修飾的eb病毒lmp1編碼序列,其制備及應用的制作方法

專利名稱：修飾的eb病毒lmp1編碼序列,其制備及應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及基于Epstein-Barr病毒(EBV)DNA的序列，特別是涉及經修飾的編碼EBV潛伏膜蛋白1抗原(LMP1)基因的DNA序列，其制備方法及其在生產用于控制EBV感染相關疾病的藥物和DNA疫苗中的應用。
EBV是引起常見于兒童和年青人的傳染性單核細胞增多癥的病原體。人群中，平均約有90％以上的成年人遭受過EBV的感染。該病毒終生在口咽部產生并通過唾液途徑傳播。其中青年人的感染則常常發生病癥，表現有高燒、白細胞計數增加、咽喉疼痛及肝脾腫大等癥狀。兒童期被感染者一般沒有任何臨床癥狀或僅表現輕微的上呼吸道感染癥狀(參見EP-A0726315)。有些個體，由于宿主免疫反應與帶毒細胞持續存在這兩種因素的相互作用，可能導致EBV相關腫瘤的發生。其中伯基特氏淋巴瘤的發生與發展與染色體重排有關。盡管并不是所有病例的腫瘤細胞中都含有EBV基因組，但在某些高發地區，有97％的伯氏淋巴瘤與EBV相關，而且控制EBV很可能減少伯氏淋巴瘤的發生。特別值得注意的是，就與EBV相關的其他腫瘤而言，差不多100％的人鼻咽癌(NPC)與EBV感染有關。大多數鼻咽癌都首先發生在鼻后區的咽隱窩部，并隨著病情惡化而很快發生轉移。目前臨床上常常通過檢測VCA/IgA和EA/IgA等抗體來早期診斷鼻咽癌并以其作為二級預防手段。
鑒于EBV與某此腫瘤的關系，人們一直在研究并試圖制備EBV特異性相關抗原、其突變蛋白及它們的抗體和核苷酸編碼序列，以其作為早期診斷EBV相關腫瘤的工具，特別是用于制備可控制腫瘤發生與發展的一個或多個因素的藥物或疫苗。例如，國際專利申請97/45444號公開了可用于制備亞單位疫苗或核酸疫苗的細胞毒性EBV病毒T細胞抗原決定簇。國際專利申請WO95/24925號描述了用作亞單位疫苗以誘導CD8+CTL反應的EBV細胞毒性T細胞抗原決定簇。國際專利申請WO94/25599公開了穩定地表達EBV抗原性糖蛋白gp250和gp350或其混合物的倉鼠細胞系及制備和培養方法。
已有越來越多的證據表明，EB病毒潛伏膜蛋白1(LMP1)對細胞生長和分化有重要作用，與幾種人類惡性疾病如鼻咽癌(NPC)、何杰金氏病及免疫母細胞淋巴癌的發生與發展密切相關(Rickinson AB etal.，Virology，3nd ed.，NY，Raven Press，2397-446，1996)。Wang等人(WangD et al，An EBV membranee proteim expressed in immortalized lymphocytestransforms established rodent cells，cell 43831-40，1995)早期研究證明了EBV-LMP1基因有致癌活性，并闡明了潛伏性EBV感染與某此腫瘤發生的直接關聯。B淋巴細胞可長期攜帶EB病毒，而且LMP1在B淋巴細胞內的瞬時過表達可誘導DNA合成。在表皮細胞中，LMP1可誘導已知能夠刺激細胞生長的表皮生長因子受體(EGFR)的表達。另外，已發現LMP1蛋白的活性區域特別是胞漿內羧基末端與EBV致癌活性有關。
我們首先證明`EB病毒感染人胚鼻咽上皮細胞移植于裸鼠，在TPA和丁酸的協同作用下能誘發人鼻咽癌。
目前，雖然已對LMP1的結構與功能進行了較深入的研究，但迄今尚未見有關修飾的LMP1基因及其相關疫苗的報道。
本發明的一個目的是提供EB病毒潛伏膜蛋白基因衍生的DNA序列，該序列基本上是由缺失了致癌相關區域的部分潛伏膜蛋白基因序列組成的。
根據本發明這一目的的一個優選實施方案，其中所說的序列具有SEQ ID NO3所示的核苷酸序列。
本發明的另一個目的是提供生產攜帶如上限定的基因片段的重組DNA序列的方法，該方法包括(1)提供刪除了潛伏膜蛋白1的部分致癌相關區域的DNA片段。
(2)使用適當的引物，以PCR方法擴增步驟(1)的DNA片段。
(3)將按照步驟(2)方法制得的DNA片段連接到適當的表達載體上，以得到攜帶缺失了EBV致癌區域之潛伏膜蛋白1基因的重組DNA。
本發明的再一個目的涉及上述重組DNA片段在制備用于診斷或治療EBV相關疾病的藥物或疫苗中的應用。


圖1顯示從已知攜帶LMP1基因的重組質粒pUC18-DhetI中獲得缺失了致癌相關序列的LMP1基因大片段(LMP1Δ)的操作。
圖2顯示攜帶LMP1Δ大片段的重組質粒pcDNAIII-LMP1Δ的構建。
圖3顯示分別導入了LMP1、LMP1Δ的NIH3T3細胞及未導入任何外來DNA的正常NIH3T3細胞培養6天時間內的細胞增殖曲線。
圖4顯示在不同的效應細胞/靶細胞比例條件下測得的百分細胞毒性T淋巴細胞殺傷活性。
本發明涉及基于EBV之潛伏膜蛋白1基因(LMP1)的修飾的DNA片段、其制備與擴增方法及其在生產用于診斷和治療包括鼻咽癌在內的EBV相關疾病的藥物或疫苗中的應用。
EBV是一種屬于皰疹病毒科的嗜淋巴細胞病毒。在靈長類動物宿主中，其能夠以整合狀態潛伏于B細胞內，導致被轉染的B細胞增殖和永生化。在EBV潛伏感染期間，潛伏基因對于細胞的轉化和增殖各自發揮不同的功能，其中已知特別重要的是EB病毒核抗原2(EBNA2)和潛伏膜蛋白1(LMP1)。
已知潛伏膜蛋白1基因位于EBV基因組的BamHI-Nhet大片段上，其可讀框(ORF)長約1311bp，相當于EBV全序列中的核苷酸序號169474至168163(左向)。LMP1是由386個氨基酸組成的磷酸化的完整跨膜蛋白。目前已知，LMP1是EBV基因編碼的唯一具有轉化淋巴細胞和上皮細胞活性的膜蛋白。LMP1基因表達陽性細胞顯示有較高的增殖能力和低分化程度。LMP1蛋白在結構上與某此離子通道蛋白相似，其跨膜區參予配體結合，而游離于胞漿中的氨基和羧基末端則具有偶聯功能，參予細胞內的信號傳遞。
另外，LMP1還通過調節一系列活性因子的活性阻止細胞凋亡，導致細胞惡性生長。例如，其可通過活化NFKb而參予細胞癌變過程，并誘導A20的表達。研究發現，LMP1基因序列的變異導致氨基酸序列特別是LMP1羧基末端序列的改變，進而改變其抗原性，并改變腫瘤細胞表面組織相容性抗原標志，使致癌基因活化的宿主細胞逃避宿主免疫系統的監視，致使細胞發生癌變。
更具體地說，在鼻咽癌發生與發展過程中，LMP1是目前已知的EBV基因編碼的唯一具有轉化上皮細胞活性的膜蛋白。另外LMP1也在MHC-1類限制性細胞毒性T淋巴細胞(CTL)的免疫呈遞、識別和加工中發揮重要作用。LMP1 N未端跨膜區域為EBV誘導的人特異性T細胞毒性殺傷提供了特異性靶抗原。在另一方面，在LMP1轉染的細胞中，細胞內粘附分子(如LFA1、LFA3、ICAM等)的表達水平提高，從而在免疫識別期加強了效應分子與靶分子的結合。基于LMP1基因的這些功能特征，本發明人試圖刪除LMP1基因3′末端對細胞轉化功能必不可少的部分序列，而保留其中具有免疫原活性和特異性殺傷活性的CTL表位部分，得到經過缺失修飾的突變體LMP1編碼序列。可以使用基于已知的LMP1氨基酸序列設計的引物，從適當的DNA文庫中篩選LMP1編碼序列。另外，也可以從適當組織來源如人鼻咽組織中制備的RNA，然后以反轉錄方法制備LMP1基因。當然，為了方便起見，最好使用適當的核酸內切酶從攜帶LMP1基因的重組質粒中直接得到所需的DNA片段。
在前兩種情況下，可以在對所說片段進行適當的修飾后，在F4 DNA連接酶存在下，將其連接到用同樣確切的適當載體(如pcDNAIII)上，然后再用適當內切酶從攜帶LMP1的重組載體上切掉，不需要的片段，以得到包括對于表達產物特異性細胞毒殺傷活性及免疫原活性必不可少的DNA編碼序列，同時缺失了C未湍的具有細胞轉化和致癌能力的DNA片段(NcoI-NcoI片段)的重組表達載體。
可以使用本領域已知的任何已知的方法瞬時轉染適當的真核宿主細胞，如CHO、COS、BHK等哺乳動物細胞。可使用的轉染方法包括，但不只限于顆粒轟擊法、電穿孔法、直接微量注射法、借助脂轉染試劑(如Lipofectarmine或Lipofectin試劑)的方法，以及病毒(如經過適當修飾的腺病毒或反轉錄病毒)介導的DNA定向送遞或轉移方法等。
根據本發明的一個優選實施方案，發明人首先從預制備的，攜帶LMP1全基因的EBV重組質粒pVC18-Dhet I中切出長約495bp的NcoI-NcoI片段，從而使所說的LMP1基因失去轉化細胞和進一步的誘導細胞惡變的能力。
可使用EBV基因組中的LMP1基因(MtuI-MiuI片段)，經單一酶切后得到刪除了LMP1部分序列的MS187片段(LMP1Δ-MS187片段)。以此片段為模板并使用適當的PCR引物對其進行PCR擴增，然后以瓊脂糖電泳法分離并回收之。
然后在T4DNA連接酶存在下將缺失了致癌相關部分序列(NcoI-NcoI片段)的LMP1基因，即本文中所說的LMP1Δ大片段連接到適當的真核表達質粒如PCNAIII中。用如此得到的重組質粒轉化適當的感受態大腸桿菌細胞(如大腸桿菌DH52細胞)，以擴增殖所需的重組質粒。經大量制備、純化及定量分析后，用所得到的重組表達質粒(pcDNAIII-LMP1Δ)瞬時轉化敘利亞地鼠腎成纖維細胞(BHK細胞)。最好使用本領域已知的Lipofectamine試劑轉染法完成真核細胞轉染步驟。
以上所述的所有DNA操作步驟，除特別指出者外均按照下Sanbrook等人(Molecular Cloning，Alaboraory Manual，2nd，ed.，Cold SpringHarbor laboretory Press，1989)所述的標準方法完成。
可將上述重組質粒(pcDNAIII-LMP1Δ)和空質粒載體(pcDNAIII)分別導入BHK靶細胞，用NPC陽性血清和LMP1特異性單克隆抗體(S12)，在間接免疫螢光法檢測細胞中LMP1Δ的表達。另一方面，分別將攜帶未缺失所述片段之LMP1基因的重組質粒(pSG5-LMP1)和攜帶缺失了致癌相關序列之LMP1基因(LMP1Δ)的重組質粒(pcDNAIII-LMP1Δ)導入NHI3T3細胞，培養細胞后觀察細胞形態及血清依賴性改變。另外，分別給裸鼠皮下接種導入了LMP1基因、LMP1Δ基因的3T3細胞和正常3T3細胞，4周后觀察動物皮下接種部位的腫瘤生長。結果可見，接種含有LMP1基因之3T3細胞的動物局部皮下有瘤狀腫塊生長，而接種含有LMP1Δ基因和不含任何外來基因之3T3細胞的動物則未見有皮下瘤狀腫塊生長。
在上述體外和體內實驗基礎上，進一步使用分別接種不同劑量pcDNAIII-LMP1Δ和空質粒載體(100μg/動物)的Balb/c小鼠作為動物模型，觀察免疫接種后動物的體內抗體生成和細胞毒性T淋巴細胞活性。
以重組DNA刺激的免疫動物的脾淋巴也細胞作為效應細胞，并以導入了重組質粒pcDNAIII-LMP1Δ的G418抗性細胞作為靶細胞，按適當的靶/效細胞比例混合并常規保溫后，在相應底物存在下，以乳酸脫氫酶法檢測效應細胞對靶細胞的殺傷水平，間接判定接受本發明的DNA免疫的動物體內CTL的活性水平(百分殺傷率)。、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、綜上所述，本發明人首先成功地構建了攜帶修飾的缺失了致癌相關序列之LMP1基因的重組表達載體。以該重質顆瞬時轉染真核宿細胞(BHK細胞)后，可使用相應的特異性抗體(S12)檢測到LMP1蛋白的表達。使用LMP1和LMP1Δ體外轉化NIH3T3細胞的比較實驗結果表明，LMP1基因能夠明顯地降低或排除細胞的血清依賴性、軟瓊脂集落形成及轉化效應細胞等生物學行為能力。由于刪去了LMP1中的部分致癌相關序列，所以當用LMP1Δ DNA序列接種裸鼠后18個月未見動物有腫瘤生長。特別是我們使用Ba1b/c小鼠模型進行的實驗顯示，當動物接受LMP1ΔDNA編碼序列后2-8周不同時間均可見有特異性抗體反應。另一方面，用攜帶LMP1Δ編碼序列的重組DNA免疫動物后，可在體內表達、加工和呈遞細胞表示的特異性抗原決定簇，進而激活和誘導特導性細胞毒T細胞反應。
因此，我們的研究證明，可以使用刪除了部分細胞結合與致癌相關序列(約495bp的NcoI-NcoI片段)的EBV潛伏膜蛋白1的DNA編碼序列，以相對簡單的方法制得可用于治療和預防目的重組DNA序列。例如，可以將本發明的LMP1Δ，或攜帶所說的基因的重組DNA與已知EBV感染細胞中制得到相應序列進行必要的同源性比較和/或表達水平測定，以檢測宿主體內是否存在EBV感染相關疾病的致病傾向。特別是，可以將本發明LMP1Δ與適當的輔助DNA混合，或連接到適當的表達載體上制成DNA疫苗，并使用適當的DNA導入方法，將本發明的DNA或核酸疫苗導入靶組織/細胞，作為一種有價值的治療和預防性疫苗，用于治療和預防某些EBV感染相關疾病，特別是鼻咽癌。
下例實施例旨在進一步舉例描述而不是以任何方式限制本發明待批權利要求的范圍。本領域技術人員可以理解到，在不違背本發明的精神和原則的前提下，對本說明所述技術實施方案的各種改動和修飾均將落入本發明待批權利要求的范圍內。
實施例1刪除了致癌相關序列的LMP1Δ大片段的制備首先用限制性內切酶NcoI消化攜帶LMP1基因的重組質粒Puc18-DhetI(由美國哈佛大學Kieff教授提供)，從中切掉下長約495bP的致癌相關片段。用Khenw酶補平所得大片段的兩末端后，重新環化得到重組質粒pUC18-MS187。然后以此片段為模板，并使用上游引物5′-GGGGCTAGATGGAACGCGACCTT-3′(SEQ ID NO1)和下游引物5′-GCCTTAAGTTAGTCATGTAGCTT-3′(SEQ ID NO2)，按下述反應條件進行PCR擴增94℃變性5分鐘后，按照94℃變1分鐘、55℃退火2分鐘和72℃聚合(延伸反應)2分鐘的程序共進行35次循環，最后72℃延伸15分鐘。
經1.5％瓊脂糖凝膠電泳分離并回收所需的PCR產物。經測序分析證實得到了缺失改癌相關序列并具有SEQ ID NO3中所示核苷酸序列的修飾LMP1基因大片段，并將其定名為LMP1Δ(參見圖1)。
實例施2重組表達質粒pcDNAHI-LMP1Δ的構建用單一限制性內切酶BamHI分別消化(37℃，1小時)真核表達質粒pcDNAIII(本室寶存)和按實施例1中所述方法制備的LMP1Δ基因片段。然后在上述反應條件下再次用EcoRI酶消失。
分別用1％和1.5％瓊脂糖凝膠電游分離兩酶切產物，并使用質粒快速回收試劑盒(Promaga)回收之。將回收得到的pcDNAIII質粒DNA和同處理的LMP1Δ DNA片段按1∶2比例混合，經連續的45℃水浴和冰水浴處理后向所得混合物中加入10XT4DNA連接酶緩沖液及T4DNA連接酶，以10ml總反應體積于16℃下保溫過夜(參見圖2)。
用如此得到連接反應混合物(5μl)轉化并用0.1McaCl2處理的感受態大腸桿菌DH52細胞，并在含有氨芐青霉素(1μg/ml)的LB瓊脂平板上37℃保溫過夜。
從瓊脂平板上收集氨芐青霉素抗性菌落，并使用含氨芐青霉素的LB培養液將陽性轉化菌株繼續37℃培養過夜。培養后收集的菌細胞，經反復凍融破碎細胞后，用苯酚/氯仿從離心(12000rpm，5分鐘)上清中提取，并用乙醇沉淀DNA。
分別用單一BamHI、BamHI+EooR和單一XhoI酶消化按上述方法得到的重組質粒，對其進行酶切鑒定。然后大量制備質粒DNA，并以分光光度法進行定量分析。
實施例3重組質粒pcDNAIII-LMP1Δ在真核宿主細胞中的表達(1)在含有10％胎牛血清的LB培養液中將敘利亞地鼠腎成纖維細胞(BHK細胞)培養(16-24小時)至生長對數期，洗細胞后以Lipofecfmine(20μl)轉染法用實施例2中得到的重組DNA轉染之(37℃，5％CO2，5小時)。轉染后換成合10％胎牛血清的1640培養液，并于37℃繼續培養48小時。
培養完成后，用0.25％胰蛋白酶處理培養的細胞單層。用上述培養液洗細胞后涂布于微量滴定板上，4℃下用丙酮固定15分鐘并用PBS洗兩次。
向細胞孔內加入NPC陽性血清及特異性LMP1抗體(S12)后，37℃保溫45分鐘。使用螢光素標記的羊抗人IgG和羊抗小鼠IgG作為第二抗體，以本領域已知的間接免疫螢光法檢測BHK細胞中LMP1Δ蛋白的表達。以空質粒轉染的BHK細胞作為對照。結果可見，pcDNAIII-LMP1Δ瞬時轉染的BHK細胞均呈現為免疫螢光陽性，而對照組BHK細胞則為陰性。
(2)在另一項比較實驗中，分別用上述重組質粒pcDNAIII-LMP1Δ和攜帶完整LMP1基因的重組質粒pSG5-LMP1(由美國哈佛大學Kieff教授惠贈)轉染NIH3T3細胞(Swiss小鼠胚胎永生化成纖維細胞系)，并以未導入任何外源DNA的正常NIH3T3細胞作為對照(均為1×104細胞/孔)，加入含遞減濃度的胎牛血清(5％、1％、0.5％)的Eagle氏培養液培養24小時后，觀察細胞的增殖水平。結果可見，pSG5-LMP1轉染的3T3細胞的生長狀態明顯好于pcDNAIII-LMP1Δ轉染的和未經任何處源DNA轉染的3T3細胞。這一結果表明，LMP1Δ基因在細胞內的表達產物可強有力地促進細胞生長與增殖(參見圖3)。
(3)將上述實驗(2)中所述的三組細胞在添加有2％胎牛血清的1640培養基中連續培養2周后，按常規方法從各組大約107個細胞中提取DNA，然后分別以三組細胞的DNA為模板，使用上游引物5′-GCGCCTAGHATGGAACACGACCTT-3′(SEQ ID NO4)，和下游引物5′-GCCTTAATTAGCATAGTAGCTT-3′(SEQ ID NO5)，按前述PCR反應程序對所得的DNA進行PCR擴增。
PCR反應產物經1.5％瓊脂糖凝膠電泳分離后顯示，以pSG5-LMP1轉染的NIH3T3細胞DNA為模板得到的擴增產物中存在一條約1.1kb的條帶，而以pcDNAIII-LMP1Δ轉染的3T3細胞DNA為模板得到的擴增產物中存在一條約800bp的條帶。相對地，對照組3T3細胞則未見任何來自外源DNA的電泳條帶。
實施例4以重組質粒pcDNAIII-LMP1Δ免疫動物后誘發的EBV-LMP1特異性體液和細胞免疫反應(1)將5周齡Balb/c(H-2d)小鼠隨機分成4組，動物經用1％苯巴比妥(0.2ml)麻醉后，分別肌肉內注射(1)空質粒pcDNAIII(100μg/動物)，和(2)pcDNAIII-LMP1Δ。三個實驗組動物經肌肉內注射途徑投用重組DNA的劑量分別為100μg/動物、20μg/動物和100μg+200單位白介素2(IL-2)/動物。第一次免疫后，分別于第二周和第六周進行兩次加強免疫。第8周時采血并分離動物脾臟，以常規間接免疫螢光法檢測動物血清中的特異性抗體滴度，并以已知的乳酸脫氫酶法檢測LMP1特異性CTL活性水平。
為了檢測被免疫動物血清中的抗體水平，使用感染了LMP1基因的痘留病毒(Vac-LMP1)和在含有G418(Promega)的選擇培養基中培養得到的P815抗性細胞作為陽性抗原材料，使用螢光素標記的羊抗鼠IgG作為第二抗體，以間接免疫螢光法檢測不同組DNA免疫之小鼠血清中LMP1特異性抗體的存在及其水平，結果如下列表1所示。
表1 DNA免疫小鼠血清特異性抗體生成及其滴度DNA免疫血清抗原Vero/Vac-LMP1Vero 抗性P815空質粒載體 - --100μg重組DNA1∶10 -1∶10200μg重組DNA1∶10 -1∶10100μg重組DNA1∶10 -1∶10+IL-2另一方面，將被免疫動物的脾細胞與Vac-LMP1感染正常小鼠脾細胞(10∶1)混合，并以所得混合細胞作為效應細胞。使用在含有G418的培養基中培養的，pcDNAIII-LMP1Δ轉染的P815細胞作為靶細胞。選擇最適靶細胞濃度及不同的效/靶比例，以乳酸脫氫酶法檢測被免疫動物的LMP1特異性CTL水平。結果如圖4所示。
從圖4所示的結果可以看出，經用本發明的重組DNA免疫后，動物體內LMP1特異性CTL活性隨著效/靶細胞比例的增加而升高。而且在各免疫組中，高劑量(200μg)組動物的CTL水平稍高于低劑量組，但沒有統計學上的顯著差異。
序列表(1)一般信息(I)申請人中國預防醫學科學院病毒學研究所(II)發明名稱修飾的EB病毒LMP1編碼序列，其制備及應用(III)序列5(IV)通信地址(A)聯系人周玲(B)街道宣武區迎新街100號(C)城市北京(D)國家中華人民共和國(E)郵編10052(V)計算機可讀形式(A)介體類型3。5寸軟盤(B)計算機IBM PC(C)操作系統WIN98(D)軟件WORD2000(VI)電訊信息電話86-10-63578308(2)SEQ ID NO。1的信息(i)序列特征(A)長度23bp(B)類型核酸TTAACTGGCACACACTCCCTTAGCCACA(2)SEQ ID NO。4的信息(i)序列特征(A)長度24bp(B)類型核酸(C)連型單鏈(D)拓撲結構線形(ii)分子類型基因組DNA(iii)序列描述SEQ ID NO。4GCGCCTAGHATGGAACACGACCTT(2)SEQ ID NO。5的信息(i)序列特征(A)長度22bp(B)類型核酸(C)連型單鏈(D)拓撲結構線形(ii)分子類型基因組DNA(iii)序列描述SEQ ID NO。5GCCTTAATTAGCATAGTAGCTT(C)連型單鏈(D)拓撲結構線形(ii)分子類型基因組DNA(iii)序列描述SEQ ID NO。1GGGGCTAGATGGAACGCGACCTT(2)SEQ ID NO。2的信息(i)序列特征(A)長度23bp(B)類型核酸(C)連型單鏈(D)拓撲結構線形(ii)分子類型基因組DNA(iii)序列描述SEQ ID NO。2GCCTTAAGTTAGTCATGTAGCTT(2)SEQ ID NO。3的信息(i)序列特征(A)長度964bp(B)類型核酸(C)連型單鏈(D)拓撲結構線形(ii)分子類型基因組DNA(iii)序列描述SEQ ID NO。3CTGCCTTGCTCCTGACACACTGCCCTGAGGATGGAACACGACCTTGAGAGGGGCCCACCGGGCCCGCGACGGCCCCCTCGAGGACCCCCCCTCTCCTCTTCCCTAGGCCTTGCTCTCCTTCTCCTCCTCTTGGCGCTACTGTTTTGGCTGTACATCGTTATGAGTGACTGGACTGGAGGAGCCCTCCTTGTCCTCTATTCCTTTGCTCTCATGCTTATAATTATAATTTTGATCATCTTTATCTTCAGAAGAGACCTTCTCTGTCCACTTGGAGCCCTTTGTATACTCCTACTGATGAGTAAGTATTACACCCTTTGCCCCACACCCCCTTTCCCTTACTCTTCCTTCTCTAACGCACTTTCTCCTCTTTCCCCAGTCACCCTCCTGCTCATCGCTCTCTGGAATTTGCACGGACAGGCATTGTTCCTTGGAATTGTGCTGTTCATCTTCGGGTGCTTACTTGGTAAGATCTAACATTCCCTAGGAATTATTTACCACACCCCACTTTTCCAACCCTAACACTCTTTTTTCAACGCAGTCTTAGGTATCTGGATCTACTTATTGGAGATGCTCTGGCGACTTGGTGCCACCATCTGGCAGCTTTTGGCCTTCTTCCTAGCCTTCTTCCTAGACCTCATCCTGCTCATTATTGCTCTCTATCTACAACAAAACTGGTGGACTCTATTGGTTGATCTCCTTTGGCTCCTCCTGTTTCTGGCGATTTTAATCTGGATGTATTACCATGGCGGCGGTGATCCACACCTTCCTACGCTGCTTTTGGGTTCTTCTGGTTCCGGTGGAGATGATGACGACCCCCACGGCCCAGTTCAGCTAAGCTACTATGACTAACCTTTCTTTACTTCTAGGCATTACCATGTCATAGGCTTGCCTGACTGACTCTCCCTCCATTTACTGGGAATGCCTTAGCTAATCACC
權利要求
1，EB病毒潛伏膜蛋白1基因衍生的重組DNA序列，該序列基本上是由缺失了致癌相關區域的部分潛伏膜蛋白1基因序列組成的。
2，根據權利要求1的重組DNA序列，其中所說的序列具有SEQID NO3所示的核苷酸序列。
3，生產攜帶如權利要求1或2限定的重組DNA序列的方法，該方法包括(1)提供刪除了潛伏膜蛋白1的部分致癌相關區域的DNA片段。(2)使用適當的引物對，以PCR方法擴增步驟(1)的DNA片段。(3)將按照步驟(2)方法制得的DNA片段連接到適當的表達載體上，以得到攜帶缺失了EBV致癌區域之潛伏膜蛋白1基因的重組DNA。
4，權利要求1或2限定的重組DNA序列在制備用于診斷或治療EBV相關疾病的藥物或疫苗中的應用。
全文摘要
本發明提供基于Epstein－Barr病毒(EBV)DNA的序列，特別是經修飾的編碼EBV潛伏膜蛋白1抗原基因的DNA序列，其制備方法及其在生產用于控制EBV感染相關疾病的藥物和DNA疫苗中的應用。
文檔編號A61K39/245GK1403574SQ0114208
公開日2003年3月19日 申請日期2001年9月11日 優先權日2001年9月11日
發明者曾毅, 周玲, 劉海鷹, 賈俊嶺, 王 琦 申請人:中國預防醫學科學院病毒學研究所