專利名稱：包含表皮生長因子作為活性成分的穩定組合物的制作方法
技術領域：
本發明涉及包含表皮生長因子(下文中稱作“EGF”)作為活性成分的穩定組合物。更具體地說，本發明涉及包含具有生物活性的EGF和能顯著增加水溶液中EGF的穩定性的羧乙烯基聚合物基質的穩定組合物。
EGF(即尿抑胃素)是由53個氨基酸殘基組成并包括3個二硫鍵的、分子量為6045的多肽。EGF被認為是皮膚和角膜的傷口愈合劑以及胃潰瘍愈合劑，因為它表現出良好的刺激各種細胞包括表皮細胞和間充質細胞的有絲分裂及其生長和控制胃酸分泌的活性。(美國專利第140998號；Carpenter，實驗細胞研究，1641-10，1986)。
盡管EGF顯示出良好的在體外刺激表皮細胞分化的活性，但開發用于治療皮膚和角膜傷口的含有EGF的局部制劑是非常困難的，原因是當EGF臨床應用于傷口時只有很小的治療傷口的作用。
EGF是生物學上不穩定的和物理化學上非同質的，所以它的愈合作用不充分且它的分解產物可能誘導變態反應。因此EGF在應用于活體時不能顯示出充分的治療傷口的作用。EGF在室溫下非常不穩定，特別是在水分的存在下。盡管傷口上DNA的合成需要約8至12小時的延滯時間，但EGF具有非常短的、約為1小時的半衰期，因而無法獲得所需作用。另外，EGF在室溫下、甚至在冷藏狀態下長時間儲存時會產生物理化學變性。當EGF施用到皮膚上時，因傷口中存在蛋白水解酶而引起的EGF的變性、分解、凝縮和沉淀導致EGF喪失生物活性(Manning等，藥學研究，6903-917，1989)。
為了克服EGF的生物不穩定性和提供其期望的傷口愈合作用，報道了在對于傷口愈合來說最重要的治療的最初幾天時間里將EGF連續施用到傷口上，以不斷地保持EGF的有效濃度(Frankline等，實驗與臨床醫學雜志，108103-108，1986)。在這點上，已研究了一些EGF持續釋放制劑，它們可以連續地提供EGF到傷口上。
結果，美國專利第4,944,948號公開了使用中性磷脂、負電荷磷脂和膽固醇連續地將EGF提供到傷口的EGF/脂質體凝膠制劑；EP出版物第312208號公開了包含藥學上可接受的各種水溶性或水膨脹性聚合物基質的、能連續釋放EGF的含水制劑。但是,盡管上述在先技術公開了能連續12小時或更久釋放EGF的制劑，但它們不適合在工業領域中生產，因為這些制劑長期儲存時不穩定。因此，一直以來都需要能長時間地保持EGF的生物活性及其物理化學穩定性諸如純度和同質性，以提供EGF作為藥物的足夠的傷口愈合作用。
作為保持EGF的物理化學穩定性和抑制EGF活性下降的方法，EP公開第205051號提供了皮膚和眼用膏霜形式的藥物組合物，它包含0.0001-0.005％(w/w)的EGF，1-10％(w/w)的表面活性劑，5-45％(w/w)的脂肪物質和0.3-0.8％(w/w)的防腐劑。EP出版物第267015號和美國專利第4717717號提供了通過向EGF中加入水溶性纖維素衍生物使其穩定的含有EGF的組合物。EP出版物第398615號和美國專利第5130298號提供了通過將EGF與藥學上可接受的金屬陽離子諸如鋅混合來穩定EGF的方法，鋅能夠防止EGF在水溶液中降解，因為EGF與鋅發生離子鍵合。
然而，盡管加入了上述穩定劑，但EGF的穩定性在4℃下只能維持約2個月。因此，當在臨床上將EGF的皮膚用局部制劑應用于傷口時，它們不適合在工業領域中采用，因為它們具有很小的傷口愈合作用且制劑的穩定性降低。
因此，非常希望開發出用于治療不能治愈的病狀等諸如在沒有特定治療劑的情形下的皮膚潰瘍或角膜損傷等的EGF的成品制劑，它們能充分地顯示出傷口愈合作用，具有能對抗生物活性損失的保護的EGF，并且當其應用時能從載體中快速地釋放出EGF到傷口上。
因此，本發明人已進行了很多研究來研制具有足夠的傷口愈合作用和良好穩定性的EGF的局部制劑。結果，我們發現包含EGF作為活性成分和酸性聚合物諸如羧乙烯基聚合物作為基質的局部制劑可以顯示出所需的良好的傷口愈合作用和與使用諸如纖維素基聚合物基質或中性聚合物基質的在先技術相比的顯著的穩定性。
發明的公開因此本發明的目的是提供含有EGF的生物學和物理化學穩定的組合物，它包含EGF作為活性成分和羧乙烯基(carboxyvinyl)聚合物作為基質(base)。
本發明的組合物包含EGF活性成分和羧乙烯基聚合物基質。EGF活性成分可以是從天然來源分離的或者使用重組DNA技術生產。EGF在組合物中的含量以制劑的總重計在0.001至1,000μg/g范圍內，優選在0.1至100μg/g范圍內，以使EGF是藥理學上有效的。本發明組合物的pH優選在4至8的范圍內，更優選在5至7的范圍內，以保持EGF溶解但沒有變性。
在本發明中用作基質的羧乙烯基聚合物是分子量為1×106至4×106的均聚物。羧乙烯基聚合物是丙烯酸和芳基蔗糖的交聯產物，它是分散于1％水溶液中時pH顯示為2.5至3.0的酸性聚合物。甚至在小于1％的低濃度下，它也有寬范圍的粘度，所以它可廣泛地用作用于口服、洗液、膏霜和凝膠制劑的懸浮體的基質。另外，不管聚合物的種類如何，羧乙烯基聚合物含有56.0至68.0％比例的羧酸殘基(carboxylicresidue)，包括卡波姆(Carbomer)934、卡波姆934P、卡波姆940、卡波姆941或卡波姆947P。羧乙烯基聚合物的含量以組合物的總重計在0.001至50wt％范圍內，優選為0.005至25wt％，更優選為0.01至10wt％。
本發明的組合物可以進一步含有藥學上可接受的添加劑，例如穩定劑、賦形劑、各向同性劑、增濕劑、pH控制劑等等。
本發明人已進行了穩定性試驗，對按照本發明的含有羧乙烯基聚合物的EGF制劑與含有另一種聚合物基質的EGF制劑在4℃和25℃下6個月的穩定性進行了比較。在這種情況下，將溶于10mM磷酸鹽緩沖劑的EGF用作對照，用ELISA法分析EGF的含量。結果，按照本發明的含有羧乙烯基聚合物基質的EGF制劑與含有另一種基質的EGF制劑以及溶于磷酸鹽緩沖劑的EGF相比在各種濃度下都顯示出顯著的穩定化。從這個結果可以確定在按照本發明的EGF制劑中的EGF通過加入羧乙烯基聚合物(不管其含量如何)得以穩定，于是該聚合物可以根據使用目的用作可任選地控制其粘度的基質和作為穩定劑加入。
按照本發明的含有EGF的組合物可以用于眼用制劑、皮膚用的局部制劑諸如霜劑、油膏、凝膠、貼敷片(patch)等，并且該組合物可以通過涂敷或攤開在棉質平坦表面的紗布上使用，且該組合物可以冷凍干燥形式儲存，然后在需要使用時溶于合適的溶劑。此外，皮膚用局部制劑可以用于美容制劑。
本發明通過下列實施例作更具體的說明。但是，應當理解本發明不以任何方式限于這些實施例。
實施例1含有卡波姆(0.1％)的滴眼劑
使用所給用量的上述組分按照常規方法制成制劑。具體地說，將甘露糖醇、對羥基苯甲酸甲酯和對羥基苯甲酸丙酯溶于適量的注射用蒸餾水中，向該溶液中加入卡波姆934P(BFGoodrich，美國)并攪拌使其分散。然后，用氫氧化鈉控制該溶液的pH后將其滅菌，并與EGF(Daewoong Pharm.，韓國)在注射用蒸餾水中的經過過濾和滅菌的溶液混合得到100g制劑。
實施例2
含有EGF的10mM磷酸鹽緩沖劑
使用所給用量的上述組分按照常規方法制成制劑。具體地說，將磷酸氫鈉和氯化鈉溶于適量的注射用蒸餾水，用20％磷酸控制該溶液的pH后將其滅菌，并與EGF在注射用蒸餾水中的經過過濾和滅菌的溶液混合得到100g制劑。
實施例3含有羧甲基纖維素鈉(0.5％)的滴眼劑
使用所給用量的上述組分按照常規方法制成制劑。具體地說，將山梨糖醇和對羥基苯甲酸甲酯溶于適量的注射用蒸餾水中，向該溶液中加入羧甲基纖維素鈉并攪拌使其分散。然后，用氫氧化鈉控制該溶液的pH后將其滅菌，并與EGF在注射用蒸餾水中的經過過濾和滅菌的溶液混合得到100g制劑。
實施例4含有卡波姆(1％)的局部凝膠制劑
使用所給用量的上述組分按照常規方法制成制劑。具體地說，將對羥基苯甲酸甲酯溶于適量的注射用蒸餾水中，向該溶液中加入卡波姆934P并攪拌使其分散。然后，用氫氧化鈉控制該溶液的pH，將該溶液與丙二醇摻合并通過加熱滅菌。之后向其中加入EGF在注射用蒸餾水中的經過過濾和滅菌的溶液而得到100g制劑。
實施例5含有泊洛沙姆(Poloxamer)(15％)的局部制劑
使用所給用量的上述組分按照常規方法制成制劑。具體地說，使用所給用量的磷酸氫鈉、氯化鈉和磷酸制備磷酸鹽緩沖劑。將對羥基苯甲酸甲酯防腐劑溶于磷酸鹽緩沖劑中。向該溶液中加入泊洛沙姆407(BASF，德國)并攪拌使其分散。然后將該溶液與丙二醇摻合，并向其中加入EGF活性成分，得到100g制劑。
實施例6含有卡波姆(0.1％)的霜制劑
使用所給用量的上述組分按照常規方法制成制劑。具體地說，將甘油和對羥基苯甲酸甲酯溶于適量的注射用蒸餾水中，向該溶液中加入卡波姆940(BF Goodrich，美國)并攪拌使其分散。然后向該溶液中加入對羥基苯甲酸丙酯和其他組分并通過熔化使其乳化。之后，用三乙醇胺控制該溶液的pH后將其滅菌，并與EGF(Daewoong Pharm.，韓國)在注射用蒸餾水中的經過過濾和滅菌的溶液混合得到100g制劑。
實施例7含有卡波姆(0.1％)的軟膏劑
使用所給用量的上述組分按照常規方法制成制劑。具體地說，將對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯和卡波姆940(BF Goodrich，美國)溶解并分散于適量的注射用蒸餾水中。向該溶液中加入剩余的蠟并在抬高的溫度下乳化。然后，該溶液通過乳化滅菌，并與EGF(DaewoongPharm.，韓國)在注射用蒸餾水中的經過過濾和滅菌的溶液混合得到100g制劑。
實施例8含有卡波姆(1％)的貼敷片制劑
使用所給用量的上述組分按照常規方法制成制劑。具體地說，將卡波姆940(BF Goodrich，美國)、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、PEG400、甘油溶解并分散于適量的注射用蒸餾水中。該溶液在抬高的溫度下滅菌，并與EGF(Daewoong Pharm.，韓國)在注射用蒸餾水中的經過過濾和滅菌的溶液混合得到100g制劑。然后，將該溶液倒入模子里形成貼敷片(patch)。
實驗1滴眼劑的穩定性測試測試在實施例1中制備的含有卡波姆的滴眼劑的穩定性，并與已知會穩定EGF的在實施例2中制備的含有羧甲基纖維素的制劑進行比較。進行該試驗來估計每種制劑在4℃和25℃下儲存時隨著時間的消逝(2、4、8和18周)后EGF的含量。將溶于10mM磷酸鹽緩沖劑的實施例2的樣品用作標準樣品，并通過Quantikine EGF ELISA試劑盒(R&D，美國)的ELISA法來估計EGF的含量。
表1顯示了含有EGF的滴眼劑與標準樣品相比的在4℃下的穩定性的結果，表2顯示了含有EGF的滴眼劑與標準樣品相比的在25℃下的穩定性的結果。
從下表1中可以看出，磷酸鹽緩沖劑中的EGF的含量在4℃下8周內下降了約10％，而在卡波姆和羧甲基纖維素中的EGF的含量直到8周都沒有變化。但是，在4℃條件下儲存18周時，磷酸鹽緩沖劑和卡波姆制劑中的EGF的含量都沒有變化，而在羧甲基纖維素中的EGF的含量在18周里下降到87.3％。
表1
從下表2中可以看出，當相同的制劑在25℃下儲存時，在磷酸鹽緩沖劑樣品中的EGF的含量在2周內下降了約20％，而在羧甲基纖維素的情況下經過4周后EGF的含量不斷下降。但是，在實施例1制劑中的EGF的含量直到8周也幾乎沒有變化。并且，當實施例1制劑在室溫下儲存18周時，EGF的含量僅下降了約13％。因此可以確定含有卡波姆的制劑甚至在室溫下儲存時EGF的穩定性也顯著提高了。
表2
實驗2局部凝膠制劑的穩定性測試測試在實施例4中制備的局部凝膠制劑的穩定性，并與含有廣泛用作局部制劑基質的中性聚合物、且已知能使水溶液中介電常數降低而導致蛋白質穩定的泊洛沙姆的局部制劑進行比較。進行該試驗來估計每種制劑在4℃和25℃下儲存18周過程中EGF的含量。將溶于10mM磷酸鹽緩沖劑的樣品用作標準樣品，并通過Quantikine EGF ELISA試劑盒(R&D，美國)的ELISA法來估計EGF的含量。
表3和表4分別顯示了每種局部凝膠制劑在4℃和25℃下的穩定性。從下表3中可以看出，含有卡波姆或泊洛沙姆的制劑的EGF含量在冷藏條件下直到8周仍沒有變化。然而，儲存18周時，含有泊洛沙姆的制劑的EGF含量下降了約10％。從下表4中可以看出，含有1％卡波姆的制劑的EGF含量直到18周也幾乎沒有變化，而含有泊洛沙姆的制劑或磷酸鹽緩沖劑制劑的EGF含量在8周內下降了約20％，然后直到18周仍不斷下降。就含有泊洛沙姆的制劑而言，下降的程度更大。正如從滴眼劑可看出的那樣，當聚合物用作基質時，EGF的含量隨時間進一步下降，還不如磷酸鹽緩沖劑，這是因為在長期儲存時聚合物可進一步促進EGF的降解。最后可以確定制劑中EGF的穩定性可以通過使用卡波姆作為基質必然得到改善。
表3
表4
實驗3霜劑、軟膏劑和貼敷片制劑的穩定性測試為了評估在實施例6、7和8中制備的含有卡波姆的制劑的穩定性，進行該試驗來估計每種制劑在4℃和25℃下儲存時隨著時間的消逝(2、4、8和18周)后EGF的含量。將溶于10mM磷酸鹽緩沖劑的實施例2的樣品用作標準樣品，并通過Quantikine EGF ELISA試劑盒(R&D，美國)的ELISA法來估計EGF的含量。
表5和表6分別顯示了每種霜劑、軟膏劑和貼敷片制劑在4℃和25℃下的穩定性。從下表5中可以看出，在冷藏條件下EGF含量沒有變化。從下表6中可以看出，在室溫下EGF含量幾乎沒有變化。因此可以確定不管制劑的類型如何，制劑中EGF的穩定性可以通過使用卡波姆基質得到改善。
表5
表6
如上述實驗中得到的結果所示，本發明提供了穩定的EGF組合物，它包含羧乙烯基聚合物作為基質和在生物學和物理化學上確保其穩定性的生物活性EGF。
權利要求
1.一種穩定組合物，它包含生物活性表皮生長因子(下文中稱作“EGF”)作為活性成分和羧乙烯基聚合物作為基質。
2.按照權利要求1的穩定組合物，其中生物活性EGF從天然來源分離或者使用重組DNA技術生產。
3.按照權利要求1的穩定組合物，其中EGF的含量以制劑的總重計在0.001至1,000μg/g范圍內。
4.按照權利要求1的穩定組合物，其中EGF的含量以制劑的總重計在0.1至100μg/g范圍內。
5.按照權利要求1的穩定組合物，其中該組合物在水溶液中的pH在4至8范圍內。
6.按照權利要求1的穩定組合物，其中羧乙烯基聚合物選自卡波姆934、卡波姆934P、卡波姆940、卡波姆941或卡波姆947P。
7.按照權利要求1的穩定組合物，其中羧乙烯基聚合物的含量以該組合物的總重計在0.001至50(w/w)％范圍內。
8.按照權利要求1的穩定組合物，其中羧乙烯基聚合物的含量以該組合物的總重計在0.005至25(w/w)％范圍內。
9.按照權利要求1的穩定組合物，其中羧乙烯基聚合物的含量以該組合物的總重計在0.01至10(w/w)％范圍內。
10.按照權利要求1的穩定組合物，它是眼用制劑。
11.按照權利要求1的穩定組合物，它是局部制劑。
12.按照權利要求11的穩定組合物，它是霜制劑。
13.按照權利要求11的穩定組合物，它是軟膏劑。
14.按照權利要求11的穩定組合物，它是凝膠制劑。
15.按照權利要求11的穩定組合物，它是貼敷片制劑。
16.按照權利要求11的穩定組合物，其中該組合物攤開在棉質平坦表面或紗布上。
全文摘要
本發明涉及一種穩定組合物,它包含表皮生長因子(下文中稱作“EGF”)活性成分和羧乙烯基聚合物基質。本發明人已確定包含EGF活性成分和酸性聚合物諸如羧乙烯基聚合物基質的EGF制劑具有與使用諸如纖維素基聚合物基質或中性聚合物基質的在先技術相比顯著的穩定性。因此,本發明的組合物可用于眼用制劑、皮膚用的局部制劑和美容制劑等等。
文檔編號A61P27/02GK1362883SQ01800267
公開日2002年8月7日 申請日期2001年2月6日 優先權日2000年2月21日
發明者楊貞華, 李章沅, 孫美英, 金永準 申請人:株式會社大熊制藥