專利名稱：一種艾滋病重組表位疫苗及其制備方法
技術領域：
本發明涉及用生物工程技術制備的疫苗及其制備方法與應用，特別是涉及一種艾滋病疫苗及其制備方法與應用。
一種艾滋病重組表位疫苗，它的活性成分為一條多肽，該多肽含有下述成員中的至少一個1)一個人免疫缺陷病毒蛋白中和表位或/和CTL表位；
2)一個人免疫缺陷病毒蛋白中和表位或/和CTL表位的變異表位；3)多個人免疫缺陷病毒蛋白中和表位或/和CTL表位；4)多個人免疫缺陷病毒蛋白中和表位或/和CTL表位的變異表位；5)一個至少一次重復的人免疫缺陷病毒蛋白中和表位或/和CTL表位；6)一個至少一次重復的人免疫缺陷病毒蛋白中和表位或/和CTL表位的變異表位；7)至少一次重復的人免疫缺陷病毒蛋白的多個中和表位或/和CTL表位；8)至少一次重復的人免疫缺陷病毒蛋白多個中和表位或/和CTL表位的變異表位。
所述中和表位和CTL表位及其變異表位可以選自ELDKWAELDEWAELDQWAELDSWAELDTWAGPGRAFYGPGQAFYGPGQTFYGPGQAWYGLEGIYYSARVIYQYMDDC為了誘導強免疫應答，疫苗中還應該含有藥學上可接受的藥用佐劑。藥用佐劑可以是鋁佐劑、油佐劑等。
本發明的另一個目的是提供一種制備艾滋病重組表位疫苗。
制備艾滋病重組表位疫苗的方法，是用限制性核酸內切酶中的同尾酶或平端酶，借助載體將下述成員中的至少一條多肽對應的核苷酸序列連接成一個人工合成基因，該基因在表達載體系統中表達，經純化即得到艾滋病重組表位疫苗1)一個人免疫缺陷病毒蛋白中和表位或/和CTL表位；2)一個人免疫缺陷病毒蛋白中和表位或/和CTL表位的變異表位；3)多個人免疫缺陷病毒蛋白中和表位或/和CTL表位；4)多個人免疫缺陷病毒蛋白中和表位或/和CTL表位的變異表位；5)一個至少一次重復的人免疫缺陷病毒蛋白中和表位或/和CTL表位；
6)一個至少一次重復的人免疫缺陷病毒蛋白中和表位或/和CTL表位的變異表位；7)至少一次重復的人免疫缺陷病毒蛋白的多個中和表位或/和CTL表位；8)至少一次重復的人免疫缺陷病毒蛋白多個中和表位或/和CTL表位的變異表位。
所述中和表位和CTL表位及其變異表位可以選自ELDKWAELDEWAELDQWAELDSWAELDTWAGPGRAFYGPGQAFYGPGQTFYGPGQAWYGLEGIYYSARVIYQYMDDC由于單個表位對應的核苷酸序列較短，不便實現基因轉移操作，因此在所述每個表位對應的寡核苷酸序列的3’端均加有標簽。
所述標簽的5’端設有終止密碼子，使其不影響目的基因翻譯從而勿需切掉該片段。
所述標簽的寡核苷酸序列的5′和3’端分別具有限制性核酸內切酶的識別位點，該二酶識別位點間的堿基優選為不包括限制性內切酶識別位點的550-650bp。
所述人工合成基因的核苷酸序列中含有限制性核酸內切酶中的同尾酶或平端酶識別位點，該合成基因的模式為 其中，Nn為需要連接的表位對應的核苷酸序列， 和 為一對同尾酶或平端酶X和X′的識別位點。
所述模式核苷酸序列 可以通過人工合成寡核苷酸單鏈，再在引物的作用下通過PCR擴增得到。
本發明具有以下優點1、該疫苗是一種能刺激產生多種中和抗體并激活CTL應答的高效多表位-表位疫苗，能有效對付病毒的變異，進而克服己有常規滅活疫苗或減毒疫苗預防效果差甚至無效的缺點；2、該疫苗的有效成分是表位多肽，這種多肽沒有HIV-1的遺傳物質及活性，不會產生因HIV-1的遺傳物質誘發的副作用，也沒有滅活疫苗或減毒疫苗可能復性的風險；3、由于表位可以事先選定，從而解決了不能直接誘導/制備預先確定的表位特異性的免疫應答的難題；4、該疫苗的設計靈活，可以綜合應用HIV-1中和表位和CTL表位，使疫苗具有同時誘導細胞免疫和體液免疫的能力；5、隨著HIV-1的變異，可以將本疫苗進行改進，不需進行長時間的試驗，降低生產成本；6、該疫苗的免疫原可以使用大腸桿菌發酵的方式進行批量生產，能夠降低成本。該技術將對世界預防醫學研究產生重大影響，將使疫苗的制備技術產生革命性變化，并且將帶來巨大的經濟效益和社會效益。
下面結合具體實施例對本發明作進一步說明。
2.利用合成的上下游通用引物采取常規PCR條件通過PCR擴增上述寡核苷酸鏈。從而在所得到的寡核苷酸鏈的5’到3’依次具有BamHI、BamHI的同尾酶BglII以及另一個內切酶XhoI的酶切位點。利用T-A克隆方法將PCR產物直接導入載體pGEM-T easy(Promega公司產品)，將所篩選到的陽性克隆，命名為pGEM-Al，用BglII和XhoI消化該陽性克隆，并導入一個經過同樣處理的標簽片段(該片段可來自含有豬瘟病毒石門株包膜蛋白E2基因的質粒pCDNA-E2，利用載體上的XhoI識別位點和基因中的BglII識別位點采用XhoI和BglII消化該質粒得到大約600bp的小片段，且其中間不含有BamHI、BglII以及XhoI的切割位點。該片段插入后由于移碼得到兩個終止密碼子而不影響目的基因的表達，故勿需切除該片段)，得到的陽性克隆命名為pGEM-A1-tag。
3.用BamHI和XhoI、BglII和XhoI兩組酶消化pGEM-A1-tag系列，回收BamHI和XhoI消化后得到的含有目的表位核苷酸序列和標記片段的小片段以及BglII和XhoI消化后得到的含有目的表位核苷酸序列和載體部分的大片段，將上述兩個片段連接，得到的陽性克隆為pGEM-A2-tag系列。
4.用步驟3所述操作處理pGEM-A2-tag系列，并結合步驟3中所得到的BamHI和XhoI消化后回收的含有目的表位核苷酸序列的小片段，可以得到pGEM-A3-tag或pGEM-A4-tag系列。
5.反復利用步驟3或4所述操作處理所得陽性質粒，可得到含有滿足表位重復要求的免疫原基因的pGEM-An-tag。
6.將BamHI和XhoI消化pGEM-An-tag得到的含有An片段的小片段插入經過同樣處理的原核表達載體pET-28(Novagen公司產品)中，得到的重組質粒命名為pET-28-An-tag，并將重組質粒轉入大腸桿菌進行誘導表達。
7.表達的重組蛋白純化后與醫用佐劑制備成艾滋病重組表位疫苗。
實施例2、制備以HIV-1 gp41上ELDKWA中和表位為基礎的抗變異艾滋病重組表位疫苗1.人工合成含有ELDKWA表位及其4個變異表位(ELDEWA、ELDQWA、ELDSWA、ELDTWA)各自對應的核苷酸序列，并添加包含同尾酶BamHI和BglII識別位點的連接頭(下劃線表示)的寡核苷酸鏈，其中包含大腸桿菌偏愛密碼子A5’gcgcggatccgaattagataaatgggcaaeatcttgataac3’B5’gcgcggatccgaacttgatgagtgggccagatcttgataac3’C5’gcgcggatccgaacttgatcagtgggccagatcttgataac3’D5’gcgcggatccgaacttgattcctgggcgagatcttgataac3’E5’gcgcggatccgaacttgatacgtgggccaggatcttgataac3’同時合成一對對應的引物，其中下游引物導入非平端酶XhoI的切割位點上游引物5’gtg cgc gga tcc3’下游引物5’ctc gag tta tca aga 3’；2.利用合成的上下游通用引物通過PCR擴增上述寡核苷酸鏈，從而在所得到的每一條寡核苷酸鏈的5’到3’依次具有BamHI、BamHI的同尾酶BglII以及另一個內切酶XhoI的酶切位點。利用T-A克隆方法將PCR產物直接導入載體pGEM-T easy(Promega公司產品)，然后將所篩選到的陽性克隆(命名為pGEM-N1系列，其中N為A、B、C、D、E)用BglII和XhoI消化，并導入一個經過同樣處理的標簽片段(該片段可來自含有豬瘟病毒石門株包膜蛋白E2基因的質粒pCDNA-E2，利用載體上的XhoI識別位點和基因中的BglII識別位點采用XhoI和BglII消化該質粒，得到大約600bp的小片段，且其中間不含有BamHI、BglII以及XhoI的切割位點。該片段插入后由于移碼得到兩個終止密碼子而不影響目的基因的表達，故勿需切除該片段)，得到的陽性克隆命名為pGEM-N1-tag系列(其中N為A、B、C、D、E)。
3.用BamHI和XhoI、BglII和XhoI兩組酶消化pGEM-N1-tag系列，回收BamHI和XhoI消化后得到的5個小片段以及BglII和XhoI消化后得到的5個大片段，將上述5個大小片段任意組合連接，得到的陽性克隆為pGEM-N2-tag系列(其中N分別為A、B、C、D、E中二者的任意組合)。
4.用步驟3所述操作處理pGEM-N2-tag系列，并結合步驟3中所得到的BamHI和XhoI消化后回收的5個小片段，可以得到pGEM-N3-tag或pGEM-N4-tag系列。
5.反復利用步驟3或4所述操作處理所得陽性系列，可將上述5條寡核苷酸鏈反復連接，直到得到含有滿足需要表位的種類和數量的免疫原基因的pGEM-Nn-tag系列。
6.將BamHI和XhoI消化pGEM-Nn-tag得到的含有Nn片段的小片段插入經過同樣處理的原核表達載體pET-28中，得到的重組質粒命名為pET-28-Nn-tag，并將重組質粒轉入大腸桿菌進行誘導表達。
7.表達的重組蛋白純化后與醫用佐劑制備成多重復抗變異重組HIV疫苗。
實施例3、制備以HIV-1 gp41上ELDKWA中和表位和gp120上GPGRAFY中和表位為基礎的重組多表位-表位疫苗1.人工合成含有ELDKWA表位和GPGRAFY表位各自對應的核苷酸序列，并添加包含同尾酶BamHI和BglII識別位點的連接頭(下劃線表示)的寡核苷酸鏈，包含大腸桿菌偏愛密碼子A5’gcgcggatccgaattagataaatgggcaagatcttgataac3’B5’gcgcggatccggccctgggcgtgccttttacagatcttgataac3’同時合成一對對應的引物，其中下游引物導入非平端酶XhoI的切割位點，；上游引物5’gtg cgc gga tcc3’；下游引物5’ctc gag tta tca aga 3’。
2.以下重復實施例2中的2-6步。
3.將BamHI和XhoI消化pGEM-Nn-tag得到的含有Nn片段的小片段插入經過同樣處理的原核表達載體pET-28a中，得到的重組質粒命名為pET-28a-Nn-tag，并將重組質粒轉入大腸桿菌進行誘導表達。
4.表達的重組蛋白純化后與醫用佐劑制備成艾滋病重組多表位-表位疫苗。
實施例4、制備以HIV-1 gp41上ELDKWA中和表位和gp120上GPGRAFY中和表位及其變異表位為基礎的艾滋病多表位-抗變異-重組表位疫苗1.人工合成含有HIV gp41上ELDKWA中和表位及其4個變異表位(ELDEWA、ELDQWA、ELDSWA、ELDTWA)和gp120上GPGRAFY中和表位及其變異表位(GPGQAFY、GPGQTFY和GPGQAWY)各自對應的核苷酸序列，并添加包含同尾酶BamHI和BglII識別位點的連接頭(下劃線標識)的寡核苷酸鏈(包含大腸桿菌偏愛密碼子)
A5’gcgcggatccgaattagataaatgggcaagatcttgataac3’B5’gcgcggatccgaacttgatgagtgggccagatcttgataac3’C5’gcgcggatccgaacttgatcagtgggccagatcttgataac3’D5’gcgcggatccgaacttgattcctgggcgagatcttgataac3’E5’gcgcggatccgaacttgatacgtgggccagatcttgataac3’F5’gcgcggatccggccctgggcgtgccttttacagatcttgataac3’G5’gcgcggatccggccctgggcaggccttttacagatcttgataac3’H5’gcgcggatccggccctgggcagaccttttacagatcttgataac3’I5’gcgcggatccggccctgggcaggcctggtacagatcttgataac3’同時合成一對對應的引物，其中下游引物導入非平端酶XhoI的切割位點上游引物5’gtg cgc gga tcc3’；下游引物5’ctc gag tta tca aga 3’。
2.以下重復實施例2中的2-6步。
3.將BamHI和XhoI消化pGEM-Nn-tag得到的含有Nn片段的小片段插入經過同樣處理的原核表達載體pET-28a中，得到的重組質粒命名為pET-28a-Nn-tag，并將重組質粒轉入大腸桿菌進行誘導表達4.表達的重組蛋白純化后與醫用佐劑制備成艾滋病多表位-抗變異-重組表位疫苗。
實施例5、制備以HIV-1 gp41上ELDKWA中和表位和gp120上GPGRAFY中和表位以及HIV-1 CTL表位(GLEGIYYSAR)和(VIYQYMDDC)為基礎的艾滋病多表位-抗變異重組表位疫苗1.人工合成含有HIV gp41上ELDKWA中和表位及其4個變異表位(ELDEWA、ELDQWA、ELDSWA、ELDTWA)和gp120上GPGRAFY中和表位及其變異表位(GPGQAFY、GPGQTFY和GPGQAWY)以及HIV-1 CTL表位(GLEGIYYSAR)和(VIYQYMDDC)各自對應的核苷酸序列，并添加包含同尾酶BamHI和BglII識別位點的連接頭(下劃線標識)的寡核苷酸鏈(包含大腸桿菌偏愛密碼子)A5’gcgcggatccgaattagataaatgggcaagatcttgataac3’B5’gcgcggatccgaacttgatgagtgggccagatcttgataac3 ’C5’gcgcggatccgaacttgatcagtgggccagatcttgataac3’D5’gcgcggatccgaacttgattcctgggcgagatcttgataac3’E5’gcgcggatccgaacttgatacgtgggccagatcttgataac3’F5’gcgcggatccggccctgggcgtgccttttacagatcttgataac3’
G5’gcgcggatccggccctgggcaggccttttacagatcttgataac3’H5’gcgcggatccggccctgggcagaccttttacagatcttgataac3’I5’gcgcggatccggccctgggcaggcctggtacagatcttgataac3’J5’gcgcggatcccgcatcttagcggtggaacgctatttaaaagacagatcttgataac3 ’K5’gcgcggatccgtcatctatcagtacatggacgactgtagatcttgataac3’同時合成一對對應的引物，其中下游引物導入非平端酶XhoI的切割位點上游引物5’gtg cgc gga tcc3’；下游引物5’ctc gag tta tca aga 3’；2.以下操作重復實施例2中的2-6步。
3.利用BamHI和XhoI分別消化pGEM-Nn-tag和原核表達載體pET-28a并通過連接篩選得到含有Nn片段的重組質粒pET-28a-Nn-tag，再將重組質粒轉入大腸桿菌進行誘導表達。
4.表達的重組蛋白純化后與醫用佐劑制備成同時具有細胞免疫和體液免疫的艾滋病多表位-抗變異-重組表位疫苗。
權利要求
1.一種艾滋病重組表位疫苗，它的活性成分為一條多肽，該多肽含有下述成員中的至少一個1)一個人免疫缺陷病毒蛋白中和表位或/和CTL表位；2)一個人免疫缺陷病毒蛋白中和表位或/和CTL表位的變異表位；3)多個人免疫缺陷病毒蛋白中和表位或/和CTL表位；4)多個人免疫缺陷病毒蛋白中和表位或/和CTL表位的變異表位；5)一個至少一次重復的人免疫缺陷病毒蛋白中和表位或/和CTL表位；6)一個至少一次重復的人免疫缺陷病毒蛋白中和表位或/和CTL表位的變異表位；7)至少一次重復的人免疫缺陷病毒蛋白的多個中和表位或/和CTL表位；8)至少一次重復的人免疫缺陷病毒蛋白多個中和表位或/和CTL表位的變異表位。
2.根據權利要求1所述的一種艾滋病重組表位疫苗，其特征在于所述中和表位和CTL表位及其變異表位選自ELDKWAELDEWAELDQWAELDSWAELDTWAGPGRAFYGPGQAFYGPGQTFYGPGQAWYGLEGIYYSARVIYQYMDDC
3.根據權利要求1或2所述的一種艾滋病重組表位疫苗，其特征在于疫苗中還含有藥學上可接受的藥用佐劑。
4.制備艾滋病重組表位疫苗的方法，是用限制性核酸內切酶中的同尾酶或平端酶，借助載體將下述成員中的至少一條多肽對應的核苷酸序列連接成一個人工合成基因，該基因在表達載體系統中表達，經純化即得到艾滋病重組表位疫苗1)一個人免疫缺陷病毒蛋白中和表位或/和CTL表位；2)一個人免疫缺陷病毒蛋白中和表位或/和CTL表位的變異表位；3)多個人免疫缺陷病毒蛋白中和表位或/和CTL表位；4)多個人免疫缺陷病毒蛋白中和表位或/和CTL表位的變異表位；5)一個至少一次重復的人免疫缺陷病毒蛋白中和表位或/和CTL表位；6)一個至少一次重復的人免疫缺陷病毒蛋白中和表位或/和CTL表位的變異表位；7)至少一次重復的人免疫缺陷病毒蛋白的多個中和表位或/和CTL表位；8)至少一次重復的人免疫缺陷病毒蛋白多個中和表位或/和CTL表位的變異表位。
5.根據權利要求4所述的制備艾滋病重組表位疫苗的方法，其特征在于所述中和表位和CTL表位及其變異表位選自ELDKWAELDEWAELDQWAELDSWAELDTWAGPGRAFYGPGQAFYGPGQTFYGPGQAWYGLEGIYYSARVIYQYMDDC
6.根據權利要求4或5所述的制備艾滋病重組表位疫苗的方法，其特征在于所述每個表位對應的寡核苷酸序列的3’端均加有標簽。
7.根據權利要求6所述的制備艾滋病重組表位疫苗的方法，其特征在于所述標簽的5’端設有終止密碼子。
8.根據權利要求6所述的制備艾滋病重組表位疫苗的方法，其特征在于所述標簽的寡核苷酸序列的5′和3’端分別具有限制性核酸內切酶的識別位點，該二酶識別位點間的堿基優選為不包括限制性內切酶識別位點的550-650bp。
9.根據權利要求4或5所述的制備艾滋病重組表位疫苗的方法，其特征在于所述人工合成基因的核苷酸序列中含有限制性核酸內切酶中的同尾酶或平端酶識別位點，該合成基因的模式為 其中，Nn為需要連接的表位對應的核苷酸序列， 和 為一對同尾酶或平端酶X和X′的識別位點。
10.根據權利要求9所述的制備艾滋病重組表位疫苗的方法，其特征在于所述模式核苷酸序列 可以通過人工合成寡核苷酸單鏈，再在引物的作用下通過PCR擴增得到。
全文摘要
本發明的名稱為一種艾滋病重組表位疫苗及其制備方法。本發明的目的是提供一種艾滋病重組表位疫苗及其制備方法。一種艾滋病重組表位疫苗，它的活性成分為一條多肽，該多肽含有下述成員中的至少一個1)一個HIV－1蛋白中和表位或/和CTL表位；2)一個HIV－1蛋白中和表位或/和CTL表位的變異表位；3)多個HIV－1蛋白中和表位或/和CTL表位；4)多個HIV－1蛋白中和表位或/和CTL表位的變異表位；5)一個至少一次重復的HIV－1蛋白中和表位或/和CTL表位；6)一個至少一次重復的HIV－1蛋白中和表位或/和CTL表位的變異表位；7)至少一次重復的HIV－1蛋白的多個中和表位或/和CTL表位；8)至少一次重復的HIV－1蛋白多個中和表位或/和CTL表位的變異表位。制備艾滋病重組表位疫苗的方法，是用限制性核酸內切酶中的同尾酶或平端酶，借助載體將與HIV－1表位對應的核苷酸序列連接成一個人合成基因，該基因在表達載體系統中表達，經純化即得到艾滋病重組表位疫苗。
文檔編號A61P31/00GK1408433SQ01136060
公開日2003年4月9日 申請日期2001年9月29日 優先權日2001年9月29日
發明者陳應華, 劉祖強, 李華, 董曉楠 申請人:清華大學, 江西省龍飛科技開發有限公司, 北京國信偉業高新技術發展有限公司