在本發明的又一個實施方案中，通式I的化合物包括其中R3選自H、OH、C1-6烷基、C1-6烷氧基、NH2、NH-C1-6烷基、N(C1-6烷基)(C1- 6烷基)、SH、S-C1-6烷基、O-Si(C1-6烷基)(C1-6烷基)(C1-6烷基)、NO2、鹵素和CH2-S-(CH2)nAr(其中n是1-4)。在優選的實施方案中，R3選自H、OH、C1-4烷基、C1-6烷氧基、NH2、NH-C1-4烷基、N(C1-4烷基)(C1- 4烷基)、SH、S-C1-4烷基、NO2和鹵素。在更優選的實施方案中，R3選自H、OH、OCH3、SH、SMe、NO2和鹵素。在最優選的實施方案中，R3選自H、OH、和OCH3。
本發明的實施方案包括通式I的化合物，其中R4選自C(X)R5、SO3Ar、NH2、NH-C1-6烷基、N(C1-6烷基)(C1-6烷基)、P(O)(OH)2、P(O)(OC1-6烷基)2和C(NH2)＝C(CN)2(其中m是1-4)。在優選的實施方案中，R4選自C(X)R5和C(NH2)＝C(CN)2。更優選的R4是C(X)R5。當R4是C(X)R5時，本發明的實施方案包括化合物其中X選自于O、S、NH和N-C1-6烷基而R5選自NH2、OH、NH(CH2)pAr、NH(CH2)pOH、(CH2)pOC1-6烷基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、NHNH2、NHC(O)NH2、NHC(O)C1-6烷氧基、N-嗎啉基和N-吡咯烷基(其中p是1-4)。在優選的實施方案中，X是O或S而R5選自NH2、OH、NH(CH2)pAr、(CH2)pOH和C1-4烷氧基(其中p是1-3)。最優選的是通式I的化合物其中X是O而R5選自NH2、OH、NH(CH2)pAr、NH(CH2)pOH和OCH3(其中p是1-2)。
本發明包括通式I的化合物其中術語“Ar”是指沒有被取代的或被取代的芳基和/或雜芳基，當是雜芳基時，它包括至多兩個雜原子，其中任選的取代基獨立地選自于下組基團OH、C1-6烷基、C1-6烷氧基、NH2、NH-C1-6烷基、N(C1-6烷基)(C1-6烷基)、SH、S-C1-6烷基、NO2、CF3、OCF3和鹵素，并且包括沒有被取代的或被取代的苯基、呋喃基、噻吩基、吲哚基、萘基、喹啉基等。在本發明的實施方案中，Ar是沒有被取代的苯基或被1-4個任選自下列基團的取代基取代的苯基OH、C1-6烷基、C1-6烷氧基、NH2、NH-C1-6烷基、N(C1-6烷基)(C1-6烷基)、SH、S-C1-6烷基、NO2、CF3、OCF3和鹵素。在優選的實施方案中，Ar是沒有被取代的苯基或被1-2個任選自下列基團的取代基取代的苯基OH、C1-4烷基、C1-4烷氧基、NH2、NH-C1-4烷基、N(C1-4烷基)(C1-4烷基)、SH、S-C1-4烷基、NO2、CF3、OCF3和鹵素。在更優選的實施方案中，Ar是沒有被取代的苯基或被1-2個任選自下列基團的取代基取代的苯基OH、OCH3、NH2、NHCH3、N(CH3)2、SH、SCH3、CF3、OCF3和鹵素。在最優選的實施方案中，Ar選自于苯基和3，4-二羥基苯基。
本發明還包括通式II的化合物及其鹽、溶劑化物和水合物 其中R1和R2獨立地選自H、OH、C1-6烷基、C1-6烷氧基、NH2、NH-C1-6烷基、N(C1-6烷基)(C1-6烷基)、SH、S-C1-6烷基、O-Si(C1-6烷基)(C1-6烷基)(C1-6烷基)、NO2、CF3、OCF3和鹵素；R3選自H、OH、C1-6烷基、C1-6烷氧基、NH2、NH-C1-6烷基、N(C1-6烷基)(C1-6烷基)、SH、S-C1-6烷基、O-Si(C1-6烷基)(C1-6烷基)(C1-6烷基)、NO2、鹵素和CH2-S-(CH2)nAr；Ar是用1-4個取代基取代的或沒有被取代的芳基或雜芳基，其中1-4個取代基獨立地選自OH、C1-6烷基、C1-6烷氧基、NH2、NH-C1- 6烷基、N(C1-6烷基)(C1-6烷基)、SH、S-C1-6烷基、NO2、CF3、OCF3和鹵素；R6是選自于由Ar、OH和OC1-6烷基組成的組中；X選自于O和S；n是0到4；并且p是1-4。
在本發明的實施方案中，通式II的化合物是其中R1和R2獨立地選自H、OH、C1-6烷基、C1-6烷氧基、NH2、NH-C1-6烷基、N(C1-6烷基)(C1-6烷基)、SH、S-C1-6烷基、O-Si(C1-6烷基)(C1-6烷基)(C1-6烷基)、NO2、CF3、OCF3和鹵素。在優選的實施方案中，R1和R2獨立地選自H、OH、C1-4烷基、C1-4烷氧基、NH2、NH-C1-4烷基、SH、S-C1-4烷基、O-Si(C1-4烷基)(C1-4烷基)(C1-4烷基)、NO2、CF3、OCF3和鹵素。在更優選的實施方案中，R1和R2獨立地選自H、OH、OCH3、O-Si(CH3)2(tBu)、S-Me、SH和NO2。在本發明最優選的實施方案中，R1和R2都是OH或OCH3或者R1是OCH3而R2是OH。
在本發明的又一個實施方案中，通式II的化合物包括那些其中R3選自H、OH、C1-6烷基、C1-6烷氧基、NH2、NH-C1-6烷基、N(C1-6烷基)(C1-6烷基)、SH、S-C1-6烷基、O-Si(C1-6烷基)(C1-6烷基)(C1-6烷基)、NO2、鹵素和CH2-S-(CH2)nAr(其中n是0-4)。在優選的實施方案中，R3選自H、OH、C1-4烷基、C1-4烷氧基、NH2、NH-C1-4烷基、N(C1-4烷基)(C1-4烷基)、SH、S-C1-4烷基、NO2和鹵素。在更優選的實施方案中，R3選自H、OH、OCH3、SH、SMe、NO2和鹵素。在最優選的實施方案中，R3選自H、OH、和OCH3。
本發明還包括通式II的化合物其中術語“Ar”是指沒有被取代的或被取代的芳基和/或雜芳基，當是雜芳基時，它包括至多兩個雜原子，其中任選的取代基獨立地選自于下組基團OH、C1-6烷基、C1-6烷氧基、NH2、NH-C1-6烷基、N(C1-6烷基)(C1-6烷基)、SH、S-C1-6烷基、NO2、CF3、OCF3和鹵素，并且包括沒有被取代的或被取代的苯基、呋喃基、噻吩基、吲哚基、萘基、喹啉基等。在本發明的實施方案中，Ar是沒有被取代的苯基或被1-4個任選自下列基團的取代基取代的苯基OH、C1-6烷基、C1-6烷氧基、NH2、NH-C1-6烷基、N(C1-6烷基)(C1-6烷基)、SH、S-C1-6烷基、NO2、CF3、OCF3和鹵素。在優選的實施方案中，Ar是沒有被取代的苯基或被1-2個任選自下列基團的取代基取代的苯基OH、C1-4烷基、C1-4烷氧基、NH2、NH-C1-4烷基、N(C1-4烷基)(C1-4烷基)、SH、S-C1-4烷基、NO2、CF3、OCF3和鹵素。在更優選的實施方案中，Ar是沒有被取代的苯基或被1-2個任選自下列基團的取代基取代的苯基OH、OCH3、NH2、NHCH3、N(CH3)2、SH、SCH3、CF3、OCF3和鹵素。在最優選的實施方案中，Ar選自于苯基和3，4-二羥基苯基。
通式II的化合物包括那些其中R6選自于Ar、OH和OC1-6烷基而p是1-4。在優選的實施方案中，R6選自于Ar和OH而p是1-2。最優選的是，當R6是Ar時，p是1，當R6是OH時，p是2。當R6是Ar時，Ar是指沒有被取代的或被取代的芳基和/或雜芳基，當是雜芳基時，它包括至多兩個雜原子，其中任選的取代基獨立地選自于下組基團OH、C1-6烷基、C1-6烷氧基、NH2、NH-C1-6烷基、N(C1-6烷基)(C1-6烷基)、SH、S-C1-6烷基、NO2、CF3、OCF3和鹵素，并且包括沒有被取代的或被取代的苯基、呋喃基、噻吩基、吲哚基、萘基、喹啉基等。在本發明的實施方案中，Ar是沒有被取代的苯基或被1-4個任選自下列基團的取代基取代的苯基OH、C1-6烷基、C1-6烷氧基、NH2、NH-C1-6烷基、N(C1-6烷基)(C1-6烷基)、SH、S-C1-6烷基、NO2、CF3、OCF3和鹵素。在優選的實施方案中，Ar是沒有被取代的苯基或被1-2個任選自下列基團的取代基取代的苯基OH、C1-4烷基、C1-4烷氧基、NH2、NH-C1-4烷基、N(C1-4烷基)(C1-4烷基)、SH、S-C1-4烷基、NO2、CF3、OCF3和鹵素。在更優選的實施方案中，Ar是沒有被取代的苯基或被1-2個任選自下列基團的取代基取代的苯基OH、OCH3、NH2、NHCH3、N(CH3)2、SH、SCH3、CF3、OCF3和鹵素。在最優選的實施方案中，Ar選自于苯基和3，4-二羥基苯基。
通式II的化合物包括那些其中X選自于O和S。在優選的實施方案中，X是O。
本發明也提供了通式III的化合物及其鹽、溶劑化物和水合物
其中R1和R2獨立地選自H、OH、C1-6烷基、C1-6烷氧基、NH2、NH-C1-6烷基、N(C1-6烷基)(C1-6烷基)、SH、S-C1-6烷基、O-Si(C1-6烷基)(C1-6烷基)(C1-6烷基)、NO2、CF3、OCF3和鹵素；R3選自H、OH、C1-6烷基、C1-6烷氧基、NH2、NH-C1-6烷基、N(C1-6烷基)(C1-6烷基)、SH、S-C1-6烷基、O-Si(C1-6烷基)(C1-6烷基)(C1-6烷基)、NO2、鹵素和CH2-S-(CH2)nAr；Ar是用1-4個取代基取代的或沒有被取代的芳基或雜芳基，其中取代基獨立地選自OH、C1-6烷基、C1-6烷氧基、NH2、NH-C1-6烷基、N(C1-6烷基)(C1-6烷基)、SH、S-C1-6烷基、NO2、CF3、OCF3和鹵素；R7是選自于由OH、NH2和OC1-6烷基組成的組中；X選自于O和S；并且n是0-4。
在本發明的實施方案中，通式III的化合物是那些其中R1和R2獨立地選自H、OH、C1-6烷基、C1-6烷氧基、NH2、NH-C1-6烷基、N(C1-6烷基)(C1-6烷基)、SH、S-C1-6烷基、O-Si(C1-6烷基)(C1-6烷基)(C1-6烷基)、NO2、CF3、OCF3和鹵素。在優選的實施方案中，R1和R2獨立地選自H、OH、C1-4烷基、C1-4烷氧基、NH2、NH-C1-4烷基、SH、S-C1-4烷基、O-Si(C1-4烷基)(C1-4烷基)(C1-4烷基)、NO2、CF3、OCF3和鹵素。在更優選實施方案中，R1和R2獨立地選自H、OH、OCH3、O-Si(CH3)2(tBu)、S-Me、SH和NO2。在本發明最優選的實施方案中，R1和R2都是OH或OCH3或者R1是OCH3而R2是OH。
在本發明又一個實施方案中，通式III的化合物包括那些其中R3選自H、OH、C1-6烷基、C1-6烷氧基、NH2、NH-C1-6烷基、N(C1-6烷基)(C1-6烷基)、SH、S-C1-6烷基、O-Si(C1-6烷基)(C1-6烷基)(C1-6烷基)、NO2、鹵素和CH2-S-(CH2)nAr(其中n是0-4)。在優選的實施方案中，R3選自H、OH、C1-4烷基、C1-4烷氧基、NH2、NH-C1-4烷基、N(C1-4烷基)(C1-4烷基)、SH、S-C1-4烷基、NO2和鹵素。在更優選的實施方案中，R3選自H、OH、OCH3、SH、SMe、NO2和鹵素。在最優選的實施方案中，R3選自H、OH和OCH3。
本發明還包括通式III的化合物其中術語“Ar”是指沒有被取代的或被取代的芳基和/或雜芳基，當是雜芳基時，它包括至多兩個雜原子，其中任選的取代基獨立地選自于下組基團OH、C1-6烷基、C1-6烷氧基、NH2、NH-C1-6烷基、N(C1-6烷基)(C1-6烷基)、SH、S-C1-6烷基、NO2、CF3、OCF3和鹵素，并且包括沒有被取代的或被取代的苯基、呋喃基、噻吩基、吲哚基、萘基、喹啉基等。在本發明的實施方案中，Ar是沒有被取代的苯基或被1-4個任選自下列基團的取代基取代的苯基OH、C1-6烷基、C1-6烷氧基、NH2、NH-C1-6烷基、N(C1-6烷基)(C1-6烷基)、SH、S-C1-6烷基、NO2、CF3、OCF3和鹵素。在優選的實施方案中，Ar是沒有被取代的苯基或被1-2個任選自下列基團的取代基取代的苯基OH、C1-4烷基、C1-4烷氧基、NH2、NH-C1-4烷基、N(C1- 4烷基)(C1-4烷基)、SH、S-C1-4烷基、NO2、CF3、OCF3和鹵素。在更優選的實施方案中，Ar是沒有被取代的苯基或被1-2個任選自下列基團的取代基取代的苯基OH、OCH3、NH2、NHCH3、N(CH3)2、SH、SCH3、CF3、OCF3和鹵素。在最優選的實施方案中，Ar選自于苯基和3，4-二羥基苯基。
通式III的化合物又包括那些其中R7選自于OH、NH2和OC1-6烷基。在優選的實施方案中，R7選自于OH和NH2。
通式III的化合物還包括那些其中X選自于O和S。在優選的實施方案中，X是O。
在本發明具體的實施方案中，本發明化合物包括(E，E)-2-(苯甲酰氨基)-3-苯乙烯基丙烯腈(CR1)；(E，E)-2-(苯甲酰氨基)-3-(3，4-二甲氧基苯乙烯基)丙烯腈(CR2)；(E，E)-2-(苯甲酰氨基)-3-(3，5-二甲氧基-4-羥基苯乙烯基)丙烯腈(CR3)；(E，E)-2-(苯甲酰氨基)-3-(3，4-二羥基苯乙烯基)丙烯腈(CR4)；
(E，E)-2-(苯乙酰氨基)-3-(3，4-二甲氧基苯乙烯基)丙烯腈(CR5)；(E，E)-2-(苯乙酰氨基)-3-(3，5-二甲氧基-4-羥基苯乙烯基)丙烯腈(CR8)；(E，E)-2-(苯丙酰氨基)-3-(3，5-二甲氧基-4-羥基苯乙烯基)丙烯腈(CR9)；(E，E)-2-(3，4-二羥基苯甲酰氨基)-3-(3，5-二甲氧基-4-羥基苯乙烯基)丙烯腈(CR11)；(E，E)-2-硫代乙酰氨基-3-(3，5-二甲氧基-4-羥基苯乙烯基)丙烯腈(CR12)；(E，E)-2-乙酰氨基-3-(3，5-二甲氧基-4-羥基苯乙烯基)丙烯腈(CR13)；(E，E)-2-羧基-3-(3，5-二甲氧基-4-羥基苯乙烯基)丙烯腈(CR14)；(E，E)-2-羰基甲氧基-3-(3，5-二甲氧基-4-羥基苯乙烯基)丙烯腈(CR15)；(E，E)-2-乙酰氨基-3-[3，4-雙(叔丁基二甲基硅氧烷基苯乙烯基)]丙烯腈(CR16)；(E，E)-2-乙酰氨基-3-(3，4-二羥基苯乙烯基)丙烯腈(CR17)；(E，E)-2-(苯甲酰氨基)-3-(3，4-雙(正丁基二甲基硅氧烷基苯乙烯基))丙烯腈(CR18)；(E，E)-2-(3，4二羥基苯甲酰氨基)-3-苯乙烯基丙烯腈(CR19)；(E，E)-2-(3，4二羥基苯甲酰氨基)-3-[3，4-雙(正丁基二甲基硅氧烷基苯乙烯基)]丙烯腈(CR20)；(E，E)-2-(3，4二羥基苯甲酰氨基)-3-(3，4-二羥基苯乙烯基)]丙烯腈(CR21)；(E，E)-2-(β-乙醇酰氨基)-3-(3，5二甲氧基-4-羥基苯乙烯基)丙烯腈(CR24)；(E，E)-2-(苯甲酰氨基)-3-(4-硝基苯乙烯基)丙烯腈(CR27)；
(E，E)-2-(3，4-二羥基苯甲酰氨基)-3-(4-硝基苯乙烯基)丙烯腈(CR28)和(E，E)-2-(1-氨基-2，2-二氰基乙烯基)-3-(4-硝基苯乙烯基)丙烯腈(CR29)。
在本發明優選的實施方案中，本發明化合物包括(E，E)-2-(苯甲酰氨基)-3-苯乙烯基丙烯腈(CR1)；(E，E)-2-(苯甲酰氨基)-3-(3，4-二甲氧基苯乙烯基)丙烯腈(CR2)；(E，E)-2-(苯甲酰氨基)-3-(3，5-二甲氧基-4-羥基苯乙烯基)丙烯腈(CR3)；(E，E)-2-(苯甲酰氨基)-3-(3，4-二羥基苯乙烯基)丙烯腈(CR4)；(E，E)-2-(苯乙酰氨基)-3-(3，4-二甲氧基苯乙烯基)丙烯腈(CR5)；(E，E)-2-(苯丙酰氨基)-3-(3，5-二甲氧基-4-羥基苯乙烯基)丙烯腈(CR9)；(E，E)-2-(3，4-二羥基苯甲酰氨基)-3-(3，5-二甲氧基-4-羥基苯乙烯基)丙烯腈(CR11)；(E，E)-2-硫代乙酰氨基-3-(3，5-二甲氧基-4-羥基苯乙烯基)丙烯腈(CR12)；(E，E)-2-乙酰氨基-3-(3，5-二甲氧基-4-羥基苯乙烯基)丙烯腈(CR13)；(E，E)-2-羧基-3-(3，5-二甲氧基-4-羥基苯乙烯基)丙烯腈(CR14)；(E，E)-2-羰基甲氧基-3-(3，5-二甲氧基-4-羥基苯乙烯基)丙烯腈(CR15)；(E，E)-2-乙酰氨基-3-(3，4-二羥基苯乙烯基)丙烯腈(CR17)；(E，E)-2-(3，4-二羥基苯甲酰氨基)-3-苯乙烯基丙烯腈(CR19)；(E，E)-2-(3，4-二羥基苯甲酰氨基)-3-(3，4-二羥基苯乙烯基)]丙烯腈(CR21)；和(E，E)-2-(β-乙醇酰氨基)-3-(3，5二甲氧基-4-羥基苯乙烯基)丙烯腈(CR24)。
在本發明更優選的實施方案中，本發明的化合物包括(E，E)-2-(苯甲酰氨基)-3-(3，4-二羥基苯乙烯基)丙烯腈(CR4)；(E，E)-2-(3，4-二羥基苯甲酰氨基)-3-(3，5-二甲氧基-4-羥基苯乙烯基)丙烯腈(CR11)；(E，E)-2-乙酰氨基-3-(3，4-二羥基苯乙烯基)丙烯腈(CR17)；(E，E)-2-(3，4-二羥基苯甲酰氨基)-3-苯乙烯基丙烯腈(CR19)；(E，E)-2-(3，4-二羥基苯甲酰氨基)-3-(3，4-二羥基苯乙烯基)丙烯腈(CR21)；和(E，E)-2-(β-乙醇酰氨基)-3-(3，5二甲氧基-4-羥基苯乙烯基)丙烯腈(CR24)。
本發明在其范圍內包括本發明化合物的藥物前體。一般來說，這類藥物前體將是本發明化合物的功能性衍生物，它們在體內容易轉化成理論上衍生的化合物。選擇和制備適當藥物前體的常規步驟被描述于例如由H.Bundaard，Elsevier1985年編寫的“藥物前體的設計。”本發明的一些化合物可以至少有一個不對稱中心。當本發明化合物有一個不對稱中心時，可以存在對映異構體。當本發明化合物具有兩個或多個不對稱中心時，它們還可以存在非對映異構體。可以理解為所有這些異構體及其任意比例的混合物都包括在本發明的范圍內。
本發明包括放射性標記形式的本發明化合物，例如，本發明化合物通過在其結構中攙入3H或14C或放射活性鹵素如125I來標記。
例如本發明化合物可以衍生于被激活的肉桂基化合物和被激活的氰基-取代的亞甲基化合物。所以，本領域普通技術人員可以希望提供基于肉桂基部分的本發明化合物的通用名。但是，基于所形成的酰基腈部分的通常術語例如苯乙烯基酰基腈應當是更合適的。
III.本發明化合物的制備方法按照本發明的另一方面，本發明化合物能夠通過類似于本領域所建立的那些工藝方法來制備。所以，本發明的化合物可以通過流程式1所顯示的反應順序來制備流程式1 可用于實施本發明的通式I、II和/或III的化合物能夠通過α，β-不飽和醛類如肉桂醛或其各種芳基-取代的類似物(IV)與具有活性α-亞甲基(V)的化合物稠合來制備。在綜述中描述了使用價在同一碳原子上的二價基丙二醛(ylidenemallononitrile)作為α-亞甲基成分的相似Knoevenagel稠合(F.Freeman.Chem.Rev.1980，V.80，P.329-350)。例如，可以在極性溶劑如乙醇中在有催化量的弱堿如β-丙氨酸存在下進行這些稠合。反應溫度在20到100℃的范圍內，取決于所用稠合物質的穩定性。
通式IV和/或V化合物可以在商業上獲得如肉桂醛及其3，5-二甲氧基-4-羥基衍生物。使用直接步驟制備通式IV和/或V的其他化合物。例如，可以從相應商業上獲得的芳基取代的肉桂酸制備各種R1，R2，R3-羥基取代的肉桂醛。流程式2給出了一個從3，4-二羥基肉桂酸(VI)制備保護了的3，4-二羥基肉桂醛(IVa)的例子。在反應順序結束時，用本領域普通技術人員所熟知的標準方法除去保護基團。
流程式2
例如通過將硝基還原成氨基的已知方法并進一步轉化成二烷基氨基或者通過將羥基轉化成鹵基的已知方法可以將R1、R2、R3取代基從一個功能基轉化成另外一個功能基。
可以獲得含有反應性亞甲基(Va)的α-氰基酰胺，例如在A.Gazit等J.Med.Chem.，1991，V.34，P.1896-1907中所描述的。例如，在沒有溶劑的情況下將氰基醋酸甲酯(VII)和適當商業上可得到的胺(VIII)加熱到100℃12-15小時，接著直接將該混合物真空蒸餾(例如使用Kugelrohr儀器)得到所需的產物(流程式3)。
流程式3 在某些情況下，必須改良上述所列的化學式，例如通過使用保護性基團來防止由反應性基團如所連接的作為取代基的反應基團所引起的副反應。這可以使用常用的保護基團例如在“有機化學的保護基團”McOmie，J.F.W.編輯，P1enum出版社，1973和在Greene，T.W.和Wuts，P.G.M.，“有機合成中的保護基團”，John Wiley&Sons，1991來實現。
可以使用標準技術實現所需化合物鹽的形成。例如，在適當溶劑中用酸或堿處理中性化合物并通過過濾、提取或任何其他適當方法分離所形成的鹽。
本發明化合物溶劑化物的形成可以隨著化合物和溶劑化物的不同而不同。一般來說，溶劑化物的形成是將化合物溶于適當的溶劑中并通過冷卻或使用抗溶劑來分離該溶劑化物。該溶劑化物通常在室溫條件下干燥。
本發明化合物的前體藥物可以是與可獲得的羥基、氨基或羧基形成的常用酯。例如，當通式I、II和/或III的化合物中的R1、R2或R3是OH時，可以在堿存在下使用激活的酸將其酰化，并任選在惰性溶劑(例如吡啶中的酸性氯化物)。已經用作前體藥物的一些常用的酯是苯酯、脂肪(C8-C24)酯、酰氧基甲基酯、氨基甲酸酯和氨基酸酯。
可以使用本領域中公知的標準方法制備本發明放射標記的化合物。例如，可以使用標準方法將氘攙入本發明的化合物中，例如用氘氣和催化劑將適當的前體藥物氫化成本發明化合物。另外一種方法，在適當溶劑如二甲基甲酰胺中，有氯胺-T存在時，使用標準碘化條件如[125I]碘化鈉可以從相應的三烷基錫(適當的是三甲基錫)制備含有放射活性的碘代的本發明化合物。在惰性溶劑如二噁烷中，有升高的溫度，適當的是50-100℃并有四(三苯基膦)鈀(O)存在時，可以使用標準鈀催化的甲錫烷基化條件從相應非放射活性的鹵素適當的碘制備成三烷基錫化合物。
IV.用途正如前面所提到的，本發明人已經制備了通式I、II和III的新化合物。所以，本發明包括本發明化合物的全部用途，包括它們在調節細胞增殖的治療方法和組合物的用途，它們用于診斷測定的用途和它們用作研究工具的用途。
一方面，本發明提供了一種包括對需要這種治療的細胞或動物給予有效量的本發明化合物的調節細胞增殖的方法。優選本發明提供了一種包括對需要治療的細胞或動物給予有效量的本發明化合物來抑制細胞增殖的方法。具體來說，本發明的方法是用于抑制異常的而不是正常細胞的增殖。異常細胞包括任何類型的可引起疾病或病情或涉及疾病或病情的細胞病情并且其中理想的是調節或抑制異常細胞增殖來治療疾病或病情。異常細胞的例子包括惡性腫瘤或癌細胞以及在炎性病情中過度增殖的細胞。
現已測定出本發明的一些化合物對殺傷癌細胞非常有效并通常不殺傷正常細胞。這些特性使得本發明化合物成為非常有用的抗癌劑。所以，在一個實施方案中，本發明提供了一種包括對需要治療的細胞或動物給予有效量的本發明化合物來抑制癌細胞增殖的方法。
可用本發明化合物治療的癌細胞是任意類型的惡性腫瘤，它包括但不限于血細胞生成的惡性病，包括白血病、淋巴瘤和骨髓瘤以及其他類型的惡性腫瘤包括肉瘤、癌、黑瘤、腺瘤、神經系統的惡性腫瘤和泌尿生殖惡性腫瘤。白血病的例子包括急性淋巴母細胞白血病(ALL)、急性髓細胞白血病(AML)、慢性髓細胞白血病(CML)、慢性淋巴細胞白血病(CLL)和幼期骨髓單核細胞白血病(JMML)。可用本發明化合物治療的ALL的類型包括能夠表達bcr-abl融合蛋白的細胞如費城陽性ALL細胞、以及費城陰性ALL細胞。淋巴瘤的例子包括B-細胞Burkitt淋巴瘤、何杰金淋巴瘤、非-何杰金淋巴瘤、包括Ki-1陽性間變性巨細胞淋巴瘤、T細胞淋巴瘤和rare淋巴瘤如組織淋巴瘤。骨髓瘤的例子包括多發性骨髓瘤。
在具體實施方案中，本發明提供了一種給予有效量的選自于下組的化合物來抑制癌細胞增殖的方法(E，E)-2-(苯甲酰氨基)-3-苯乙烯基丙烯腈(CR1)；(E，E)-2-(苯甲酰氨基)-3-(3，4-二甲氧基苯乙烯基)丙烯腈(CR2)；(E，E)-2-(苯甲酰氨基)-3-(3，5-二甲氧基-4-羥基苯乙烯基)丙烯腈(CR3)；(E，E)-2-(苯甲酰氨基)-3-(3，4-二羥基苯乙烯基)丙烯腈(CR4)；(E，E)-2-(苯乙酰氨基)-3-(3，4-二甲氧基苯乙烯基)丙烯腈(CR5)；(E，E)-2-(苯乙酰氨基)-3-(3，5-二甲氧基-4-羥基苯乙烯基)丙烯腈(CR8)；(E，E)-2-(苯丙酰氨基)-3-(3，5-二甲氧基-4-羥基苯乙烯基)丙烯腈(CR9)；(E，E)-2-(3，4-二羥基苯甲酰氨基)-3-(3，5-二甲氧基-4-羥基苯乙烯基)丙烯腈(CR11)；(E，E)-2-硫代乙酰氨基-3-(3，5-二甲氧基-4-羥基苯乙烯基)丙烯腈(CR12)；(E，E)-2-乙酰氨基-3-(3，5-二甲氧基-4-羥基苯乙烯基)丙烯腈(CR13)；(E，E)-2-羧基-3-(3，5-二甲氧基-4-羥基苯乙烯基)丙烯腈(CR14)；(E，E)-2-羰基甲氧基-3-(3，5-二甲氧基-4-羥基苯乙烯基)丙烯腈(CR15)；(E，E)-2-乙酰氨基-3-[3，4-雙(叔丁基二甲基硅氧烷基苯乙烯基)]丙烯腈(CR16)；(E，E)-2-乙酰氨基-3-(3，4-二羥基苯乙烯基)丙烯腈(CR17)；(E，E)-2-(苯甲酰氨基)-3-(3，4-雙(正丁基二甲基硅氧烷基苯乙烯基))丙烯腈(CR18)；(E，E)-2-(3，4二羥基苯甲酰氨基)-3-苯乙烯基丙烯腈(CR19)；(E，E)-2-(3，4二羥基苯甲酰氨基)-3-[3，4-雙(正丁基二甲基硅氧烷基苯乙烯基)]丙烯腈(CR20)；(E，E)-2-(3，4二羥基苯甲酰氨基)-3-(3，4-二羥基苯乙烯基)]丙烯腈(CR21)；(E，E)-2-(β-乙醇酰氨基)-3-(3，5二甲氧基-4-羥基苯乙烯基)丙烯腈(CR24)；(E，E)-2-(苯甲酰氨基)-3-(4-硝基苯乙烯基)丙烯腈(CR27)；(E，E)-2-(3，4-二羥基苯甲酰氨基)-3-(4-硝基苯乙烯基)丙烯腈(CR28)和(E，E)-2-(1-氨基-2，2-二氰基乙烯基)-3-(4-硝基苯乙烯基)丙烯腈(CR29)。
在優選的實施方案中，本發明提供了一種給予有效量的選自下列的化合物來抑制癌細胞增殖的方法(E，E)-2-(苯甲酰氨基)-3-(3，4-二羥基苯乙烯基)丙烯腈(CR4)；(E，E)-2-(3，4-二羥基苯甲酰氨基)-3-(3，5-二甲氧基-4-羥基苯乙烯基)丙烯腈(CR11)；(E，E)-2-乙酰氨基-3-(3，4-二羥基苯乙烯基)丙烯腈(CR17)；(E，E)-2-(3，4二羥基苯甲酰氨基)-3-苯乙烯基丙烯腈(CR19)；(E，E)-2-(3，4二羥基苯甲酰氨基)-3-(3，4-二羥基苯乙烯基)丙烯腈(CR21)；和(E，E)-2-(β-乙醇酰氨基)-3-(3，5二甲氧基-4-羥基苯乙烯基)丙烯腈(CR24)。
本領域普通技術人員能夠推定本發明的哪一個本發明化合物具有治療用途，例如抑制任何類型的惡性腫瘤或細胞增殖疾病。在本文所述的實施例35-56的細胞增殖測定法中可以檢測化合物抑制細胞生長的功效。所以，本發明的方法、用途和組合物只包括具有所需功效的那些化合物。
可以檢測本發明化合物在體外和體內抑制癌細胞，特別是造血細胞惡性生長的能力。已經發現所測試的好幾個化合物能夠在培養基中以亞-微-摩爾劑量消除癌細胞的生長。具體來說，發現CR4、CR11和CR19對各種細胞類型如急性淋巴母細胞白血病、費城陽性白血病和急性淋巴母細胞白血病非常有效。低納摩爾劑量的CR4和CR19都對癌細胞有較高毒性，同時不影響正常細胞的生長和分化。長期暴露于低濃度的化合物可以達到這些效果。所以，一方面，本發明提供了一種對需要這種治療的細胞或動物給予有效量的本發明化合物優選CR4、CR11或CR19來抑制造血癌細胞增殖的方法。
使用鼠模型已經測定出化合物CR4在體內能夠有效殺傷人的費城陽性急性淋巴母細胞白血病細胞。CR4能夠有效減少腫瘤負載和ALL細胞浸潤器官。消除癌細胞生長所需劑量不會導致動物可測定的非特異性損傷。
也測定出了本發明化合物如CR4和CR11是有效的活體外清除劑。活體外給藥可以從惡性腫瘤患者除去骨髓細胞并用本發明化合物活體外清除。這樣清除將會殺傷腫瘤細胞同時保持正常骨髓的完整。清除后，將這些細胞洗滌并再導入患者。
在活體外清除測定過程中，短期(1-24小時)內將這些細胞暴露于相對高劑量的化合物(50μM-100μM)，從而消除了癌細胞的生長，同時相對不影響在相同時間暴露于相同劑量的正常細胞。誘發編程性細胞死亡會影響癌細胞的死亡。所以，在本發明的又一方面，提供了一種用本發明化合物優選CR4和CR11活體外處理惡性腫瘤患者的骨髓來殺傷惡性腫瘤細胞，然再將處理過(或清除)骨髓再導入給患者的方法。
除了惡性腫瘤，本發明的化合物可用于治療其他涉及畸變的或異常的細胞增殖的疾病。可用本發明治療的其他細胞增殖疾病包括炎癥疾病、變態反應、自身免疫疾病、移植排斥的牛皮癬、再狹窄、關節硬化和其他任何需要抑制、預防或阻遏細胞生長的疾病。使用本領域普通技術人員所公知的測定法和技術可以測試本發明化合物在特殊細胞增殖疾病的功效。例如，下列參考文獻提供了各種疾病的測定法。風濕性關節炎C.S.Kasyapa等“咯利普蘭(rolipram)對IL-15-刺激的THF-α生成的調節”，Journal of Immunology(1999)163卷第8236頁。變態反應T.Adachi等“一種新Lyn-結合肽抑制劑阻斷嗜酸性細胞分化”。Journal of Immunology(1999)163卷第939頁。牛皮癬R.Uchert的“IL-15對角蛋白細胞編程性細胞死亡的抑制牛皮癬pathegenosis的新參數”Journal ofImmunology(2000)165卷第224頁(在U上有一個umlatt)。牛皮癬A.H.Enk的“T-細胞受體模擬肽及其在T-細胞調節疾病中的有效應用”，International Archives of Allergy andImmunology(2000)第123卷第275頁。
本發明化合物是酪氨酸激酶調節劑并且可用于調節酪氨酸激酶的活性，包括抑制酪氨酸激酶的活性來治療各種疾病如上述所提到的所有增殖疾病。所以，本發明提供了一種對需要治療的細胞或動物給予有效量的本發明化合物來調節酪氨酸激酶活性的方法。在另一方面，本發明提供了一種對需要治療的細胞或動物給予有效量的本發明化合物來抑制酪氨酸激酶活性的方法。
當本發明化合物可以通過抑制酪氨酸激酶活性起作用時，本領域普通技術人員將會想到本發明化合物可能的其他作用模式或機理。
本發明化合物優選配制成對人給藥的適合體內給藥的生物相容形式的藥物組合物。所以，在又一方面，本發明提供了含有與適當稀釋劑或載體混合的本發明化合物的藥物組合物。
用已知制備可對患者給藥的藥學上可接受的組合物的方法可以制備含有本發明化合物的組合物，即有效量的活性物質與含有藥學上可接受的載體的混合物組合。適當的載體例如在Remington藥物科學(Remington藥物科學，Mack出版公司，Easton，Pa.，美國1985)中進行了描述。在此基礎上，該組合物包括但不限于與一種或多種藥學上可接受的載體或稀釋劑相關并且包含在具有適當pH和與生理液體等滲的緩沖溶液中的物質的溶液。
本發明化合物可以使用游離堿的形式、鹽、溶劑化物和水合物的形式。所有形式都在本發明的范圍內。可以形成酸加成鹽并提供更方便的使用形式；實踐上，使用鹽形式本質上相當于使用堿形式。可用來制備酸加成鹽的酸最好包括那些當與游離堿結合時，能夠形成藥學上可接受的鹽，即是那些藥物劑量鹽中的陰離子是對動物器官沒有毒性的，從而游離堿固有的有益特性沒有被起因于陰離子的副作用所破壞。盡管優選堿性化合物的藥學上可接受的鹽，但是所有酸加成鹽都可以用作游離堿的來源，甚至特殊鹽本身只需要作為中間產物，例如當只是為了純化和鑒別而形成的鹽，或者當它作為離子交換步驟制備藥學上可接受的鹽的中間體。
在本發明范圍內的藥學上可接受的鹽包括那些來自下列酸的鹽無機酸如鹽酸、硫酸、磷酸和氨基磺酸；和有機酸如醋酸、檸檬酸、乳酸、酒石酸、丙二酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、對甲苯磺酸、環己基磺酸、奎寧酸等。
按照本發明的方法，所述的化合物或鹽或溶劑化物可以根據所選的給藥途徑以各種形式給予患者，這一點對本領普通技術人員是清楚的。本發明組合物可以經口或胃腸外給藥。胃腸外給藥包括靜脈內、腹膜內、皮下、肌肉內、經皮、經鼻、肺內、鞘內、直腸內和局部給藥方式。胃腸外給藥可以在選定時間內連續輸液。
本發明化合物或其鹽、溶劑化物可以口服給藥，例如與惰性稀釋劑或與可吸收的可食carder，或者它可以被包裹在硬或軟的殼明膠膠囊中，或者它可以被壓制成片，或者它可以被直接攙入飲食的食品中。對口服給藥來說，本發明化合物可以與賦型劑混合并以可食片、頰用片、錠劑、膠囊、酏劑、懸浮液、糖漿、糯米紙囊劑等使用。
本發明化合物也可以胃腸外或腹膜內給藥。本發明化合物作為游離堿或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物的溶液制備是在水中與表面活性劑如羥丙基纖維素適當混合。也可以在甘油、液體聚乙二醇、DMSO及其含有或不含酒精的混合物或油中制備分散液。在常規的儲藏和使用條件下，這些制劑包括防止微生物生長的防腐劑。本領域普通技術人員應當知道怎樣制備適當的制劑。例如在Remington藥物科學(1990-第18版)和在1999年公開的美國藥典國家配方(USP24NF19)中描述了選擇和制備適當制劑的常用步驟和成分。
適合于注射使用的藥物形式包括無菌水溶液或分散液和用于臨時配制無菌注射溶液或懸浮液的無菌粉末。在各種情況中，它們都必須是無菌的并且容易注射存在的內容物必須是流體。
本發明化合物可以對動物單獨給藥或與藥學上可接受的上述載體組合給藥，這些載體的比例由化合物的溶解性和化學性、所選擇的給藥途徑和標準制藥實際來決定。
本發明化合物和/或組合物的劑量能夠根據許多因素的不同而變化，這些因素包括化合物的藥物動力學特性、給藥方式、受體的年齡、健康和體重、癥狀的性質和程度、治療頻率和共同治療的類型，如果需要的話，化合物在所治療動物中的廓清率。本領域普通技術人員能夠根據上述因素決定適當的劑量。本發明化合物可以根據臨床反應最初以可調節成所需的劑量來給藥。例如，本發明化合物給藥范圍在大約1納摩爾到大約100毫摩爾，優選50納摩爾到50毫摩爾。對活體外短期例如30分鐘到1小時或更長時間治療細胞來說，可以使用比體內療法更高劑量的化合物；例如可以使用50μM或更高的濃度。
本發明也包括了本發明化合物或組合物抑制細胞增殖優選癌細胞增殖的用途。本發明還包括本發明化合物或組合物制備可抑制細胞增殖優選癌細胞增殖的藥物的用途。
本發明化合物能夠單獨使用或者與其他可調節酪氨酸激酶活性的藥劑組合或者與其他治療細胞增殖疾病的類型(它可以或不可以調節酪氨酸激酶活性)組合使用。本領域中已知的可抑制酪氨酸激酶活性的藥劑包括，但不限于，反義核酸和靶向編碼受體酪氨酸激酶的核酸的核酶、可調節酪氨酸激酶活性的抗體和其他小分子酪氨酸激酶抑制劑如在US5,891,917、US5,217,999、US5,773,476、US5,935,993、US5,656,655、US5,677,329和US5,789,427中所述的那些。同時用于治療不同類型惡性腫瘤的治療細胞增殖疾病的其他類型的療法有許多例子。通常的療法是基于惡性腫瘤類型并不能特異性靶向酪氨酸激酶活性。在本發明的具體方面，本發明化合物可以與其他療法和治療白血病的治療劑結合使用。
除了上述治療用途，本發明化合物也可以用于診斷測定、篩選測定和作為研究工具。
在診斷測定中，本發明化合物可用于鑒別或測定細胞增殖疾病。在這種實施方案中，本發明化合物可以被放射標記(如本文前面所述)并與大量細胞接觸。細胞上放射標記的出現表明細胞增殖疾病。在具體實施方案中，本發明放射標記的化合物可用于測定表達bcr-abl融合蛋白的細胞的存在。
在篩選測定中，本發明化合物可用于鑒定調節細胞增殖或酪氨酸激酶活性的其他化合物。作為研究工具，本發明化合物可用于受體結合測定法和研究酪氨酸激酶的定位測定。在這種測定法中，該化合物也可以放射標記。
下列非限定型實施例是詳細說明本發明的。
實施例實施例1-34的材料和方法H NMR色譜是在500MHz用四甲基硅烷(TMS，Me4Si)作內標(δ＝0)在Varian Unity Plus色譜儀上獲得的。電子噴射質譜是在樣本直接導入到離子源的API III加三倍四極質譜(美國)上記錄的。薄層色譜層析是用0.25mm厚的UV-254鋁-裱背的TCL板(kieselgel 60 F254，默克，德國)上進行的。實施例13的化合物的HPLC分離是在Waters 600色譜分析儀(美國)Nova-Pak C183.9×300mm柱(Waters，美國)上進行的。真空蒸餾是用Kugelrohr儀器(Aldrich，美國)在蒸餾爐上所標溫度進行的。3，5-二甲氧基-4-羥基肉桂醛、4-硝基肉桂醛/3，4-二甲氧基肉桂酸、3，4-二羥基肉桂酸、3，4-二甲氧基苯甲胺、苯甲胺、苯乙胺、苯丙胺、氰基醋酸甲酯、2-氰基硫代乙酰胺、2-氰基乙酰胺、氰基醋酸、β-乙醇胺、2-氨基-1-亞丙基-1，1，3-三羰基腈是從Aldrich(美國)購買的并可回收使用。試劑是來自Aldrich(美國)。溶劑是從Caledon(加拿大)購買的。
實施例1N-(氰基乙酰基)-3，4-二甲氧基苯甲酰胺(A1) 向3，4-二甲氧基苯甲胺(2.7ml，18mmol)中加入氰基醋酸甲酯(1.6ml，18mmol)。將該反應加熱到100℃14小時。冷卻得到暗棕色固體，從乙醇中重結晶得到2.90g產物(69％得率)。
該產物得到下列分析數據NMR(CD3COCD3，δ，ppm)3.62(s，2H，CH2CN)，3.78(s，6H，(OMe)2)，4.34(br.s.，2H，NHCH2Ph)，6.84(dd，1H，J1.95和8.1Hz，H6)，6.88(d，1H，J8.1Hz，H5)，6.93(d，1H，J1.95 Hz，H2)，7.80(br.s.，1H，NH).MS，m/e(相對強度，％)235(19)[M+H]+，252(100)[M+NH4]+，257(33)[M+Na]+.
實施例2N-(氰基乙酰基)-3，4-二羥基苯甲酰胺(A2) 在氬氣下-78℃向N-(氰基乙酰基)-3，4-二甲氧基苯甲酰胺(實施例1，0.2g，0.85mmol)的20ml的CH2Cl2中加入三溴化硼(0.24ml，2.56mmol)的2.5ml的CH2Cl2。2小時后，將反應升到室溫并攪拌過夜。將該反應冷卻到0℃，加入10ml的1N HCl，該溶液用3×50ml的乙酸乙酯萃取，沖洗有機相到中性pH，用MgSO4干燥至干。殘余物通過硅膠色譜層析法(CHCl3-MeOH，20∶1)純化得到黃色固體(0.07g，40％得率)。該產物得到下列分析數據NMR(CD3COCD3，δ，ppm)2.83(s，(OH)2)，3.60(s，2H，CH2CN)，4.25(br.s.，2H，NHCH2Ph)，6.63(dd，1H，J1.95和8.1Hz，H6)，6.75(d，1H，J8.1Hz，H5)，6.79(d，1H，J1.95Hz，H2)，7.71(br.s.，1H，NH).MS，m/e(相對強度，％)207(38)[M+H]+，224(100)[M+NH4]+，229(2.6)[M+Na]+.
實施例3(E，E)-2-(3，4-二羥基苯甲酰氨基)-3-(3，5-二甲氧基-4-羥基苯乙烯基)丙烯腈(CR11)； 向3，5-二甲氧基-4-羥基肉桂醛(0.042g，0.2mmol)和N-(氰基乙酰基)-3，4-二羥基苯甲酰胺(實施例2，0.042g，0.2mmol)的10ml乙醇中加入3mg的β-丙氨酸并將該反應回流6小時。加水并將固體從5ml乙醇重結晶兩次得到0.06g(75％)的紅色固體。該產物得到下列分析數據
NMR(CD3COCD3，δ，ppm)2.81(s，(OH)3)，3.89(s，6H，(OMe)2)，4.39(br.s.，2H，NHCH2Ph)，6.68(dd，1H，J1.95和8.1Hz，Hz，H6’)，6.76(d，1H，J8.1Hz，H5’)，6.86(d，1H，J1.95 Hz，H2’)，7.07(br.s，2H，H2+6)，7.16(dd，1H，J11.7和15.1Hz，PhCCHCCN烯族)，7.37(d，1H，J 15.1Hz，PhCH烯族)，7.70(br.s.，1H，NH)，7.98(dd，1H，J0.75和11.7Hz，CHCN烯族).MS，m/e(相對強度，％)397(100)[M+H]+，414(14)[M+NH4]+.
實施例4N-(氰基乙酰基)苯甲酰胺(A3) 按照實施例1中所述將氰基醋酸甲酯(1.3ml，14mmol)加入到苯甲胺(1.5ml，14mmol)來制備該化合物。直接從該反應混合物(Kugelrohr儀器(Aldrich)，0.1mmHg，爐溫180-190℃)真空蒸餾該化合物得到淡白色固體(2.34g，95％)。該產物得到下列分析數據NMR(CD3COCD3，δ，ppm)3.39(s，2H，CNCH2)，4.46(d，2H，J5.4 Hz，NHCH2Ph)，6.40(br.s.，1H，NH)，7.24-7.36(m，5H，Ph).MS，m/e(相對強度，％)175(64)[M+H]+，192[M+NH4]+.
實施例53，4-二甲氧基肉桂醇(A6) 向0.42g(2.0mmol)的3，4-二甲氧基肉桂酸的50ml MeOH溶液中加入SOCl2(50μl)并在60℃將該混合物攪拌5小時。去干甲醇并在20℃無水THF(50ml)中用1M的氫化二異丁基鋁(8.0mmol)THF溶液還原所得到的3，4-二甲氧基肉桂酸甲酯1小時。加水，混合物用EtOAc萃取，用MgSO4干燥并真空蒸餾(Kugelrohr儀器(Aldrich)，0.1mm Hg，爐溫185-190℃)得到淡白色固體，得率0.36g(92％)，熔點70-71℃。該產物得到下列分析數據NMR(CD3COCD3，δ，ppm)3.77，3.82(2×s，2×3H，OMe+OMe)，4.19(d，2H，J5.0Hz，CH2OH)，6.25(dt，1H，J5.0和15.5Hz，PhCCH烯族)，6.51(d，1H，J 15.5 Hz，PhCH烯族)，6.89(m，2H，H5+6)，7.05(br.s.，1H，H2).MS，m/e(相對強度，％)177(100)[M-OH]+，195(4)[M+H]+，212(59)[M+NH4]+，217(26)[M+Na]+.
實施例63，4-二甲氧基肉桂醛(A7) 向重鉻酸吡啶鎓(3.88g，10.3mmol)和4g研細的新鮮激活的分子篩3_的20ml的CH2Cl2混合物中加入3，4-二甲氧基肉桂醇的10ml的CH2Cl2(實施例5，1.00g，5.1mmol)。將該反應攪拌2小時，加入0.5ml的甲醇，殘余物通過硅膠并用300ml的醋酸乙酯沖洗。蒸發后，用硅膠色譜層析法(己烷-EtOAc，5∶1)純化該化合物得到結晶油(0.62g，63％)。該產物得到下列分析數據NMR(CD3COCD3，δ，ppm)3.90(2×s，2×3H，OCH3+OCH3)，6.70(dd，1H，J7.6和16.0Hz，PhC＝CH烯族)，7.05(d，1H，J 8.3 Hz，H5)，7.28(dd，1H，J1.4和8.3Hz，H6)，7.37(d，1H，J 1.4 Hz，H2)，7.60(d，1H，J 16.0 Hz，PhCH烯族)，9.65(d，1H，J7.6Hz，CHO).MS，m/e(相對強度，％)193(100)[M+H]+，210(26)[M+NH4]+.
實施例7(E，E)-2-(苯甲酰氨基)-3-(3，4-二甲氧基苯乙烯基)丙烯腈(CR2)
按照實施例3所述將3，4-二甲氧基肉桂醛(實施例6，0.04g，0.2mmol)加入N-(氰基乙酰基)苯甲酰胺(實施例4，0.036g，0.2mmol)來制備該化合物。回流1小時和從乙醇重結晶后得到黃色固體(0.045g，62％)。該產物得到下列分析數據NMR(CD3COCD3，δ，ppm)3.90(s，2×3H，OMe+OMe)，4.57(d，2H，J＜2Hz，NHCH2Ph)，7.08(br.s.，1H，H2)，7.17(dd，1H，J11.5和15.2Hz，PhCCHCCN烯族)，7.23-7.42(m，8H，芳香族+H5+H6+PhCH烯族)，7.90(br.t，1H，NH)，8.05(dd，1H，J0.55和11.5Hz，CHCN烯族)。
實施例8(E，E)-2-(苯甲酰氨基)-3-(3，4-二羥基苯乙烯基)丙烯腈(CR4)-方法A 將三溴化硼(0.033ml，0.34mmol)加入(E，E)-2-(苯甲酰氨基)-3-(3，4-二甲氧基苯乙烯基)丙烯腈(實施例7，0.04g，0.11mmol)。殘余物通過硅膠色譜層析法(CHCl3-MeOH，10∶1)純化得到橘黃色固體(0.02g，55％得率)。該產物得到下列分析數據NMR(CD3COCD3，δ，ppm)2.86(br.s.，2H，(OH)2)，4.55(m，2H，NHCH2Ph)，6.90-7.42(m，10H，Ph+Ph’+烯族)，7.87(br.s.，1H，NH)，8.02(dd，1H，J＜0.5和11.4Hz，CHCN烯族).MS，m/e(相對強度，％)295(61)[M+H-CN]+， 321(100)[M+H]+，338(30)[M+NH4]+.
實施例93，4-雙(叔丁基二甲基硅氧基)肉桂酸(A8)
向3.6g(20mmol)的3，4-二羥基肉桂酸的300ml MeOH溶液中加入SOCl2(100μl)并在60℃將該混合物攪拌5小時。將甲醇揮干并在50℃用10.2g(68mmol)的t-BuMe2SiCl和9.2g(136mmol)咪唑的100ml的DMF處理所得到的甲酯0.5小時。將混合物用水稀釋并用己烷萃取。己烷揮干。殘余物真空蒸餾(Kugelrohr儀器(Aldrich)，0.1mm Hg，爐溫200-210℃)并在-20℃從己烷結晶得到白色固體，得率7.5g(89％)，熔點57-58℃。該產物得到下列分析數據MS，m/e(相對強度，％)423(100)[M+H]+，440(98)[M+NH4]+。
實施例103，4-雙(叔丁基甲基硅氧基)肉桂醇(A9) 按照實施例5所述在20℃無水THF(25ml)中用1M的氫化二異丁基鋁(4.0mmol)THF溶液處理3，4-二羥基肉桂酸雙(BDMS)醚甲酯(實施例9，0.42g，1.0mmol)1小時。真空蒸餾(Kugelrohr儀器(Aldrich)，0.1mmHg，爐溫185-200℃)后，得到白色粘稠油，得率0.33g(85％)。該產物得到下列分析數據NMR(CD3COCD3，δ，ppm)0.23，0.24(2×s，2×6H，Me2Si+Me2Si)，1.00，1.02(2×s，2×9H，t-BuSi+t-BuSi)，4.19(d，2H，J 4.9 Hz，CH2OH)，6.22(dt，1H，J4.9和16.0Hz，PhCCH烯族)，6.49(d，1H，J 16.0 Hz，PhCH烯族)，6.85(d，1H，J 8.2 Hz，H5)，6.92(dd，1H，J2.1和8.2Hz，H6)，6.97(d，1H，J 2.1 Hz，H2).MS，m/e(相對強度，％)377(100)[M-OH]+，395(2)[M+H]+，412(15)[M+NH4]+.
實施例113，4-雙(叔丁基二甲基硅氧基)肉桂醛(A10) 按照實施例6所述將3，4-雙(叔丁基二甲基硅氧基)肉桂醇(實施例10，0.2g，0.5mmol)的5ml的CH2Cl2溶液加入重鉻酸吡啶鎓(0.38g，1mmol)和1g分子篩3_的20ml的CH2Cl2混合物來制備該化合物。殘余物通過硅膠并用300ml的EtOAc-己烷1∶1沖洗。蒸發后化合物用硅膠色譜層析法(EtOAc-己烷，5∶1)純化得到油狀物(0.15g，76％)。該產物得到下列分析數據NMR(CD3COCD3，δ，ppm)0.26和0.28(2×s，2×6H，Me2Si+Me2Si)，1.01 and 1.02(2×s，2×9H，t-BuSi+t-BuSi)，6.60(dd，1H，J7.7和15.9Hz，PhCCH烯族)，7.01(dd，1H，J＜0.5和8.9Hz，H6)，7.27(m，2H，H2+5)，7.60(d，1H，J 15.9 Hz，PhCH烯族)，9.65(d，1H，J 7.7 Hz，CHO).MS，m/e(相對強度，％)367(3)[M+H-CN]+，393(100)[M+H]+，410(10)[M+NH4]+.
實施例12(E，E)-2-(苯甲酰氨基)-3-[3，4-雙(叔丁基二甲基硅氧烷基苯乙烯基)]丙烯腈(CR18) 按照實施例3將3，4-雙(叔丁基二甲基硅氧基)肉桂醛(實施例11，0.100g，0.26mmol)加入N-(氰基乙酰基)苯甲酰胺(實施例4，0.044g，0.26mmol)來制備該化合物。回流2.5小時后，用硅膠色譜層析法(己烷-EtOAc，15∶1)純化得到黃色固體(0.090g，64％)。該產物得到下列分析數據NMR(CD3COCD3，δ，ppm)0.24和0.25(2×s，2×6H，Me2Si+Me2Si)，1.01 and 1.02(2×s，2×9H，t-BuSi+t-BuSi)，4.55(br.s.，2H，NHCH2Ph)，7.00(d，1H，J 8.5 Hz，H4)，7.12(dd，1H，J11.7和15.6Hz，PhCCHCCN烯族)，7.24-7.43(m，8H，芳香族和烯族質子)，7.93(br.s.，1H，NH)，8.02(dd，1H，J＜0.5和11.7Hz，CHCN烯族).MS，m/e(相對強度，％)523(30)[M+H-CN]+，540(24)[M+NH4-CN]+，549(89)[M+H]+，566(100)[M+NH4]+.
實施例13(E，E)-2-(苯甲酰氨基)-3-(3，4-二羥基苯乙烯基)]丙烯腈(CR4)-方法B 在20℃用60μl 1M的氟化四正丁基胺在2ml干THF中的THF溶液處理(E，E)-2-(苯甲酰氨基)-3-[3，4-雙(正丁基二甲基硅氧烷基苯乙烯基)]丙烯腈(實施例12，0.028g，0.052mmol)0.5小時。蒸發后，將該化合物溶于5ml的氯仿-甲醇，20∶1，通過硅膠并用氯仿-甲醇，20∶1沖洗。殘余物用HPLC色譜層析法(MeCN-HO，60∶40，在340nmUV測定)純化得到橘黃色固體(0.010g，62％)。分析數據與實施例8中所述制備的化合物相同。
實施例14(E，E)-2-(3，4-二羥基苯甲酰氨基)-3-苯乙烯基丙烯腈(CR19) 按照實施例3所述，將肉桂醛(0.018ml，0.14mmol)加入N-(氰基乙酰基)-3，4-二羥基苯甲酰胺(實施例2，0.03g，0.14mmol)來制備該化合物。回流2小時和從乙醇重結晶后，得到黃色固體(0.027g，59％)。該產物得到下列分析數據NMR(CD3COCD3，δ，ppm)2.82(br.s.，2H，(OH)2)，4.39(br.s.，2H，NHCH2Ph)，6.70(dd，1H，J1.9和8.2Hz，H6’)，6.76(d，1H，J 8.2 Hz，H5’)，6.87(d，1H，J 1.9 Hz，H2’)，7.30(dd，1H，J11.3和15.7Hz，PhCCHCCN烯族)，7.47和7.73(2×m，6H，arc芳香族質子和PhCH烯族)，7.82(br.s.，1H，NH)，8.04(dd，1H，J＜0.5 and 11.3Hz，CHCN烯族).MS，m/e(相對強度，％)321(100)[M+H]+，338(65)[M+NH4]+.
實施例15(E，E)-2-(3，4-二羥基苯甲酰氨基)-3-[3，4-雙(叔丁基二甲基硅氧基苯乙烯基)]丙烯腈(CR20) 按照實施例3所述，將3，4-雙(叔丁基二甲基硅氧基)肉桂醛(實施例11，0.015g，0.038mmol)加入N-(氰基乙酰基)-3，4-二羥基苯甲酰胺(實施例2，0.0079g，0.038mmol)來制備該化合物。回流2小時并從乙醇重結晶后，得到黃色固體(0.014g，64％)。該產物得到下列分析數據NMR(CD3COCD3，δ，ppm)0.22和0.24(2×s，2×6H，Me2Si+Me2Si)，1.01和1.03(2×s，2×9H，t-BuSi+t-BuSi)，2.72(br.s.，2H，(OH)2)，4.41(br.s.，2H，NHCH2Ph)，6.68-7.42(m，8H，芳香族和烯族質子)，7.75(br.s.，1H，NH)，8.00(dd，1H，J＜0.5和12.0Hz，CHCN烯族).MS，m/e(相對強度，％)555(5)[M+H-CN]+，572(8)[M+NH4-CN]+，581(46)[M+H]+，598(100)[M+NH4]+.
實施例16(E，E)-2-(3，4-二羥基苯甲酰氨基)-3-(3，4-二羥基苯乙烯基)丙烯腈(CR21)
按照實施例13所述，在20℃，在1.5ml的干THF中，用60μl的1M的四正丁基氟化銨的THF溶液處理(E，E)-2-(3，4-二羥基苯甲酰氨基)-3-[3，4-雙(叔丁基二甲基硅氧基苯乙烯基)]丙烯腈(實施例15，0.026g，0.044mmol)0.5小時。純化后，得到黃色固體(0.006g，43％)。該產物得到下列分析數據NMR(CD3COCD3，δ，ppm)4.38(s，1H，NHCH2Ph)，6.67-7.22(m，6H，Ph+Ph’)，7.05(dd，1H，J11.8和15.5Hz，PhC＝CH烯族)，7.34(d，1H，J15.5Hz，PhCH烯族)，7.70(br.s，1H，NH)，8.00(d，1H，J 11.8 Hz，CH＝CCN烯族).MS，m/e(相對強度，％)186(86)[(HO)2C6H3CH＝CHCH＝CCN]+，202(28)，242(100)[M+H-C6H3(OH)2]+，353(13)[M+H]+，370(6)[M+NH4]+.
實施例17(E，E)-2-(苯甲酰氨基)-3-苯乙烯基丙烯腈(CR1) 按照實施例3所述，將肉桂醛(0.048ml，0.38mmol)加入N-(氰基乙酰基)苯甲酰胺(實施例4，0.066g，0.38mmol)來制備該化合物。回流1小時并從乙醇中重結晶后得到白色固體(0.074g，68％)。該產物得到下列分析數據NMR(CD3COCD3，δ，ppm)4.55(s，1H，NHCH2Ph)，7.24-7.51(m，11H，Ph+Ph’+PhCCHCCN烯族)，7.72(br.d，1H，J 6.5 Hz，CHCN烯族)，7.98(br.s.，1H，NH)，8.05(d，1H，J 11.7 Hz，PhCH烯族).MS，m/e(相對強度，％)289(100)[M+H]+，306(92)[M+NH4]+.
實施例18(E，E)-2-(苯甲酰氨基)-3-(3，5-二甲氧基-4-羥基苯乙烯基)丙烯腈(CR3) 按照實施例3所述，將3，5-二甲氧基-4-羥基肉桂醛(0.10g，0.48mmol)加入N-(氰基乙酰基)苯甲酰胺(實施例4，0.084g，0.48mmol)來制備該化合物。回流3小時并從乙醇中重結晶后得到黃色固體(0.10g，57％)。該產物得到下列分析數據NMR(CD3COCD3，δ，ppm)3.90(s，6H，(OMe)2)，4.55(m，2H，NHCH2Ph)，7.08(br.s，2H，H2+6)，7.17(dd，1H，J11.5和15.2Hz，PhCCHCCN烯族)，7.22-7.41(m，6H，Ph’+PhCH烯族)，7.90(br.s.，1H，NH)，8.01(dd，1H，J0.55和11.7Hz，CHCN烯族).MS，m/e(相對強度，％)275(14)[M+H-CN-MeOH-MeOH]+，307(9)[M+H-CN-MeOH]+，339(4)[M+H-CN]+，365(100)[M+H]+，382(16)[M+NH4]+.
實施例19N-(氰基乙酰基)苯基丙酰胺(A5) 按照實施例1所述，將氰基醋酸甲酯(0.98ml，11.1mmol)加入到苯丙胺(1.58ml，11.1mmol)來制備該化合物。直接從反應混合物中真空蒸餾(Kugelrohr儀器(Aldrich)，0.1mm Hg，爐溫195-200℃)該化合物得到淡白色固體(2.18g，97％)。該產物得到下列分析數據NMR(CD3COCD3，δ，ppm)1.88(q，2H，J 7.3 Hz，PhCCH2)，2.66(t，2H，J7.3Hz，PhCH2)，3.28(s，2H，CNCH2)，3.33(dt，2H，J7.3和6.6Hz，PhCCCH2)，6.02(br.s.，1H，NH)，7.15-7.30(m，5H，Ph).MS，m/e(相對強度，％)203(88)[M+H]+，220(100)[M+NH4]+.
實施例20N-(氰基乙酰基)苯基乙酰胺(A4) 按照實施例1所述，將氰基醋酸甲酯(1.1ml，12.4mmol)加入到苯乙胺(1.55ml，12.4mmol)來制備該化合物。直接從反應混合物中真空蒸餾(Kugelrohr儀器(Aldrich)，0.1mm Hg，爐溫190-195℃)該化合物得到淡白色固體(2.14g，91％)。該產物得到下列分析數據NMR(CD3COCD3，δ，ppm)2.80(t，2H，J 7.6 Hz，PhCH2)，3.46(br.t，2H，J7.6Hz，PhCCH2)，3.54(s，2H，CNCH2)，7.20-7.31(m，5H，Ph)，7.51(br.s.，1H，NH).MS，m/e(相對強度，％)189(100)[M+H]+，206(99)[M+NH4]+.
實施例21(E，E)-2-(苯乙酰氨基)-3-(3，4-二甲氧基苯乙烯基)丙烯腈(CR5) 按照實施例3所述，將3，4-二甲氧基肉桂醛(實施例6，0.1g，0.52mmol)加入到N-(氰基乙酰基)苯乙胺(實施例20，0.1g，0.52mmol)來制備該化合物。回流1小時并從乙醇中重結晶后獲得黃色固體(0.12g，63％)。該產物得到下列分析數據NMR(CD3COCD3，δ，ppm)2.91(t，2H，J 7.5 Hz，Ph’CH)，3.59(br.t，2H，J7.5Hz，Ph’CCH)，3.88，3.89(2×s，2×3H，OCH3+OCH3)，7.04(d，1H，J 8.6 Hz，H5)，7.16(dd，1H，J11.8和15.0Hz，PhC＝CH烯族)，7.20-7.42(m，9H，芳香族+烯族)，7.97(d，1H，J 11.8 Hz，CH＝CCN烯族).MS，m/e(相對強度，％)363(100)[M+H]+，380(34)[M+NH4]+.
實施例22(E，E)-2-(苯乙酰氨基)-3-(3，5-二甲氧基-4-羥基苯乙烯基)丙烯腈(CR8) 按照實施例3所述，將3，5-二甲氧基-4-羥基肉桂醛(0.1g，0.48mmol)加入到N-(氰基乙酰基)苯乙胺(實施例20，0.091g，0.48mmol)來制備該化合物。殘余物用硅膠色譜層析法(CHCl3-己烷，1∶1)純化得到黃色固體(0.15g，83％得率)。該產物得到下列分析數據NMR(CD3COCD3，δ，ppm)2.95(t，2H，J 7.6 Hz，CH2Ph’)，3.62(m，2H，CH2CPh’)，3.94(s，6H，(OMe)2)，7.11(s，2H，H2+6)，7.19(dd，1H，J11.7和15.3Hz，PhCCHCCN烯族)，7.23-7.36(m，5H，Ph’)，7.41(d，1H，J 15.3 Hz，PhCH烯族)，7.45(br.s.，1H，NH)，7.99(d，1H，J 11.7 Hz，CHCN烯族).MS，m/e(相對強度，％)379(100)[M+H]+，396(7)[M+NH4]+.
實施例23(E，E)-2-(苯丙酰氨基)-3-(3，5-二甲氧基-4-羥基苯乙烯基)丙烯腈(CR9) 按照實施例3所述，將3，5-二甲氧基-4羥基肉桂醛(0.10g，0.48mmol)加入到N-(氰基乙酰基)苯丙胺(實施例19，0.097g，0.48mmol)來制備該化合物。回流3小時后，殘余物用硅膠色譜層析法(CHCl3-己烷，1∶1)純化得到棕色固體(0.17g，90％得率)。該產物得到下列分析數據NMR(CD3COCD3，δ，ppm)2.09(q，2H，J 7.5 Hz，NHCCH2CPh’)，2.85(t，2H，J 7.5 Hz，CH2Ph’)，3.57(m，2H，CH2CPh’)，4.06(s，6H，(OMe)2)，7.24(s，2H，H2+6)，7.32(dd，1H，J11.7和15.3 Hz，PhCCHCCN烯族)，7.33-7.46(m，5H，Ph’)，7.53(d，1H，J 15.3 Hz，PhCH烯族)，7.58(br.s.，1H，NH)，8.11(d，1H，J 11.7 Hz，CHCN烯族).MS，m/e(相對強度，％)331(40)，348(30)，359(34)，376(32)，393(100)[M+H]+，410(24)[M+NH4]+.
實施例24(E，E)-2-硫代乙酰氨基-3-(3，5-二甲氧基-4-羥基苯乙烯基)丙烯腈(CR12) 按照實施例3所述，將3，5-二甲氧基-4-羥基肉桂醛(0.15g，0.72mmol)加入到2-氰基硫代乙酰胺(0.073g，0.72mmol)來制備該化合物。回流1小時后，殘余物在TLC-板上用己烷-乙酸乙酯，1∶1純化得到紅色固體(0.10g，52％得率)。該產物得到下列分析數據NMR(CD3COCD3，δ，ppm)2.85(br.s.，OH+NH2)，3.91(s，6H，(OMe)2)，7.11(s，2H，H2+6)，7.20(dd，1H，J11.6和15.1Hz，PhCCHCCN烯族)，7.46(d，1H，J 15.1 Hz，PhCH烯族)，8.22(dd，1H，J0.73和11.6Hz，CHCN烯族).MS，m/e(相對強度，％)289(100)，291(60)[M+H]+，312(8)[M+Na]+.
實施例25(E，E)-2-乙酰氨基-3-(3，5-二甲氧基-4-羥基苯乙烯基)丙烯腈(CR13) 按照實施例3所述，將3，5-二甲氧基-4-羥基肉桂醛(0.1g，0.48mmol)加入到2-氰基乙酰胺(0.04g，0.48mmol)來制備該化合物。回流3小時并從乙醇重結晶后，得到橘黃色固體(0.083g，63％得率)。該產物得到下列分析數據NMR(CD3COCD3，δ，ppm)2.82-2.88(br.s.，OH+NH2)，3.90(s，6H，(OMe)2)，7.08(s，2H，H2+6)，7.16(dd，1H，J11.6和15.1Hz，PhCCHCCN烯族)，7.38(d，1H，J 15.1 Hz，PhCH烯族)，7.96(dd，1H，J0.73和11.6Hz，CHCN烯族).MS，m/e(相對強度，％)275(100)[M+H]+，292(28)[M+NH4]+.
實施例26(E，E)-2-羧基-3-(3，5-二甲氧基-4-羥基苯乙烯基)丙烯腈(CR14) 按照實施例3所述，將3，5-二甲氧基-4-羥基肉桂醛(0.1 5g，0.72mmol)加入到氰基乙酸(0.061g，0.72mmol)來制備該化合物。回流1小時并從乙醇重結晶后，得到黃色固體(0.15g，75％)。該產物得到下列分析數據NMR(CD3COCD3，δ，ppm)3.00(br.s.，OH)，3.91(s，6H，(OMe)2)，7.12(s，2H，H2+6)，7.21(dd，1H，J11.6和15.1Hz，PhCCHCCN烯族)，7.50(d，1H，J 15.1 Hz，PhCH烯族)，8.04(dd，1H，J0.73和11.6Hz，CHCN烯族).MS，m/e(相對強度，％)276(66)[M+H]+，293(100)[M+NH4]+.
實施例27(E，E)-2-羰基甲氧基-3-(3，5-二甲氧基-4-羥基苯乙烯基)丙烯腈(CR15) 按照實施例3所述，將3，5-二甲氧基-4-羥基肉桂醛(0.15g，0.72mmol)加入到氰基乙酸甲酯(0.064ml，0.72mmol)來制備該化合物。回流1小時并從乙醇重結晶后，得到橘黃色固體(0.2g，90％)。該產物得到下列分析數據NMR(CD3COCD3，δ，ppm)2.84(br.s.，OH)，3.84(s，3H，COOMe)，3.91(s，6H，(OMe)2)，7.12(s，2H，H2+6)，7.21(dd，1H，J11.6和15.1Hz，PhCCHCCN烯族)，7.53(d，1H，J 15.1 Hz，PhCH烯族)，8.05(dd，1H，J0.73 and 11.6Hz，CHCN烯族).MS，m/e(相對強度，％)290(100)[M+H]+，307(99)[M+NH4]+.
實施例28(E，E)-2-乙酰氨基-3-[3，4-雙(叔丁基二甲基硅氧基苯乙烯基)]丙烯腈(CR16) 按照實施例3所述，將3，4-雙(叔丁基二甲基硅氧基)肉桂醛(實施例11，0.15g，0.38mmol)加入到2-氰基乙酰胺(0.032g，0.38mmol)來制備該化合物。回流0.5小時后，通過硅膠色譜層析法(己烷-EtOAc，5∶1)純化得到結晶油(0.10g，57％)。該產物得到下列分析數據NMR(CD3COCD3，δ，ppm)0.22 和0.24(2×s，2×6H，Me2Si+Me2Si)，1.01和1.03(2×s，2×9H，t-BuSi+t-BuSi)，7.01，7.23-7.29(m，3H，芳香族)，7.11(dd，1H，J11.9和15.3Hz，PhC＝CH烯族)，7.40(d，1H，J15.3 Hz，PhCH烯族)，7.98(d，1H，J 11.9 Hz，CH＝CCN烯族).MS，m/e(相對強度，％)459(100)[M+H]+，476(89)[M+NH4]+實施例29(E，E)-2-乙酰氨基-3-(3，4-二羥基苯乙烯基)丙烯腈(CR17) 按照實施例13所述，在20℃，在苯中，用過量的1M的四正丁基氟化銨的THF溶液處理(E，E)-2-乙酰氨基-3-(3，4-雙(叔丁基二甲基硅氧基苯乙烯基)]丙烯腈(實施例28，0.1g，0.22mmol)0.5小時。純化后，得到黃色固體(0.04g，85％)。該產物得到下列分析數據MS，m/e(相對強度，％)231(83)[M+H]+，248(100)[M+NH4]+.
實施例30N-(氰基乙酰基)β-乙醇酰胺(A11) 向β-乙醇胺(1.37ml，22.6mmol)中加入氰基乙酸甲酯(2.0ml，22.6mmol)。將該反應物在100℃加熱30小時。冷卻得到棕色固體，從乙醇中重結晶得到2.10g產物(71％)。該產物得到下列分析數據MS，m/e(相對強度，％)129(30)[M+H]+，146(100)[M+NH4]+.
實施例31(E，E)-2-(β-乙醇酰氨基)-3-(3，5-二甲氧基-4-羥基苯乙烯基)丙烯腈(CR24) 向3，5-二甲氧基-4-羥基肉桂醛(0.018g，0.086mmol)中加入N-(氰基乙酰基)β-乙醇酰胺(實施例30，0.010g，0.086mmol)。回流2小時并在硅膠上用CHCl3-MeOH，5∶1純化得到黃色固體(0.024g，87％)。該產物得到下列分析數據NMR(CD3COCD3，δ，ppm)3.47，3.67(2×m，4H，NHCH2+CH2OH)，3.90(s，6H，OCH3+OCH3)，7.07(br.s，2H，H2+6)，7.16(dd，1H，J11.7和15.2Hz，PhC＝CH烯族)，7.31(br.s，1H，NH)，7.38(d，1H，J 15.2 Hz，PhCH烯族)，7.97(d，1H，J 11.7 Hz，CH＝CCN烯族).MS，m/e(相對強度，％)319(70)[M+H]+，341(100)[M+Na]+.
實施例32(E，E)-2-(苯甲酰氨基)-3-(4-硝基苯乙烯基)丙烯腈(CR27) 按照實施例3所述，將4-硝基肉桂醛(0.022g，0.12mmol)加入到N-(氰基乙酰基)苯甲酰胺(實施例4，0.022g，0.12mmol)來制備該化合物。回流1小時后，產物用硅膠色譜層析法(CHCl3-MeOH，5∶1)純化得到黃色固體(0.033g，81％)。該產物得到下列分析數據NMR(CD3COCD3，δ，ppm)4.56(br.s，2H，NHCH2)，7.24-7.38(m，6H，Ph’+NH)，7.47(dd，1H，J11.1和15.2 Hz，PhC＝CH烯族)，7.62(d，1H，J 15.2Hz，PhCH烯族)，8.02，8.32(2×br.d，4H，J8.8和8.3Hz，Ph)，8.08(d，1H，J 11.1 Hz，CH＝CCN烯族).MS，m/e(相對強度，％)334(100)[M+H]+，351(16)[M+NH4]+，356(28)[M+Na]+.
實施例33(E，E)-2-(3，4-二羥基苯甲酰氨基)-3-(4-硝基苯乙烯基)丙烯腈(CR28) 按照實施例3所述，將4-硝基肉桂醛(0.009g，0.05mmol)加入到N-(氰基乙酰基)3，4-二羥基苯甲酰胺(實施例2，0.010g，0.05mmol)來制備該化合物。回流2小時并從乙醇中重結晶后，得到黃色固體(0.007g，39％)。該產物得到下列分析數據NMR(CD3COCD3，δ，ppm)2.81，2.83(2×br.s，2H，OH+OH)，4.39(br.s，2H，NHCH2)，6.69(br.d，1H，J＜0.5和7.6Hz，H6’)，6.76(d，1H，J 7.6 Hz，H5’)，6.86(br.d，1H，J＜0.5Hz，H2’)，7.47(dd，1H，J11.7和15.2Hz，PhC＝CH烯族)，7.61(d，1H，J 15.2 Hz，PhC烯族)，7.91(br.s，1H，NH)，8.02，8.31(2×br.d，4H，J8.2和8.8Hz，Ph)，8.06(d，1H，J 11.7 Hz，CH＝CCN烯族).MS，m/e(相對強度，％)331(21)[M-OH-OH]+，348(47)[M-OH]+，366(100)[M+H]+，383(97)[M+NH4]+.
實施例34(E，E)-2-(1-氨基-2，2-二氰基乙烯基)-3-(4-硝基苯乙烯基)丙烯腈(CR29) 按照實施例3所述，將4-硝基肉桂醛(0.051g，0.29mmol)加入到2-氨基-1-丙烯基-1，1，3-三腈(0.038g，0.29mmol)來制備該化合物。回流4小時并從乙醇中重結晶后，得到黃色固體(0.08g，51％)。該產物得到下列分析數據NMR(CD3COCD3，δ，ppm)7.54(dd，1H，J11.1和15.8Hz，PhC＝CH烯族)，7.67(d，1H，J 15.8 Hz，PhCH烯族)，7.99(d，1H，J 11.1 Hz，CH＝CCN烯族)，8.08，8.32(2×br.d，4H，J8.8和8.8Hz，Ph).MS，m/e(相對強度，％)309(100)[M+NH4]+，314(67)[M+Na]+.
實施例35在培養物中CR4對正常骨髓分化的作用按照Fausser和Messner(1978，Blood，52(6)143-8)和Messner和Fausser(1980，Blut，41(5)327-33)并作一些改動進行CFU-GEMM測定。簡而言之，將肝素處理過的骨髓細胞在Percoll(1.077gm/ml)(Pharmacia Fine Chemical，Piscataway NJ)上鋪層并在4℃以400g離心分離10分鐘以除去中性白細胞和RBCs。將2×105個細胞/ml的分級分離的BM細胞在補加30％FCS(CanseraRexdale，ON.)或正常人血漿、含有G-CSF(10ng/ml，Amgen)、IL-3(40U/ml，Immunex)、MGF(50ng/ml，Immunex)、紅細胞生成素(2u/ml，Epprex)或TPO(10ng/ml，Amgen)、5×10-5M β-2-巰基乙醇和特定濃度的CR4的細胞因子混合液的含有0.9％(vol/vol)甲基纖維素的IMDM(OCI，Toronto)中培養。將1ml體積的培養混合物平鋪在35mm培養皿上并在37℃、5％CO2濕潤環境中溫育。在14天評價所有培養基物BFU-E集落(定義為500個以上血紅蛋白化細胞或3個或更多個紅細胞類亞集落的聚集體)數、CFU-GM集落(定義為粒性白細胞或單核細胞-巨噬細胞或二者)數、CFU-Meg集落(包括4個或更多巨核細胞)數和CFU-GEMM集落(含有所有各種細胞的混合群體)數。
圖1所示的結果表明在至多5μM的劑量下CR4對正常骨髓的毒性可忽略不計。在10μM劑量下CR4開始產生一些BFU-E集落形成的抑制作用，但同時顯著刺激了CFU-GM集落數。
實施例36在培養物中低劑量的CR4對費城陽性急性淋巴母細胞白血病的殺傷在沒有外源性生長因子存在下，將1ml體積的Ph+ALL細胞平鋪在35mm的在含特定濃度的CR4的0.9％(vol/vol)甲基纖維素(Fluka，瑞士)中有αMEM(Gibco)加10％FCS(Cansera Rexdale，ON.)的培養皿(Nunc，Gibco)上。將培養物放在37℃、5％CO2的濕潤環境中。在12天或更早時用倒置顯微鏡計算由20個以上的細胞組成的集落數。
圖2中所示結果表明在低納摩爾劑量(35-100)下CR4對Ph ALL細胞增殖和存活有顯著抑制作用。在相同濃度下CR4對正常細胞沒有影響。
實施例37在培養物中低劑量的CR4對費城陽性Z119急性淋巴母細胞白血病細胞的殺傷在沒有外源性生長因子存在下，將1ml體積的Z119細胞以1×104個細胞/ml的密度平鋪在35mm的在含特定濃度的CR4的0.9％(vol/vol)甲基纖維素(Fluka，瑞士)中有IMDM(OCI，Toronto)加20％FCS(Cansera Rexdale，ON.)培養皿(Nunc，Gibco)上。將培養物放在37℃、5％CO2的濕潤環境中。在7天或更早時用倒置顯微鏡計算由20個以上的細胞組成的集落數。
圖3中所示結果表明在低納摩爾劑量下CR4對Z119 ALL細胞增殖和存活有顯著抑制作用。在相同濃度下CR4對正常細胞沒有影響。
實施例38在培養物中低劑量的CR4對AML-3急性髓白血病細胞的殺傷在沒有外源性生長因子存在下，將1ml體積的0CI-AML-3細胞以3.3×103個細胞/ml的密度平鋪在35mm含αMEM加20％FCS(Cansera Rexdale，ON.)、0.9％(vol/.vol)甲基纖維素(Fluka，瑞士)和特定濃度的CR4的培養皿(Nunc，Gibco)上。將培養基在37℃、5％CO2的濕潤環境中溫育。在5-6天用倒置顯微鏡對含20以上的細胞的集落計數。
圖4中所示結果表明在低納摩爾劑量(300-600nM)CR4對AML-3細胞增殖和存活有顯著抑制作用。在相同濃度CR4對正常細胞沒有影響。
實施例39在培養基中低劑量的CR4對Ly-MN淋巴瘤細胞的殺傷在沒有外源性生長因子存在下，將1ml體積的Ly-MN細胞平鋪在35mm的含IMDM(OCI，Toronto)加20％人cord血漿、0.9％(vol/.vol)甲基纖維素(Fluka，瑞士)和特定濃度的CR4的培養皿(Nunc，Gibco)上。將培養基放在37℃、5％CO2的濕潤環境中。在5天或更早時用倒置顯微鏡對20個以上細胞組成的集落計數。
圖5中所示結果表明在低納摩爾劑量CR4對細胞增殖和存活有顯著抑制作用并且在2.5μM有抑制作用。在相同濃度CR4對正常細胞沒有影響。
實施例40在培養基中CR4對原發性幼期骨髓(PrimaryJuvenile Myelo)-單核細胞白血病細胞的殺傷將肝素處理過的來自JMML患者的骨髓細胞在Percoll(1.077gm/ml)(Pharmacia Fine Chemical，Piscataway NJ)上鋪層并在4℃以400g離心分離10分鐘以除去中性白細胞和RBCs。將細胞進一步分級分離并在Miltenyi MS柱(Miltenyi Biotec GmbH，德國)純化獲得CD34+細胞的早期先祖群體。將分離的BM CD34+細胞以1×104個細胞/ml的密度在補加30％FCS(Cansera Rexdale，ON.)和特定濃度的CR4的含0.9％(vol/vol)甲基纖維素的IMDM(OCI，Toronto)中培養。將1ml體積的培養混合物平鋪在35mm培養皿上并在37℃、5％CO2濕潤環境中溫育。在12天或更早時用倒置顯微鏡對由20以上的細胞組成的集落計數。
圖6所示的結果表明CR4具有中等程度的殺傷原始JMML細胞的能力，在5μM濃度時達到80-90％抑制率。
實施例41在培養基中低劑量的CR4對OCI-LY2淋巴瘤細胞的殺傷在沒有外源性生長因子存在下，將1ml體積的OCI-LY2細胞平鋪在35mm的含IMDM(OCI，Toronto)加20％人脊髓血漿、0.9％(vol/.vol)甲基纖維素(Fluka，瑞士)和特定濃度的CR4的培養皿(Nunc，Gibco)上。將培養基放在37℃、5％CO2的濕潤環境中。在5天或更早時用倒置顯微鏡對20以上個細胞組成的集落計數。
圖7中所示結果表明在低毫摩爾劑量CR4對細胞增殖和存活有顯著抑制作用(在2.5μM，90％)。在相同濃度CR4對正常細胞沒有影響。
實施例42在培養基中CR17和CR21對費城陽性ALL細胞的殺傷在沒有外源性生長因子存在下，將1ml體積的ALL細胞平鋪在35mm的含αMEM(Gibco)加20％FCS(Cansera Rexdale，ON.)、0.9％(vol/.vol)甲基纖維素(Fluka，瑞士)和特定濃度的C化合物的培養皿(Nunc，Gibco)上。將培養基在37℃、5％CO2的濕潤環境中溫育。在12天用倒置顯微鏡對含20以上的細胞的集落計數。
圖8中所示結果表明在1-2.5μM劑量CR17對細胞生長有顯著抑制作用。在5μM濃度CR21對細胞生長沒有影響。
實施例43在培養基中CR17和CR21對費城陽性ALL細胞的殺傷在沒有外源性生長因子存在下，將1ml體積的ALL細胞平鋪在35mm的含αMEM(Gibco)加20％FCS(Cansera Rexdale，ON.)、0.9％(vol/.vol)甲基纖維素(Fluka，瑞士)和特定濃度的化合物的培養皿(Nunc，Gibco)上。將培養基在37℃、5％CO2的濕潤環境中溫育。在12天用倒置顯微鏡對含20以上的細胞的集落計數。
圖9中所示結果表明在1-2.5μM劑量CR17和CR21都對細胞生長有顯著抑制作用。
實施例44在培養基中CR24對費城陽性ALL細胞的殺傷在沒有外源性生長因子存在下，將1ml體積的ALL細胞平鋪在35mm的含αMEM(Gibco)加20％FCS(Cansera Rexdale，ON.)、0.9％(vol/.vol)甲基纖維素(Fluka，瑞士)和特定濃度的CR24的培養皿(Nunc，Gibco)上。將培養基在37℃、5％CO2的濕潤環境中溫育。在9天用倒置顯微鏡對含20以上的細胞的集落計數。
圖10中所示結果表明在0.5μM的低濃度時CR24可有效抗Ph+ALL細胞，這證實了在2.5和5μM之間實際上完全抑制了細胞生長。
實施例45在培養基中CR19對費城陽性ALL細胞的殺傷在沒有外源性生長因子存在下，將1ml體積的ALL細胞平鋪在35mm的含αMEM(Gibco)加20％FCS(Cansera Rexdale，ON.)、0.9％(vol/.vol)甲基纖維素(Fluka，瑞士)和特定濃度的CR19的培養皿(Nunc，Gibco)上。將培養基在37℃、5％CO2的濕潤環境中溫育。在9天用倒置顯微鏡對含20以上的細胞的集落計數。
圖11中所示結果表明在250和500nM之間的納摩爾濃度之間CR19可高效抗Ph+ALL細胞。
實施例46在培養基中CR19對正常骨髓分化的作用按照Fauser和Messner(1978，Blood，52(6)1243-8)和Messner和Fausser(1980，Blut，41(5)327-33)并作一些改動進行CFU-GEMM測定。簡而言之，將肝素處理過的骨髓細胞在Percoll(1.077gm/ml)(Pharmacia Fine Chemical，Piscataway NJ)上鋪層并在4℃以400g離心分離10分鐘以除去中性白細胞和RBCs。將2×105個細胞/ml的分級分離的細胞在補加30％FCS(CanseraRexdale，ON.)或正常人血漿、含有G-CSF(10ng/ml，Amgen)、IL-3(40U/ml，Immunex)、MGF(50ng/ml，Immunex)、紅細胞生成素(2u/ml，Epprex)或TPO(10ng/ml，Amgen)、5×10-5M β-2-巰基乙醇和特定濃度的CR19的細胞因子混合物的含有0.9％(vol/vol)甲基纖維素的IMDM(OCI，Toronto)中培養。將1ml體積的培養混合物平鋪在35mm培養皿上并在37℃、5％CO2濕潤環境中溫育。在14天評價所有培養基中BFU-E集落(定義為500個以上血紅蛋白化細胞或3個或更多個紅細胞類亞集落聚集體)數和CFU-C集落(定義為粒性白細胞或單核-巨噬細胞或二者)數。
圖12所示的結果表明在2.5μM CR19對BFU-E集落發展的顯著抑制，盡管在該濃度它也促進了CFU-C集落的形成。在5μM顯示出刺激作用并且BFU-E集落實際上不存在。
實施例47CR24、CR17和CR21對正常骨髓分化的作用按照Fauser和Messner(1978，Blood，52(6)1243-8)和Messner和Fausser(1980，Blut，41(5)327-33)并作一些改動(British Journal of Haematology，1992，80，第40-48頁)進行CFU-GEMM測定。簡而言之，將肝素處理過的骨髓細胞在Percoll(1.077gm/ml)(Pharmacia Fine Chemical，Piscataway NJ)上鋪層并在4℃以400g離心分離10分鐘以除去中性白細胞和RBCs。將2×105個細胞/ml的分級分離的BM細胞在補加30％FCS(CanseraRexdale，ON.)或正常人血漿、含有G-CSF(10ng/ml，Amgen)、IL-3(40U/ml，Immunex)、MGF(50ng/ml，Immunex)、紅細胞生成素(2u/ml，Epprex)或TPO(10ng/ml，Amgen)、5×10-5M β-2-巰基乙醇和特定濃度的CR19的細胞因子混合液的含有0.9％(vol/vol)甲基纖維素的IMDM(OCI，Toronto)中培養。將1ml體積的培養混合物平鋪在35mm培養皿上并在37℃、5％CO2濕潤環境中溫育。在14天評價所有培養基中BFU-E集落(定義為500個以上血紅蛋白化細胞或3個或更多個紅細胞類亞集落聚集體)數和CFU-C集落(定義為粒性白細胞或單核-巨噬細胞或二者)數。
圖13所示的結果表明在10或20μM的濃度CR24對骨髓集落的形成有最小抑制，而CR17和CR21都能在較高的20μM劑量抑制CFU-E集落的形成。
實施例48用CR4體內清除正常骨髓將肝素處理過的骨髓細胞在Percoll(1.077gm/ml)(PharmaciaFine Chemical，Piscataway NJ)上鋪層并在4℃以400g離心分離10分鐘以除去中性白細胞和RBCs。
為了清除步驟，將細胞以1×106/ml再懸浮于含或不含50μMCR4的完全培養基。在37℃、5％CO2將細胞與CR4溫育2.5小時。在結束時將細胞用培養基充分沖洗以除去CR4，然后以2×105個細胞/ml在含補加30％FCS(Cansera Rexdale，ON.)或正常人血漿、含有G-CSF(10ng/ml，Amgen)、IL-3(40U/ml，Immunex)、MGF(50ng/ml，Immunex)、紅細胞生成素(2u/ml，Epprex)或TPO(10ng/ml，Amgen)、5×10-5M β-2-巰基乙醇和特定濃度的CR19的細胞因子混合液的含有0.9％(vol/vol)甲基纖維素的IMDM(OCI，Toronto)中培養。將1ml體積的培養混合物平鋪在35mm培養皿上并在37℃、5％CO2濕潤環境中溫育。在14天評價所有培養基中BFU-E集落(定義為500個以上血紅蛋白化細胞或3個或更多個紅細胞類亞集落聚集體)數、CFU-C集落(定義為粒性白細胞或單核-巨噬細胞或二者)數和CFU-GEMM集落(含所有細胞的混合群體)數。
圖14所示的結果表明暴露于50μM CR4 2.5小時不會導致對集落形成的顯著抑制。而BFU-E集落出現輕微的下降，CFU-C集落數實際上顯著增加。
實施例49用CR4體外清除Z119急性淋巴母細胞白血病為了清除測定，將細胞再懸浮于含或不含CR4的完全培養基并在37℃、5％CO2將細胞與CR4溫育0-5小時。然后將細胞用培養基充分沖洗以除去CR4，再懸浮并在沒有外源性生長因子存在下，將1ml體積的細胞平鋪在35mm含αMEM(Gibco)加20％FCS(CanseraRexdale，ON.)、0.9％(vol/.vol)甲基纖維素(Fluka，瑞士)和特定濃度的CR19的培養皿(Nunc，Gibco)上。將培養基放在37℃、5％CO2的濕潤環境中。在9天或更早時用倒置顯微鏡對含20個以上的細胞的集落計數。
圖15中所示結果表明在所檢查的濃度CR4顯示出快速殺傷Z119細胞。50μM時，在只暴露2.5小時時CR4顯示出完全抑制，而在相同時期用25μM的CR4能夠達到85％的殺傷。將細胞暴露于25μM的CR45小時導致隨后細胞生長的完全脫離。
實施例50用CR4體外清除OCI-Ly2淋巴瘤細胞為了清除測定，將細胞再懸浮于含或不含CR4的完全培養基并在37℃、5％CO2將細胞與CR4溫育0-5小時。然后將細胞用培養基充分沖洗以除去CR4，再懸浮并在沒有外源性生長因子存在下，將1ml體積的細胞以5×103個細胞/ml平鋪在35mm的含IMDM(OCI，Toronto)加20％人cord血漿的0.9％(vol/.vol)甲基纖維素(Fluka，瑞士)的培養皿(Nunc，Gibco)上。將培養基放在37℃、5％CO2的濕潤環境中。在5天或更早時用倒置顯微鏡對含20個以上的細胞的集落計數。
圖16中所示結果表明在25-50μM只暴露5小時時CR4顯示出顯著殺傷(90％)OCI-Ly2細胞。同時在所實驗的更低的12.5μM劑量也能夠達到顯著抑制。
實施例51用CR4體外清除OCI-AML-3急性骨髓白血病細胞為了清除測定，將細胞再懸浮于含或不含CR4的完全培養基并在37℃、5％CO2將細胞與CR4溫育0-5小時。然后將細胞用培養基充分沖洗以除去CR4，再懸浮并在沒有外源性生長因子存在下，將1ml體積的細胞以5×103個細胞/ml平鋪在35mm的含αMEM(Gibco)加10％FCS(Cansera Rexdale，ON.)的0.9％(vol/.vol)甲基纖維素(Fluka，瑞士)的培養皿(Nunc，Gibco)上。將培養基放在37℃、5％CO2的濕潤環境中。在5天或更早時用倒置顯微鏡對含20個以上的細胞的集落計數。
圖17中所示結果表明在50μM只暴露2.5-5小時時CR4顯示出顯著殺傷OCI-AML-3細胞。同時在所實驗的更低的25μM劑量也能夠達到顯著抑制。
實施例52用CR4體外清除Romas B細胞Burkitt淋巴瘤細胞為了清除測定，將細胞再懸浮于含或不含CR4的完全培養基并在37℃、5％CO2將細胞與CR4溫育0-5小時。然后將細胞用培養基充分沖洗以除去CR4，再懸浮并在沒有外源性生長因子存在下，將1ml體積的細胞平鋪在35mm的含RPMI1640(Gibco)加10％FCS(Cansera Rexdale，ON.)的0.9％(vol/.vol)甲基纖維素(Fluka，瑞士)的培養皿(Nunc，Gibco)上。將培養基放在37℃、5％CO2的濕潤環境中。在12天或更早時用倒置顯微鏡對含20個以上的細胞的集落計數。
圖18中所示結果表明在50μM暴露5小時后CR4顯示出顯著殺傷(70％)Ramos細胞。
實施例53用CR4殺傷HuNS1多發性骨髓瘤在沒有外源性生長因子存在下，將1ml體積的HUNS1細胞以1×104個細胞/ml平鋪在35mm的含αMEM加20％ FCS(CanseraRexdale，Ont.)、0.9％(vol/.vol)甲基纖維素(Fluka，瑞士)和特定濃度的CR4的培養皿(Nunc，Gibco)上。將細胞培養基在37℃、5％CO2的濕潤環境中溫育。在5-6天用倒置顯微鏡對含20個以上的細胞的集落計數。
圖19中所示結果表明在高納摩爾到低毫摩爾之間的劑量(在2.5μM＞90％)CR4顯著抑制了細胞增殖和存活。在相同濃度下CR4對正常細胞沒有影響。
實施例54對NOD-SCID小鼠的費城陽性急性淋巴母細胞白血病的體內治療照射(350拉德)NOD-SCID小鼠并注射5×106費城陽性Z119急性淋巴母細胞白血病細胞。24小時后，皮下植入Alzet微型滲透泵(Alza公司，Paolo Alto，CA)，該泵含20mM的CR4的50％DMSO/基質溶液或只有50％DMSO/基質。使用Alzet2001泵，保持總體積200μl并在7-10天內每小時1μl。7天后替換該泵。各小鼠接受每日劑量0.154mg的CR4。
14(圖20A)和21(圖20B)天后，殺死小鼠并從前后肢抽取骨髓。制備單一細胞懸浮液，溶解紅細胞并用PE標記的同型、抗人CD19和抗人HLA-DR抗體給樣本染色以測定Z119細胞的存在。這些抗體都不能與鼠性細胞交叉反應。
在第14天，也對骨髓細胞培養基進行操作以評估Z119細胞的存在。將5×104BM細胞在補加有30％由FCS(Cansera Rexdale，ON.)和正常人血漿組成的1∶1混合物的含0.9％(vol/vol)甲基纖維素的IMDM(OCI，Toronto)中培養。不加細胞因子。在這些條件下沒有鼠源細胞的生長。將1ml體積的培養基混合物平鋪在35mm培養皿上并在37℃、5％CO2的濕潤環境中溫育。在9天評價所有培養基的ALL集落數。
圖20A和20B中所示的結果表明在第14和21天殺死時，在所有用CR4治療的小鼠中可以觀察到相對于DMSO治療對照小鼠骨髓的ALL浸潤顯著下降。
在對照小鼠中，可以觀察到脾、肝和腎的大量浸潤，以及ALL細胞在外周血液中的存在。除了ALL細胞浸潤到骨髓下降90％外，用CR4治療降低了器官和血液的ALL浸潤到可測定水平之下。
這樣，CR4在50nM到5μM濃度范圍抗各種癌細胞包括急性淋巴母細胞白血病、費城陽性ALL、急性骨髓白血病、骨髓瘤和B-譜系淋巴瘤是高度有效的。同時，當在CR4存在下溫育正常細胞直到達到10-20μM或更大濃度時可以看到最小毒性。CR4特別對抗bcr-abl轉化的費城陽性細胞具有活性，在40nM的低濃度時達到＞90％的去除率。CR4在高劑量(25-50μM)體外清除費城陽性ALL、AML和淋巴瘤測定時也是高效的，在2.5到5小時的暴露時間引起＞90％的生長抑制。在相同的劑量和時間不影響正常骨髓生長和分化。CR4對癌細胞顯示出高水平毒性和最小非特異性細胞毒性損傷的結合。
CR4在整個動物模型中也是高效(實施例54)。該化合物顯示了好的滯留特性，靜脈注射30分鐘后在血液中還是可以測定到的。在人PH+ALL的鼠模型中，CR4在兩周期間引起ALL浸潤到ALL細胞90％以上的下降，將ALL細胞浸潤到肝臟、腎臟、脾臟和外周血液中的百分率下降到可測定的水平。相反，只用載體治療的對照小鼠顯示出所有這些器官的巨大浸潤。沒有觀察到非特異性毒性的跡象。
實施例55用CR11體外清除正常骨髓將肝素處理過的骨髓細胞在Percoll(1.077gm/ml)(PharmaciaFine Chemical，Piscataway NJ)上鋪層并在4℃以400g離心分離10分鐘以除去中性白細胞和RBCs。
為了清除步驟，將細胞以1×106/ml再懸浮于含或不含50μMCR11的完全培養基。在37℃、5％CO2將細胞與tryrphostin溫育7小時。在結束時將細胞用培養基充分沖洗以除去CR11，然后以2×105個細胞/ml在含補加30％FCS(Cansera Rexdale，ON.)或正常人血漿、含有G-CSF(10ng/ml，Amgen)、IL-3(40U/ml，Immunex)、MGF(50ng/ml，Immunex)、紅細胞生成素(2u/ml，Epprex)或TPO(10ng/ml，Amgen)、5×10-5M β-2-巰基乙醇的細胞因子混合液的含有0.9％(vol/vol)甲基纖維素的IMDM(OCI，Toronto)中培養。將1ml體積的培養混合物平鋪在35mm培養皿上并在37℃、5％CO2濕潤環境中溫育。在14天評價所有培養基中BFU-E集落(定義為500個以上血紅蛋白化細胞或3個或更多個紅細胞類亞集落聚集體)數、CFU-C集落(定義為粒性白細胞或單核-巨噬細胞或二者)數和CFU-GEMM集落(含所有細胞的混合群體)數。
圖21所示的結果表明暴露于50μM CR11 7小時不會導致對集落形成的任何顯著抑制。BFU-E、CFU-GEMM和CFU-C集落都是正常的。
實施例56用CR11體外清除費城陽性急性淋巴母細胞白血病為了清除測定，將細胞再懸浮于含或不含CR11的完全培養基并在37℃、5％CO2將細胞與CR4溫育0-7小時。然后將細胞用培養基充分沖洗以除去CR11，再懸浮并在沒有外源性生長因子存在下，將1ml體積的細胞平鋪在35mm含αMEM(Gibco)加20％ FCS(CanseraRexdale，ON.)、0.9％(vol/.vol)甲基纖維素(Fluka，瑞士)的培養皿(Nunc，Gibco)上。將培養基放在37℃、5％CO2的濕潤環境中。在9天或更早時用倒置顯微鏡對含20個以上的細胞的集落計數。
圖22中所示結果表明在50μM暴露7小時后CR22顯示出完全殺傷PH+ALL細胞。
實施例57溶解費城(PH+)ALL系Z119和Z181(5×106個細胞/點)并用Bcr-Abl抗體免疫沉淀用溶胞緩沖液洗兩次并用激酶測定緩沖液洗一次沉淀物，再懸浮于含不同濃度的CR4的相同緩沖液中。加入10μCi33PγATP后，在室溫將該沉淀物與藥物一起溫育10分鐘。加入SDS-PAGE還原樣本緩沖液后20分鐘終止反應并在8-16％SDS-PAGE凝膠上分離。將產物轉移到硝基纖維素膜上并用放射自顯影法顯影。
圖23所示的結果表明在Z199和Z181 ALL細胞系中1到10μM濃度的CR4化合物有效阻斷了Bcr-Abi激酶活性。
實施例58將費城(PH+)ALL系Z119(5×106個細胞/點)與不同濃度的CR4預溫育5小時并用Jak2抗體免疫沉淀將細胞溶解在溶胞緩沖液中并用Jak2抗體免疫沉淀。加入10μCi33PγATP后，用溶胞緩沖液洗兩次并用激酶測定緩沖液洗一次沉淀物。加入SDS-PAGE還原樣本緩沖液后20分鐘終止反應并在8-16％SDS-PAGE凝膠上分離。將產物轉移到硝基纖維素膜上并用放射自顯影法顯影。
圖24所示的結果表明在6μM濃度顯著地抑制了Jak2激酶活性并且在較高濃度還可以阻斷。
當參考目前被認為是優選實施例描述本發明時，應當清楚本發明并不是限定于所公開的實施例中。相反，本發明目的是覆蓋包括在本發明所附權利要求的構思和范圍的各種改良和等同方案。
本文參考了所有公開出版物、專利和專利申請的全部加以引用，就如同參考了每個單獨公開出版物、專利或專利申請的全文具體地和分別地加以引用。
權利要求
1.通式I的化合物及其鹽、溶劑化物或水合物 其中R1和R2獨立地選自H、OH、C1-6烷基、C1-6烷氧基、NH2、NH-C1-6烷基、N(C1-6烷基)(C1-6烷基)、SH、S-C1-6烷基、O-Si(C1-6烷基)(C1-6烷基)(C1-6烷基)、NO2、CF3、OCF3和鹵素；R3選自H、OH、C1-6烷基、C1-6烷氧基、NH2、NH-C1-6烷基、N(C1-6烷基)(C1-6烷基)、SH、S-C1-6烷基、O-Si(C1-6烷基)(C1-6烷基)(C1-6烷基)、NO2、鹵素和CH2-S-(CH2)nAr；R4選自C(X)R5、SO3Ar、NH2、NH-C1-6烷基、N(C1-6烷基)(C1-6烷基)、P(O)(OH)2、P(O)(OC1-6烷基)2和C(NH2)＝C(CN)2；X選自于O、S、NH和N-C1-6烷基；R5選自NH2、OH、NH(CH2)pAr、NH(CH2)pOH、(CH2)pOC1-6烷基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、NHNH2、NHC(O)NH2、NHC(O)C1-6烷氧基、N-嗎啉基和N-吡咯烷基；并且Ar是用1-4個取代基取代的或沒有被取代的芳基或雜芳基，其中取代基獨立地選自OH、C1-6烷基、C1-6烷氧基、NH2、NH-C1-6烷基、N(C1-6烷基)(C1-6烷基)、SH、S-C1-6烷基、NO2、CF3、OCF3和鹵素；n是0到4；并且p是1-4。
2.按照權利要求1的化合物，其中R1和R2獨立地選自H、OH、C1-4烷基、C1-4烷氧基、NH2、NH-C1-4烷基、SH、S-C1-4烷基、O-Si(C1-4烷基)(C1-4烷基)(C1-4烷基)、NO2、CF3、OCF3和鹵素。
3.按照權利要求2的化合物，其中R1和R2獨立地選自H、OH、OCH3、O-Si(CH3)2(tBu)、S-Me、SH和NO2。
4.按照權利要求3的化合物，其中R1和R2都是OH或者R1和R2都是OCH3。
5.按照權利要求4的化合物，其中R1是OCH3并且R2是OH。
6.按照權利要求1的化合物，其中R3選自H、OH、C1-4烷基、C1-4烷氧基、NH2、NH-C1-4烷基、N(C1-4烷基)(C1-4烷基)、SH、S-C1-4烷基、NO2和鹵素。
7.按照權利要求6的化合物，其中R3選自H、OH、OCH3、SH、SMe、NO2和鹵素。
8.按照權利要求7的化合物，其中R3選自H、OH和OCH3。
9.按照權利要求1的化合物，其中R4選自于C(X)R5和C(NH2)＝C(CN)2。
10.按照權利要求9的化合物，其中R4是C(X)R5。
11.按照權利要求10的化合物，其中X選自于O和S。
12.按照權利要求10的化合物，其中R5選自NH2、OH、NH(CH2)pAr、NH(CH2)pOH和C1-4烷氧基。
13.按照權利要求12的化合物，其中p是1-3。
14.按照權利要求13的化合物，其中R5選自NH2、OH、NH(CH2)pAr、NH(CH2)pOH和OCH3。
15.按照權利要求14的化合物，其中p是1-2。
16.按照權利要求1的化合物，其中Ar是未取代的苯基或用1-4個取代基取代的苯基，其中的取代基任選于下組OH、C1-6烷基、C1-6烷氧基、NH2、NH-C1-6烷基、N(C1-6烷基)(C1-6烷基)、SH、S-C1-6烷基、NO2、CF3、OCF3和鹵素。
17.按照權利要求14的化合物，其中Ar是未取代的苯基或用1-4個取代基取代的苯基，其中的取代基任選于下組OH、C1-6烷基、C1-6烷氧基、NH2、NH-C1-6烷基、N(C1-6烷基)(C1-6烷基)、SH、S-C1-6烷基、NO2、CF3、OCF3和鹵素。
18.按照權利要求16和17中的任何一個的化合物，其中Ar是未取代的苯基或用1-2個取代基取代的苯基，其中的取代基任選于下組OH、C1-6烷基、C1-6烷氧基、NH2、NH-C1-4烷基、N(C1-4烷基)(C1-4烷基)、SH、S-C1-4烷基、NO2、CF3、OCF3和鹵素。
19.按照權利要求18的化合物，其中Ar是未取代的苯基或用1-2個取代基取代的苯基，其中的取代基任選于下組OH、OCH3、NH2、NHCH3、N(CH3)2、SH、S-CH3、CF3、OCF3和鹵素。
20.按照權利要求19的化合物，其中Ar選自于苯基和3，4-二羥基苯基。
21.按照權利要求1的化合物，選自(E，E)-2-(苯甲酰氨基)-3-苯乙烯基丙烯腈(CR1)；(E，E)-2-(苯甲酰氨基)-3-(3，4-二甲氧基苯乙烯基)丙烯腈(CR2)；(E，E)-2-(苯甲酰氨基)-3-(3，5-二甲氧基-4-羥基苯乙烯基)丙烯腈(CR3)；(E，E)-2-(苯甲酰氨基)-3-(3，4-二羥基苯乙烯基)丙烯腈(CR4)；(E，E)-2-(苯基乙酰氨基)-3-(3，4-二甲氧基苯乙烯基)丙烯腈(CR5)；(E，E)-2-(苯基乙酰氨基)-3-(3，5-二甲氧基-4-羥基苯乙烯基)丙烯腈(CR8)；(E，E)-2-(苯基丙酰氨基)-3-(3，5-二甲氧基-4-羥基苯乙烯基)丙烯腈(CR9)；(E，E)-2-(3，4-二羥基苯甲酰氨基)-3-(3，5-二甲氧基-4-羥基苯乙烯基)丙烯腈(CR11)；(E，E)-2-硫代乙酰氨基-3-(3，5-二甲氧基-4-羥基苯乙烯基)丙烯腈(CR12)；(E，E)-2-乙酰氨基-3-(3，5-二甲氧基-4-羥基苯乙烯基)丙烯腈(CR13)；(E，E)-2-羧基-3-(3，5-二甲氧基-4-羥基苯乙烯基)丙烯腈(CR14)；(E，E)-2-羰基甲氧基-3-(3，5-二甲氧基-4-羥基苯乙烯基)丙烯腈(CR15)；(E，E)-2-乙酰氨基-3-[3，4-雙(正丁基二甲基硅氧烷基苯乙烯基)]丙烯腈(CR16)；(E，E)-2-乙酰氨基-3-(3，4-二羥基苯乙烯基)丙烯腈(CR17)；(E，E)-2-(苯甲酰氨基)-3-[3，4-雙(叔丁基二甲基硅氧烷基苯乙烯基)]丙烯腈(CR18)；(E，E)-2-(3，4-二羥基苯甲酰氨基)-3-苯乙烯基丙烯腈(CR19)；(E，E)-2-(3，4-二羥基苯甲酰氨基)-3-[3，4-雙(正丁基二甲基硅氧烷基苯乙烯基)]丙烯腈(CR20)；(E，E)-2-(3，4-二羥基苯甲酰氨基)-3-(3，4-二羥基苯乙烯基)]丙烯腈(CR21)；(E，E)-2-(β-乙醇酰氨基)-3-(3，5二甲氧基-4-羥基苯乙烯基)丙烯腈(CR24)；(E，E)-2-(苯甲酰氨基)-3-(4-硝基苯乙烯基)丙烯腈(CR27)；(E，E)-2-(3，4-二羥基苯甲酰氨基)-3-(4-硝基苯乙烯基)丙烯腈(CR28)和(E，E)-2-(1-氨基-2，2-二氰基乙烯基)-3-(4-硝基苯乙烯基)丙烯腈(CR29)。
22.按照權利要求21的化合物，選自(E，E)-2-(苯甲酰氨基)-3-苯乙烯基丙烯腈(CR1)；(E，E)-2-(苯甲酰氨基)-3-(3，4-二甲氧基苯乙烯基)丙烯腈(CR2)；(E，E)-2-(苯甲酰氨基)-3-(3，5-二甲氧基-4-羥基苯乙烯基)丙烯腈(CR3)；(E，E)-2-(苯甲酰氨基)-3-(3，4-二羥基苯乙烯基)丙烯腈(CR4)；(E，E)-2-(苯基乙酰氨基)-3-(3，4-二甲氧基苯乙烯基)丙烯腈(CR5)；(E，E)-2-(苯基丙酰氨基)-3-(3，5-二甲氧基-4-羥基苯乙烯基)丙烯腈(CR9)；(E，E)-2-(3，4-二羥基苯甲酰氨基)-3-(3，5-二甲氧基-4-羥基苯乙烯基)丙烯腈(CR11)；(E，E)-2-硫代乙酰氨基-3-(3，5-二甲氧基-4-羥基苯乙烯基)丙烯腈(CR12)；(E，E)-2-乙酰氨基-3-(3，5-二甲氧基-4-羥基苯乙烯基)丙烯腈(CR13)；(E，E)-2-羧基-3-(3，5-二甲氧基-4-羥基苯乙烯基)丙烯腈(CR14)；(E，E)-2-羰基甲氧基-3-(3，5-二甲氧基-4-羥基苯乙烯基)丙烯腈(CR15)；(E，E)-2-乙酰氨基-3-(3，4-二羥基苯乙烯基)丙烯腈(CR17)；(E，E)-2-(3，4-二羥基苯甲酰氨基)-3-苯乙烯基丙烯腈(CR19)；(E，E)-2-(3，4-二羥基苯甲酰氨基)-3-(3，4-二羥基苯乙烯基)]丙烯腈(CR21)；和(E，E)-2-(β-乙醇酰氨基)-3-(3，5二甲氧基-4-羥基苯乙烯基)丙烯腈(CR24)。
23.按照權利要求22的化合物，選自(E，E)-2-(苯甲酰氨基)-3-(3，4-二羥基苯乙烯基)丙烯腈(CR4)；(E，E)-2-(3，4-二羥基苯甲酰氨基)-3-(3，5-二甲氧基-4-羥基苯乙烯基)丙烯腈(CR11)；(E，E)-2-乙酰氨基-3-(3，4-二羥基苯乙烯基)丙烯腈(CR17)；(E，E)-2-(3，4-二羥基苯甲酰氨基)-3-苯乙烯基丙烯腈(CR19)；(E，E)-2-(3，4-二羥基苯甲酰氨基)-3-(3，4-二羥基苯乙烯基)丙烯腈(CR21)；和(E，E)-2-(β-乙醇酰氨基)-3-(3，5二甲氧基-4-羥基苯乙烯基)丙烯腈(CR24)。
24.化合物(E，E)-2-(苯甲酰氨基)-3-(3，4-二羥基苯乙烯基)丙烯腈(CR4)。
25.化合物(E，E)-2-(3，4-二羥基苯甲酰氨基)-3-(3，5-二甲氧基-4-羥基苯乙烯基)丙烯腈(CR11)。
26.化合物(E，E)-2-(3，4-二羥基苯甲酰氨基)-3-苯乙烯基丙烯腈(CR19)。
27.一種組合物，它含有權利要求1到26中的任何一項的化合物并混有藥學上可接受的稀釋劑或載體。
28.權利要求1到26中任何一項所述的可調節細胞增殖的化合物在制備可調節細胞增殖藥物方面的用途。
29.權利要求1到26中任何一項所述的可抑制細胞增殖的化合物在抑制細胞增殖方面的用途。
30.權利要求1到26中任何一項所述的可抑制癌細胞增殖的化合物在抑制癌細胞增殖藥物方面的用途。
31.權利要求1到26中任何一項所述的化合物在治療癌癥方面的用途。
32.按照權利要求30或31的用途，其中所述的癌癥是造血細胞癌。
33.按照權利要求30或31的用途，其中所述的癌癥是白血病、淋巴組織瘤、骨髓瘤或惡性腫瘤。
34.按照權利要求33的用途，其中白血病是急性淋巴母細胞白血病、費城陽性白血病、費城陰性白血病、急性髓細胞白血病、慢性骨髓白血病、慢性淋巴細胞白血病或幼稚型脊髓單核細胞白血病。
35.按照權利要求34的用途，其中所述的白血病是急性淋巴母細胞白血病。
36.一種調節細胞增殖的方法，包括對需要治療的細胞或動物給予有效量的權利要求1到26任一項所述的可調節細胞增殖的化合物或權利要求27的組合物。
37.一種抑制細胞增殖的方法，包括對需要治療的細胞或動物給予有效量的權利要求1到26任一項所述的可抑制細胞增殖的化合物或權利要求27的組合物。
38.一種抑制癌細胞增殖的方法，包括對需要治療的細胞或動物給予有效量的權利要求1到26任一項所述的可抑制癌細胞增殖的化合物或權利要求27的組合物。
39.一種治療癌癥的方法，包括對需要治療的細胞或動物給予有效量的權利要求1到26任一項所述的可抑制癌細胞增殖的化合物或權利要求27的組合物。
40.按照權利要求38或39的方法，其中所述的癌癥是造血細胞癌。
41.按照權利要求38或39的方法，其中所述的癌癥是白血病、淋巴組織瘤、骨髓瘤或惡性腫瘤。
42.按照權利要求41的方法，其中所述的白血病是急性淋巴母細胞白血病、攻擊性費城陽性白血病、急性髓細胞白血病、慢性骨髓白血病、慢性淋巴細胞白血病或幼稚型脊髓單核細胞白血病。
43.按照權利要求42的方法，其中所述的白血病是急性淋巴母細胞白血病。
全文摘要
本發明公開了一種可用于治療各種細胞增殖疾病如惡性腫瘤的苯乙烯基丙烯腈的新化合物。該化合物為通式(I)。
文檔編號A61K31/66GK1429202SQ01808936
公開日2003年7月9日 申請日期2001年4月12日 優先權日2000年4月13日
發明者C·M·羅夫曼, T·格蘭伯格, O·魯諾瓦, P·德明, N·沙爾夫 申請人:Hsc研究與開發有限合伙公司