新的鉤端螺旋體外膜蛋白、其編碼序列及用途的制作方法

專利名稱：新的鉤端螺旋體外膜蛋白、其編碼序列及用途的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術和醫學領域，具體地說，本發明涉及新的編碼鉤端螺旋體外膜蛋白-OMP20(Outer membrane protein 20kD)的多核苷酸，以及此多核苷酸編碼的多肽。本發明還涉及此多核苷酸和多肽的用途和制備。具體地說，本發明的多肽是一種新的可作為免疫抗原。
背景技術：
鉤端螺旋體病是一種分布廣泛的人獸共患病，主要分布在中國南方以及東南亞、南亞等發展中國家和地區。在中國，本病1995年列入法定傳染病。1955-1993年，年平均發病率為十萬分之七，年平均死亡率占發病人數的1.02％。
中國鉤體病的的流行菌群以黃疸出血群和波摩那群為主。黃疸出血群有15個血清型，其中以賴型最為常見。1958年，從四川溫江地區賴姓患者體內分離出賴型賴株，并得到國際鉤端螺旋體分類小組會確認，該菌株現保存在中國預防醫學科學院流行病與微生物學研究所。
中國雖在該病的防治方面取得了巨大的成功，但對該病的致病和免疫的機理仍了解不夠。
鉤端螺旋體(Leptospira sp.)屬格蘭氏陰性菌，外膜是菌體的一個組成部分，位于鉤端螺旋體細胞的最外層，外膜蛋白質具有抗原活性，是抗體和補體的主要作用對象。鉤端螺旋體菌苗是鉤端螺旋體病特異性預防的一種生物制品，經歷了死菌苗、活菌苗、純化菌苗、基因工程重組菌苗的發展階段。然而，這些疫苗的效果還不令人滿意。目前為止，仍沒有開發出利用鉤端螺旋體外膜蛋白的免疫制劑。
因此，本領域迫切需要開發新的利用鉤端螺旋體外膜蛋白作為抗原的疫苗。

發明內容
本發明的目的是提供一種新的鉤端螺旋體外膜蛋白OMP20蛋白以及其片段、類似物和衍生物。
本發明的另一目的是提供編碼這些多肽的多核苷酸。
本發明的另一目的是提供生產這些多肽的方法以及該多肽和編碼序列的用途。
在本發明的第一方面，提供新穎的分離出的OMP20多肽，它包含具有SEQID NO2氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。較佳地，該多肽是具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽。
在本發明的第二方面，提供編碼分離的這些多肽的多核苷酸，該多核苷酸包含一核苷酸序列，該核苷酸序列與選自下組的一種核苷酸序列有至少70％相同性(a)編碼上述鉤端螺旋體OMP20多肽的多核苷酸；和(b)與多核苷酸(a)互補的多核苷酸。較佳地，該多核苷酸編碼具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽。更佳地，該多核苷酸的序列是選自下組的一種(a)具有SEQ ID NO1中1-585位的序列。
在本發明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的載體，以及被該載體轉化或轉導的宿主細胞或者被上述多核苷酸直接轉化或轉導的宿主細胞。
在本發明的第四方面，提供了制備具有鉤端螺旋體OMP20蛋白活性的多肽的方法，該方法包含(a)在適合表達鉤端螺旋體OMP20蛋白的條件下，培養上述被轉化或轉導的宿主細胞；(b)從培養物中分離出具有鉤端螺旋體OMP20蛋白活性的多肽。
在本發明的第五方面，提供了與上述的鉤端螺旋體OMP20多肽特異性結合的抗體。還提供了可用于檢測的核酸分子，它含有上述的多核苷酸中連續的10-585個核苷酸。
在本發明的第六方面，提供了檢測樣品中是否存在OMP20蛋白的方法，它包括將樣品與OMP20蛋白的特異性抗體接觸，觀察是否形成抗體復合物，形成了抗體復合物就表示樣品中存在OMP20蛋白。
在本發明的第七方面，提供了本發明多肽和編碼序列的用途。例如本發明的鉤端螺旋體OMP20蛋白的編碼序列或其片段，可被作為引物用于PCR擴增反應，或者作為探針用于雜交反應，或者用于制造基因芯片或微陣列。
在本發明的第八方面，提供了一種疫苗組合物，它含有安全有效量的本發明的鉤端螺旋體OMP20多肽或其片段以及藥學上可接受的載體。
本發明的其它方面由于本文的技術的公開，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。


下列附圖用于說明本發明的具體實施方案，而不用于限定由權利要求書所界定的本發明范圍。
圖1是本發明的鉤端螺旋體的外膜蛋白質電泳圖譜，其中OMP20用箭頭標出。其中，泳道1為外膜蛋白質，泳道2為分子量標準從上到下為68KD，60KD，41KD，30KD，18KD，15KD。箭頭所指的是目標蛋白質OMP20。
具體實施例方式
本發明人經過廣泛而深入的研究，從問號鉤端螺旋體(Leptospirainterrogans)黃疸出血群賴型賴株中分離純化和鑒定了一種新的外膜蛋白質OMP20，該外膜蛋白可作為抗原用于疫苗的設計和制備。在此基礎上完成了本發明。
在本發明中，術語“OMP20蛋白”、“OMP20多肽”或“鉤端螺旋體外膜蛋白OMP20”可互換使用，都指具有鉤端螺旋體外膜蛋白OMP20氨基酸序列(SEQ IDNO2)的蛋白或多肽。它們包括含有或不含起始甲硫氨酸的鉤端螺旋體外膜蛋白OMP20。
如本文所用，“分離的”是指物質從其原始環境中分離出來(如果是天然的物質，原始環境即是天然環境)。如活體細胞內的天然狀態下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態中同存在的其他物質中分開，則為分離純化的。
如本文所用，“分離的OMP20蛋白或多肽”是指OMP20多肽基本上不含天然與其相關的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質。本領域的技術人員能用標準的蛋白質純化技術純化OMP20蛋白。基本上純的多肽在非還原聚丙烯酰胺凝膠上能產生單一的主帶。
本發明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優選重組多肽。本發明的多肽可以是天然純化的產物，或是化學合成的產物，或使用重組技術從原核或真核宿主(例如，細菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細胞)中產生。根據重組生產方案所用的宿主，本發明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發明的多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。
本發明還包括鉤端螺旋體OMP20蛋白的片段、衍生物和類似物。如本文所用，術語“片段”、“衍生物”和“類似物”是指基本上保持本發明的天然鉤端螺旋體OMP20蛋白相同的生物學功能或活性的多肽。本發明的多肽片段、衍生物或類似物可以是(i)有一個或多個保守或非保守性氨基酸殘基(優選保守性氨基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(ii)在一個或多個氨基酸殘基中具有取代基團的多肽，或(iii)成熟多肽與另一個化合物(比如延長多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列或蛋白原序列，或與抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根據本文的教導，這些片段、衍生物和類似物屬于本領域熟練技術人員公知的范圍。
在本發明中，術語“鉤端螺旋體OMP20多肽”指具有鉤端螺旋體OMP20蛋白活性或免疫原性的SEQ ID NO.2序列的多肽。該術語還包括具有與鉤端螺旋體OMP20蛋白相同功能的、SEQ ID NO.2序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數個(通常為10個以內，更佳地為5個以內)氨基酸。該術語還包括鉤端螺旋體OMP20蛋白的活性片段和活性衍生物。
該多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴緊度條件下能與鉤端螺旋體OMP20 DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗鉤端螺旋體OMP20多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發明還提供了其他多肽，如包含鉤端螺旋體OMP20多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發明還包括了鉤端螺旋體OMP20多肽的可溶性片段。通常，該片段具有鉤端螺旋體OMP20多肽序列的至少約10個連續氨基酸，通常至少約30個連續氨基酸，較佳地至少約50個連續氨基酸，更佳地至少約80個連續氨基酸，最佳地至少約100個連續氨基酸。這些片段也可用作免疫原以誘導針對鉤端螺旋體的免疫應答反應。
發明還提供鉤端螺旋體OMP20蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然鉤端螺旋體OMP20多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導的遺傳變異體。誘導變異體可以通過各種技術得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產生隨機誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學的技術。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應理解，本發明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級結構)形式包括體內或體外的多肽的化學衍生形式如乙酰化或羧基化。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進一步加工步驟中進行糖基化修飾而產生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優化了溶解性能的多肽。
在本發明中，“鉤端螺旋體OMP20蛋白保守性變異多肽”指與SEQ ID NO2的氨基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個，最佳地至多3個氨基酸被性質相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據表1進行氨基酸替換而產生。
表1


本發明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成熟多肽的編碼區序列可以與SEQ ID NO1所示的編碼區序列相同或者是簡并的變異體。如本文所用，“簡并的變異體”在本發明中是指編碼具有SEQ ID NO2的蛋白質，但與SEQ ID NO1所示的編碼區序列有差別的核酸序列。本發明的核苷酸序列可以根據密碼子的對應關系，根據SEQ ID NO2的氨基酸推導出。
編碼SEQ ID NO2的成熟多肽的多核苷酸包括只編碼成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列)以及非編碼序列。
術語“編碼多肽的多核苷酸”可以是包括編碼此多肽的多核苷酸，也可以是還包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
本發明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發生的等位變異體或非天然發生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領域所知的，等位變異體是一個多核苷酸的替換形式，它可能是一個或多個核苷酸的取代、缺失或插入，但不會從實質上改變其編碼的多肽的功能。
本發明還涉及與上述的序列雜交且兩個序列之間具有至少50％，較佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本發明特別涉及在嚴格條件下與本發明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸。在本發明中，“嚴格條件”是指(1)在較低離子強度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)雜交時加有變性劑，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/O.1％Ficoll，42℃等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在90％以上，更好是95％以上時才發生雜交。并且，可雜交的多核苷酸編碼的多肽與SEQ ID NO2所示的成熟多肽有相同的生物學功能和活性。
本發明還涉及與上述的序列雜交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的長度至少含15個核苷酸，較好是至少30個核苷酸，更好是至少50個核苷酸，最好是至少100個核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的擴增技術(如PCR)以確定和/或分離編碼OMP20蛋白的多聚核苷酸。
本發明的鉤端螺旋體OMP20核苷酸全長序列或其片段通常可以用PCR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴增法，可根據本發明所公開的有關核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設計引物，并用市售的cDNA庫或按本領域技術人員已知的常規方法所制備的cDNA庫作為模板，擴增而得有關序列。當序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴增，然后再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。這通常是將其克隆入載體，再轉入細胞，然后通過常規方法從增殖后的宿主細胞中分離得到有關序列。
此外，還可用人工合成的方法來合成有關序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然后再進行連接可獲得序列很長的片段。
目前，已經可以完全通過化學合成來得到編碼本發明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領域中已知的各種現有的DNA分子(或如載體)和細胞中。此外，還可通過化學合成將突變引入本發明蛋白序列中。
本發明也涉及包含本發明的多核苷酸的載體，以及用本發明的載體或OMP20蛋白編碼序列經基因工程產生的宿主細胞，以及經重組技術產生本發明所述多肽的方法。
通過常規的重組DNA技術(Science，1984；2241431)，可利用本發明的多聚核苷酸序列可用來表達或生產重組的OMP20多肽。一般來說有以下步驟(1).用本發明的編碼鉤端螺旋體OMP20多肽的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達載體轉化或轉導合適的宿主細胞；(2).在合適的培養基中培養的宿主細胞；(3).從培養基或細胞中分離、純化蛋白質。
本發明中，鉤端螺旋體OMP20多核苷酸序列可插入到重組表達載體中。術語“重組表達載體”指本領域熟知的細菌質粒、噬菌體、酵母質粒、植物細胞病毒、哺乳動物細胞病毒如腺病毒、逆轉錄病毒或其他載體。在本發明中適用的載體包括但不限于在細菌中表達的基于T7的表達載體；在哺乳動物細胞中表達的pMSXND表達載體和在昆蟲細胞中表達的來源于桿狀病毒的載體。總之，只要能在宿主體內復制和穩定，任何質粒和載體都可以用。表達載體的一個重要特征是通常含有復制起點、啟動子、標記基因和翻譯控制元件。
本領域的技術人員熟知的方法能用于構建含鉤端螺旋體OMP20編碼DNA序列和合適的轉錄/翻譯控制信號的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術、DNA合成技術、體內重組技術等。所述的DNA序列可有效連接到表達載體中的適當啟動子上，以指導mRNA合成。表達載體還包括翻譯起始用的核糖體結合位點和轉錄終止子。
此外，表達載體優選地包含一個或多個選擇性標記基因，以提供用于選擇轉化的宿主細胞的表型性狀，如真核細胞培養用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋白(GFP)，或用于大腸桿菌的四環素或氨芐青霉素抗性。
包含上述的適當DNA序列以及適當啟動子或者控制序列的載體，可以用于轉化適當的宿主細胞，以使其能夠表達蛋白質。
宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高等真核細胞，如哺乳動物細胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬；鼠傷寒沙門氏菌的細菌細胞；真菌細胞如酵母；植物細胞；果蠅S2或Sf9的昆蟲細胞；CHO、COS、293細胞、或Bowes黑素瘤細胞的動物細胞等。
用重組DNA轉化宿主細胞可用本領域技術人員熟知的常規技術進行。當宿主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態細胞可在指數生長期后收獲，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉化也可用電穿孔的方法進行。當宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉染方法磷酸鈣共沉淀法，常規機械方法如顯微注射、電穿孔、脂質體包裝等。
獲得的轉化子可以用常規方法培養，表達本發明的基因所編碼的多肽。根據所用的宿主細胞，培養中所用的培養基可選自各種常規培養基。在適于宿主細胞生長的條件下進行培養。當宿主細胞生長到適當的細胞密度后，用合適的方法(如溫度轉換或化學誘導)誘導選擇的啟動子，將細胞再培養一段時間。
在上面的方法中的重組多肽可在細胞內、或在細胞膜上表達、或分泌到細胞外。如果需要，可利用其物理的、化學的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領域技術人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于常規的復性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術及這些方法的結合。
重組的鉤端螺旋體OMP20蛋白或多肽有多方面的用途，其中包括(但不限于)作為抗原用于制備疫苗。
另一方面，本發明還包括對鉤端螺旋體OMP20 DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結合于鉤端螺旋體OMP20基因產物或片段。較佳地，指那些能與鉤端螺旋體OMP20基因產物或片段結合但不識別和結合于其它非相關抗原分子的抗體。本發明還包括那些能與修飾或未經修飾形式的鉤端螺旋體OMP20基因產物結合的抗體。
本發明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab’或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；或嵌合抗體。
本發明的抗體可以通過本領域內技術人員已知的各種技術進行制備。例如，純化的鉤端螺旋體OMP20基因產物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動物以誘導多克隆抗體的產生。與之相似的，表達鉤端螺旋體OMP20蛋白或其具有抗原性的片段的細胞可用來免疫動物來生產抗體。本發明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術來制備。
疫苗組合物本發明的疫苗可以是預防性的(即預防感染)或治療性的(即在感染后治療疾病)。
這些疫苗包含免疫性抗原或免疫原、免疫原性多肽、蛋白或蛋白片段、或核酸(如核糖核酸或脫氧核糖核酸)，通常與″藥學上可接受的載體″組合，這些載體包括本身不誘導產生對接受該組合物的個體有害的抗體的任何載體。合適的載體通常是大的、代謝緩慢的大分子，如蛋白質、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、氨基酸聚合物、氨基酸共聚物、脂質凝集物(如油滴或脂質體)以及無活性的病毒顆粒。這些載體是本領域普通技術人員所熟知的。另外，這些載體可起免疫刺激劑(″佐劑″)作用。另外，抗原或免疫原可以和細菌類毒素(如白喉、破傷風、霍亂、幽門螺桿菌等病原體的類毒素)偶聯。
增強組合物效果的較佳的佐劑包括但不局限于(1)鋁鹽(alum)，如氫氧化鋁、磷酸鋁、硫酸鋁等；(2)水包油型乳劑配方(有或沒有其它特異性的免疫刺激劑，如胞壁酰肽(見下文)或細菌細胞壁成分)，例如，(a)MF59(PCT出版物No.WO90/14837)，其含有5％鯊烯、0.5％吐溫80和0.5％Span 85(任選地含有不同量的MTP-PE(見下文)，雖然并不需要)，用微量流化器(如110Y型微量流化器(Microfluidics，Newton，MA))制成亞微米級顆粒；(b)SAF，其含有10％鯊烯、0.4％吐溫80、5％普盧蘭尼克(pluronic)嵌段聚合物L121以及thr-MDP(見下文)，微量流化成亞微米級乳劑或渦流振蕩產生粒徑較大的乳劑，和(c)RibiTM佐劑系統(RAS)(Ribi Immunochem，Hamilton，MT)，其含有2％鯊烯、0.2％吐溫80以及取自單磷酰脂A(MPL)、二霉菌酸海藻糖酯(TDM)、和細胞壁骨架(CWS)的一種或多種細菌細胞壁組分，較佳的是MPL+CWS(DetoxTM)；(3)皂素佐劑，例如可采用StimulonTM(Cambridge Bioscience，Worcester，MA)或從其產生的顆粒，如ISCOM(免疫刺激性復合物)；(4)Freund完全佐劑(CFA)和Freund不完全佐劑(IFA)；(5)細胞因子，如白介素(如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12等)、干擾素(如γ干擾素)、巨噬細胞集落刺激因子(M-CFS)、腫瘤壞死因子(TNF)等；(6)細菌ADP-核糖基化毒素(如霍亂毒素CT，百日咳毒素PT或大腸桿菌熱不穩定毒素LT)的脫毒變異體，尤其是LT-K63、LT-R72，CT-S109、PT-K9/G129；參見例如WO93/13302和WO92/19265；以及(7)作為免疫刺激劑來增強組合物效果的其它物質。
如上所述，胞壁酰肽包括但不局限于，N-乙酰-胞壁酰-L-蘇氨酰-D-異谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰-去胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺(nor-MDP)、N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰氨酰基-L-丙氨酸-2-(1’-2’-二棕櫚酰-sn-甘油-3-羥基磷酰氧)-乙胺(MTP-PE)等。
包括免疫原性組合物在內的疫苗組合物(如可包括抗原，藥學上可接受的載體以及佐劑)，通常含有稀釋劑，如水，鹽水，甘油，乙醇等。另外，輔助性物質，如潤濕劑或乳化劑、pH緩沖物質等可存在于這類運載體中。此外，包括免疫原性組合物在內的疫苗組合物可含有在藥學上可接受載體中的抗原、多肽、蛋白、蛋白片段或核酸。
更具體地，包括免疫原性組合物在內的疫苗，包含免疫學有效量的免疫原性多肽，以及上述其它所需的組分。″免疫學有效量″指以單劑或連續劑一部分給予個體的量對治療或預防是有效的。該用量根據所治療個體的健康狀況和生理狀況、所治療個體的類別(如非人靈長類等)、個體免疫系統合成抗體的能力、所需的保護程度、疫苗的配制、治療醫師對醫療狀況的評估、及其它的相關因素而定。預計該用量將在相對較寬的范圍內，可通過常規實驗來確定。
通常，可將疫苗組合物或免疫原性組合物制成可注射劑，例如液體溶液或懸液；還可制成在注射前適合配入溶液或懸液、液體賦形劑的固體形式。該制劑還可乳化或包封在脂質體中，在上述藥學上可接受的載體下增強佐劑效果。
常規方法是從腸胃外(皮下或肌內)途徑通過注射給予免疫原性組合物。適合其它給藥方式的其它配方包括口服制劑、栓劑和透皮應用。治療劑量可以是單劑方案或多劑方案。疫苗可以結合其它免疫調節劑一起給予。
作為以蛋白質為基礎的疫苗的一種替代方案是，可以采用DNA疫苗接種。
在本發明的一個實例中，提供了一種分離的多核苷酸，它編碼具有SEQ IDNO2所示氨基酸序列的多肽。本發明的多核苷酸是從人樹突狀細胞cDNA文庫中分離出的。其序列如SEQ ID NO1所示，它包含的多核苷酸序列全長為585個堿基，其開放讀框位于1-585位，編碼全長為195個氨基酸的鉤端螺旋體OMP20蛋白(SEQID NO2)。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1菌體培養1)培養基使用EMJH液體培養基，配制5×的EMJH培養基1000，稱取BSA 50g。無水醋酸鈉0.5g，丙酮酸鈉1g，硫酸亞鐵0.25g，1.5％的氯化鎂3.5ml，0.4％的硫酸鋅5ml，0.15的硫酸銅1ml，磷酸氫二鈉12.6g，磷酸二氫鉀1.5g，氯化鈉5g，氯化銨1.25g，0.05％的VB122ml，VB10.025g，調pH為7.27.6，定容至1000ml分別以0.7、0.45、0.2nm孔徑的硝酸纖維素膜過濾除菌。使用時，用無菌水其5倍稀釋。
2)培養條件30℃，100轉/分鐘搖動培養40小時。
3)菌株問號鉤端螺旋體黃疸出血群賴型賴株。10分鐘，取上清。5ml碳酸鈉(pH11)稀釋，搖勻，置于冰上1小時。1小時。1ml Tris-HCL(pH7.3)洗一次。20分鐘。含外膜蛋白質(混合物)。的混合物進行SDS-PAGE電泳，條件是4％濃縮膠，12.5％分離所示。泳道1為外膜蛋白質，泳道2為分子量標準從上到下為
YPDGLTRPGFSYK(SEQ ID NO3)NVDVNSPEAIADSLNEK(SEQ ID NO4)KLPDSYALEITGHTDAIGPEQAEGAK(SEQ ID NO5)NVDVNSPEAIADSLNEKLK(SEQ ID NO6)隨后根據這幾段肽的氨基酸序列，采用Sequest軟件，在本申請人構建的蛋白質數據庫中檢索，得到唯一的開放閱讀框的序列。atggtcaaaa agattttgaa tctgattctg ctcggtgcaa ttgcattttc attcactctc 60tgctcctctg ctgaaaaaaa agaggaatcc gcagctcctg agccttcaac gcaagagcaa 120tccgcagctg caaacagaaa tgttgacgtc aattctccgg aagcgatcgc agattcttta 180aacgaaaaac taaaagattt ccgatatcca gacggtttaa ctcgtcctgg atttagttat 240aaaaaagcgg atgttacccc tggtgatttc agcgagtggt ctaaaacaaa cgctcctgta 300atcaaagaag gtcttagaaa acttccagat agttacgctc ttgaaattac aggacacacc 360gatgcgatcg gtcccgaaca agcagaaggt gctaaaaaag gaaatatttt ttactctgag 420cttcgtgcaa atgcagttaa acaagcttta atcaaacaag ggattccagc aaatcgtatc 480gttactaaag gtgccggttc ttccgagcca gtttctggtc ttgatgcgaa agatgctaaa 540aatagaagag tcactttccg ttttgcgact tccgcaccac aacaa 585(SEQ ID NO1)其開放閱讀框位于1-585位，編碼的蛋白質序列如下MVKKILNLIL LGAIAFSFTL CSSAEKKEES AAPEPSTQEQ SAAANRNVDV 50NSPEAIADSL NEKLKDFRYP DGLTRPGFSY KKADVTPGDF SEWSKTNAPV 100IKEGLRKLPD SYALEITGHT DAIGPEQAEG AKKGNIFYSE LRANAVKQAL 150IKQGIPANRI VTKGAGSSEP VSGLDAKDAK NRRVTFRFAT SAPQQ 195(SEQ ID NO2)OMP20蛋白的理論分子量為20980 Da，與電泳圖譜完全吻合。
實施例5蛋白質結構研究采用PSORT軟件進行，證明該蛋白質可能有N端可剪切信號肽(位置是前17個氨基酸)，用于裝運到細胞膜外，所以該蛋白質可能位于膜間質或外膜。盡管外膜蛋白質也是跨膜蛋白，但并沒有通常膜蛋白的疏水穿膜結構域。而氨基酸組成分析認為該蛋白質有可能在外膜上。
采用Wu-Blast軟件進行，相似性最高的蛋白質為空腸彎曲桿菌(Campylobacter jejuni)的外膜脂蛋白18。此蛋白質為另一種細菌空腸彎曲桿菌中的外膜蛋白質，兩者序列相似比為29％。另外，此蛋白質與其他細菌如大腸桿菌等中的外膜蛋白質A家族(outer membrane A family)都有一定的同源性。因此可以確定該蛋白質為一種外膜蛋白質。
實施例6免疫制劑用常規基因工程方法將膜蛋白基因克隆入融合表達載體，融合表達的受體菌選用大腸桿菌或結核桿菌(卡介苗)。在大腸桿菌中表達的外膜蛋白須先將其分離、濃縮、提純，加入福氏佐劑制備成膜蛋白免疫原。在卡介苗中表達的膜蛋白，可直接作為免疫原，即疫苗。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
序列表<110>中國科學院上海生命科學研究中心國家人類基因組南方研究中心中國預防醫學科學院流行病與微生物研究院<120>新的鉤端螺旋體外膜蛋白、其編碼序列及用途<130>016032<160>6<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>585<212>DNA<213>Leptospira interrogans<220><221>CDS<222>(1)..(585)<400>1atg gtc aaa aag att ttg aat ctg att ctg ctc ggt gca att gca ttt48Met Val Lys Lys Ile Leu Asn Leu Ile Leu Leu Gly Ala Ile Ala Phe1 5 10 15tca ttc act ctc tgc tcc tct gct gaa aaa aaa gag gaa tcc gca gct96Ser Phe Thr Leu Cys Ser Ser Ala Glu Lys Lys Glu Glu Ser Ala Ala20 25 30cct gag cct tca acg caa gag caa tcc gca gct gca aac aga aat gtt 144Pro Glu Pro Ser Thr Gln Glu Gln Ser Ala Ala Ala Asn Arg Asn Val35 40 45gac gtc aat tct ccg gaa gcg atc gca gat tct tta aac gaa aaa cta 192Asp Val Asn Ser Pro Glu Ala Ile Ala Asp Ser Leu Asn Glu Lys Leu50 55 60aaa gat ttc cga tat cca gac ggt tta act cgt cct gga ttt agt tat 240Lys Asp Phe Arg Tyr Pro Asp Gly Leu Thr Arg Pro Gly Phe Ser Tyr65 70 75 80aaa aaa gcg gat gtt acc cct ggt gat ttc agc gag tgg tct aaa aca 288Lys Lys Ala Asp Val Thr Pro Gly Asp Phe Ser Glu Trp Ser Lys Thr85 90 95aac gct cct gta atc aaa gaa ggt ctt aga aaa ctt cca gat agt tac 336Asn Ala Pro Val Ile Lys Glu Gly Leu Arg Lys Leu Pro Asp Ser Tyr100 105 110gct ctt gaa att aca gga cac acc gat gcg atc ggt ccc gaa caa gca 384Ala Leu Glu Ile Thr Gly His Thr Asp Ala Ile Gly Pro Glu Gln Ala115 120 125gaa ggt gct aaa aaa gga aat att ttt tac tct gag ctt cgt gca aat 432Glu Gly Ala Lys Lys Gly Asn Ile Phe Tyr Ser Glu Leu Arg Ala Asn130 135 140gca gtt aaa caa gct tta atc aaa caa ggg att cca gca aat cgt atc 480Ala Val Lys Gln Ala Leu Ile Lys Gln Gly Ile Pro Ala Asn Arg Ile145 150 155 160gtt act aaa ggt gcc ggt tct tcc gag cca gtt tct ggt ctt gat gcg 528Val Thr Lys Gly Ala Gly Ser Ser Glu Pro Val Ser Gly Leu Asp Ala165 170 175aaa gat gct aaa aat aga aga gtc act ttc cgt ttt gcg act tcc gca 576Lys Asp Ala Lys Asn Arg Arg Val Thr Phe Arg Phe Ala Thr Ser Ala180 185 190cca caa caa 585Pro Gln Gln195<210>2<211>195<212>PRT<213>Leptospira interrogans<400>2Met Val Lys Lys Ile Leu Asn Leu Ile Leu Leu Gly Ala Ile Ala Phe1 5 10 15Ser Phe Thr Leu Cys Ser Ser Ala Glu Lys Lys Glu Glu Ser Ala Ala20 25 30Pro Glu Pro Ser Thr Gln Glu Gln Ser Ala Ala Ala Asn Arg Asn Val35 40 45Asp Val Asn Ser Pro Glu Ala Ile Ala Asp Ser Leu Asn Glu Lys Leu50 55 60Lys Asp Phe Arg Tyr Pro Asp Gly Leu Thr Arg Pro Gly Phe Ser Tyr65 70 75 80Lys Lys Ala Asp Val Thr Pro Gly Asp Phe Ser Glu Trp Ser Lys Thr
85 90 95Asn Ala Pro Val Ile Lys Glu Gly Leu Arg Lys Leu Pro Asp Ser Tyr100 105 110Ala Leu Glu Ile Thr Gly His Thr Asp Ala Ile Gly Pro Glu Gln Ala115 120 125Glu Gly Ala Lys Lys Gly Asn Ile Phe Tyr Ser Glu Leu Arg Ala Asn130 135 140Ala Val Lys Gln Ala Leu Ile Lys Gln Gly Ile Pro Ala Asn Arg Ile145 150 155 160Val Thr Lys Gly Ala Gly Ser Ser Glu Pro Val Ser Gly Leu Asp Ala165 170 175Lys Asp Ala Lys Asn Arg Arg Val Thr Phe Arg Phe Ala Thr Ser Ala180 185 190Pro Gln Gln195<210>3<211>13<212>PRT<213>Leptospira interrogans<400>3Tyr Pro Asp Gly Leu Thr Arg Pro Gly Phe Ser Tyr Lys1 5 10<210>4<211>17<212>PRT<213>Leptospira interrogans<400>4Asn Val Asp Val Asn Ser Pro Glu Ala Ile Ala Asp Ser Leu Asn Glu1 5 10 15Lys<210>5<211>26<212>PRT<213>Leptospira interrogans<400>5Lys Leu Pro Asp Ser Tyr Ala Leu Glu Ile Thr Gly His Thr Asp Ala1 5 10 15Ile Gly Pro Glu Gln Ala Glu Gly Ala Lys20 25<210>6<211>19<212>PRT<213>Leptospira interrogans<400>6Asn Val Asp Val Asn Ser Pro Glu Ala Ile Ala Asp Ser Leu Asn Glu1 5 10 15Lys Leu Lys
權利要求
1.一種分離的鉤端螺旋體OMP20多肽，其特征在于，它包含具有SEQ IDNO2氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
2.如權利要求1所述的多肽，其特征在于，該多肽是具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽。
3.一種分離的多核苷酸，其特征在于，它包含一核苷酸序列，該核苷酸序列與選自下組的一種核苷酸序列有至少70％相同性(a)編碼如權利要求1和2所述多肽的多核苷酸；(b)與多核苷酸(a)互補的多核苷酸。
4.如權利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸編碼具有SEQ IDNO2所示氨基酸序列的多肽。
5.如權利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸的序列選自下組(a)具有SEQ ID NO1中1-585位的序列。
6.一種載體，其特征在于，它含有權利要求3所述的多核苷酸。
7.一種遺傳工程化的宿主細胞，其特征在于，它含有權利要求6所述的載體。
8.一種具有鉤端螺旋體OMP20蛋白活性的多肽的制備方法，其特征在于，該方法包含(a)在適合表達鉤端螺旋體OMP20蛋白的條件下，培養權利要求7所述的宿主細胞；(b)從培養物中分離出具有鉤端螺旋體OMP20蛋白活性的多肽。
9.一種能與權利要求1所述的鉤端螺旋體OMP20蛋白特異性結合的抗體。
10.一種疫苗組合物，其特征在于，它含有安全有效量的權利要求1所述的多肽和藥學上可接受的載體。
全文摘要
本發明提供了一種新的鉤端螺旋體外膜蛋白－OMP20蛋白，編碼OMP20蛋白的多核苷酸和經重組技術產生這種OMP20蛋白的方法。OMP20蛋白是一種有用的制備疫苗的免疫原。本發明還公開了編碼這種OMP20蛋白及其編碼序列用于制備疫苗的用途。
文檔編號A61K38/16GK1414016SQ0113200
公開日2003年4月30日 申請日期2001年10月26日 優先權日2001年10月26日
發明者曾嶸, 夏其昌, 任雙喜, 陳竺, 趙國屏, 徐建國, 黃紅壘 申請人:中國科學院上海生命科學研究院, 國家人類基因組南方研究中心, 中國預防醫學科學院流行病與微生物學研究所