專利名稱：一種利用天然牛膽汁在動物牛體外培育藥用牛膽結石的方法
技術領域：
本發明屬于制藥技術領域，特別涉及一種中藥原料藥的制造方法。
背景技術：
牛膽結石即牛黃，是珍貴的中藥材。它具有清心、豁痰、開竅、涼肝、息風、清熱解毒等功用。我國許多名貴中成藥，如安宮牛黃丸、六神丸等均以牛黃為主藥配制而成。但是牛體內自然成石率僅為1～2％，因此，藥源奇缺，價格昂貴、依賴進口，不僅花費了大量的外匯，而且也制約了我國傳統醫藥工業的發展。
1956年以來，我國的醫藥工作者積極從事人工牛黃的研究，1971年人工牛黃應用于中成藥組方中，部分緩解了天然牛黃的供需矛盾。但這種人工牛黃主要是膽酸、豬去氧膽酸和極微量的膽紅素以及大量淀粉研末過篩而得的粉末，不是牛膽結石，其成份、結構、含量及已知各種微量成份均與天然牛黃相差太遠，不具備天然牛黃的性狀、結構、成份、含量特征，臨床療效遠不及天然牛黃。
上世紀70年代以來，我國云南、廣東、內蒙等地的醫藥工作者，在活牛膽囊內培植牛黃的實驗研究獲得了成功。但需對牛體進行剖腹手術并且該手術比較復雜，而且2-3年才能剖腹取出尼龍絲網、刮下棕黃色附著物。成石率低，產量小，膽紅素含量低，質量不穩定。而且，此產品并不是牛膽結石，而是沉積在尼龍絲網上的棕黃色膽色素鈣顆粒及粘液。刮下干燥后所形成的粉末。因此，不可能規模化生產。
上世紀70年代初，武漢同濟醫科大學附屬同濟醫院肝膽外科蔡紅嬌醫師(即本發明的發明人)在對人類膽結石形成的原因和機理進行研究，并獲得成功的基礎上，進一步用此原理進行牛膽囊膽汁內培育牛膽結石的研究，取得了成功并于1989年1月25日申報了“一種人工體外制作牛膽結石的方法”的發明專利(申請號89100505.6)。利用該方法制作的牛膽結石，其外觀、結構、成份、含量與天然牛黃基本相同。但是限于當時的條件，特別是1985年版《中國藥典》對牛黃的膽酸、膽紅素含量未作規定，因此，其制成的牛膽結石的膽紅素、膽酸等含量較低。不僅如此，上述方法除配方的牛膽汁之外，制備膽紅素鈣，多用豬膽汁代替，膽汁未經細菌發酵即可以成石。因此，但其制成的牛膽結石卻含有豬去氧膽酸。1990年(《中國藥典》1990年版一部)明確規定牛黃是牛膽結石，含膽紅素35％以上，膽酸7％以上，并規定了相應的鑒別和檢測方法。因此用上述方法制成的牛膽結石不能滿足新的《中國藥典》對牛膽結石規定的藥用要求。
三、發明的內容本發明是在ZL89100505.6發明專利的基礎上，根據新的《中國藥典》要求而研制的一種既能規模化生產，又能滿足新的《中國藥典》要求的在動物牛體外制作牛膽結石(即體外培育牛黃)的方法。
本發明的技術方案如下1.制備發酵牛膽汁(1)調節天然牛膽汁中的牛磺酸含量，使其達到藥用要求。
(2)將大腸桿菌、變形桿菌或腸球菌的單一菌液或其組合菌液適量按常規接種方法接種到天然牛膽汁中，對天然牛膽汁進行細菌發酵處理。
2.利用發酵牛膽汁制備復合膽紅素鈣(1)取出定量的發酵牛膽汁，加入1-4倍量的澄清飽和鈣鹽溶液，對其進行攪拌，加熱至沸，濾取棕紅色沉淀物。
(2)在棕紅色沉淀物中，加入適量的水對其進行攪拌、洗滌，靜置后濾去上清液，再依據藥用要求加入適量的膽紅素、膽酸，去氧膽酸和無機鹽后，對其進行攪拌、混勻(可即用或干燥備用)。
3.在15℃-37℃條件下，利用發酵牛膽汁和復合膽紅素鈣在牛體外培育牛膽結石
(1)制備成石膽汁取出定量體積的發酵牛膽汁，按發酵牛膽汁量500～1500ml/kg的比例加入復合膽紅素鈣(復合膽紅素鈣按干燥后的重量計算)，再加入適量的水溶液，充分攪拌后，靜置。
(2)培育牛膽結石①對成石牛膽汁用酸液進行PH調節，使其PH值在6.8以下；②對成石膽汁進行偏軸定向旋轉，待其類球形結石形成后，停止旋轉，靜置培育，取出結石進行干燥處理。
本發明形成牛膽結石的機理是利用上述物理、生物和化學的方法，改變牛膽汁的理化性，從而形成了成石牛膽汁。成石膽汁經過調節PH，在適度溫度條件下形成蛋白氫鍵，部分蛋白變形、凝固，形成結石的核心。核心的活動中心由于靜電吸引，使成石膽汁中的膽紅素鈣鹽顆粒和膽紅素高聚物顆粒向中心沉積。高分子有機物質對沉淀顆粒起架橋作用，即線型聚合物的功能對顆粒的吸附作用，呈網狀層層吸附，逐漸增大，從而形成牛膽紅素鈣結石。
根據本發明在牛體外培育的牛膽結石，其結石機理與天然牛膽結石形成機理基本相同，其性狀、結構、成份乃至氨基酸，微量元素含量與天然牛黃一致，其鎮靜、抗驚厥、退熱、降壓作用和抗菌、消炎作用的強度與天然牛黃一致。本發明的工藝條件完備，其產品的有效成份及其含量穩定，完全符合現行《中國藥典》的規定。成石效率高，可進行規模化工業生產。其生產成本大大低于天然牛黃，具有較好的社會效益和經濟效益。
具體實施例方式
1.實施方式一(1)天然牛膽汁的獲取取出新鮮牛膽汁，按優質牛黃要求，調節牛磺酸含量使其達到7％，置入消毒罐內，低溫保存備用。
(2)制備發酵牛膽汁將牛膽汁置于發酵罐內，按每10000ml牛膽汁接種100ml菌體溶液的比例，將大腸桿菌和變形桿菌的組合菌液接種至牛膽汁中，發酵80小時備用。
(3)制備復合膽紅素鈣①取發酵牛膽汁20000ml加入22000ml澄清飽和氧化鈣溶液，攪拌、煮沸，冷卻后，取出棕紅色沉淀物。
②棕紅色沉淀物加純凈水10000ml，充分攪拌，靜置后傾去上清液，加入膽紅素至其含量達45％以上，再加入硫酸鋅3g、硫酸鎂3g，攪拌、混勻，備用。
(4)在37℃室溫條件下培育藥用牛膽結石①制備成石牛膽汁取發酵牛膽汁1000ml加入到經過上述步驟(3)制備的2kg復合膽紅素鈣中，再加水3000ml，攪拌成懸浮液，備用。
②制取牛膽結石a.用稀硫酸對成石膽汁進行PH調節，使其PH值為5.8；b.對成石牛膽汁進行偏軸定向旋轉，待類球形結石形成后，停止旋轉、靜置培育，取出進行干燥處理，即得約800g的牛膽結石成品。
按干燥品計算，上述牛膽結石成品含膽酸為13％，含膽紅素為36％，其它成份及其含量與天然牛黃基本一致，符合現行《中國藥典》的規定。
2.實施方式二(1)天然牛膽汁的獲取殺牛時，在無菌操作的條件下，摘取膽囊，選用無雜質、未受污染、金黃色者，傾出膽汁于消毒罐內，按優質牛黃要求，調節牛磺酸，使其含量至6％，低溫保存備用。
(2)制備發酵牛膽汁將牛膽汁置于發酵罐內，按每10000ml牛膽汁接種200ml菌體溶液的比例，將大腸桿菌接種至牛膽汁中，發酵96小時，備用。
(3)制備復合膽紅素鈣①取發酵牛膽汁20000ml加入60000ml澄清飽和氫氧化鈣液，攪拌、煮沸、冷卻至50℃，取出棕紅色沉淀物。
②棕紅色沉淀物加冷開水10000ml，攪拌、靜置30分鐘，傾去上清液，加入膽紅素至其含量達45％以上，再加入膽酸120g，去氧膽酸50g、硫酸鎂5g，硫酸鋅5g，攪拌、混勻，冷卻備用。
(4)在26℃室溫條件下，培育藥用牛膽結石①制備成石牛膽汁取發酵牛膽汁1000ml，加入到經過上述步驟(3)制備的1kg復合膽紅素鈣中，再加入復合膽紅素鈣制備過程中濾出的水溶液3000ml，攪拌成懸浮液，制成成石牛膽汁。
②制取牛膽結石a.用稀鹽酸對成石牛膽汁進行PH調節，使其PH值為6。b.利用偏心搖轉機(ZL99238345.5)對成石牛膽汁定向旋轉，在旋轉速率60轉/分的條件下，旋轉20分鐘，即形成類球形物，靜置培育4小時后，取出進行干燥處理，即可制成約800g的牛膽結石成品。
上述成品呈類球形形狀，直徑0.5～3cm，表面黃紅色至棕紅色，體輕、質松脆，有同心層紋，氣香，味苦而后甘，有清涼感，嚼之易碎，不粘牙。按干燥品計算，其膽酸含量17％，膽紅素含量36％，其余成份乃至氨基酸，微量元素含量與優質天然牛黃基本一致。符合現行《中國藥典》的規定。
3.實施方式三(1)天然牛膽汁的獲取取出新鮮牛膽汁，置入消毒罐內，低溫保存備用。
(2)制備發酵牛膽汁將牛膽汁置于發酵罐內，按10000ml牛膽汁接種300ml菌體溶液的比例，將腸球菌接種至牛膽汁中，發酵92小時，備用。
(3)制備復合膽紅素鈣①取發酵牛膽汁29600ml，濾過加入88800ml澄清飽和氧化鈣溶液，攪拌、煮沸，冷卻后取出棕紅色沉淀物。
②棕紅色沉淀物加水充分攪拌，靜置后傾去上清液再加入膽紅素至其含量達45％以上，然后加入膽酸100g、去氧膽酸40g、硫酸鋅3g、硫酸鎂3g，攪拌、混勻。
(4)在15℃室溫條件下，培育藥用牛膽結石
①制備成石牛膽汁取發酵牛膽汁1250ml加入到經過上述步驟(3)制備的1kg復合膽紅素鈣中，再加入復合膽紅素鈣制備過程中濾出的水溶液3000ml，攪拌成懸浮液，備用。
②制取牛膽結石(a)用稀鹽酸對成石膽汁進行PH調節，使其PH值為5.6；(b)對成石牛膽汁進行偏軸定向旋轉，待類球形結石形成后，停止旋轉，靜置培育，取出進行干燥處理，即制成約1000g的牛膽結石成品。
按干燥品計算，上述牛膽結石成品的膽酸含量在15％，膽紅素含量在36.5％，其它成份及其含量與天然牛黃基本一致，符合現行《中國藥典》的規定。
權利要求
1.一種利用天然牛膽汁在動物牛體外培育藥用牛膽結石的方法，其特征在于(1)制備發酵牛膽汁①調節天然牛膽汁中的牛磺酸含量，使其達到藥用要求；②將大腸桿菌、腸球菌、變形桿菌的單一菌液或其組合菌液接種到天然牛膽汁中，對天然牛膽汁進行細菌發酵處理；(2)利用發酵牛膽汁制備復合膽紅素鈣①取出定量的發酵牛膽汁，加入1～4倍量的澄清飽和鈣鹽溶液，對其進行攪拌、加熱至沸，濾取棕紅色沉淀物；②在棕紅色沉淀物中，加入適量的水對其進行攪拌、洗滌，靜置后濾去上清液，再依據藥用要求加入適量的膽紅素、膽酸、去氧膽酸和無機鹽后，攪拌、混勻；(3)在15℃～37℃條件下，利用發酵牛膽汁和復合膽紅素鈣在牛體外培育牛膽結石①制備成石膽汁取出定量體積的發酵牛膽汁，按其500～1500ml/kg的比例加入復合膽紅素鈣，再加入適量的水溶液，充分攪拌后靜置。②培育牛膽結石a.用酸性溶液調節成石膽汁的PH，使其PH值在6.8以下；b.對成石膽汁進行偏軸定向旋轉，待其類球形結石形成后，停止旋轉，靜置培育，然后取出結石進行干燥處理。
全文摘要
一種利用天然牛膽汁在動物牛體外培育藥用牛膽結石的方法。先對天然牛膽汁進行牛磺酸調節和細菌發酵,制取發酵牛膽汁。在發酵牛膽汁中加入澄清飽和鈣鹽溶液,攪拌、加熱至沸,濾取棕紅色沉淀物,對其加水進行攪拌、洗滌,靜置濾去上清液后,根據藥用要求加入膽紅素、膽酸、去氧膽酸、無機鹽等藥用有效成份,攪拌混勻,制取復合膽紅素鈣。按適當的比例定量取出發酵牛膽汁和復合膽紅素鈣,加入水溶液進行攪拌后,用酸性溶液調節其pH值在6.8以下,對其進行偏軸定向旋轉,待結石形成后靜置培育,取出結石進行干燥處理。其產品的性狀、結構、成份及其含量、藥效及臨床療效均與優質天然牛黃一致,并且質量穩定、成石率高,能規模化生產。
文檔編號A61K35/413GK1347700SQ01133550
公開日2002年5月8日 申請日期2001年10月12日 優先權日2001年10月12日
發明者蔡紅嬌 申請人:武漢大鵬藥業有限公司