人米勒管衍生上皮細胞及其分離和使用方法

專利名稱：人米勒管衍生上皮細胞及其分離和使用方法
技術領域：
本發明屬于發育生物學和細胞生物學領域。具體而言，本發明涉及能夠分化成子宮、輸卵管、陰道、和宮頸細胞的米勒管衍生上皮細胞群體、分離米勒管衍生上皮細胞的方法、米勒管衍生上皮細胞的表征、和米勒管衍生上皮細胞的用途。
背景技術：
在過去的幾十年里，在關于女性生殖器官發育的研究中投入了大量的時間和精力。雖然研究背后的動力隨實驗室而不同，但是所有的研究工作都針對涉及女性整體健康的重要常見問題。這些問題包括宮頸癌、不孕、子宮內膜異位癥、子宮癌、宮外孕、卵巢囊腫、和子宮纖維瘤。例如，考慮到宮頸癌是世界范圍內女性中第二位最常見癌癥，每年診斷出大約450,000個新病例和近200,000例因宮頸癌的死亡，宮頸癌是關于女性健康的特別重要的話題(Pisani等人，J.Cancer，55891-903，1993)。盡管今天尚不知道宮頸癌的病因，然而有許多報告提出人乳頭瘤病毒(特別是HPV-16和HPV-18)感染可能是形成宮頸癌的原因。盡管宮頸癌研究在過去已經獲得進展，然而一些最關鍵的工作因人組織模型的缺乏而受阻。同樣，關于卵巢癌、子宮癌、子宮纖維瘤、或子宮內膜異位的研究也將極大受益于宮頸、子宮、輸卵管(法婁皮歐氏管)、和陰道的人組織模型的獲得。
女性生殖系統的宮頸、子宮、輸卵管、和部分陰道是在胚胎發生的早期由米勒管(也稱為副中腎管)形成的。在人類胚胎中，原始性腺嵴發育成原始性腺。在懷孕大約7周時，兩性都具有原始生殖管和原始性腺，后者發育成皮質和髓質。在遺傳女性中，皮質發育成米勒管，而髓質退化。相反，在遺傳男性中，髓質發育成睪丸，而皮質退化。隨著人類胚胎發育的進行，隨著米勒抑制物(或MIS)的分泌，男性的米勒管開始退化(Ganong，William F.，《Review of MedicalPhysiology》即醫學生理學回顧，第23章“The GonadsDevelopmentand Function of the Reproductive System”即性腺生殖系統的發育和功能，第15版，Appleton和Lange，1991)。米勒管是沿著與中腎管約略平行的中腎延伸并騰空形成泄殖腔的兩對胚管。在女性中，米勒管的上部形成輸卵管，而下部融合形成子宮、宮頸、和部分陰道。
關于米勒管的先前工作集中于米勒管的解剖和結構特征。例如，一項研究揭示了鳥類中極其類似人的米勒嵴的運動和米勒管的免疫組織化學染色(Jacob，M.等人，Cells Tissures Organs，164(2)63-81，1999)。在另一項研究中，通過超聲波檢查人類胎兒來研究發育中的尿殖道(Lawrence，W.D.等人，American Journal ofObstetrics and Gyneclogy，167(1)185-193，1992)。其它研究聚焦于發育中胎兒的基因表達模式(Pellegrini，M.等人，Anat.Embryol.，196(6)427-433，1997)。雖然這些研究在其各自領域是重要的，但是它們沒有提供關于分離米勒管衍生上皮細胞的方法的任何傳授，它們也沒有提供關于培養米勒管衍生上皮細胞并使之保留多能性的方法的任何傳授。只有很少(如果有的話)的報告是關于已經分離的米勒管衍生上皮細胞，關于具有分化成子宮、宮頸、輸卵管、和陰道細胞的多能性的米勒管衍生上皮細胞的報道更少。因此，需要發現米勒管衍生上皮細胞群體，和分離并表征米勒管衍生上皮細胞的方法。本文公開的發明滿足了這些需要，并公開了其它使用方法。
發明概述在一個方面，本發明涉及基本純的人米勒管衍生上皮細胞群體，它們具有分化成輸卵管、子宮、陰道、或宮頸細胞的多能性。
在另一方面，本發明涉及分離基本純的人米勒管衍生上皮細胞群體的方法，它們具有分化成輸卵管、子宮、陰道、和宮頸細胞的多能性。
在還有一個方面，本發明涉及維持基本純的人米勒管衍生上皮細胞群體的方法，它們具有分化成輸卵管、子宮、陰道、和宮頸細胞的多能性，以及維持或培養這些米勒管衍生上皮細胞并使之保持多能性的方法。
在還有一個方面，本發明涉及向異源受體提供免疫原的來源的方法，以及基本純的米勒管衍生上皮細胞群體作為免疫原的用途。
在還有一個方面，本發明涉及通過使用基本純的米勒管衍生上皮細胞群體或由其分化的細胞作為米勒管衍生細胞的來源并將米勒管衍生上皮細胞施用于非人哺乳動物受體來生成米勒管衍生細胞或由其分化的細胞(即輸卵管、子宮、陰道、和宮頸細胞)的人組織模型的方法。
在另一方面，本發明涉及提供細胞療法的方法，即將基本純的人米勒管衍生上皮細胞群體或由其分化的細胞導入受體。
在另一方面，本發明涉及提供藥物開發手段的方法，其中基本純的人米勒管衍生上皮細胞群體用作米勒管衍生生物學成分的來源，其中一種或多種上述米勒管衍生生物學成分是開發中藥物的作用靶。
在另一方面，本發明涉及提供生物測定法開發的方法，其中基本純的人米勒管衍生上皮細胞群體用作核酸或蛋白質的來源，其中核酸或蛋白質用作生物測定法或生物測定法開發中的一種或多種主要成分。
圖的簡述本專利的文件包括至少一幅彩圖。專利和商標事務所將在收到請求和必需的費用后提供本專利及彩圖的拷貝。


圖1A顯示了在相差顯微鏡下看到的米勒管上皮(MTE)細胞，呈緊密的上皮細胞集落。
圖1B顯示了在相差顯微鏡下看到的MTE細胞，在培養物中具有高密度時MTE細胞形成圓頂樣結構(由箭頭指示)。
圖1C顯示了在相差顯微鏡下看到的MTE細胞，具有平滑細胞外形和纖細的突起。這種細胞形態類似子宮內膜上皮細胞培養物。
圖2顯示了關于MTE細胞上幾種標記的免疫過氧化物酶染色的顯微照片。圖2A顯示了MTE細胞關于細胞角蛋白19的染色。圖2B顯示了MTE細胞關于細胞角蛋白10、11、和18的染色。圖2C顯示了MTE細胞關于細胞角蛋白13和16的染色。圖2D顯示了MTE細胞關于波形蛋白的染色。
圖3顯示了RT-PCR實驗結果，其中將Hoxa9、Hoxa10、和Hoxa11基因特異的PCR引物用于檢測由MTE細胞提取的總RNA中的HOX基因轉錄本。箭頭指示HOX基因轉錄本條帶的預期大小。
圖4顯示了移植到裸鼠中的米勒管上皮細胞移植重組體的組織學分析結果。MTE細胞形成類似子宮內膜和輸卵管的結構。“M”指示間充質部分，“L”指示內腔，長箭頭指示頂端上皮的位置，短箭頭指示腺上皮的位置。
發明實施方式為了幫助本領域技術人員實踐本發明而提供下文詳述。不應將詳述解釋成對本發明的限制，因為本領域普通技術人員可以修改本文公開的實施方案而不違背本發明的精神和范圍。在整篇公開書中，引用了多種發表物、專利、和已發表專利說明書作為參考。將這些發表物、專利、和已發表專利的公開書完整收入本公開書作為參考。
除非另有說明，本發明的實踐將采用免疫學、分子生物學、微生物學、細胞生物學、和重組DNA的常規技術，它們屬于本領域的技術范圍之內。參閱例如《MOLECULAR CLONINGA LABORATORY MANUAL》即分子克隆實驗室手冊，Sambrook等人，第2版，1989；《CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY》即分子生物學通用方案，F.M.Ausubel等人編，1987；《METHODS IN ENZYMOLOGY》即酶學方法叢書，Academic出版公司，PCR 2PRACTICAL APPROACH即PCR 2實踐方法，M.J.MacPherson、B.D.Hames、和G.R.Taylor編，1995；《ANTIBODIESA LABORATORY MANUAL》即抗體實驗室手冊，Harlow和Lane編，1988；和《ANIMAL CELL CULTURE》即動物細胞培養，R.I.Freshney編，1987。定義在用于說明書和權利要求書時，單數形式“一個”和“一種”包括復數指稱，除非文章另有清楚說明。例如，術語“一個細胞”包括一群細胞，還包括它們的混合物。
在用于說明書和權利要求書時，術語“米勒管衍生上皮細胞”、“米勒管衍生細胞”、和“米勒管細胞”可以互換，指由人米勒管衍生的細胞。這些細胞能夠分裂，而且尚未開始定型為基本不分裂的終端分化階段。“米勒管衍生上皮細胞”和“米勒管細胞”最初衍生自人胚的副中腎嵴。盡管男性和女性胚胎都具有米勒管，然而男性的米勒管隨著胚胎發育、隨著米勒抑制物(MIS)的分泌而退化，而女性的米勒管發育成輸卵管、子宮、子宮內膜、宮頸、和陰道上部。
“米勒管上皮細胞”和“MTE細胞”在本文中可以互換，指在標準體外細胞條件下培養的米勒管衍生上皮細胞。
在用于本文時，“副中腎管”和“米勒管”可以互換。“副中腎管”和“米勒管”衍生自胚胎發育早期的原始生殖管。
“多能性”指細胞仍能成為多種細胞但不再能夠成為體內任何細胞類型(即全能性)的階段。
在用于本文時，“由預定的米勒管衍生的”指多能細胞越過作為原始性腺嵴的一部分的階段且在最終分化的米勒管衍生細胞(諸如成熟的輸卵管、子宮、宮頸、和陰道細胞)階段之前的發育階段。稱為“由預定的米勒管衍生的”細胞被定型成為米勒管衍生細胞，但尚未開始發育成最終分化的米勒管衍生細胞。引起預定的米勒管衍生細胞開始分化的因素是不同的。非限制性范例包括暴露于激素(如雌激素、孕酮、促黃體素、等)、與周圍組織(即間充組織)的細胞-細胞接觸、和細胞的微環境。
“抗體”指能夠結合抗原的免疫球蛋白分子。在用于本文時，該術語不僅涵蓋完整的免疫球蛋白分子，還包括抗獨特型抗體、突變體、片段、融合蛋白、人源化蛋白質、和包含具有所需特異性的抗原識別位點的免疫球蛋白分子的修飾。
術語“抗原”指包含抗體能夠結合的一個或多個表位的分子。抗原可能是具有免疫原性的分子，即能夠誘導免疫應答。抗原被認為是一類免疫原。在用于本文時，術語“抗原”意欲指全長蛋白及其包含一個或一群表位的肽片段。
術語“表面抗原”和“細胞表面抗原”在本文中可以互換，指細胞的質膜成分。這些成分包括但不限于整合型和外周型膜蛋白、糖蛋白、多糖、脂類、和糖基磷脂酰肌醇(GPI)連接蛋白。“整合型膜蛋白”指穿越細胞質膜脂雙層的跨膜蛋白。典型的整合型膜蛋白包含至少一個跨膜區段，它通常包含疏水氨基酸殘基。外周型膜蛋白不伸入脂雙層的疏水內部，它們通過與其它膜蛋白的非共價相互作用而結合膜表面。GPI連接蛋白是通過插入脂雙層的脂尾而停留在細胞表面的蛋白質。
術語“單克隆抗體”在用于本文時指具有基本同質的抗體群體的抗體組合物。它并非意欲限制抗體的來源或生成方式(如通過雜交瘤或重組合成)。單克隆抗體是高度特異的，針對單一的抗原位點。與通常包含針對不同決定簇(表位)的不同抗體的常規(多克隆)抗體制劑相反，每種單克隆抗體針對抗原上的單一決定簇。
“單克隆抗體群體”指一群異質單克隆抗體，即群體所包含的各個單克隆抗體可能識別彼此不同的抗原決定簇。
“免疫原”指能夠誘導免疫應答的任何物質。將稱為免疫原的物質描述成具有“免疫原性”。誘導免疫應答包括但不限于激活體液應答(如生成抗體)或細胞應答(如引發細胞毒性T細胞)、炎癥應答(如募集白細胞)、和分泌細胞因子和淋巴因子。
術語“異源”在指稱用于免疫或移植的細胞時指細胞衍生自基因型與受體不同的實體。例如，異源細胞可以衍生自相對于受體的不同物種或相同物種的不同個體。衍生自一種物種的個體的胚細胞與相同物種的成體是異源的。“異源”在指稱受體時指受體的基因型與將要導入受體的細胞的來源不同。
“外植體”指取自人胎的米勒管組織。通常將外植體用作米勒管衍生細胞的來源。可以通過幾種方法由外植體分離細胞。一種方法是將米勒管組織外植體(整個組織或切成小塊)置于已知成分基本培養基中，并使米勒管的細胞由實體組織塊自然遷移到培養基中。另一種方法是將米勒管組織進行酶促消化或機械處理，促使細胞離開實體組織。
若細胞衍生自胚胎的三種胚層(外胚層、內胚層、或中胚層)之一，則細胞分別具有“外胚層”、“內胚層”、或“中胚層”起源。外胚層是外層，生成表皮細胞和神經系統。內胚層是內層，生成消化管的內襯及其相關器官。中間層即中胚層生成幾種器官(包括但不限于心臟、腎臟、間皮、和性腺)、結締組織(如骨、肌肉、腱)、和血細胞。
術語“培養基”和“細胞培養基”可以互換，指培養過程中哺乳動物細胞生長其中的水性微環境。培養基包含物理化學、營養、和激素微環境。
當血清在培養基中的體積百分比不能屏蔽細胞表面的抗原性位點或抗體結合位點時，則細胞培養基“基本不含血清”。通常在細胞培養基包含低于大約50％(體積比)、優選低于大約25％、甚至更優選低于大約5％、最優選低于大約0.1％的血清時，采用術語“基本不含血清”。
當在至少大約50％、更優選至少大約75％、甚至更優選至少大約90％、最優選至少大約95％的米勒管上皮細胞表面上，沒有衍生自血清的血清生物分子結合細胞表面，使得抗原位點或抗體結合位點受到結合或不能受到抗體或其部分的抗原識別，則此時細胞表面“基本不含血清生物分子”。可以通過顯微鏡或流式細胞計量術測量細胞大小，從而測定細胞表面。例如，各種已知大小的合成珠常用于校準流式細胞計量術。可以將少量的校準珠與MTE細胞混和，并通過流式細胞計量術分析產生的群體。然后可以將MTE細胞與校準珠的大小進行比較。既然珠的大小是已知的，那么就可以實現細胞表面積的計算。
在用于本文時，“基本純的”米勒管上皮細胞群體指包含至少大約85％、優選至少大約90％、甚至更優選至少大約95％或更多米勒管上皮細胞的細胞群體。
“已知成分培養基”、“基本細胞維持培養基”、“營養培養基”、和“基本營養培養基”在本文中可以互換，指包含培養過程中細胞存活和/或生長所必需的營養和激素需求且其成分已知的培養基。通常通過加入生長和/或存活所必需的營養物和生長因子來配制已知成分培養基。已知成分培養基通常提供至少一種來自下列一項或多項的成分1)所有必需氨基酸，通常是基本的一套20種氨基酸加胱氨酸；2)能源，通常是碳水化合物的形式，諸如葡萄糖；3)維生素和/或有低濃度需要的其它有機化合物；4)游離脂肪酸；和5)微量元素，其中微量元素定義為通常有很低濃度(通常是微摩爾級范圍)需要的無機化合物或天然存在元素。已知成分培養基還可任選的添加一種或多種來自下列任何項的成分1)一種或多種促有絲分裂劑；2)鹽和緩沖液，例如鈣、鎂、和磷酸鹽；3)核苷和堿基，諸如腺苷、胸苷、次黃嘌呤；和4)蛋白質和組織水解物。
在用于本文時，“條件培養基”指不含完整細胞、MTE細胞曾在其中生長的培養基。在營養培養基中生長的米勒管衍生細胞可能釋放可促進前分化原始狀態的米勒管上皮細胞連續存活、生長、和維持的因子。條件培養基可用于重建細胞沉淀，或者加到早已存在于培養板中的細胞中。條件培養基可以單獨使用，或者添加到用于飼養米勒管衍生細胞的營養培養基中。既然條件培養基衍生自營養培養基，而且本文所述營養培養基基本不含血清，那么條件培養基也基本不含血清。
“標準保溫條件”指在放置細胞的保溫箱中為了組織培養而設計的物理化學條件。標準保溫條件通常是大約37℃和大約5％CO2及增溫。應當在無菌條件下執行所有組織培養技術和設備。
“米勒管上皮細胞聚集體”、“MTE聚集體”、和“MTE細胞球”在全文中可以互換，指一塊米勒管上皮細胞單層，即在物理上緊密接近且具有細胞-細胞接觸的成片細胞。
“移植重組體”在用于本文時指米勒管上皮細胞聚集體與間充組織一起放置的組合單位。間充組織可以具有米勒管衍生的或非米勒管衍生的來源。間充組織可以來自移植受體的異源物種。間充組織還可以來自米勒管上皮細胞來源的異源物種。可以將移植重組體在底層(優選柔軟的生物學底層，如瓊脂)上保溫一段時間，即大約1小時-96小時、更優選大約6小時-48小時、甚至更優選過夜(大約24小時)。
“血清”在用于本文時指哺乳動物血液在血液凝結后剩余的流動相。
“血清生物分子”在用于本文時指在血清中發現的生物學組合物。范例包括但不限于清蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白、和γ-球蛋白。血清生物分子可以包括在血清中自然發現的或衍生自對血清的加工和處理的生物學組合物(整個或部分)。
術語“哺乳動物”指溫血脊椎動物，包括但不限于人、小鼠、大鼠、兔、猿猴、運動動物、和寵物。米勒管上皮細胞的分離和維持本發明的米勒管上皮細胞是由人胎米勒管衍生組織分離得到的。胎兒的年齡在大約1周-大約40周之間、優選大約8周-大約30周之間、甚至更優選大約17周-大約25周之間。可以通過大體解剖、外觀、和在胎兒中的定位來鑒定米勒管衍生組織。辨別米勒管的外觀特征是沿著與中腎管約略平行的中腎延伸并在女性中騰空形成泄殖腔的兩對胚管，管的上部形成輸卵管，而下部融合形成子宮和部分陰道。一旦進行了鑒定，將胎兒米勒管衍生組織與過量的結締組織分開，用基本培養基清洗五次，然后進行顯微解剖。顯微解剖的目的是將實體組織分成完整組織塊的小塊使得基本營養培養基更多的接觸組織塊中的米勒管衍生細胞，和/或將米勒管衍生細胞與米勒管組織塊分開。顯微解剖的非限制性范例包括實施機械剪切強制的裝置(即勻漿器、缽與杵、搗碎機、等)、實施切割或撕裂的裝置(即解剖刀、注射器、鑷子、等)、或超聲裝置。或者，顯微解剖胎兒米勒管衍生組織的另一種方法是使用酶處理。本領域眾所周知用于顯微解剖組織的多種酶。一種方法包括在維持由米勒管衍生組織分離的細胞存活的緩沖培養基中使用膠原酶-分散酶消化經部分剪切的米勒管衍生組織。酶量取決于胎兒的年齡和米勒管組織的大小。在一個實施方案中，使用膠原酶-分散酶的酶處理可能降低總的細胞產量。因此，應降低酶的用量，或者根本不用。在其它實施方案中，酶處理可能增加總的細胞產量。因此，可以單獨使用酶處理，或者聯合顯微解剖方法。有極其多種基本細胞維持培養基可用于將液體的pH維持在促進米勒管上皮細胞存活的范圍內并提供能夠在其中進行酶促消化的額外體積。非限制性范例包括F12/DMEM、Ham氏F10(Sigma)、CMRL-1066、極限必需培養基(MEM，Sigma)、RPMI-1640(Sigma)、Dulbecco氏修改Eagle氏培養基(DMEM，Sigma)、和Iscove氏修改Eagle氏培養基(IMEM)。另外，可以使用Ham和Wallace，Meth.Enz.，5844，1979；Barnes和Sato，Anal.Biochem.，102225，1980；或Mather J.P.和Roberts P.E.，1998，《Introduction to Cell and Tissue Culture》即細胞和組織培養導論，Plenum出版社，紐約中描述的任何基本營養培養基。
然后將小塊米勒管組織置于基本細胞維持培養基中。可以使用多種基本細胞維持培養基。范例包括但不限于Ham氏F12培養基、RPMI-1640、和CMRL-1066。為了獲得促進米勒管上皮細胞存活和生長的更佳條件，可以向基本培養基中添加多種營養物。范例包括但不限于胰島素、轉鐵蛋白、α-生育酚、和抑酶肽。在一個優選實施方案中，使用下列量的營養物來促進米勒管上皮細胞的存活和生長至少大約10ng/ml胰島素且不超過大約1mg/ml胰島素，更優選大約10μg/ml胰島素；至少大約1μg/ml轉鐵蛋白且不超過大約100μg/ml轉鐵蛋白，更優選大約10μg/ml轉鐵蛋白；至少大約0.1μg/ml α-生育酚且不超過大約1mg/ml α-生育酚，更優選大約5μg/ml α-生育酚；至少大約1μg/ml抑酶肽且不超過大約100μg/ml抑酶肽，更優選大約5μg/ml抑酶肽。
米勒管上皮細胞由米勒管組織遷移至米勒管組織所處培養基中。在一個實施方案中，米勒管上皮細胞以聚集體形式由米勒管組織遷移至培養基中。在另一個實施方案中，米勒管上皮細胞以單細胞形式由米勒管組織遷移至培養基中。在另一個實施方案中，由米勒管組織遷移出來的米勒管上皮細胞不再包埋在米勒管組織中，而是與該組織松散相連。然后將米勒管衍生細胞重懸于基本細胞維持培養基。可以在未經或經過不同底層包被的組織培養容器(即燒瓶、平板、等)中培養米勒管上皮細胞。可以使用的底層的非限制性范例包括纖連蛋白、層粘連蛋白、膠原、聚賴氨酸、硝酸纖維素、尼龍、和聚四氟乙烯。在一個實施方案中，在經層粘連蛋白包被的組織培養容器中在上文所述優選營養培養基中培養米勒管上皮細胞。在另一個實施方案中，在未經包被的組織培養容器中在上文所述優選營養培養基中培養米勒管上皮細胞。組織培養容器的大小與將要置于容器中的米勒管組織的量成正比。熟練技術人員可以通過逐步增加置于組織培養容器中的米勒管組織來確定組織培養容器的正確大小。當首次將米勒管組織置于組織培養容器中時，培養基就總濁度而言通常是清澈的。當米勒管衍生細胞由米勒管組織碎塊遷移出來后，培養基將變得越來越不透明和越來越混濁。當由于由米勒管組織遷移出來的米勒管衍生細胞的數量增加或由于米勒管衍生細胞的生長而培養基高度混濁時，向組織培養容器中加入更多營養培養基以補充米勒管細胞消耗掉的營養物。或者，當隨著米勒管上皮細胞的數量增加而培養基變得混濁時，可以由組織培養容器中取出少量細胞并檢查細胞存活力，例如通過錐蟲藍染色。已經超越限度容納過多細胞的組織培養容器將開始顯示細胞存活力下降。熟練技術人員就可以將組織培養容器的內容物轉移至更大(如更大的體積)的其它容器以容納數目漸增的細胞。在一個實施方案中，將組織培養容器的整個內容物轉移至更大體積的另一個容器。在另一個實施方案中，將米勒管細胞懸浮液分配到裝有新鮮營養培養基的幾個分開的組織培養容器中(也稱為“傳代培養”)。以這種方式可以獲得基本純的米勒管細胞群體。
可以在未經或經過不同底層包被的組織培養容器(如燒瓶、平板、等)中培養培養的米勒管細胞或米勒管上皮(MTE)細胞。可以使用的底層的非限制性范例包括纖連蛋白、層粘連蛋白、膠原、聚賴氨酸、硝酸纖維素、尼龍、和聚四氟乙烯。當在具有或沒有底層的優選營養培養基中培養時，MTE細胞形成單層。在一個實施方案中，在未被包被的組織培養瓶中生長的MTE細胞形成單層。在另一個實施方案中，在優選營養培養基中處于高密度的MTE細胞形成閉合的膨脹囊，其自由漂浮在優選營養培養基中。在還有一個實施方案中，MTE細胞在組織培養容器中形成單層片或單層聚集體。在還有一個實施方案中，MTE聚集體粘附于組織培養容器的表面并增殖形成單層細胞集落。可以傳代培養這些集落以繁殖MTE細胞。多種方法可用于MTE細胞集落的傳代培養。一種方法是通過酶處理使集落由塑料組織培養瓶壁脫附。在一個更優選的實施方案中，使用諸如膠原酶-分散酶等酶，其用量有效的使MTE聚集體由組織培養瓶壁解離同時保持細胞的聚集體結構。有效量是至少大約10％、更優選至少大約1％、最優選至少大約0.1％膠原酶-分散酶(體積比)。在MTE集落由組織培養瓶壁脫附后，用基本培養基(優選本文公開的營養培養基)洗去酶，并將MTE集落置于裝有營養培養基(優選本文公開的營養培養基)的新瓶中。可以將全部MTE集落置于一個加入營養培養基的組織培養瓶中，或者將部分MTE集落置于一個加入營養培養基的組織培養瓶中。通過這種方式的傳代培養，可以在至少大約2個月內、更優選至少1個月內、最優選至少2-3周內獲得匯合的細胞培養物。或者，可以量漸增的加入諸如堿性成纖維細胞生長因子(FGF)和毛喉素等生長因子以刺激增殖。在有些實施方案中，加入的FGF和/或毛喉素可促進MTE細胞的更高增殖速率且不縮短壽命。因此，當熟練技術人員期望較高增殖速率時，可以加入FGF和/或毛喉素。在其它實施方案中，加入的FGF和/或毛喉素可促進MTE細胞的更高增殖速率但縮短MTE細胞的壽命。因此，熟練技術人員可以根據他的需要來決定是否對MTE細胞數目增加的渴求高于對MTE細胞壽命的考慮。
飼養米勒管上皮細胞的頻率取決于MTE細胞的營養物代謝速率。營養物代謝速率越高，需要越頻繁的飼養MTE細胞。一般而言，隨著細胞代謝培養基中的營養物，培養基的酸度將升高。有些營養培養基(如RPMI-1640、DMEM、EMEM、等)具有指示酸度的培養基顏色，當培養基高度酸性時將變成明亮的粉紅色。然后可以加入營養培養基，將原有培養基的酸度降至維持MTE細胞存活并促進MTE細胞生長的酸度。或者，可以由組織培養容器中取出一小部分MTE細胞并檢查細胞存活力，例如通過錐蟲藍染色檢查。若營養培養基已被代謝掉，則細胞存活力將變差(即低于50％)。在一個實施方案中，可以通過用新的營養培養基更換整個舊的營養培養基來飼養米勒管上皮細胞。在另一個實施方案中，可以用曾經培養這些細胞的條件培養基來飼養米勒管上皮細胞。因為要求保護的米勒管上皮細胞對于本發明而言是獨特的，而且將分泌這些細胞特異的因子，所以由米勒管上皮細胞衍生的條件培養基也是獨特的。促進米勒管上皮細胞存活和生長的飼養頻率優選大約每周一次。本發明的米勒管上皮細胞可以傳代多次(大約4-5次)而不衰老且未誘導這些米勒管上皮細胞分化成最終分化的子宮、宮頸、陰道、或輸卵管細胞。米勒管上皮細胞的表征以本文公開的方式分離得到的本發明的米勒管上皮細胞群體具有幾個定義特征。首先，米勒管上皮細胞處于可以描述成“由預定的米勒管衍生的”階段。本發明的米勒管上皮細胞具有成為子宮、宮頸、陰道、或輸卵管細胞的能力。可以通過形態學或特異標記或者這兩種技術的聯合來實現米勒管上皮細胞的鑒定。MTE細胞的形態表征為彼此緊密接近、具有細胞-細胞接觸、且在緊密集落中生長的多邊形或卵形細胞的單層結構。當MTE細胞在組織培養容器中處于高密度時，它們能夠形成圓頂樣結構。圓頂樣結構的形成是腺上皮細胞的獨特特征。圓頂樣結構的形成指示MTE細胞在相鄰細胞之間形成閉合連接或緊密連接。通過常規或冷凍斷裂電子顯微術，或者通過對閉合連接標記的染色(即閉合連接蛋白質Z01、Z02、等)，可以使閉合連接顯現出來。除了形成圓頂樣結構，MTE細胞還能夠將蛋白質分泌到圓頂的內腔中。可以通過染料(即蘇木精、曙紅、等)的染色使蛋白質顯現出來。MTE細胞能夠呈現的其它形態是具有平滑外形和纖細突起的上皮細胞類型，與來自成人子宮內膜的子宮內膜上皮細胞培養物相似。
可用于檢測MTE細胞的標記包括但不限于MTE細胞表面上的細胞角蛋白(CK)1、5、6、7、8、10、11、13、15、16、18、和19和波形蛋白。可以采用對CK和波形蛋白特異的抗體來評估這些細胞表面標記。可以使用的抗體的范例包括但不限于來自Sigma化學公司的抗細胞角蛋白(CK)抗體克隆4.62、克隆8.12、克隆8.13和來自Sigma化學公司的抗波形蛋白抗體克隆13.2。抗CK抗體和抗波形蛋白抗體可用于免疫組織化學或流式細胞計量術中對MTE細胞的直接或間接染色。
本發明的MTE細胞還可由HOX基因的表達來表征。HOX基因是在果蠅中沿前后軸確定位置數值的同源異型選擇者基因的脊椎動物同系物。Hoxa9基因表達限于法婁皮歐氏管(輸卵管)，Hoxa10基因表達限于子宮內膜，Hoxa11基因表達限于宮頸內上皮細胞(Taylor，H.S.等人，Biology of Reproduction，571338-1345，1997)。使用本文公開的方法分離并培養MTE細胞，由MTE細胞提取總RNA，并使用對Hoxa9、Hoxa10、和Hoxa11基因序列特異的引物進行逆轉錄酶聚合酶鏈式反應(RT-PCR)。
本發明的MTE細胞還可由它們對不同激素或化合物的敏感性來表征。已知米勒抑制物(MIS)引起男性胚胎中米勒管的退化。將MIS應用于MTE細胞能夠引起幾種通過相差顯微鏡可觀察到的細胞形態效應。或者，可以通過暴露于MIS來調控MIS受體的表達。可以通過流式細胞計量術及MIS受體特異抗體來評估受體表達。激素諸如孕酮、雌激素、或促黃體素(LH)能夠影響MTE細胞。在女性胚胎中，暴露于孕酮和雌激素引起米勒管分化成子宮、輸卵管、宮頸、和部分陰道。在暴露于LH后，可以使用相差顯微鏡對MTE細胞監測細胞形態效應。或者，可利用增殖實驗監測細胞應答LH的生長。再或者，可以對MTE細胞進行子宮、宮頸、輸卵管、或陰道組織特異標記的染色，并通過免疫組織化學或流式細胞計量術進行分析。
在不含血清的培養基中將本發明的米勒管上皮細胞維持在可以描述成“由預定的米勒管衍生的”階段的階段。本文公開的基本細胞維持培養基或優選營養培養基或者條件培養基可用于在體外培養米勒管上皮細胞。本發明的米勒管上皮細胞具有在本文公開的優選無血清營養培養基中傳代多次的能力。在每次傳代的過程中和在每次傳代后的任意時間點，多能性得到維持，本發明的米勒管上皮細胞能夠分化成有功能的米勒管衍生細胞。另外，正如本文公開的，在每次傳代后的任意時間點，米勒管上皮細胞可以用作免疫原、用于細胞療法、用于生物測定法、用于建立人米勒管衍生模型、或用于藥物發現和/或開發。
本發明米勒管上皮細胞的另一個特征是在移植到受體哺乳動物的腎膜下后能夠分化成子宮、宮頸、輸卵管、或陰道細胞。米勒管上皮細胞可以單層形式生長，然后聯合間充組織并置于受體哺乳動物的腎膜下。優選的是，將人米勒管上皮細胞聚集體聯合大鼠尿殖間充組織，并置于受體哺乳動物的腎膜下。可以取下部分移植物用于使用標記、形態學、或其聯合的分析來鑒定米勒管衍生細胞及由其分化的細胞。米勒管上皮細胞的用途作為免疫原的用途米勒管上皮細胞的一種用途是作為免疫原。正如本發明公開的，獨特的無血清培養條件允許米勒管上皮細胞的細胞表面保持不含可能結合表面的血清蛋白質或血清生物分子。通過使用本文公開的無血清分離和培養技術，避免了抗原性位點可能被血清生物分子的結合所“屏蔽”的潛在問題。因此，可以生成針對最近才能夠獲得的、在使用含血清培養條件時被“屏蔽”的抗原的一組抗體。通過本文公開的方法分離和培養的米勒管上皮細胞可以作為免疫原施用于異源受體。可以通過幾種方法來實現MTE細胞作為免疫原的施用。將MTE細胞作為免疫原施用于異源受體的方法包括但不限于免疫接種、通過直接接觸(諸如擦拭或刮涂裝置)施用于膜、通過氣霧劑施用于粘膜、和口服施用。正如本領域眾所周知的，免疫接種可以是消極的或積極的免疫。可以通過不同路徑來執行免疫接種方法，包括但不限于腹膜內注射、皮內注射、局部注射。免疫接種的受試者包括哺乳動物，諸如小鼠。免疫接種的路徑和方案通常遵循已建立的用于抗體刺激和生成的常規技術。雖然此實施方案采用小鼠，但是可以依照本發明方法操作任何哺乳動物受試者包括人或由此而來的抗體生成細胞，作為生成哺乳動物雜交瘤細胞系的基礎。通常，將小鼠腹膜內接種免疫原性量的MTE細胞，然后用相似量的免疫原進行加強。或者，通過外科手術將在非生物學膜基質上生長的細胞移植到宿主哺乳動物腹膜內。最后一次加強后幾天收集淋巴樣細胞(優選來自小鼠的脾淋巴樣細胞)，并由此制備細胞懸浮液用于融合。
使用Kohler B.和Milstein C.，Nature，256495-497，1975的一般體細胞雜交技術，依照Buck D.W.等人，In Vitro，18377-381，1982的修改方案，由淋巴細胞和永生化骨髓瘤細胞制備雜交瘤。可以利用的骨髓瘤系，包括但不限于X63-Ag8.653和來自美國加利福尼亞州圣迭戈市細胞分配中心(Cell Distribution Center)索爾克研究所(Salk Institue)的細胞系，可用于雜交。該技術包括使用融合劑諸如聚乙二醇或者通過本領域技術人員眾所周知的電手段來融合骨髓瘤細胞和淋巴樣細胞。融合后，將細胞與融合培養基分開，并在選擇生長培養基諸如HAT培養基中培養，以消除未雜交的親本細胞。本文所述任何培養基都可用于培養分泌單克隆抗體的雜交瘤。作為細胞融合技術的另一種變通，可以將EBV永生化B細胞用于生成本發明的單克隆抗體。如果需要，將雜交瘤進行擴增和亞克隆，并通過常規免疫測定流程(如放射免疫測定法、酶免疫測定法、或熒光免疫測定法)對上清液測定抗免疫原活性。
可以使用已知流程在體外或在體內培養生成這些抗體的雜交瘤。如果需要，可以通過常規免疫球蛋白純化流程，諸如硫酸銨沉淀、凝膠電泳、透析、層析、和超濾，由培養基或體液分離單克隆抗體。若存在非期望活性，則可以通過例如使制劑流過由免疫原附著于固相而制成的吸附劑并由免疫原洗脫或釋放期望抗體而進行消除。
以這種方式，可以使用本發明的米勒管上皮細胞，生成針對米勒管上皮細胞特異性細胞表面抗原的一組新抗體。一旦通過本文公開的方法生成了針對米勒管上皮細胞上的細胞表面抗原的單克隆抗體，抗體就具有幾種用途。為了構建重組抗體或人源化抗體，可以將抗體測序和克隆。米勒管上皮細胞特異抗體的其它用途包括但不限于生物學測試或純化(即通過諸如流式細胞計量術和淘選等方法來分離米勒管衍生上皮細胞)、治療性用途(即通過抗體與靶細胞的結合來促進或阻滯細胞的生長或者通過抗體與靶細胞的結合來促進或阻滯細胞團的生長)、生物學標記(即其它米勒管衍生細胞或非米勒管衍生細胞的鑒定)、和臨床診斷(即癌性子宮、宮頸、輸卵管、或陰道細胞的鑒定)。
作為免疫原的另一種用途是調控異源受體中總的免疫應答。正如本領域詳細記錄的，導入異源受體的外源物質諸如細胞或器官可以誘導多種免疫應答。免疫應答可能是排斥(如在器官移植中)、T細胞激活(如交叉引發)、無反應性、或耐受的形式。總的免疫應答可能是全身的或局部的。在期望局部免疫應答的情況中，例如在性腺區域中，以有效量將免疫原諸如米勒管上皮細胞導入性腺區域。可以將量漸增的米勒管上皮細胞導入異源受體，隨后監測免疫應答，由此以逐步方式測定有效量。可以通過許多方法來監測總的免疫應答(如抗體生成、細胞因子生成、T細胞增殖、無反應性、耐受、等)，包括但不限于ELISA、增殖實驗、使用細胞表面標記的流式細胞計量術、和免疫組織化學。米勒管上皮細胞用于藥物發現的用途米勒管上皮細胞的另一種用途涉及藥物發現。既然尚未以本文公開的方式分離和培養預定的多能米勒管上皮細胞群體，那么米勒管上皮細胞群體可能分泌迄今尚未發現或表征的蛋白質。使用血清的先前培養技術可能抑制蛋白質的分泌。或者，當蛋白質分泌和與血清生物分子相互作用時，它們的功能、構象、或活性可能發生變化。由米勒管上皮細胞分泌的蛋白質受到來自血清生物分子的最小干涉，因而可能在生理學和拓撲學上更準確。因此，由米勒管上皮細胞分泌的蛋白質可以作為作用靶用于藥物開發。在一個實施方案中，可以將藥物制成在體內靶向米勒管上皮細胞和/或由其分化的細胞上的特異蛋白質。藥物的結合可能促進米勒管上皮細胞分化成子宮、宮頸、輸卵管、和陰道細胞。當期望子宮、宮頸、輸卵管、或陰道細胞新生時，例如在部分和完全子宮切除或組織損傷的情況中，這種方法可能是有用的。米勒管上皮細胞用于細胞療法的用途在另一種用途中，將米勒管上皮細胞系用于細胞療法。米勒管上皮細胞及由其衍生的細胞的移植是細胞療法的這樣一種范例。在期望成熟性腺細胞諸如子宮、宮頸、輸卵管、子宮內膜、和陰道細胞的情況中，可以使用本發明的米勒管衍生細胞，因為它們具有分化成子宮、宮頸、輸卵管、子宮內膜、和陰道細胞的能力。為了實踐這種用途，使用本文公開的方法分離米勒管上皮細胞，并在不含血清的已知成分營養培養基中進行培養。在經過或未經底層包被的組織培養容器中培養米勒管上皮細胞以獲得米勒管上皮細胞單層聚集體。將米勒管上皮細胞聚集體在標準保溫條件下培養至少大約一次細胞周期傳代、更優選至少大約兩次細胞周期傳代、最優選至少大約三次細胞周期傳代。然后可以將米勒細胞聚集體施用于受體并使之分化。或者，米勒細胞聚集體可用作基因療法的細胞載體，其中用一種或多種基因轉染米勒細胞，裝入投遞裝置，然后施用于受體。在另一個實施方案中，將米勒細胞聚集體置于腎膜下，并使之分化成子宮、宮頸、輸卵管、和陰道細胞。在另一個實施方案中，將米勒細胞聚集體用于包含細胞且限制其它細胞接近的裝置(即Theracyte)，以限制免疫系統應答。米勒管上皮細胞用于生成人組織模型的用途米勒管上皮細胞的另一種用途是在非人哺乳動物中構建人組織模型。將米勒管上皮細胞聚集體置于間充組織的頂端以形成移植重組體。間充組織可以是米勒管衍生組織或非米勒管衍生組織，而且可以衍生自與用于分離米勒管上皮細胞的物種不同的物種。在一個工作實施例中，將人米勒管上皮細胞置于大鼠間充尿殖組織的頂端以形成移植重組體。通過首先使用本文公開的方法分離人米勒管上皮細胞，然后聯合來自不同器官的間充組織，熟練技術人員可以逐步方式確定最佳組合。在有些實施方案中，使用不同物種(如大鼠)作為間充組織的來源，與人米勒管上皮細胞聯合。異源物種的使用允許將人特異標記用于測定已分化米勒管衍生細胞的身份。若使用大鼠間充組織，則假陽性的可能性降低。同樣，使用尿殖間充組織取代米勒管衍生間充組織降低了鑒定已分化米勒管衍生細胞時假陽性的可能性。將包含米勒管上皮細胞球且其置于間充組織上的移植重組體在柔軟底層(諸如瓊脂)培養優選大約半天-大約3天、更優選大約1天，然后置于受體哺乳動物的腎膜下。可能的受體哺乳動物包括但不限于小鼠和大鼠。通常，在移植部位，供體組織容易受到受體免疫系統的攻擊。為了減輕移植排斥，可以使用幾種技術。一種方法是以亞致死劑量輻射照射受體，以破壞可能攻擊移植物的免疫細胞。另一種方法是給予受體以環孢菌素或其它T細胞免疫遏制藥物。在使用小鼠作為受體哺乳動物時，多種方法可能減輕移植排斥。這樣的一種方法是使用免疫缺陷小鼠(裸鼠或重度聯合免疫缺陷或SCID)。在一個工作實施例中，將人米勒管上皮細胞球置于大鼠尿殖間充組織上，并置于免疫缺陷小鼠的腎膜下。將移植重組體在受體中保留大約1周-大約52周、優選大約5周-大約40周、甚至更優選大約6周-大約8周之后，收獲移植物并分析米勒管上皮細胞分化。在有些情況中，需要移植物的一小部分用于分析。在免疫組織化學分析中可以利用本文公開的MTE細胞及由其衍生的細胞的特異標記。另外，這些標記的一種或多種的聯合可以聯合細胞形態學使用，以測定移植的功效。
在一個實施方案中，可以在SCID(重度聯合免疫缺陷)小鼠中構建人米勒管衍生模型。可以如下構建這種人米勒管衍生模型使用通過本文公開的方法分離和培養人米勒管上皮細胞，使用人米勒管上皮細胞生成移植重組體，然后將移植重組體置于小鼠的腎膜下。在植入腎膜下大約1-10周、優選大約6-8周后，收獲移植物或其部分，并進行免疫組織化學分析。可以使用的米勒管衍生細胞上的細胞表面標記包括但不限于CK1、5、6、7、8、10、11、13、15、16、18、和19和波形蛋白。將本文公開的抗CK抗體或抗波形蛋白抗體用于分析組織模型系統的功效。或者，可使用米勒管衍生組織的已分化細胞中的受體(諸如雌激素受體和孕酮受體)特異標記。評估米勒管上皮細胞分化結果的還有一種方法是形態學。米勒管上皮細胞具有多邊形或卵形外觀，而已分化細胞類型具有與上皮細胞一致的形態，這對于本領域普通技術人員是眾所周知的。為了更完整的評估，可以將形態學聯合細胞表面標記使用。米勒管上皮細胞在生物測定法中的用途本文公開的米勒管上皮細胞可用于多種生物測定法。在一種用途中，將米勒管上皮細胞用于測定哪種生物學因子是分化所必需的。通過以逐步方式使用米勒管上皮細胞并聯合不同生物學化合物(諸如激素、特定生長因子、等)，可發現一種或多種特定生物學化合物能夠誘導成為子宮細胞的分化。采用相同的逐步聯合，可發現一種或多種特定生物學化合物能夠誘導成為輸卵管細胞的分化，這對宮頸和陰道細胞同樣是可能的。米勒管上皮細胞在生物學測定法中的其它用途是差異顯示(即mRNA差異顯示)和使用來自米勒管上皮細胞的分泌型蛋白質的蛋白質-蛋白質相互作用。可以通過諸如酵母雙雜交系統等技術來測定蛋白質-蛋白質相互作用。來自米勒管上皮細胞的蛋白質可用于鑒定與米勒管上皮細胞相互作用的其它未知蛋白質或其它細胞類型。這些未知蛋白質可以是下列一種或多種生長因子、激素、酶、轉錄因子、翻譯因子、和腫瘤抑制基因。涉及米勒管上皮細胞和這些細胞形成的蛋白質-蛋白質相互作用和蛋白質-蛋白質或甚至細胞-細胞接觸的效果的生物測定法可用于測定周圍組織(諸如間充組織)如何促進米勒管上皮細胞的分化。
下列實施例提供了分離、表征、和使用米勒管上皮細胞的詳述。這些實施例并非意欲以任何方式限制本發明。
實施例實施例1米勒管上皮細胞的分離由加利福尼亞州Alameda縣的Advanced Bioscience Research即高級生物科學研究所獲得孕齡17-25周的人胎米勒管組織。當組織抵達后，立即將米勒管清除過多的結締組織，并在顯微鏡下用刀片或剪刀切成小段。
將每個樣品的小段米勒管置于T75組織培養瓶中。培養基是添加10μg/ml胰島素、10μg/ml轉鐵蛋白、5μg/ml α-生育酚、和5μg/ml抑酶肽的無血清F12/DMEM，培養條件是37℃、5％CO2。沒有加入附著因子。小段米勒管中的上皮細胞增殖，遷移出來，并在原代培養的第一周附著于塑料表面。有些小段形成閉合膨脹囊并漂浮在培養基中。大多數小段組織保留在懸浮液中。附著于瓶壁上的上皮細胞增殖而形成大型集落。集落的大小在大約2周內達到直徑大約1-2cm。此時，可以將細胞傳代培養用于增殖。
可以用0.1％(體積比)膠原酶-分散酶處理MTE細胞集落。該酶混合物使細胞由塑料表面脫附，并使細胞保持小型單層聚集體形式。用營養培養基洗去酶后，以1∶10的稀釋因子在營養培養液中涂布MTE細胞。涂布效率較低，但是細胞級分在傳代培養后的第一周貼壁，并在2-3周內產生匯合的細胞培養物。每周補充培養基。堿性成纖維細胞生長因子(FGF)和毛喉素能夠刺激細胞增殖，但是生長因子似乎會縮短細胞的壽命。以這種方式將細胞傳代4-5次。實施例2米勒管上皮細胞的表征在相差顯微鏡下，根據形態將在原代培養中生長的細胞集落鑒定為都是上皮細胞。細胞保持彼此緊密接觸。由MTE細胞呈現的細胞形態有兩種。一種是緊密的上皮細胞集落(圖1A)。這些MTE細胞經歷了活潑的細胞分裂。MTE細胞顯得較小。處于高密度時，MTE趨向于形成圓頂樣結構(圖1B，以箭頭指示)。圓頂樣結構指示MTE細胞在相鄰細胞之間形成閉合連接。另外，MTE細胞將蛋白質分泌到圓頂的空腔中。另外，處于高密度時，細胞能夠在附著于塑料表面的最底層的上面形成第二層圓形細胞。
觀察到的另一種形態是具有平滑外形和纖細突起的MTE細胞(圖1C)。還在衍生自成人子宮內膜的子宮內膜上皮細胞培養物中觀察到這種細胞形態。這可能是由于米勒管產生許多類型的上皮細胞(即輸卵管、子宮、陰道、和宮頸)所致。實施例3MTE細胞關于細胞角蛋白和波形蛋白的免疫組織化學染色將MTE細胞單層培養物用3％低聚甲醛原位固定大約1小時。或者，可以將MTE細胞單層培養物用乙醇于-20℃固定大約5秒鐘，然后使之空氣干燥。用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗去固定劑后，將細胞順序在封閉緩沖液(5％山羊血清和0.1％吐溫20溶于PBS)中保溫大約30分鐘，然后是一抗大約1小時，再然后是抗小鼠Ig-辣根過氧化物酶大約1小時，各步之間用PBS漂洗。所用一抗是來自Sigma化學公司的抗細胞角蛋白抗體克隆4.62、8.12、8.13(圖3C)、和抗波形蛋白克隆VIM 13.2，使用供應商推薦的稀釋度。為了呈現抗體對MTE細胞的染色，將MTE細胞在由Sigma片劑制備的過氧化物酶底物DAB/H2O2中保溫。棕色產物指示存在特異抗原(圖2)。MTE細胞中的細胞角蛋白染色大大強于MTE細胞中的波形蛋白染色。實施例4MTE細胞中HOX基因轉錄本的檢測未成熟米勒管上皮細胞表達所有三種HOX基因，Hoxa9、Hoxa10、和Hoxa11(Taylor，H.S.等人，Biology of Reproduction，571338-1345，1997)。Hoxa9限于輸卵管細胞；Hoxa10限于子宮內膜細胞；而Hoxa11限于宮頸內上皮細胞。為了測試Hox基因的表達，由5代后的MTE細胞提取總RNA，并使用Hox特異引物通過RT-PCR擴增RNA。所用引物是Hoxa9accagaactggtcggtgat和agaggtacctggagacgat (SEQ ID NOS1-2)
Hoxa10cgcagaacatcaaagaagag和tgagaaaggcggaagtagc (SEQ ID NOS3-4)Hoxa11tacgtctcgggtccagat和atggcgtactctctgaaggt (SEQ ID NOS5-6)在2％瓊脂糖凝膠上將PCR產物分開，并用溴化乙錠將凝膠染色，以檢測PCR條帶。MTE細胞表達所有三種HOX基因(Hoxa9、Hoxa10、和Hoxa11)(圖3)。該結果得到了原位雜交的進一步確認。實施例5MTE細胞用于構建人組織模型或細胞療法的用途將由3代后的單層培養物收獲的MTE細胞與大鼠尿殖竇間充組織聯合使用，以生成組織移植重組體。將移植重組體在瓊脂板上培養大約24小時。然后，將移植重組體植入裸鼠(重度聯合免疫缺陷或SCID小鼠)的腎膜下。使植入物生長大約2個月，然后切除移植重組體組織并進行組織學分析。結果顯示MTE細胞形成類似子宮內膜或輸卵管的結構(圖4)。
權利要求
1.基本純的人米勒管衍生上皮細胞群體，其中所述米勒管衍生上皮細胞具有分化成子宮、輸卵管、宮頸、和陰道細胞的多能性。
2.依照權利要求1的米勒管衍生上皮細胞，其中在不含血清的培養基中維持米勒管衍生上皮細胞。
3.依照權利要求2的米勒管衍生上皮細胞，其中在不含血清的培養基中維持的米勒管衍生上皮細胞保留了分化成子宮、輸卵管、宮頸、和陰道細胞的多能性。
4.依照權利要求3的米勒管衍生上皮細胞，其中所述米勒管衍生上皮細胞的細胞表面基本不含血清生物分子。
5.依照權利要求1的米勒管衍生上皮細胞，其中所述米勒管衍生上皮細胞能夠通過至少一種細胞表面標記的表達而得到鑒定。
6.依照權利要求5的米勒管衍生上皮細胞，其中所述細胞表面標記是細胞角蛋白。
7.依照權利要求6的米勒管衍生上皮細胞，其中所述細胞角蛋白選自下組細胞角蛋白1、細胞角蛋白5、細胞角蛋白6、細胞角蛋白7、細胞角蛋白8、細胞角蛋白10、細胞角蛋白11、細胞角蛋白13、細胞角蛋白15、細胞角蛋白16、細胞角蛋白18、和細胞角蛋白19。
8.依照權利要求7的米勒管衍生上皮細胞，其中所述米勒管衍生上皮細胞還表達波形蛋白作為細胞表面標記。
9.依照權利要求8的米勒管衍生上皮細胞，其中所述米勒管衍生上皮細胞具有多邊形上皮細胞的形態。
10.分離基本純的米勒管衍生上皮細胞群體的方法，包括a)顯微解剖人胎米勒管衍生上皮細胞來源；b)將米勒管衍生上皮細胞來源置于不含血清的營養培養基中，其培養條件足以維持所述米勒管衍生上皮細胞的存活，其中不含血清的營養培養基所含營養物包括胰島素、轉鐵蛋白、α-生育酚、和抑酶肽；c)維持合適的培養條件，該條件足以使米勒管衍生細胞由米勒管衍生細胞來源遷移至不含血清的營養培養基中；d)維持合適的培養條件，該條件足以使米勒管衍生細胞形成單層集落；并e)將所述單層集落傳代培養，以獲得基本純的米勒管衍生上皮細胞群體。
11.向異源受體提供免疫原的來源的方法，包括以在所述受體中有效誘導免疫應答的量將權利要求1所述人米勒管衍生上皮細胞群體施用于所述受體。
12.在非人哺乳動物受體中生成米勒管衍生細胞的人組織模型的方法，包括將權利要求1所述人米勒管衍生上皮細胞群體施用于所述受體，其中首先在不含血清的培養基中維持所述米勒管衍生上皮細胞，然后施用于所述受體中能夠支持所述米勒管衍生上皮細胞的生長和分化的部位。
13.向受體提供細胞療法的方法，包括將權利要求1所述人米勒管衍生上皮細胞群體施用于所述受體，其中首先在不含血清的培養基中培養所述米勒管衍生上皮細胞，然后施用于所述受體中能夠支持所述米勒管衍生上皮細胞的生長和分化的部位。
14.提供米勒管衍生的組織特異性生物學成分的來源用于至少一種藥物的藥物開發的方法，包括分離權利要求1所述人米勒管衍生上皮細胞群體，并使用所述米勒管衍生上皮細胞或其任意細胞部分作為開發中藥物的作用靶。
15.提供核酸或蛋白質的來源用于生物測定法開發的方法，包括由權利要求1所述人米勒管衍生上皮細胞分離核酸或蛋白質，并使用所述核酸或蛋白質作為生物測定法中的一種或多種主要成分。
全文摘要
本發明公開了基本純的人米勒管衍生上皮細胞群體,以及分離和培養米勒管衍生上皮細胞的方法。通過小心操作米勒管衍生上皮細胞生長其中的微環境,可以得到多次傳代,其中米勒管衍生上皮細胞能夠成為子宮、宮頸、陰道、和輸卵管細胞。另外,本文還公開了使用人米勒管衍生上皮細胞及由其分化的細胞的幾種方法。
文檔編號A61K35/12GK1423692SQ01808098
公開日2003年6月11日 申請日期2001年4月4日 優先權日2000年4月7日
發明者李榮皓, J·P·瑪瑟 申請人:雷文生物技術公司