專利名稱：檢測和殺傷上皮癌細胞的方法
相關申請本申請是未決的國際申請PCT/US00/05387的部分繼續，國際申請于2000年2月28日遞交，名稱為“檢測和殺傷上皮癌細胞的方法”。
本發明的另一方面是涉及選擇性殺傷上皮癌細胞的方法。
在更進一步的方面，本發明涉及在正常細胞存在的情況下檢測上皮癌細胞和/或選擇性殺傷這種細胞的方法，其中癌細胞線粒體在足夠長的時間內保留線粒體標記劑，以識別和/或殺傷這種細胞。定義本文使用的下列術語具有所指出的含義“癌”或“癌性的”細胞在廣義上使用，包括入侵的癌細胞，原位癌細胞和嚴重發育異常的細胞。
“線粒體標記劑”意指一種化合物，其被活的癌細胞的線粒體選擇性地吸收，并選擇性地在癌細胞中保留足夠的時間，使得識別和/或殺傷癌細胞，或使癌細胞喪失能力。
“殺傷”細胞意指或者引起細胞死亡、凋亡，或者引起細胞不能繁殖和轉移的改變。
“加合物”意指線粒體標記劑和癌癥化學治療劑的共價或非共價反應產物。
“佐劑”意指是線粒體標記劑，其與其它化學治療劑結合，協同地或通過與其他試劑的加和作用，使殺傷癌細胞的能力提高。
例如，在Chenz，中國口腔病學雜志(2744-47(1992))和Filurin(口腔病學(俄羅斯)7244-47(1993))中公開了使用熒光素和熒光素衍生物的方法。這些方法包括使用染料，接著在紫外光下檢查，以檢測選擇性發出熒光的癌/癌變前組織。另一種現有技術的方法包括用甲苯胺藍漂洗上皮，接著通過普通的視覺檢查檢測任何選擇性染色的組織。這種方法已被公開，例如在Burkett(美國6,086,852)，Tucci(美國5,372,801)和Mashberg(美國4,321,251)的專利中公開。以類似的方式使用其它噻嗪染料和惡嗪染料在Pomerantz的美國專利5,882,627中公開。
迄今為止，已經建立理論，認為這種染料選擇性“標記”癌性組織是因為染料保留在癌性組織細胞間相對較大的間隙空間中，而不能有效地透過正常組織較緊密的細胞內連接，或選擇性地保留在這種相對較小的空間中。
與甲苯胺藍因選擇性保留在癌細胞間相對較大的間隙中，從而選擇性標記癌上皮組織的看法相反，這種陽離子染料，例如若丹明、熒光素、惡嗪和噻嗪染料(包括甲苯胺藍)和其它陽離子超活體標記劑選擇性染色上皮組織的機制是，標記劑在癌細胞線粒體中被選擇性吸收和選擇性保留。這種選擇性的線粒體吸收和保留明顯是由于與正常細胞線粒體相比，癌細胞線粒體的較高電位(在膜內側上的負電荷)。參見，例如Chen等，癌細胞1/改變的表型，75-85(冷泉港實驗室，1984)；Lampidis等，癌癥研究43，716-720(1983)。事實上，超活體陽離子染料和其它超活體陽離子標記劑對癌細胞的選擇性標記和在癌細胞線粒體中的保留與癌細胞的一種特性有關，該特性看來是造成癌細胞快速克隆生長和轉移能力的原因，即，癌細胞線粒體的較高電位是細胞能量的來源，是細胞產生ATP(三磷酸腺苷)的驅動力。
另一方面，我們發現一種在正常細胞存在的情況下選擇性殺傷癌細胞的治療方法。
我們的檢測方法包含下列步驟，將陽離子超活體線粒體標記劑遞送至上皮(其包含正常的和癌性的細胞)可疑癌性部位位點的組織，從而引起所述標記劑被吸收并選擇性保留在癌細胞的線粒體中。然后通過任何適宜的方法檢測癌細胞，例如，在可見光或所選擇的不可見光下，進行儀器或視覺檢查。
在又一實施方案中，標記劑被線粒體吸收后，在可疑癌性部位的位點使用漂洗試劑，從而提高標記劑自正常細胞線粒體釋放的速度，進而增加診斷方法的選擇性。
根據本發明的另一重要實施方案，我們提供一種選擇性殺傷癌上皮細胞的方法，包括下列步驟用陽離子超活體線粒體標記劑在可疑癌性部位的位點接觸癌細胞，以引起細胞死亡或使癌細胞基本上不能增殖。可以單一的不連續劑量，或連續地，或重復的不連續劑量將標記劑遞送至癌細胞，每次給藥后使用或不使用漂洗試劑。
在本發明的又一實施方案中，我們提供了一種提高癌癥化學治療劑的選擇性和殺傷癌細胞能力的方法，包括下列步驟或者(1)形成陽離子超活體標記劑和化學治療劑的反應產物，并將反應產物遞送至癌性上皮細胞，或者(2)將陽離子超活體標記劑與癌化學治療劑結合，通過加和或協同效果，或二者兼有，提高化學治療劑的選擇性和殺傷能力。
本發明的這些，其它和進一步的實施方案對本領域的技術人員是顯而易見的，可以通過下列實施例更好地理解本發明。實施例用于說明本發明，而不是對其范圍的限定，本發明的范圍僅通過權利要求加以限定。
在本發明的實踐和以下操作實施例中，陽離子超活體線粒體標記劑，包括染料，包括甲苯胺藍0，阿利辛藍，孔雀綠，酚藏花紅，吖啶黃素，焦寧Y，甲苯藍和亮綠；和“非-染料”化合物，包括甲基花青素，羥基硫胺素，替莫碘銨，依利醋銨和呋唑氯銨。
根據本發明目前的優選實施方案，優選的線粒體標記劑是惡嗪和噻嗪類染料。噻嗪類染料是特別優選的，尤其是甲苯胺藍0，天青A，天青B及其環取代和N-取代類似物。
為了被選擇性吸收并被保留在癌細胞線粒體中，標記劑或標記劑+化學治療劑的反應產物必須具有低于大約5,000的分子量。此外，由于各種密切相關的類似物的選擇標記和治療活性的顯著差異，標記劑的分子結構似乎顯著影響其在正常活細胞存在的情況下，選擇標記和/或殺傷活的癌細胞的能力。這些細胞標記和殺傷能力的差異與標記劑分子的結構特點有關，例如，標記劑分子的環-取代和N-取代的類型和位置，其涉及下列作用機理中的一種、多種或全部1.標記劑分子的結構，例如，陽離子分子上環和N-取代的位置和性質，影響正電荷的有效性并阻礙標記劑或其“堆積”基團被線粒體膜上或線粒體內部的負電荷吸引。
2.標記劑分子的結構使其插入癌細胞線粒體DNA或沿著癌細胞線粒體DNA的外部“堆積”。
3.標記劑分子的結構使其或其堆積基團與線粒體中特異性活性位點結合，例如與4種特異性蛋白結合，和/或與線粒體膜內表面的心肌磷脂沉淀。
4.標記劑的結構影響其還原電位及其變為不帶電荷的“無色”形式的趨勢。
5.標記劑的結構影響其酸度(pKa)，而且，又影響陽離子標記劑在生理pH下脫質子的能力。這樣，陽離子形式的染料可被吸引到線粒體膜的外表面，在線粒體膜上，染料陽離子可能丟失質子并伴隨丟失其正電荷，由此釋放中性形式的染料，其可以更容易地透過膜的非極性基質，并得以進入線粒體內部。
機制1染料-膜)、2(染料-堿基對或染料-染料)、和3(染料-蛋白質或染料-脂質)的分子間相互作用取決于染料的疏水性-親脂性，該性質可以通過各種方法評估，其中的一種方法是評估水溶液和低極性有機溶劑，如1-辛醇之間的分配系數(即，log P值)。機制4和5取決于疏水性-親脂性，這是由于反應物和產物在還原電位(氧化形式對還原形式)和pKa(中性形式對帶電形式)的不同溶劑化作用。例如，相對于仲胺(R2NH2+)，疏水性阻礙質子化叔脂肪胺(R3NH+)的溶劑化作用，由此降低它們的酸度。
根據本發明目前的優選實施方案，使用log P值約從-1.0至5的陽離子超活體標記劑。
提供下列實施例以使本領域的技術人員理解并實現本發明，并確定目前的優選實施方案。這些實施例僅用于說明之目的，而不限制本發明的范圍，本發明的范圍僅通過附加的權利要求來限定。
實施例1活體癌細胞中線粒體標記劑的吸收和保留在含有20％胎牛血清，1mM谷氨酰胺，氫化可的松，胰島素，鐵傳遞蛋白，雌二醇，硒和生長激素的RPMI培養基中，制備100，50，10和1μg/ml不同濃度的各種陽離子標記劑。
用每一種標記劑和濃度，在具有5％CO2和95％相對濕度的組織培養恒溫箱中，37EC培養癌細胞5分鐘，然后使用與1％醋酸孵育2分鐘的方法漂洗兩次。培養和漂洗之后，在第30分鐘，1小時，2小時，4小時和8小時收集細胞。然后用2-丁醇提取細胞，用分光光度法對標記劑進行定量分析。
結果表明標記劑在癌細胞和正常細胞線粒體中的積聚速率和標記劑自癌細胞釋放的選擇性具有濃度依賴性，但是這種濃度依賴性開始不太明顯。甲苯胺藍0的飽和濃度出現在10μg/ml和以上的濃度。類似地可以確定其它標記劑的飽和濃度。除非另有說明，甲苯胺藍0的保留實驗在10μg/ml的濃度進行，其它標記劑的保留實驗在用這種方法確定的飽和濃度進行。
實施例2標記劑在活細胞中的線粒體定位在培養和漂洗各種細胞系之后，使用不同的陽離子標記劑，通過使用共聚焦高分辨率顯微鏡和相差顯微鏡分析標記劑的線粒體定位。
在包括20％的胎牛血清和生長因子的完全生長培養基中培養活細胞，并在37EC保持。這些細胞在線粒體中積聚并保留標記劑。當這些細胞隨后在不含標記劑的培養基中生長時，癌細胞保留標記劑超過大約1小時，但正常上皮細胞在約15分鐘內釋放標記劑。
與活細胞相比，死細胞和用逸散線粒體膜電位的標記劑處理過的細胞失去線粒體染色并在細胞核中積聚標記劑。
實施例3標記劑自線粒體膜電位逸散的線粒體釋放用改變線粒體電位的已知試劑預處理上皮癌細胞，接著用陽離子超活體線粒體標記劑處理。這些預處理試劑包括疊氮化物和氰化物制劑和二硝基苯酚。
上皮癌細胞同樣經各種染料預染色，然后用這些已知試劑進行后處理。分析染料自細胞的釋放或染料向他亞細胞間隔，包括向細胞核的轉移。
用這些試劑預處理的細胞不能在線粒體中積聚染料，用這些試劑進行后處理，預染色細胞的線粒體釋放染料。
實施例4鱗狀癌的組織外植體分析切除的上皮癌新鮮外植體的標記劑吸收和保留。切除后，從周圍組織顯微解剖癌瘤，切成3mm切片，并作為外植體組織培養物在37℃培養。然后這些外植體與各種標記劑孵育，然后提取以量化標記劑。
口腔癌(SqCHN)快速吸收標記劑并延長這些標記劑的保留。在沒有標記劑的培養基中培養大約1小時之后，標記劑開始從細胞釋放。然而，當細胞在不合生長因子，胎牛血清和其他培養基添加劑的培養基中培養時，標記劑釋放得更快。當細胞在不利條件如低溫下生長時，標記劑也較快地釋放。
實施例5正常上皮細胞的組織外植體用外科手術方法從口腔上皮正常區域獲得的細胞被作為正常上皮培養物培養。然后這些培養物與標記劑孵育，以分析標記劑的吸收和保留。
與癌細胞不同，正常上皮細胞從它們的線粒體快速釋放標記劑，且自細胞釋放得更快。至10-15分鐘，大多數標記劑從線粒體釋放。
實施例6標記劑-化學治療劑加合物使用下列陽離子線粒體標記劑和各種已知化學治療劑的加合物替換實施例1-5的標記劑，除了癌細胞殺傷率和化學治療劑的選擇性實質上提高之外，結果基本相似。
標記劑 化學治療劑甲苯胺藍0 甲氨喋呤若丹明123 氮芥實施例7佐劑組合物已知癌化學治療劑和線粒體標記劑的下列組合顯示出協同或至少加和的癌細胞殺傷效果化學治療劑陽離子標記劑紫杉醇甲苯胺藍泰索帝天青A長春新堿 阿利辛藍選擇性治療的效果在下列實施例中，根據2000年7月11日授權給Burkett的美國專利6,086,852，中公開的制造方法制備甲苯胺藍藥物。然后用半制備的HPLC分餾和分離藥物組分，生產在‘852專利中鑒定的，由峰5、6、7和8代表的類似物。由峰7和8代表的化合物是甲苯胺藍異構體區(regioisomers)，在-2位(峰8)和-4位(峰7)具有環甲基。峰5代表的化合物是峰7的N-脫甲基衍生物，峰6代表的化合物是峰8的N-脫甲基衍生物。
實施例8與活的正常口腔上皮細胞相比，分析甲苯胺藍0分餾過程中獲得的由峰5、6、7和8代表的化合物，對活的口腔癌細胞(SqCHN)的選擇毒性。鱗狀癌細胞和正常上皮細胞的分離培養物與不同的染料餾分孵育，然后用不含染料的培養基清洗。然后再在生長培養基中培養細胞，觀察8天以確定細胞殺傷的程度。與僅僅大約20％正常細胞的殺傷相比，峰6化合物導致95％癌細胞的死亡。峰8化合物顯示89％的癌細胞死亡，而它僅引起約20％正常細胞的殺傷。因而，峰6和8化合物的選擇性保留對癌細胞是有選擇毒性的。
陽離子染料選擇性進入線粒體導致線粒體電位的中斷，該電位是細胞能量的來源和細胞產生ATP(三磷酸腺苷)的驅動力。癌細胞快速分裂和轉移的能力取決于這種高能量源泉的有效性。
然而，對電荷的作用似乎不是涉及的唯一機制，因為由峰5和峰7代表的化合物也是陽離子染料，它們卻未表現出與峰6和8相同的對癌的選擇毒性。因此，峰6和8的化合物看來具有其它的分子性能，導致它們對癌細胞的選擇毒性。
實施例9峰6和8化合物的治療特性是通過進一步的體內試驗確定的，體內試驗使用其它癌細胞和正常上皮細胞的分離物，按照實施例8的方法進行。試驗項目包括頭和頸、食道、肺、子宮頸和皮膚的其他鱗狀癌，以及其它類型的癌，包括腺癌，淋巴瘤和肉瘤。用攜瘤動物進行“腫瘤生長阻滯”和“腫瘤消退測定”的體內試驗，包括植入Balb-C小鼠頭和頸和肺的癌瘤，以分析這些化合物的體內治療效果。這些進一步的體外和體內試驗證實了峰6和8化合物對較多種癌細胞的選擇毒性。
已經以使本領域技術人員能夠理解和實施的方式描述了本發明，而且已經確定了本發明目前的優選實施方案。
權利要求
1.一種通過選擇性標記癌上皮細胞線粒體而在體內檢測癌上皮細胞的診斷方法，包括將陽離子超活體線粒體標記劑遞送至上皮的步驟。
2.一種選擇性殺傷上皮癌細胞的方法，包括將陽離子超活體線粒體標記劑遞送至上皮癌細胞的步驟。
3.根據權利要求2的方法，其中標記劑是陽離子超活體線粒體標記劑和癌化學治療藥物的反應產物。
4.根據權利要求2的方法，其中標記劑和其它的癌化學治療藥物共同遞送至上皮癌細胞，該癌化學治療藥物通過與標記劑殺傷癌細胞不同的機制選擇性殺傷癌細胞。
5.根據權利要求1或2的方法，其中對陽離子超活體線粒體標記劑進行選擇以提供一種分子結構，該結構不會阻礙標記劑的正電荷被線粒體膜上的負電荷吸引。
6.根據權利要求1或2的方法，其中對陽離子超活體線粒體標記劑進行選擇以提供一種分子結構，該結構允許標記劑與線粒體的特異性位點結合。
7.根據權利要求1或2的方法，其中對陽離子超活體線粒體標記劑進行選擇以提供一種結構，該結構可以插入線粒體的DNA或者沿著線粒體DNA堆積。
8.根據權利要求1或2的方法，其中對陽離子超活體線粒體標記劑進行選擇以提供一種分子結構，該結構影響標記劑的還原電位以使其在進入線粒體之前、之中或之后，變為不帶電荷的無色形式。
9.根據權利要求1或2的方法，其中對陽離子超活體線粒體標記劑進行選擇，以提供一種在生理pH下脫質子的分子結構。
10.根據權利要求1或2的方法，其中陽離子超活體線粒體標記劑具有0-5的log P值。
全文摘要
一種通過選擇性標記癌細胞線粒體,通過將陽離子超活體線粒體標記劑遞送至上皮而檢測癌性上皮細胞診斷方法。通過將陽離子超活體線粒體標記劑遞送至上皮癌細胞,實現在正常細胞存在的情況下選擇性殺傷癌性上皮細胞的目的。該殺傷劑還可以包含標記劑和癌化學治療藥物的反應產物或者與藥物的混合物。
文檔編號A61K47/48GK1365288SQ01800660
公開日2002年8月21日 申請日期2001年2月27日 優先權日2000年2月28日
發明者塞繆爾·伯納爾, 道格拉斯·D·伯克特, 拉爾夫·E·格林, 塞斯·D·羅斯 申請人:日拉公司