專利名稱：源于臍帶血的活化淋巴細胞、含有所述淋巴細胞作為主要成分的制劑和制備所述制劑的 ...的制作方法
技術領域：
本發明涉及源于臍帶血的活化淋巴細胞、含有前述淋巴細胞作為主要成分的藥物制劑和制備前述制劑的方法與成套器具(kit)，該制劑用于治療各種腫瘤和感染疾病并預防這些疾病發生和復發，以及加快各種器官的干細胞吸收等。
背景技術：
最近，人們已經對使免疫系統耐受生物防御的淋巴細胞表現出濃厚的興趣。特別地，T-淋巴細胞是具有有效的細胞免疫性的重要細胞之一，并根據單克隆抗體的反應性被分類為以下組。舉例來說，對抗CD3抗體(CD是分化簇(Cluster of differentiation)的縮寫)具有反應性的T-淋巴細胞屬于CD3陽性細胞。對從這些淋巴細胞顯示的抗原與它們的功能之間的關系已經進行了大量的研究。
在CD3陽性細胞中顯示CD45 RA-抗原的淋巴細胞是原初T-淋巴細胞，它被視為沒有抗腫瘤活性。相反地，在前述CD3陽性細胞中顯示CD45 RO-抗原的淋巴細胞是記憶T-淋巴細胞，它被認為具有抗腫瘤活性的作用。發明者之一Sekine已經報道用固相抗CD3抗體和白細胞介素2增殖淋巴細胞是可能的，以使作為增殖結果獲得的自身淋巴細胞可以擁有抗腫瘤作用(日本專利公開HEI 03-80076(A))。
已經有一些報道說源于外周血等的淋巴細胞可以通過使用抗CD-3抗體或白細胞介素2被增殖，從而產生具有抗腫瘤作用的自身淋巴細胞。另外，本發明的一些發明者Ito等已經報道用抗CD3抗體和白細胞介素2增殖的自身淋巴細胞對先天性免疫缺陷患者的病毒感染有效(Kimiya Ito和Teruaki Sekine，月刊＂Igakunoayumi＂，Ishiyaku Pub.Inc.，第181卷，(1997)，第6期，第426-427頁)。
骨髓移植通常在患者和供者白細胞血型(本文以下略作＂HLA ＂)適合的情況下進行。但是，因為有許多類型的HLA，所以患者和供者的HLA彼此相同的情況非常少見。在現有情況下，當患者和供者間僅HLA主要成分相同時就進行骨髓移植。不利的是，患者和供者間HLA的不完全匹配可能在骨髓移植中引起宿主疾病(本文以下略作＂GVHD＂)。
為了治療將引起嚴重病情的GVHD疾病，使用免疫抑制劑。給予了免疫抑制劑的患者暫時克服疾病，但大多數發生巨細胞病毒或EB病毒感染的嚴重局面，導致死亡。因此，Elizabeth等報道了通過從骨髓供者的淋巴細胞誘導特定的CD4陽性細胞可以治療骨髓移植患者的巨細胞病毒感染，從而預防并治療在免疫抑制情況下引起的病毒感染(Elizabeth A.Walter.M.D.等，The NewEngland Journal of Medicine，第333卷，第1038-1044頁)。
另外，由去除術過程制備的異源淋巴細胞已經在臨床上被用于治療白血病患者，即供者白細胞輸血(本文以下略作＂DLT＂)。盡管DLT具有高的治療價值，但已證實使用DLT的治療引起50％到80％的白血病患者患急性GVHD和20％的白血病患者患致死的GVHD(Kolb.H.J.等，Blood，第86卷，第2041-2050頁，(1995)，和Slavin S.等，Experimental Hematology，第23卷，第1553-1562頁，(1995))。要花很長時間進行去除術，因此給供者施加沉重的負擔。
Giralt等報道了使用不含CD8陽性細胞的白細胞的DLT(Giralt，S.，等，Blood，第86卷，第4338-4343頁，(1995))。Ritz等報道了使用由去除術制備的CD4陽性細胞的DLT(ClaretEJ.等，Journal of Clinical Investigation，第100卷，第4期，第855-866頁，(1997))。在這兩篇報道中都報道產生了GVL(移植物抗白血病(＂Graft versus leukemia＂)的縮寫)的作用，但GVL作用是弱的，輕微的GVL有利地作用于患者。
最近，已有研究試圖使用臍帶血中含有的細胞來代替從外周血或髓血制備的細胞，這實際上已被髓骨移植接替。然而，一般來說，臍帶血中含有的淋巴細胞是原初淋巴細胞，它們不被抗原刺激，因此通常被視為既沒有抗腫瘤活性也沒有抗病毒作用。
臍帶中含有的臍帶血可以在不給供者增加負擔的情況下獲得，而且幾乎沒有對HLA的限制。因此，與從骨髓或外周血收集的細胞相比，它對供者是有利的。但是，臍帶血接種可能更高頻率地使腫瘤復發，并且從病毒感染的可能性和接種細胞的吸收的角度而言是不利的。
發明內容
本發明提供活化淋巴細胞和含有活化淋巴細胞的藥物制劑，所述制劑可以接種到受體，而沒有腫瘤復發的危險，消除由臍帶血移植引起的引起病毒感染和復發腫瘤的可能性。
本發明還提供活化淋巴細胞和從活化淋巴細胞制備的藥物制劑，其具有高的吸收所接種的制劑中的細胞的能力。
本發明還提供方法和成套器具，它們可以制備這樣的藥物制劑，該制劑能被接種到受體，而沒有腫瘤復發的危險，消除由臍帶血移植引起的引起病毒感染和復發腫瘤的可能性。
根據本發明，提供了源于臍帶血并經增殖的活化淋巴細胞。這種源于臍帶血的淋巴細胞通過從臍帶血分離淋巴細胞并在體外直接增殖所分離的淋巴細胞而制備或者通過從臍帶血分離單核細胞并在體外增殖單核細胞而制備。分離的淋巴細胞或單核細胞用白細胞介素2和/或抗CD3抗體活化并增殖。
根據本發明的源于臍帶血的淋巴細胞可以接種到受體或患者，而沒有腫瘤復發的危險，消除由臍帶血移植引起的引起病毒感染疾病，即病毒感染和復發腫瘤的可能性。
根據本發明的藥物制劑通過從臍帶血分離單核細胞，用白細胞介素2和/或抗CD3抗體活化并增殖這樣分離的單核細胞以獲得活化并增殖的淋巴細胞，并且將活化并增殖的淋巴細胞作為主要成分添加其中而制備。
根據本發明的藥物制劑用于治療腫瘤和感染疾病并預防這些疾病的發生和復發。
另外，本發明提供制備源于臍帶血的活化淋巴細胞的方法和成套器具，其包括從臍帶血分離單核細胞，和用白細胞介素2和/或抗CD3抗體活化并增殖這樣分離的單核細胞以獲得活化并增殖的淋巴細胞的過程。
根據本發明的方法和成套器具，可以得到所期望的高能力活化淋巴細胞和藥物制劑，其可以接種到受體，而沒有腫瘤復發的危險，消除由臍帶血移植引起的引起病毒感染和復發腫瘤的可能性。
在理解本文以下描述的實施方案的基礎上，本發明的其它和進一步的目的將變得明顯，或將在所附的權利要求中指明，而且本領域技術人員在實踐中將會發現本文沒有提及的許多優點。
具體實施例方式
根據本發明的制備源于臍帶血的活化淋巴細胞和含有活化淋巴細胞作為主要成分的藥物制劑的方法將在本文以下詳細描述。[臍帶血收集]本發明中源于臍帶血的活化淋巴細胞可以通過活化并增殖從臍帶收集的臍帶血而獲得。從臍帶的血管抽取臍帶血是可取的。另外，可以將肝素或檸檬酸添加到所收集的臍帶血中，以防止所收集的臍帶血凝固。可以使用在臍帶血庫中為移植而保存的臍帶血的一部分。根據本發明的源于臍帶血的活化淋巴細胞可以從0.001ml到100ml臍帶血制備。[源于臍帶血的活化淋巴細胞]源于臍帶血的活化淋巴細胞的增殖通過公知的淋巴細胞培養方法實現。本發明對培養方法沒有任何限制。舉例來說，可以在存在白細胞介素2和抗CD3抗體之一或二者都存在下增殖本發明的活化淋巴細胞。從增殖效率的角度而言，在白細胞介素2和抗CD3抗體都存在下進行增殖是可取的。
在本發明的實施方案中的增殖的情況中，使用市售白細胞介素2。優選使用培養基來培養淋巴細胞以使這樣獲得的活化淋巴細胞濃度為1000到2000U/ml。使用中，這個實施方案中的白細胞介素2可以溶解于培養細胞的普通培養基中。也就是說，根據本發明的方法可以采用培養基如水、生理鹽水、Dulbecco氏磷酸鹽緩沖鹽水溶液、RPMI-1640、DMEM、IMDM和AIM-V，它們都廣泛地用于該領域。為了防止白細胞介素2活性降低，一將其溶解就冷藏是可取的。
這些培養基的類型在本發明中沒有特別的限制，與要培養的淋巴細胞同質(congenial)的任何類型的培養基都可以在本發明中使用。舉例來說，可以使用通過向生物學上源于血清等的培養液或平衡鹽水溶液中添加氨基酸、維生素和/或核酸堿基而獲得的合成培養基。RPMI-1640、AIM-V、DMEM、IMDM等可以用作培養基。這些培養基中，RPMI-1640是最可取被使用的。特別地，正常人血清具有極好的增殖作用，并且因此可以適合用作培養淋巴細胞的培養基。本文所述的培養基在市場上均有售。
舉例來說，淋巴細胞的培養可以通過普通細胞培養方法在培養箱中實現。在30℃到40℃，優選在37℃，在二氧化碳濃度為1％到10％，優選為5％的條件下進行培養是適當的。培養所需的天數在本發明中沒有限制，但培養淋巴細胞2到20天，更優選為3到14天是可取的，以使抗CD3抗體的刺激信息傳遞至細胞。向培養基中加入適量的培養液是可取的，同時在顯微鏡下觀察細胞的狀態以在培養過程中計數細胞的數目。
在培養開始后幾天中，培養的細胞沒有明顯的改變，但是通常在三天后開始增殖。在這一階段，令人滿意的培養引起培養液從桔黃色變為黃色。為了防止培養液變質和白細胞介素2降低，每一至七天向培養基中加入培養液。
在抗CD3抗體存在下的培養完成后，培養可以進一步在沒有抗CD3抗體存在下繼續進行。也就是說，淋巴細胞可以在不含抗CD3抗體的容器中繼續培養，容器如培養瓶、滾瓶和透氣性培養袋。培養可以繼續直至將淋巴細胞給予患者。盡管淋巴細胞的培養在這里所述的條件下進行，但建議在與上述在抗CD3抗體的存在下的培養相同的條件下進行淋巴細胞的培養。也就是說，在淋巴細胞的培養中使用適當濃度的人血清和無血清培養基從花費、可使用性和安全性的角度而言是十分有利的。
舉例來說，在開始培養淋巴細胞時，可以將臍帶血或單核細胞懸浮在含白細胞介素2的培養液中，將培養液置于含有固相抗CD3抗體的培養容器中。另外，可以使用各種類型的細胞因子、增殖活化因子、促細胞分裂原等以增殖并活化源于臍帶血的淋巴細胞。
刺激淋巴細胞的抗CD3抗體可以通過使用純化的CD3分子而在植物或動物中得到，而且使用商品化的OKT-3抗體(由OrthoPharmaceutical Corp.制備)是方便的，OKT-3抗體在穩定性和花費上是有利的。但是，本發明對抗體沒有任何限制，并且可以采用能夠促進淋巴細胞增殖和活化的任何其它抗體。
從淋巴細胞的增殖效率和處理特性的角度而言，使用固相抗CD3抗體是可取的。可以使用將抗體變為固相的器具，由玻璃、聚氨酯、聚烯烴、聚苯乙烯等制成的增殖容器。另外，可以使用用于增殖細胞的滅菌塑料瓶。可以選擇增殖容器的適當大小。
使抗CD3抗體變為固相的固化通過向特定的器皿中加入抗CD3抗體的稀溶液并讓其在某個溫度，如4到37℃靜置2到24小時而進行。在本發明的實施方案中，使用用生理Dulbecco氏磷酸鹽緩沖鹽水溶液稀釋到0.1到30μg/ml的固相抗CD3抗體是可取的。
固化后，這樣獲得的固相抗CD3抗體被貯藏在冷凍室或冰箱(4℃)中直到使用。使用時，除去溶液。如果需要，抗CD3抗體可以用Dulbecco氏磷酸鹽緩沖鹽水溶液等在室溫下淋洗。
這樣獲得的源于臍帶血的淋巴細胞被進一步加工成制劑，如下描述。從源于臍帶血的淋巴細胞制備的制劑在治療、預防或減輕諸如腫瘤或感染的各種疾病中被廣泛有效地使用。
本文所用的術語“制劑”意指具有生物防御作用的含有源于臍帶血的淋巴細胞作為主要成分的所有物質。即，可以使用任何含有源于臍帶血的淋巴細胞的制劑。舉例來說，可以使用懸浮在適當溶液中的源于臍帶血的淋巴細胞。盡管可以可取地使用以下形式，其中源于臍帶血的淋巴細胞為了流體治療而懸浮于生理鹽水中，該形式含有人血清，但是，本發明并沒有特定地限制其形式。
在本發明的實施方案中，通過在試管中直接增殖臍帶血，或從臍帶血分離單核細胞并用白細胞介素2和/或抗CD3抗體活化并增殖這樣分離的單核細胞，可以制備如上所述的含有源于臍帶血的淋巴細胞作為主要成分的制劑。
根據本發明的制劑中源于臍帶血的淋巴細胞可以用各種基因或者固有(intrinsic)基因的缺省(default)或修飾基因制備。通過使用缺乏人免疫缺陷病毒感染的必需輔因子的源于臍帶血的淋巴細胞，可能預防并治療人免疫缺陷病毒感染或者由人免疫缺陷病毒在免疫缺陷癥狀中引起的各種感染。此外，盡管根據本發明的制劑可以被用于供者和患者的HLA彼此匹配的情況是理所當然的事，但是，甚至當供者和患者的HLA不匹配時，也可以使用本發明的制劑。
含有根據本發明的源于臍帶血的淋巴細胞作為主要成分的制劑可以應用于治療和預防癌癥、免疫缺陷、自身免疫疾病的疾病，要經受臍帶血干細胞移植的變應性疾病的患者以及各種感染疾病。
根據本發明的制劑不僅可以有效地用于治療和預防如上所述的各種腫瘤，而且可以有效地用于治療和預防白血病和其它實體癌。
可以用本發明的制劑治療的癌癥列舉如下肺癌、胃癌、結腸癌、直腸癌、肝癌、胰腺癌、膽囊癌、卵巢癌、子宮癌、睪丸癌、前列腺癌、白血病、肉瘤、腦腫瘤等。免疫缺陷綜合征分為獲得性免疫缺陷和先天性免疫缺陷。根據本發明的制劑對其有效的獲得性免疫缺陷包括惡性復合免疫缺陷(SCID)、維-奧綜合征、腺苷脫氨酶缺損和嘌呤核苷磷酸化酶缺損。但是，本發明不僅限于這些綜合征。
根據本發明的制劑對其有效的先天性免疫缺陷包括由使用制癌制劑、免疫抑制制劑或類固醇引起的繼發免疫缺陷，以及由人免疫缺陷病毒感染引起的AIDS。但是，本發明并不限于這些疾病。根據本發明的制劑對其有效的自身免疫疾病包括系統性紅斑狼瘡、慢性風濕、斯舍格倫綜合征、重癥肌無力、惡性貧血和橋本氏病，但是，本發明并不限于這些疾病。
此外，根據本發明的制劑在治療和預防中不僅可以提供給免疫性減退的患者，而且可以提供給對特定病毒沒有免疫性的患者。根據本發明的制劑對其有效的變應性疾病包括支氣管性氣喘、日本雪松花粉病、蕁麻疹、風疹等。但是，本發明并不限于這些疾病。根據本發明的制劑可以用于治療、預防和減輕各種類型的變應性疾病。
根據本發明的制劑對其有效的感染包括病毒感染、微生物感染、真菌感染、原生動物干染、衣原體感染病、支原體感染等。在病毒感染中有由巨細胞病毒和EB病毒引起的感染。但是，本發明并不限于這些感染。也就是說，根據本發明的制劑在治療和預防由皰疹病毒，如單純皰疹病毒和水痘-帶狀皰疹病毒，以及逆轉錄病毒，如人白血病病毒和人免疫缺陷病毒引起的病毒感染有效。
根據本發明的制劑對其有效的前述微生物感染包括由綠膿桿菌溶血素、耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌(MRSA)和其它致病桿菌引起的感染。根據本發明的制劑甚至可以用于由未知或難以識別的病原體引起的感染和它們的偶見疾病。[制備含有源于臍帶血的活化淋巴細胞作為主要成分的制劑的成套器具]盡管根據本發明的源于臍帶血的活化淋巴細胞成分可以單獨用作試劑，但是，源于臍帶血的淋巴細胞、培養液和固化抗CD3抗體的瓶的組合組成了制備根據本發明的的源于臍帶血的活化淋巴細胞的成套器具。用該成套器具，容易確定地制備根據本發明的制劑。
在本發明的成套器具中使用的培養液可以被預先放入固化抗CD3抗體的瓶中。貯存在瓶中的源于臍帶血的活化淋巴細胞可以冷藏。這樣，通過制備至少由兩種成分作為多個試劑組成的成套器具，可以容易地制備根據本發明的制劑并將其用于預防和治療上述各種病毒感染和各種疾病。
根據本發明的含有源于臍帶血的活化淋巴細胞的制劑可以以冷凍狀態保存并根據需要用于預防和治療各種疾病。[劑量]由本發明的方法所制備的含有前述活化淋巴細胞作為主要成分的制劑的量，可以根據要給予本發明制劑的患者的癥狀與狀態任意確定。一般來說，每1千克患者體重可以適當地給予1×103到1×108數量級的淋巴細胞。優選地，在預期制劑的效率下可以給予患者1×103到1×108個淋巴細胞。[給藥]根據本發明的制劑以注射或靜脈滴注的方式給予患者是可取的。更優選的是使用含有向其中加入前述細胞的生理鹽水的注射劑或靜脈滴注劑，生理鹽水使人血清白蛋白的濃度為0.01％到5％。根據本發明的制劑的給藥可以適當地通過靜脈滴注或注射入靜脈、動脈或局部而進行。盡管要給予制劑的量取決于給藥方法或部位，但是，給予1到500ml制劑是可取的。使用期望量的含有上述規定量細胞的制劑是更加可取的。推薦給予患者本發明的制劑的頻率為每天一次到每月一次，而且制劑的給予次數至少為一次。[實驗實施方案1]1、培養瓶的配置用Dulbecco氏磷酸鹽緩沖鹽水溶液(Nipro MedicalCorporation銷售)將3ml OKT3溶液(由OrthoPharmaceutical Corp.生產并由Janssen-Kyowa Co.，Ltd.進口)稀釋到5μg/ml，并注入培養瓶(由Sumitomo BakeliteCompany Ltd.生產的MS-200)中，以使瓶的底部浸入溶液中。
將培養瓶中含有的溶液在冰箱中保存過夜，之后，用排出器吸出OKT3。然后，向瓶中倒入10ml生理鹽水，蓋上瓶并劇烈搖動，然后，打開瓶并取出溶液。再向瓶中加入01ml生理鹽水(HikariParmaceutical Co.Ltd.)。再用塞子蓋上瓶并劇烈搖動瓶。此后，打開瓶并將剩余液體內容物從瓶和塞子中小心移走。
在瓶中，將43.5ml培養基(RPMI1640+7，由Nikken BioMedical Laboratory Inc.生產)和35000U/ml的IL-2(由Cetus Corporation生產)、0.5ml兩性霉素B(由LifeTechnologies Oriental Inc.進口并銷售)，以及0.5ml人血清的混合物混合以獲得培養基。準備三只同樣的瓶。瓶在使用前被保存在冰箱中。2、血液收集從三個供者的臍帶收集5到20ml臍帶血，并添加肝素。3、所收集的臍帶血的培養最初，從冰箱中取出在上述過程1中準備的瓶并讓其靜置10分鐘。確證每一個瓶中的培養基都完全溶解后，向三個瓶的每一個中倒入100μl在上述過程2中獲得的臍帶血，并輕輕攪拌以使每一個瓶中的臍帶血均勻分散。此后，在濕度為95％，CO2濃度為5％(第一天)的培養箱(Sanyo Electric Biomedical Co.，Ltd.生產的MIP-3033)中開始培養。4、用提爾克氏溶液(Turk′solution)測量細胞數目10μl在上述過程2中收集的臍帶血與40μl提爾克氏溶液(由Muto Kagaku Yakuhin生產)混合。將10μl混合物施加于血細胞計數器(Perkin Elmer Corporation生產，產品號9731)，并在顯微鏡(由Olympus Optical Co.，Ltd.生產的211320型)下測量以計數細胞數目。獲得的結果是三個瓶中的細胞的總數目分另為1.3×105、1.5×105、1.4×105。5、用于分析細胞表面抗原的臍帶血單核細胞的分離在凈化臺(Showa Science Co.，Ltd.生產的S-1100型)上，從含有這樣收集的臍帶血的注射器無菌地取下皮下注射針頭，不接觸注射器和針頭的連接部分，并且換上另一個皮下注射針頭(19G×1·1/2”針頭，Nipro Medical Corporation生產)。然后，將5ml淋洗培養基(Nikken Bio Medical LaboratoryInc.生產)放入體積為15ml的離心沉降管(Iwaki Glass Co.，Ltd.生產，產品號為2327-015)中，進一步，將收集的臍帶血慢慢加入離心沉降管中。此后，用塞子將離心沉降管緊緊蓋住，然后上下翻轉幾次使之混合。
接下來，通過使用容量為10ml的移液管(移液管4105，Corning International進口并銷售)向體積為15ml的離心沉降管中注入15ml Lymphosepar-1(Immuno-BiologicalLaboratories Co.，Ltd.生產)。然后，將10ml用淋洗培養基稀釋的臍帶血倒入離心沉降管中，其后，用制動關閉的離心分離機在20℃的離心分離溫度以相對低的1800rpm速度離心15分鐘，以不擾動試管中的溶液表面(使用由Kokusan Co.，Ltd生產的離心沉降器H-700R)。
離心沉降后，將試管中離心的液體內容物的上清液用抽吸器在無菌條件下慢慢吸出，直到離心沉降在試管中的淋巴細胞層以上約1cm的深度，以不吸入淋巴細胞。然后，通過使用容量為5ml的移液管吸出試管中的淋巴細胞層，以不吸入血塊，并且用容量為15ml的離心沉降管收集，該管中預先含有10ml淋洗培養基(RPMI1640+6)。之后，用塞子將離心沉降管蓋上并上下翻轉幾次以混合。其后，離心沉降管在20℃的離心分離溫度于1800rpm下離心10分鐘。
在離心沉降管被進一步離心后，除去試管中的上清液，通過使用渦流混合器完全分散細胞沉淀。最后，向其中加入10ml淋洗培養基，試管被再次上下翻轉以充分混合懸浮液。然后，取出500μl試管中的懸浮液到三個1.5ml的微管(K.K.Asist進口并銷售)中以形成三個懸浮液樣品，用于測量CD3、HLA-DR和CD4、CD8的百分含量以及分析細胞的表面抗原。6、細胞表面抗原的分析為了沉降細胞，通過使用離心沉降器(Sakuma Seisakjo Inc.生產的M-150型)，將上面過程5中所制備的三個懸浮液樣品在4℃的離心分離溫度下以6000rpm離心分離5分鐘。吸出每個樣品的上清液后，將8μl PBS(-)和8μl CD3/HLA-DR抗體(NipponBecton Dickinson Company，Ltd.進口并銷售，產品號為340048)加入到第一個樣品管中，將8μl CD4/CD8抗體(NipponBecton Dickinson Company，Ltd.進口并銷售)加入到第二個樣品管中。然后，這些樣品反應30分鐘。
為了控制樣品的非特異性反應，向第三個樣品管中加入8μl的PBS(-)。反應后將鞘流體(ISOTON-2，Bectman Coulter Inc.生產)加入到各樣品管中。然后，在攪拌后，將各管中的內容物用渦流混合器攪拌并在4℃于6000rpm離心5分鐘，以沉降細胞。吸出各管中的上清液后，加入800μl鞘流體。然后徹底攪拌管中的懸浮液并將其分別注入到FACS測量管(Nippon BectonDickinson Company，Ltd.進口并銷售)中。
通過使用測量裝置FCAScan(Nippon Becton DickinsonCompany，Ltd.進口并銷售)根據裝置所附的說明書進行FACS測量。其結果表明CD3、HLA-DR、CD4和CD8陽性細胞的百分含量在第一個樣品中是28％、3％、39％和7％，在第二個樣品中是18％、1％、17％和3％，在第三三個樣品中是15％、4％、16％和8％。7、用提爾克氏溶液測量細胞數目制備10μl上述過程3中培養了7天的細胞和40μl提爾克氏溶液(Muto Kagawa Yakuhin生產)的混合物。
將10μl這樣獲得的混合物施加于血細胞計數器(PerkinElmer Corporation生產，產品號9731)，并在顯微鏡(由Olympus Optical Co.，Ltd.生產的211320型)下測量計數細胞的數目。測量的結果表明瓶中的細胞總數目分別為1.7×107、1.9×107、1.7×107。8、七天時細胞表面抗原的分析進行了在前述過程3和4中培養開始七天后的細胞的FACS上，細胞的表面抗原分析。分析結果表明CD3、HLA-DR、CD4和CD8的比率在第一個樣品中是98％、10％、79％和20％，在第二個樣品中是98％、22％、78％和20％，在第三個樣品中是97％、56％、72％和27％。
同樣，在過程3和4中培養開始七天后，進行了CD45RA抗體(Nippon Becton Dickinson Company，Ltd.進口并銷售，產品號為347723)和CD45RO抗體(Nippon Becton DickinsonCompany，Ltd.進口并銷售，產品號為347967)的陽性分析。分析結果表明CD45RA和CD45RO的比率分別為7％和73％。因為源于臍帶血的活化淋巴細胞實際上有陽性CD45RO，所以認為他們實現了優越的抗腫瘤作用和抗感染保護作用。[實驗實施方案2]臍帶血單核細胞的培養將在上述過程5中分離的臍帶血單核細胞在上述過程1中準備的培養瓶中培養。結果可以發現細胞的增殖。[實驗實施方案3]促進血原干細胞吸收的研究將所增殖的源于臍帶血的活化淋巴細胞給予患者，這些細胞源于以過程1中所述方式移植給接受臍帶血的患者的臍帶血的一部分。但是，抗體并不立即在患者體內產生。從這個事實可以明顯地看出源于臍帶血的活化淋巴細胞具有促進血原干細胞吸收的作用。
從前面的描述中可以明顯看出源于臍帶血并增殖的活化淋巴細胞或含有根據本發明方法的源于臍帶血的活化淋巴細胞的制劑對預防和治療各種類型的腫瘤和各種類型的感染非常有效。此外，源于臍帶血的活化淋巴細胞及其制劑不僅可以有效地用于預防上述疾病的復發，無論是否進行了移植，而且促進干細胞或其它器官的吸收。
權利要求
1.源于臍帶血的活化淋巴細胞，其通過從所述臍帶血分離淋巴細胞并在體外直接增殖并活化所述分離的淋巴細胞而制備。
2.如權利要求1所述的源于臍帶血的活化淋巴細胞，其中所述源于臍帶血的淋巴細胞用白細胞介素2和/或抗CD3抗體增殖并活化。
3.源于臍帶血的活化淋巴細胞，其通過從臍帶血分離單核細胞并在體外增殖所述分離的單核細胞而制備。
4.如權利要求3所述的源于臍帶血的活化淋巴細胞，其中所述源于臍帶血的淋巴細胞用白細胞介素2和/或抗CD3抗體增殖并活化。
5.預防或治療腫瘤和感染疾的制劑，其含有源于臍帶血的活化淋巴細胞，所述活化淋巴細胞通過從所述臍帶血分離淋巴細胞并在體外直接增殖并活化所述分離的淋巴細胞而制備。
6.如權利要求5所述的制劑，其中所述源于臍帶血的淋巴細胞用白細胞介素2和/或抗CD3抗體增殖并活化。
7.如權利要求5所述的制劑，其中所述感染疾病是病毒感染。
8.預防或治療腫瘤和感染疾病的制劑，其含有源于臍帶血的活化淋巴細胞，所述活化淋巴細胞通過從臍帶血分離單核細胞并在體外增殖所述分離的單核細胞而制備。
9.如權利要求8所述的制劑，其中所述源于臍帶血的淋巴細胞用白細胞介素2和/或抗CD3抗體增殖并活化。
10.促進器官干細胞吸收的制劑，其含有源于臍帶血的活化淋巴細胞，所述活化淋巴細胞通過從所述臍帶血分離淋巴細胞并在體外直接增殖并活化所述分離的淋巴細胞而制備。
11.如權利要求10所述的制劑，其中所述源于臍帶血的淋巴細胞用白細胞介素2和/或抗CD3抗體增殖并活化。
12.用于制備預防或治療腫瘤和感染疾病的制劑的成套器具，所述制劑含有源于臍帶血的活化淋巴細胞，所述活化淋巴細胞通過從所述臍帶血分離淋巴細胞并在體外直接增殖并活化所述分離的淋巴細胞而制備。
13.如權利要求12所述的成套器具，其中所述源于臍帶血的淋巴細胞用白細胞介素2和/或抗CD3抗體增殖并活化。
14.用于制備預防或治療腫瘤和感染疾病的制劑的成套器具，所述制劑含有源于臍帶血的活化淋巴細胞，所述活化淋巴細胞通過從臍帶血分離單核細胞并在體外增殖所述分離的單核細胞而制備。
15.如權利要求14所述的成套器具，其中所述源于臍帶血的淋巴細胞用白細胞介素2和/或抗CD3抗體增殖并活化。
16.制備預防或治療腫瘤和感染疾病的制劑的方法，所述制劑含有源于臍帶血的活化淋巴細胞，所述活化淋巴細胞通過從所述臍帶血分離淋巴細胞并在體外直接增殖并活化所述分離的淋巴細胞而制備。
17.如權利要求16所述的方法，其中所述源于臍帶血的淋巴細胞用白細胞介素2和/或抗CD3抗體增殖并活化。
18.制備預防或治療腫瘤和感染疾病的制劑的方法，所述制劑含有源于臍帶血的活化淋巴細胞，所述活化淋巴細胞通過從臍帶血分離單核細胞并在體外增殖所述分離的單核細胞而制備。
19.如權利要求18所述的方法，其中所述源于臍帶血的淋巴細胞用白細胞介素2和/或抗CD3抗體增殖并活化。
全文摘要
源于臍帶血的活化淋巴細胞對預防和治療各種類型的腫瘤和各種類型的感染非常有效。用白細胞介素2和/或抗CD3抗體,源于臍帶血的淋巴細胞通過從臍帶血分離淋巴細胞并在體外直接增殖所分離的淋巴細胞或從臍帶血分離單核細胞并在體外增殖該單核細胞而制備。此外,源于臍帶血的活化淋巴細胞可以有效地用于預防疾病的復發生和促進干細胞或其它器官的吸收。
文檔編號A61K38/00GK1363681SQ0114040
公開日2002年8月14日 申請日期2001年12月4日 優先權日2000年12月4日
發明者關根暉彬, 伊藤仁也, 清水則夫, 馬場憲三, 山口智宏, 黑巖保幸 申請人:胡曼泰克有限公司