專利名稱：氧化苦參堿在制備治療腎綜合征出血熱藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及氧化苦參堿(苦參素)的用途，尤其涉及氧化苦參堿在制藥領域的用途。
氧化苦參堿是一種用途十分廣泛的氧化生物堿，中國專利96109782.5公開了氧化苦參堿在制備治療乙型病毒性肝炎藥物中的應用；中國專利00125891.5公開了氧化苦參堿在制備治療肝纖維化藥物中的應用；中國專利00125890.7公開了氧化苦參堿在制備治療丙型病毒性肝炎藥物中的應用；中國專利公開了00127585.2氧化苦參堿在制備治療潰瘍性結腸炎藥物中的應用，而該化合物在制備治為腎綜合征出血熱藥物中的應用尚未見報道。
世界上人類病毒性出血熱共有13種，根據該病腎臟有無損害，分為有腎損及無腎損兩大類。在我國主要為腎綜合征出血熱(HFRS)，又稱流行性出血熱(EHF)；在朝鮮稱朝鮮出血熱(KHF)；在蘇聯稱出血性腎病腎炎(HNN)；由于特異性血清學診斷的確立及病原學的解決，1982年世界衛生組織統一定名為腎綜合征出血熱。
本病是由朝鮮出血熱病毒(或稱漢坦病毒)引起，以鼠類為主要傳染源的自然疫源性疾病；可通過呼吸道、消化道、接觸傳播、母嬰傳播和蟲媒傳播；以發熱、出血傾向及腎臟損害為主要臨床特征的急性病毒性傳染病，典型的出血熱一般有發熱、低血壓、少尿、多尿及恢復五期經過，如處理不當病死率很高；HFRS病毒的傳播幾乎遍及世界各大洲。在我國已有半個世紀的流行史，八十年代中期以來，我國本病年發病數逾已10萬，已成為除病毒性肝炎外，危害最大的一種病毒性疾病。
研究表明，腎綜合征出血熱的致病機理主要有(1)早期發病可能是由于病毒直接作用結果，與感染病毒株的型別、毒力、數量以及病毒結構蛋白不同有關。本病毒為單鏈、負性RNA型，分大(L)、中(M)、小(S)三不同片段屬布尼亞病毒科的一個新屬，稱為漢坦病毒屬，病毒蛋白由四個結構蛋白組成，即G1、G2為包膜糖蛋白，NP為核蛋白，L蛋白可能為多聚酶。G1、G2蛋白上存在中和抗原和血凝素抗原，并能誘導中和抗體；(2)由病毒啟動的免疫損傷。病毒在機體內大量復制，同時刺激免疫系統產生抗體，并能激活補體系統產生組胺等活性物質使血管擴張，血漿外滲近而形成免疫復合物在血管、腎小球基底膜、血小板等表面沉積，形成變態反應；(3)微循環障礙。目前對腎綜合征出血熱主要采用綜合性治療，特別應早期抓好抗病毒治療及液體療法，對重癥患者要及時抓緊抗休克、預防出血及腎功能衰竭的治療，早期積極地抗病毒治療，對減輕病理損傷、阻斷病情進展具有重要作用。迄今尚缺乏可治愈腎綜合征出血熱的特異藥物。臨床上多采用病毒唑、干擾素等抗病毒治療，效果尚不能肯定。因此，在臨床實踐中，發展了多種對腎綜合征出血熱有一定療效的中藥或中西藥復方制劑，臨床應用表明，這些藥物對緩解癥狀，減少西藥用量，或在一定時期作為主要治療藥物等均有一定的積極作用。
據《本草綱目》記載中藥苦參，性寒味苦，具有清熱解毒、抗菌消炎作用；近15年對氧化苦參堿及苦參堿的研究較多，1994年上海市傳染病醫院實驗發現氧化苦參堿有抗麻鴨乙型肝炎病毒作用，其作用機制可能與氧化苦參堿特殊的極性分子結構有關，這一發現提示氧化苦參堿可能具有廣泛的抗病毒作用，可減輕病毒對組織器官的病理性損傷，迅速控制病毒血癥；氧化苦參堿及苦參堿可抑制炎癥介質的釋放，可調節小鼠和大鼠腹腔肥大細胞組織胺釋放，可有效抑制IgE交聯及組胺、白三烯等介質釋放，并具有穩定細胞膜用；氧化苦參堿對免疫系統細胞增殖的影響同細胞狀態密切相關，升高白細胞作用及抑制自身免疫可應用于自身免疫性肝炎及白細胞及血小板減少的治療，這種雙向免疫調節功能，可緩解繼發性細胞因子在發病機理中間環節作用，從而阻斷病理改變過程，使病情得到逆轉。近年來研究發現苦參素可用于治療腎綜合征出血熱，顯示一定療效。發明內容本發明需要解決的技術問題是提供氧化苦參堿的新用途，即在制藥中的新用途，具體說是提供氧化苦參堿在制備治療腎綜合征出血熱藥物中的應用。
為了更好地理解本發明的實質，以下將氧化苦參堿的毒性實驗、實驗研究和臨床實驗結果來說明其在制藥領域中的應用。
氧化苦參堿是從苦參或苦豆子中提取的白色水溶液性固體，分子式C15H24N2O2·H2O，分子量為284.36。采用文獻“中藥化學成分提取分離手冊”，中國中醫藥出版社，1998年8月第1版報道的方法提取分離氧化苦參堿，純度98％以上，其余為槐定堿。用無熱源去離子水的純凈蒸餾水將氧化苦參堿溶解，消毒配制成400mg/ml/支或800mg/2ml/支的注射劑備用；或按本領域技術人員公知的方法制備氧化苦參堿膠囊，以淀粉為填充劑，以8％淀粉漿為黏合劑，制成顆粒，然后裝膠囊，制成的膠囊規格為400mg/囊。
具體實驗和臨床結果分述如下一、動物毒性實驗1小鼠口服苦參素急性毒性實驗在中科院上海藥物研究所進行。采用實施例3所配制的膠囊，昆明小鼠一次灌胃苦參素，根據預實驗，最高劑量443.0mg/kg，以0.75的比例遞減，即為443.0、332.0、249.0、186.9、140.2mg/kg5個劑量組，連續觀察14天。大劑量組(443.0、332.0mg/kg)藥后5～10分鐘活動稍減少，20分鐘左右呈現雙耳發紅。各給藥組均出現大便濕軟，但成形。死亡發生在24小時內，尸檢可見心臟淤血，其它各臟器未見明顯異常。存活者15天全部解剖，肉眼檢查主要臟器未見病變。死亡率用Bliss法求得LD50為234.55mg/kg；95％可信限為202.15～272.14mg/kg。
2苦參素小鼠肌肉注射急性毒性實驗在上海醫科大學藥學院進行。采用實施例1配制的注射劑，昆明小鼠肌肉注射，用死亡率用Bliss法求得LD50為452.24mg/kg；95％可信限為366.77～551.35mg/kg。死亡動物尸檢肉眼未見任何病變。
小結上述實驗說明苦參素毒性非常低，臨床使用安全。
二、苦參素抗腎綜合征出血熱病毒的實驗研究(一)對腎綜合征出血熱病毒體外抑制實驗
1材料(1)病毒株國際標準腎綜合征出血熱病毒76-118株，由中國預防醫學科學院研究所保存。實驗用每毫升含100個病毒感染性滴度的病毒(100TCID50/ml)。
(2)細胞非洲綠猴腎Vero傳代的E6克隆系，139～141代。其中含3％小牛血清維持液。
(3)藥物采用實施例1的注射劑。各稀釋度均用維持液配制。實驗過程中設立空白對照。
2方法(1)藥物對Vero E6細胞的毒性作用。將已長成單層的Vero E6細胞分別以5、10、50、100、200、300、500、750、1000μg/ml的藥物濃度處理培養2周后，觀察細胞形態。
(2)藥物對腎綜合征出血熱病毒侵入細胞的阻斷作用。以20、50、100、200、300、500μg/ml的藥物濃度預處理細胞12小時后，再以腎綜合征出血熱病毒攻擊，培養2周后用免疫熒光法檢查。
(3)對腎綜合征出血熱病毒的直接殺滅作用。以50、100、200、300、500、750μg/ml的藥物濃度和100TCID50/0.1ml的病毒等量混合，作用不同時間后，再將其感染細胞，用免疫熒光法檢查。
(4)對腎綜合征出血熱病毒的增殖抑制作用。病毒感染細胞24小時后，以不同的藥物濃度加入細胞培養基，培養2周后用免疫熒光法檢查。
1觀察指標以免疫熒光法檢測細胞內病毒抗原，如果感染細胞未見熒光陽性，表示病毒已被殺滅或抑制，同時計算抗病毒指數。
2結果(1)1000μg/ml的藥物濃度組培養5天后細胞顆粒增多，折光性差，細胞形態明顯改變，部分細胞脫落，其余各濃度未見藥物對Vero E6細胞的毒性作用。
(2)各濃度在不同時間預先處理的實驗組細胞與未用藥處理的對照組細胞均出現特異性應熒光，病毒感染性滴度為105/0.1ml，抗病毒指數1，表明苦參素不能阻斷病毒侵入細胞。
(3)300μg/ml苦參堿藥物濃度，在24小時組TCID50為103/0.1ml，對照組為104/0.1ml(兩組數據P＜0.05)，抗病毒指數1.51，提示苦參堿對病毒有直接殺傷作用。見表1。
(4)50μg/ml苦參堿藥物濃度對病毒增殖有抑制作用，此濃度以上各組，其感染滴度和對照組比均有顯著差異(P＜0.05)，藥物濃度增加，抗病毒作用增強。見表2。
表1苦參素對腎綜合征出血熱病毒的直接殺滅作用(X±S)
與對照組比較，*P＜0.05。
表2苦參素對腎綜合征出血熱病毒增殖的抑制作用(X±S)
與對照組比較，*P＜0.05。
小結苦參素對細胞的毒性作用低；對腎綜合征出血熱病毒有直接殺滅作用；對腎綜合征出血熱病毒的增殖有明顯抑制作用，藥物濃度增加，抗病毒效力增加。
(二)對腎綜合征出血熱病毒體內抑制實驗1.材料(1)病毒株國際標準腎綜合征出血熱病毒76-118株，由中國預防醫學科學院研究所保存，其感染滴度為TCID5010-4。
(2)實驗動物2周齡地鼠30只，體重7.0～9.8克，雌雄兼有，隨機平均分成實驗組和對照組。
(3)采用實施例3的膠囊，按100mg/kg體重口腔插管灌胃。
2.方法兩組動物分別腹腔接種腎綜合征出血熱病毒2.0ml，于接種當日，實驗組灌胃1ml，每日一次連續灌胃9天，對照組不作任何處理。
3.觀察指標進食、精神狀態、體重、發病時間、病程時間及死亡情況；發病死亡地鼠均取肺組織作冷凍切片，用間接免疫熒光法測腎綜合征出血熱病毒抗原；同時將肺組織研磨、凍融接種Vero-E6細胞進行病毒分離培養，分別于12和18天，檢測有無腎綜合征出血熱病毒；未發病地鼠10天后處死，同樣進行上述檢測。
4.結果(1)發病地鼠癥狀表現進食銳減、活動少、身體卷曲如弓，體重每天減0.4g；給藥實驗組雖出現典型病癥，但表現較輕，體重每天減少0.15g；(2)實驗組比對照組發病時間推遲(P＜0.05)，病程延長(P＜0.05)；結果見表3和表4。
(3)實驗組30只地鼠，25只發病死亡，死亡率83.3％，對照組地鼠全部死亡，對照組明顯高于實驗組；(4)死亡地鼠均檢出腎綜合征出血熱病毒，未死亡地鼠簡潔免疫熒光和組織培養均未檢出該病毒。
表3腎綜合征出血熱病毒感染地鼠發病時間比較
表4腎綜合征出血熱病毒感染地鼠病程時間比較
小結地鼠因灌注苦參素而受到保護，其發病時間推遲、病程延長、死亡率降低。
三、苦參素治療腎綜合征出血熱臨床療效觀察1病例選擇收集3個月腎綜合征出血熱患者53例，男46例，女7例，年齡20～63歲，平均43.6歲；病例選擇為入院病程2～5天，全部病例均符合1986年南京全國腎綜合征出血熱會議制定的診斷標準，并經血清抗-腎綜合征出血熱病毒-IgM檢查均陽性，早期定度10例、中度38例、輕度12例；同時隨機設立對照組50例，兩組病人入院時的性別、年齡和病情等方面基本相同，入院平均發病率治療組為4.05±0.98天，對照組4.12±0.64天；如愿時平均體溫治療組為(39.04±0.51)℃，對照組平均體溫治療組為(39.01±0.54)℃，兩組對比無顯著差異(P＞0.05)，具可比性。
2方法治療組在綜合治療的基礎上，加用實施例2的注射劑，每天二次肌注，連續5天；對照組僅給予綜合治療，不用其他抗病毒藥物和免疫制劑。
3觀察指標用藥后1～6小時觀察體溫、脈搏、血壓1次，每天觀察出血情況，并檢查尿蛋白、血<p>5、將上述混合物烘干加工成品。
本發明可以加工成為粉型、顆粒型或餅干型等各種形式的食品。
表一為成人營養日需量及蠶豆與奶粉每100克所含營養成份表
本發明與其他同類營養保健食品相比，其營養成份更全面、合理，營養比例更均衡，如奶粉中的Vc的含量較低，而鈣磷的含量過高，又如奶粉中不含蘿卜素，而且膽固醇較高；在保健方面，本發明能調節人體新陳代謝機能，提高機體免疫力，無任何副作用，適用于各類人群食用；在生產加工方面，加工工藝簡單，原料易種植、保存，生產成本低。
四、具體實施例實施例一本發明組成配方為蠶豆、枸杞；上述配方的重量比為蠶豆∶枸杞為3∶1。
本發明的制備方法為1、按上述配方比例稱取蠶豆和枸杞；2、將蠶豆微火炒熟、粉碎；3、將枸杞烘干粉碎；4、將蠶豆粉與枸杞粉均勻混合；5、將上述混合物烘干后裝袋。
小結苦參素對控制腎綜合征出血熱病毒感染有一定作用，治療早期腎綜合征出血熱，在加快退熱時間、改善腎功能、減少出血、改善肝功能、減少少尿期發生和提高治愈率等方面明顯優于對照組。
由上述公開的毒性實驗、抗病毒機理實驗研究和臨床試驗可見1.毒性實驗研究顯示，苦參素毒性非常低，臨床使用安全、方便。
2.對腎綜合征出血熱病毒體外抑制實驗研究顯示，苦參素對細胞的毒性作用低；對腎綜合征出血熱病毒有直接殺滅作用；對腎綜合征出血熱病毒的增殖有明顯抑制作用，藥物濃度增加，抗病毒效力增加。
3.對腎綜合征出血熱病毒體內抑制實驗研究顯示，苦參素對綜合征出血熱病毒感染的地鼠有明顯保護作用，使其發病時間推遲、病程延長、死亡率降低。
4.臨床試驗研究表明，苦參素對控制腎綜合征出血熱病毒感染有一定作用，治療早期腎綜合征出血熱，在加快退熱時間、改善腎功能、減少出血、改善肝功能、減少少尿期發生和提高治愈率等方面明顯優于對照組。
以下將通過實施例對本發明進行說明。
實施例1用1000ml無熱源去離子的純凈蒸餾水將400g氧化苦參堿溶解，混合均勻，消毒配制成800mg/2ml/支的注射劑，裝瓶制成品。
實施例2用1000ml無熱源去離子的純凈蒸餾水將400g氧化苦參堿溶解，混合均勻，消毒配制成400mg/1ml/支的注射劑，裝瓶制成品。
實施例3按本領域技術人員公知的方法制備氧化苦參堿膠囊，以淀粉為填充劑，以8％淀粉漿為黏合劑，制成顆粒，然后裝膠囊，制成的膠囊規格為400mg/囊。配方如下氧化苦參堿 400克淀粉 320克8％淀粉漿 80毫升
權利要求
1.氧化苦參堿在制備治療腎綜合征出血熱藥物中的應用。
全文摘要
本發明公開了氧化苦參堿(苦參素)在制備治療腎綜合征出血熱藥物中的新用途。氧化苦參堿毒性低，臨床使用安全、方便；氧化苦參堿在對腎綜合征出血熱病毒體外、體內抑制實驗研究顯示，氧化苦參堿對細胞的毒性作用低、對腎綜合征出血熱病毒有直接殺滅作用并能明顯抑制該病毒的增殖；對感染該病毒的地鼠有明顯保護作用，使其發病時間推遲、病程延長、死亡率降低；臨床試驗研究表明，氧化苦參堿對控制該病毒感染有一定作用，能加快退熱時間、改善腎功能、減少出血、改善肝功能、減少少尿期發生。因此氧化苦參堿是治療腎綜合征出血熱有效、安全的藥物。
文檔編號A61K31/4375GK1416813SQ0113216
公開日2003年5月14日 申請日期2001年11月9日 優先權日2001年11月9日
發明者吳同新, 潘怡 申請人:上海綠谷偉業生態工程有限公司