核糖口服液的制作方法

專利名稱：核糖口服液的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種核糖口服液，尤其是一種D-核糖口服液。
核糖是生物工程高科技產品。核糖是心肌細胞的營養源，同時又是ATP合成的前體物質。核糖對異丙基腎上腺素導致的必肌細胞損傷具有保護作用。核糖主要從分子水平調節細胞的生理代謝功能，激活細胞內代謝酶活性，修復損傷的細胞。核糖在體內經磷酸戊糖代謝途徑為體內合成芳香族氨基酸、核苷酸提供前體物質。
核糖和ATP有著特殊的關系，它是ATP的組成糖，是其中的核心物質，在細胞中核酸類物質包括ATP的體內合成者是以D-核糖為底物經若干步反應后完成的。
外源ATP難以直接進入細胞內部，會在胞外降解，而核糖卻可以很容易進入細胞內部，這樣核糖就可以替代外源ATP來使用；因而就找到了一種方法可以通過腸胃吸收或非腸胃吸收的方式，提高體內的核糖水平，誘導體內內源ATP的合成，提高細胞體內的ATP水平，從而提高能量，這樣就實現的抗疲勞的保健功能。
D-核糖是五碳糖，以化合物的形式存在于一切細胞中。核糖是生命遺傳物質脫氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)的核心部分，也是各種核苷酸如三磷酸腺苷(ATP)的組成糖，還是各種核苷酸輔酶的組成糖。D-核糖在生物體內的代謝、生理活性作用主要有以下幾方面(1)核糖是核苷酸合成的底物生物體在合成核苷酸的時候，是以核糖作為合成核酸的中心起始物質。生物體在合成核酸時，首先從5’-磷酸核糖開始，然后生成5’-磷酸核糖焦磷酸(PRPP)，再經過一系列酶促反應，將碳、氮原子逐一加到環上，先生成次黃嘌呤核苷酸，然后再由次黃嘌呤核苷酸轉變為其它嘌呤核苷酸進行核酸代謝。因此核糖是核苷酸合成的物質基礎。
(2)提供生物體內各種生化反應的起始材料核糖進入的氧化戊糖磷酸循環又稱為己糖——磷酸支路途徑。這一條途徑為一個多樣性的有機體在形成芳香族氨基酸與酚類物質時，提供了部分碳架；同時提供生物合成還原作用所必須的還原勢源泉——還原型輔酶II(NADPH2)。還原性輔酶II是許多生化反應所必不可少的。在戊糖磷酸循環途徑中，它的產物是許多重要物質合成的必要產物，如核糖-5-磷酸是核苷酸的底物；赤蘚糖-4-磷酸是合成L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、L-色氨酸等芳香族氨基酸的底物以及包括木質素在內的酚類物質的前體物質。
(3)戊糖磷酸循環代謝在糖代謝過程中，核糖利用無機磷形成核糖-1-磷酸，轉變成核糖-5-磷酸后，進入戊糖磷酸循環轉變成3-磷酸-甘油醛和果糖-6-磷酸。3-磷酸-甘油醛在轉變成丙酮酸時產生三磷酸腺苷(ATP)，而果糖-6-磷酸變為葡萄糖-6-磷酸進入酵解系統形成丙酮酸，請參見圖3。
D-核糖在戊糖磷酸循環途徑中，由一部分核糖-5-磷酸轉變成葡萄糖-6-磷酸時不需要消耗ATP。在酵解系統中，由葡萄糖形成葡萄糖-6-磷酸第一步反應就需要ATP參與葡萄糖磷酸化。
(4)核糖與ATP的作用D-核糖參與戊糖磷酸循環途徑，經戊糖磷酸支路，每一個分子的NADPH2經呼吸鏈磷酸化可以合成3個分子的ATP，一個核糖分子可提供能量合成35個ATP分子。
人體內ATP的作用是十分重要的，沒有內源ATP的幫助，人的生命就不能繼續，這是由于沒有能量存在，所有的有機過程就不能發生。在氧化磷酸化途徑中，由于ATP的三磷酸鍵連在細胞膜上，外源ATP不能透過細胞壁，血液循環中的外源ATP難以直接進入局部缺血組織細胞。而核糖在細胞內可以合成ATP。人體能量儲存和利用均以ATP為中心。每個ATP含有2個高能磷酸鍵，水解為二磷酸腺苷(ADP)時可釋放8000卡熱量，能增加血流量，促進組織代謝及蛋白質合成。ATP對心臟的作用不僅是提供能量，它對心臟具有發動機引火的作用。通過生成環腺苷酸(cAMP)而激活磷酸化酶的活性，增加糖的氧化，從而生成更多的ATP。缺血組織恢復與能量代謝即ATP儲備、合成和消耗密切相關。ATP減少，需能活動受損，Na+進入細胞內，細胞腫脹，細胞器(線粒體、內質網等)也發生腫脹；而ATP的缺乏又使離子轉運發生障礙，從而加重了機體代謝的障礙，使缺血組織難于恢復，甚至由于溶酶體膜的通透性增加，溶酶釋放，導致細胞破壞、死亡。由于養分和氧的供應障礙，有氧代謝停止，線粒體產能障礙，線粒體只能通過氧代謝產生能量，必然導致ATP儲備下降。
(5)核糖作用機理核糖是心肌細胞的營養源，同時又是合成ATP的前體物質，對異丙基腎上腺素導致的心肌細胞損傷具有保護作用。核糖主要從分子水平調節細胞生理代謝功能；激活細胞內代謝酶活性，修復損傷的細胞。
心肌保護與ATP密切相關，心肌ATP含量是衡量細胞完整性以及恢復可能性的最好指標。供心功能恢復與心肌ATP含量有關，供心功能恢復與供心能量代謝密切相關。當ATP含量下降到缺血前的50％時，心肌將產生不可逆的病理變化，既使灌后收縮功能也難于恢復。
心肌缺氧后，若增加心臟組織中核糖含量，可以使得心肌合成腺苷酸的水平上升90％，同時還可以使5’-磷酸核糖焦磷酸(PRPP)在心肌組織中的積累量增加，保護心肌細胞，減少損傷。心肌缺血后，靜脈滴注核糖溶液后，可以使ATP再生能力提高8倍。
在局部缺氧的情況下，氧化磷酸化所儲存的ATP減少，而ATP是必須要提供肌肉收縮的能量，在這時候，肌細胞就利用無氧磷酸化來提供所需要的ATP。無氧磷酸化發生在胞質和線粒體中，高能磷酸鍵以磷酸肌酸(CP)、二磷酸腺苷(ADP)、一磷酸腺苷(AMP)的形式表現。
最主要的無氧磷酸化反應；當興奮持續時，ATP減少要通過CP供能來恢復ATP。當CP減少時，就要使用其它儲存的能量。這時候，丙酮酸轉化為乳酸，提供了額外的能量，而在核糖代謝時就同時產生了ATP和丙酮酸，丙酮酸進一步產生ATP，這樣就提供了大量能量。從而降低疲勞程序。
第二個恢復ATP的反應發明內容本發明依據上述相關理論，結合自身特點，選擇了前述配伍提供一種D-核糖口服液，經動物試驗表明具有抗疲勞的作用，且無毒副作用。
本發明D-核糖口服液的功效成分、含量及功效成分的檢驗方法如下(1)功效成分本產品的主要功效成分是D-核糖。
英文名稱D-Ribose化學名稱D-呋喃核糖。
分子式C5H10O5分子量150.13。
結構式為 本產品功效成份D-核糖其理化性能為白色結晶粉末狀，微有芳香之味，極易吸潮，能溶于水和甲醇，在水中有過飽和傾向，常以糖漿形式存在。微溶于乙醇，不溶于醚、苯、丙酮及氯仿。熔點86-87℃，比旋度-19.5°--25.0°(24℃水中).
(2)含量(重量百分數)35-40％(3)功效成分的檢驗方法參見產品企業標準Q/320201UCA02-2000。
圖2是D-核糖口服液生產工藝簡圖。
圖3是戊糖磷酸循環代謝示意圖。
下面結合附圖對本發明作進一步說明。
參見

圖1，D-核糖生產工藝以莽草酸營養缺陷型突變株枯草桿菌(Bacillus subtilis JSIM-1018)，經斜面活化、茄子瓶培養后接種于以葡萄糖、玉米漿、無機鹽組成的種子培養基中進行擴大培養，種子液轉接于由淀粉水解糖、酵母粉、硫酸銨組成的發酵培養基中進行發酵生產。
發酵液經板框過濾、膜過濾去菌體、去蛋白等雜質，過濾液經離交法脫鹽、脫色后得到離交液，離交液經濃縮、冷凍結晶、干燥、粉碎精制而成為D-核糖。
參見圖2，核糖口服液生產工藝本發明產品根據中國專利95112736.5號的發酵工程生產的D-核糖為主要生產原料。
取D-核糖200-500kg，溶解于600升蒸餾水中，用蒸餾水定容到1000升。核糖溶液經膜過濾后分裝成10000小瓶，每瓶100ml。按巴斯德滅菌法消毒，經檢驗、包裝、抽檢后制備成為核糖口服液成品。
(一)D-核糖生產工藝操作過程(1)生產菌株枯草桿菌(Bacillus subtilis JSIM-1018)。莽草酸營養素缺陷型，缺失轉酮醇酶。江蘇省微生物研究所選育并保存。
(2)菌株培養及培養條件保藏菌種接種于由葡萄糖、蛋白胨、酵母膏、NaCl、瓊脂組成的培養基中，30℃培養48小時。菌株經活化后，轉接于茄子瓶斜面，茄子瓶斜面在30℃培養48小時后，用無菌水洗下，置于接種瓶內，備用。
(3)種子培養①種子罐種子罐為不銹鋼制標準罐，夾套冷卻，六彎葉型攪拌，攪拌轉速250轉/分，種子罐裝液量為70％。
②配料在種子罐內加入適量自來水，在攪拌狀態下，將已稱量好的種子原料葡萄糖、磷酸二氫鉀、玉米漿、酵母膏投入種子罐內。夾套加熱溶解，用液堿調節培養基PH到7.0-7.2左右后，投入適量消泡劑，用水定容后，滅菌。
③接種與培養接種量及接種。按100升種子液1-2只茄子瓶斜面計算茄子瓶用量。在生長豐滿的茄子瓶中加入無菌水洗下菌落，合并到接種瓶內。用壓差法接入種子罐內。
培養條件。接種完畢進行通風攪拌培養。罐壓0.05-0.1Mpa，培養溫度36±1℃，通風量1∶0.3，攪拌轉速200轉/分。培養時間18-22小時。
(4)發酵培養①發酵罐發酵罐為不銹鋼制標準發酵罐，列管冷卻，六彎葉二組攪拌漿，轉速140轉/分-200轉/分，發酵罐裝液量為70％。
②配料發酵罐內的料液主要是糖液、碳酸鈣、米玉漿、酵母粉、硫酸銨，用自來水配制，料液PH7.0-7.2，加入消泡劑，滅菌。
③移種與培養管道消毒；移種前一小時進行移種管道消毒。管道消毒條件表壓0.2Mpa，溫度130℃；消毒時間30-40分鐘。
移種；待發酵罐內溫度降至38±1℃，開始移種。移種時用壓差法將種子罐內已培養好的種子液接入發酵罐內。
發酵培養條件移種完畢進行通風攪拌培養。培養條件為罐壓0.05Mpa-0.1Mpa；培養溫度38±1℃；攪拌轉速140-200轉/分；發酵周期68-76小時；風量1∶0.35-0.6。
④提取、精制發酵結束后，發酵液經板框過濾、膜過濾除去菌體、蛋白質等雜質后，得到發酵清液。發酵清液經陰、陽離交柱處理后，濃縮至糖漿狀，經乙醇沉淀結晶后，60℃減壓濃縮、結晶、烘干，粉碎過篩后，得到D-核糖。
詳細制備D-核糖的方法參見中國專利95112736.5號內容，該專利為本發明的參考文獻。
以下結合附圖2對D-核糖口服液生產工藝進行詳細說明。
核糖口服液生產工藝操作過程(1)配料罐空消配料罐主要用于核糖口服液的配料。配料罐空消條件為表壓0.1-0.2Mpa，溫度121℃-130℃，空消時間30-40分鐘。
(2)罐裝瓶空消罐裝瓶空消條件為；表壓0.1-0.2Mpa，溫度121℃-130℃，空消時間30-40分鐘。
(3)蒸餾水制備蒸餾水制備按照《中華人民共和國藥典》2000年版二部中蒸餾水的要求進行制備。
(4)配料在配料罐內加入適量蒸餾水，在攪拌狀態下，將已稱量好的D-核糖350-400kg，溶解于600升蒸餾水中，夾套加熱40-50℃溶解，用蒸餾水定容到1000升。
(5)膜過濾將已配置好的35-40％的核糖溶液通過0.2μ～0.45μ膜過濾設備進行除菌過濾后，得到過濾液。
(6)分裝將已過濾的核糖溶液分裝成10000小瓶，每瓶100ml，壓蓋、封口。
(7)消毒按巴斯德滅菌法進行消毒。
(8)成品經檢驗、包裝、抽檢合格后制成核糖口服液成品。
本發明中關鍵工序工藝控制點(1)種子培養液種子接種后12小時取樣分析。12小時后，每隔3小時取樣分析種子生長過程中種子液PH、種子生長光密度(O.D值)、殘糖、顯微鏡檢查，跟蹤菌種生長情況。
種子培養液質量控制指標及移種條件O.D凈長0.2以上。
顯微鏡鏡檢革蘭氏染色陽性，菌種形態呈彎曲型、數字型、鎖狀型，無雜菌。
(2)發酵培養接種量；10％。發酵18-24小時后，每隔6小時取樣測定PH、菌種生長光密度(O.D值)、殘糖、核糖產物、顯微鏡檢查，跟蹤發酵生長情況。
(3)發酵放罐條件控制當發酵接經終點時，發酵液O.D值不變，PH值回升，葡萄糖耗盡，D-核糖濃度不再增加時，即可放罐。
(4)D-核糖質量控制

(5)核糖口服液質量控制

本發明中對工藝衛生、環境衛生的要求(1)空氣。發酵生產過程中種子罐、發酵罐內所用的空氣，是經過空氣凈化系統處理過的無菌空氣。
(2)種子室生產環境。種子室為無菌室，微生物菌種培養的操作在無菌室的無菌條件下進行。
(3)操作材料.試管斜面、茄子瓶斜面制備時所需棉塞、試管、茄子瓶、三角瓶、接種瓶，口服液灌裝瓶，使用前必須在0.1Mpa 121℃滅菌30-40分鐘后方可使用。
(4)空氣分過濾器消毒。空氣分過濾器在發酵罐空消時同時進行消毒。消毒完畢后用無菌風吹干，備用。
(5)空消。配料前，種子罐、發酵罐空消。空消條件表壓0.1-0.2Mpa；溫度121℃-130℃；空消時間30-40分鐘。
(6)種子罐實消。滅菌條件表壓0.1Mpa，溫度121℃，時間10-20分鐘。滅菌結束后降溫冷卻，備用。
(7)發酵罐消毒.采取實罐消毒。滅菌條件表壓0.1Mpa。溫度118℃-120℃，時間10-20分鐘。滅菌溫度升到118℃時，開始計時。
(8)口服液配料罐空消。配料前，口服液配料罐必須空消。空消條件表壓0.1-0.2Mpa；溫度121℃-130℃；空消時間30-40分鐘。
(9)口服液生產環境。口服液生產環境為潔凈區，空氣潔凈度為30萬級。
(10)工廠環境。工廠四周綠化，建立污水處理系統，注意環境保護，工廠生產環境為花園式工廠。
本發明的D-核糖口服液經國家體育總局運動醫學研究所興奮劑檢測中心進行興奮劑檢測，未發現國際奧委會2000年規定禁用的刺激劑、麻醉劑、B-阻斷劑、利尿劑和甾體激素類藥物。
本發明的核糖口服液，經江蘇省疾病預防控制中心依據《食品安全性毒理學評價程序和方法》評價，得出如下結論1.小鼠急性經口毒性試驗雌雄小鼠經口LD50值均大于21.50g/kg b.wt.，該樣品屬無毒級。
2.Ames試驗平板摻入法，劑量達5000μg/皿，加及不加S9，對標準測試菌TA97a、TA98、TA100和TA102均未檢出明顯的誘變活性。
3.小鼠骨髓嗜多染細細胞微核試驗劑量達5.00g/kg b.wt/d，未檢出對雌雄小鼠骨髓嗜多染紅細胞的致微核作用。
4小鼠睪丸初級精母細胞染色體畸變分析劑量達5.00g/kg b.wt。未檢出對雌雄小鼠睪丸初級精母細胞染色體的誘變活性。
5.30天喂養試驗劑量達10.00g/kg b.wt/d.(雌雄大鼠實際攝入量分別為相當于推薦劑量的193倍和169倍)，該樣品對大鼠各項受試指標均未見明顯有害作用。
本發明的核糖口服液經江蘇省疾病預防控制中心依據衛生部(1996)《保健食品功能學評價程序和檢驗方法》進行評價，得出如下結論昆明種小鼠連續30天經口灌胃給予本發明的核糖口服液，劑量分別為1.25、2.50(相當于成人每日每千克體重推薦攝影入量的10倍)、5.00g/kgb.wt，另設陰性對照組(水)，灌胃量均為20ml/kg b.w.。結果如下1.本發明的核糖口服液各劑量組小鼠負重游泳時間均比陰性對照組延長，其中低劑量組與陰性對照組相比具極顯著性差異(p<0.01>，高劑量組與陰性對照組相比具顯著性差異(p<0.01>，負重游泳試驗陽性.
2.本發明的核糖口服液各劑量組小鼠肝糖原含量與陰性對照組相比均升高，其中低\中劑量組與陰性對照組相比具顯著性差異(p<0.05>，高劑量組與陰性對照組相比具極顯著性差異(p<0.01>。
3.本發明的核糖口服液各劑量組小鼠運動后血清BUN含量均低于陰性對照組，其中中劑量組與陰性對照組相比具顯著性差異(p<0.05>，低\高劑量組與陰性對照組相比具極顯著性差異(p<0.01>。
4.本發明的核糖口服液各劑量組小鼠運動后血乳酸升高幅度與陰性對照組相比無顯著性差異(p＞0.05>，休息45min后低、中劑量組血乳酸降低幅茺大于陰性對照組，其中低劑量組血乳酸降低幅度與陰性對照組相比具顯著性差異(p<0.05>。
根據保健食品功能學評價標準，本發明的核糖口服液具有抗疲勞作用。制備例1D-核糖的制備1.培養基配制(1).斜面培養基配制(％)取葡萄糖0.5，蛋白胨1.0，酵母膏0.4，氯化鈉0.1，瓊脂2.0，PH7.2。
(2)種子培養基(％)玉米淀粉酶解糖2.0，玉米漿1.0，磷酸氫二鉀0.5，磷酸二氫鉀0.2，硫酸鎂0.1，硫酸錳0.005，PH7.2。
(3)發酵培養基(％)玉米淀粉酶解糖18，玉米漿0.6，硫酸銨1.0，酵母粉0.2，硫酸鎂0.1，硫酸錳0.01，碳酸鈣2.0，PH7.5。
(4)發酵將保藏的Bacillus subtitis JSIM-1018菌株保藏號為CGMCC NO 0328接種至5只茄子瓶斜面上，30℃培養48小時，用無菌生理鹽水，將斜面上菌苔洗下，在無菌條件下合并入血清瓶中，用壓差法接入種子罐中。種子罐容積300升，裝液量200升，轉速250轉/分，風量1∶0.5，在溫度為35℃±1℃下，培養22小時，接入盛有發酵培養基2000升的發酵罐中，轉速160轉/分，風量1∶0.8，接種量10％，在溫度為38±1℃發酵70小時，發酵液中D-核糖含量81.75克/升。
將發酵液調PH8.0，加脫乙酰甲殼素300PPM，發酵液經沉淀后將上清液與沉淀分開，沉淀部分用壓濾法除去沉淀，合并上清液。上清液經陽柱、陰柱脫鹽，活性炭脫色，50℃減壓濃縮到35％的D-核糖漿，實際得純D-核糖124.5千克。實施例1D-核糖口服液的制備產品配方為(1)D-核糖，35-40千克。
(2)蒸餾水，60升，溶解后用蒸餾水定容到100升。
D-核糖相對含量的重量百分數為35-40％。
制備的蒸餾水應符合《中華人民共和國藥典》2000版二部中蒸餾水的要求.本品為口服液，內容物為無色至淺黃色。核糖口服液的主要功效成分是D-核糖。根據功能性試驗的結果，D-核糖單組分就具有所申報的功能，而D-核糖易吸潮，在水中溶解度極大，可以和水以任意比混溶。50％以上核糖溶液粘稠、流動性差。為了便于貯藏和人體吸收，采用35-40％的D-核糖溶液形式進行配比。如無特殊說明，本發明中所用的百分數均為重量百分數。
本發明的核糖口服液是生物工程高科技產品，經功能實驗證明，本品具有延長小鼠負重游時間和爬桿時間，降低小鼠運動時血清尿素并減少糖元消耗，具有明顯的抗疲勞作用。本品經檢測未發現國際奧委會2000年規定的禁用藥物，不含任何激素、無毒副作用。
核糖是人體心肌細胞的營養源，又是ATP合成的前體物質。核糖主要從分子水平調節細胞的的生理代謝酶的活性，修復損傷細胞。外源ATP難以進入細胞內部，會在胞外降解，核糖很容易進入細胞內部，誘導ATP的合成，從而提供能量，實現抗疲勞的保健功能。
D-核糖在水中有極大的溶解度，核糖結晶固體的特性是在空氣中容易吸潮，不易保存。國外的D-核糖產品主要以粉末或膠囊的形式出，而本發明的D-核糖產品是以口服液形式出品。D-核糖這種物質具有一些比較特殊的性質，主要體現為吸濕性極強，粉末狀態很難貯藏；而如果采用添加固化劑如凝膠的辦法形式，則含量過低，且不易吸收，為了達到理想劑量必段吞服很多，給使用者帶來很多不便。采用口服液的形式則有效避免了以上問題，便于保藏，延長有效期，降低貯藏條件的要求，便于使用者服用。
權利要求
1.一種核糖口服液，其特征在于D-核糖200-500千克，蒸餾水600升，溶解后用蒸餾水定容到1000升，D-核糖的相對含量為20-50％(重)。
2.根據權利要求1所述的核糖口服液，其特征在于D-核糖350-400千克，蒸餾水600升，溶解后用蒸餾水定容到1000升，D-核糖的相對含量為35-40％(重)。
3.根據權利要求1所述的核糖口服液，其特征在于該方法包括(1)配料罐空消配料罐主要用于核糖口服液的配料，配料罐空消條件為表壓0.1-0.2Mpa，溫度121℃-130℃，空消時間30-40分鐘；(2)灌裝瓶空消灌裝瓶空消條件為；表壓0.1-0.2Mpa，溫度121℃-130℃，空消時間30-40分鐘；(3)蒸餾水制備蒸餾水制備按照《中華人民共和國藥典》2000年版二部中蒸餾水的要求進行制備；(4)配料在配料罐內加入適量蒸餾水，在攪拌狀態下，將已稱量好的D-核糖350-400kg，溶解于600升蒸餾水中，夾套加熱40-50℃溶解，用蒸餾水定容到1000升；(5)膜過濾將已配置好的35-40％的核糖溶液通過0.2μ∽0.45μ膜過濾設備進行除菌過濾后，得到過濾液；(6)分裝將已過濾的核糖溶液分裝成10000小瓶，每瓶100ml，壓蓋、封口；(7)消毒按巴斯德滅菌法進行消毒；(8)成品經檢驗、包裝、抽檢合格后制成核糖口服液成品。
全文摘要
一種核糖口服液，其特征在于；D－核糖350－400千克，蒸餾水600升，溶解后用蒸餾水定容到1000升，D－核糖的相對含量為35－40％(重)。本發明的核糖口服液是生物工程高科技產品，經功能實驗證明，本品具有延長小鼠負重游時間和爬桿時間，降低小鼠運動時血清尿素并減少糖元消耗，具有明顯的抗疲勞作用。本品經檢測未發現國際奧委會2000年規定的禁用藥物，不含任何激素、無毒副作用。
文檔編號A61K31/7004GK1421209SQ0114012
公開日2003年6月4日 申請日期2001年11月26日 優先權日2001年11月26日
發明者柏建新, 鄧崇亮, 朱曉宏 申請人:江蘇省微生物研究所