專利名稱：納米相鈣磷鹽/膠原/高分子骨復合多孔材料的制備方法
技術領域：
本發明涉及一種納米相鈣磷鹽/膠原/高分子骨復合多孔材料的制備方法，屬生物工程技術領域。
骨修復材料的研制開發一直是生物醫學工程領域大批科學工作者努力的方向。現在手術中實際使用的骨修復材料效果最好的是自體骨和異體骨。但是自體骨數量有限，而異體骨又有免疫排斥和感染疾病的危險。人們已經開發了由金屬、陶瓷、高分子以及其復合材料制成的多種骨修復材料。但是這些材料各有不足，但是這些材料各有不足，沒有那一種能在臨床中與自體骨或異體骨比美。考慮到自體骨和異體骨的生物學優勢主要在于它們的成分和結構與天然骨完全相同，骨組織工程的原理認為一個具有和天然骨相似的組成和微觀結構的框架材料將會具有優異的生物學性能。
天然骨是具有精密分級結構的膠原和鈣磷鹽的復合物。骨中的鈣磷鹽主要是形狀不規則的片狀納米晶，這些晶體的c軸大致平行。晶體寬度大約30-45nm，厚度4-6nm。臨近的片晶構成鈣磷鹽晶體層，在空間上與膠原層交替排列，片層間距在納米數量級，周期為10nm左右。排列高度有序的膠原作為一種細胞外基質對細胞活動也有重要影響。除了成分上的特點以外，天然骨還具有很高的孔隙率，孔洞之間是開放互聯的。這對于營養物質的輸運，骨細胞的遷移繁殖，舊骨的吸收和新骨的生成都至關重要。
poly(lactide-co-glycolide)(以下簡稱PLGA)是poly(lactic acid)(以下簡稱PLA)與poly(glycolic acid)(以下簡稱PGA)的共聚物，長期的醫療實踐和實驗室的研究都表明這種材料的生物相容性非常優異，而且由于PLA和PGA降解行為的不同，它們的共聚物PLGA的降解速度可以通過調整共聚物中兩者的比例來控制。
本發明的目的是提出一種納米相鈣磷鹽/膠原/高分子骨復合多孔材料的制備方法，通過把生物相容性好、降解速度可控、易于成型的高分子材料與納米晶磷酸鈣膠原基復合材料整合，成為具有高度孔隙率、合適孔徑尺寸的框架材料，得到具有優異生物相容性和生物活性的可降解骨替代材料，作為可降解骨替代材料在醫療方面得到廣泛應用。還將框架與BMP等生長因子結合，最大限度的提高材料的生物活性。
本發明提出的用于骨修復的納米相鈣磷鹽/膠原/高分子骨復合多孔材料的制備方法，包括下列各步驟(1)在酸溶的膠原溶液中緩慢滴加含有鈣離子的溶液，滴加量為每克膠原滴加鈣離子0.01～0.16mol，滴加的同時攪拌，其中的酸為鹽酸、硝酸或乙酸中的任何一種，膠原溶液的濃度為5.0×10-5～5.0×10-3g/ml；(2)在上述第一步的溶液中邊攪拌邊緩慢滴加含磷酸根離子的水溶液，加入的磷酸根離子的量與加入的鈣離子的量的摩爾比為Ca∶P=1～2∶1；(3)在上述第一步的溶液中邊攪拌邊緩慢滴加NaOH溶液至pH值為6～8,PH值用試紙或pH計測定，在pH值為5～6時開始出現沉淀，pH值為7時出現白色懸濁液；(4)將溶液靜置1～5天，除去上清，離心分離出沉淀，用去離子水清洗后，放入凍干機內冰凍干燥，隨后研磨制得干粉備用(5)將PLA∶PGA=50∶50～90∶10、分子量為50,000～150,000的PLGA置于燒瓶中，加入溶劑，在40～70℃的溫度下配制質量體積濃度為0.02～0.15g/ml的溶液，其中的溶劑為1,4-二氧六環、氯仿或二甲基亞砜中的任何一種；(6)在第(5)步的溶液中加入第(4)步制得的干粉，并混合均勻，干粉與PLGA的質量比為1∶2～3∶2，制得PLGA/鈣磷鹽/膠原混合溶液；(7)采用溶鹽法或熱致分相并凍干溶劑的方法制備PLGA/鈣磷鹽/膠原復合多孔框架材料若使用溶鹽法，首先將篩分過的100～400微米的NaCl晶體或蔗糖晶體加到PLGA/鈣磷鹽/膠原混合溶液中，加入的比例為NaCl/蔗糖∶PLGA/鈣磷鹽/膠原混合物=1～5∶1，在40～70℃下攪拌均勻，待溶劑快蒸干時將剩余物注模成型，隨后用真空處理除去未揮發溶劑，用去離子水在25℃條件下浸泡48小時除去造孔劑，最后用真空除去水；若采用熱致分相并凍干溶劑的方法，則將上述第六步中配成的溶液倒入模具中冷凍，溫度為-20℃～4℃，充分冷凍后，將模具轉移到冰凍干燥機中進行冷凍干燥除去溶劑晶體，為了將徹底清除溶劑，冷凍干燥兩天以后材料放入真空烘箱中三天；(8)將上述第七步的制品用環氧乙烷蒸氣消毒2～4小時，或參照相關國標用Co60照射消毒后保存，即得骨修復的納米相鈣磷鹽/膠原/高分子骨復合多孔材料。
本發明的方法中用生物自組裝合成了納米晶磷酸鈣膠原基復合材料，該材料由納米相的鈣磷鹽和膠原分子自組裝而成。它在納米尺度上具有重復片層結構，周期為10-15nm，由膠原層和鈣磷鹽層交替排列而成，由于其從成分和結構上仿天然骨，因此具有很好的生物相容性和很高的生物活性。
本發明方法制備的用于骨修復的納米相鈣磷鹽/膠原/PLGA骨復合多孔材料，具有優異的生物相容性，而且結構上也具有仿骨性。其鈣磷鹽晶體尺寸在納米量級，與有機成分膠原的結合緊密，排列有一定規律。框架整體具有大量連通的60～400微米微孔，且孔隙率很高約為65％～90％，孔隙率與溶液濃度或篩分的造孔劑顆粒大小有關。此材料的強度和生物相容性也很好。很有希望作為骨材料得到應用。
下面介紹
具體實施例方式本發明實施例中所用的膠原為益而康公司的Ⅰ型膠原凝膠(濃度固含量1％，所含膠原為純化的牛皮膠原)，CELLON公司購買的液態Ⅰ型膠原(濃度0.3％溶液PH值由HCl調整所含膠原為純化的牛皮膠原)，天津第二附屬醫院的Ⅰ型膠原凝膠(濃度固含量1％，所含膠原為純化的牛跟腱膠原)；所用的含PO43-的溶液為Na2HPO4,H3PO4,(NH4)2HPO4的水溶液；所用的含鈣離子的溶液為CaCl26H2O,Ca(NO3)2,CaCl22H2O的水溶液。使用的PLGA為PLA∶PGA 50∶50 70∶30 85∶15幾種不同比例的共聚物，分子量分別為80,000 100,000 150,000。實施例1所用材料為從益而康公司購買的Ⅰ型膠原凝膠(濃度固含量1％，所含膠原為純化的牛皮膠原)、分析純CaCl26H2O、分析純Na2HPO4、分析純1,4-二氧六環、PLGA(PLA∶PGA 70∶30)分子量∶100,000。
(1)將20g膠原凝膠溶于300ml 0.5M乙酸溶液中，緩慢滴加18.3ml 1mol/l CaCl2和11ml 1mol/l Na2HPO4，滴加的同時用磁力攪拌器攪拌；(2)繼續攪拌，同時緩慢滴加0.5mol/l的NaOH溶液至PH值為7；(3)靜置溶液1天，除去上清，離心分離出沉淀用去離子水反復清洗三次后放入凍干機內進行冰凍干燥，研磨后制得干粉備用；(4)60℃取1克PLGA溶于10ml 1,4-二氧六環中，初步溶解后加入第(3)步制備的干粉1克。
(5)溶液在60℃下攪拌10小時后補足揮發的溶劑量，繼續攪拌10分鐘。
(6)將(4)中的溶液倒入聚四氟乙烯模具中，于0℃冷凍2小時。
(7)將冷凍成型的材料轉移到凍干機中冷凍干燥48小時除去1,4-二氧六環。
(8)將材料放入真空烘箱中三天，溫度為37℃，真空度為-0.1MPa。
(9)使用環氧乙烷蒸氣消毒3小時后收存。
實施例2所用材料為天津第二附屬醫院的Ⅰ型膠原凝膠(濃度固含量1％，所含膠原為純化的牛跟腱膠原)、分析純CaCl22H2O、分析純(NH4)2HPO4、分析純1,4-二氧六環、PLGA(PLA∶PGA 50∶50)分子量80,000。
(1)20g膠原凝膠溶于300ml 0.1M HNO3溶液中，緩慢滴加10ml 1mol/l CaCl2和10ml 1mol/l(NH4)2HPO4，滴加的同時用磁力攪拌器攪拌；(2)繼續攪拌，同時緩慢滴加0.5mol/l的NaOH溶液至PH值為7；(3)靜置溶液4天，除去上清，離心分離出沉淀用去離子水反復清洗三次后放入凍干機內進行冰凍干燥，研磨后制得干粉備用；(4)50℃下取0.6克PLGA溶于10ml 1,4-二氧六環中，初步溶解后加入第(3)步制備的干粉0.3克。
(5)溶液在50℃下攪拌10小時后補足揮發的溶劑量，繼續攪拌10分鐘。
(6)將(4)中的溶液倒入聚四氟乙烯模具中，于-10℃冷凍2小時。
(7)將冷凍成型的材料轉移到凍干機中冷凍干燥48小時除去1,4-二氧六環。
(8)將材料放入真空烘箱中三天，溫度為37℃，真空度為-0.1MPa。
(9)使用環氧乙烷蒸氣消毒2小時后收存。
實施例3所用材料為CELLON公司購買的液態Ⅰ型膠原(濃度0.3％溶液PH值由HCl調整所含膠原為純化的牛皮膠原)、分析純二甲基亞砜、分析純的CaCl2·6H2O、分析純H3PO4(含量＞=85％密度1.689g/ml)。PLGA(PLA∶PGA70∶30)分子量100,000(1)100ml膠原溶液中滴加溶于10ml去離子水中的1.125ml H3PO4，滴加的同時用磁力攪拌器攪拌；(2)稱取結晶良好的CaCl26H2O 6.01g溶于20ml去離子水使其完全溶解將其滴加入上一步制得的溶液中后，繼續攪拌1小時；(3)繼續攪拌，同時緩慢滴加0.75mol/l的NaOH溶液至PH值為7；(4)靜置溶液1天，除去上清，離心分離出沉淀用去離子水反復清洗三次后放入凍干機內進行冰凍干燥，研磨后制得干粉備用；(5)取0.6克PLGA溶于12ml二甲基亞砜中，初步溶解后加入第(3)步制備的干粉0.4克。
(6)溶液在40℃下攪拌10小時后補足揮發的溶劑量，繼續攪拌10分鐘。
(7)將(4)中的溶液倒入聚四氟乙烯模具中，于0℃冷凍2小時。
(8)將冷凍成型的材料轉移到凍干機中冷凍干燥48小時除去二甲基亞砜。
(9)將材料放入真空烘箱中三天，溫度為37℃，真空度為-0.1MPa。
(10)使用環氧乙烷蒸氣消毒4小時后收存。
實施例4所用材料為益而康公司購買的Ⅰ型膠原凝膠(濃度固含量1％，所含膠原為純化的牛皮膠原)、分析純氯仿、分析純Ca(NO3)2、分析純Na2HPO4、PLGA(PLA∶PGA 85∶15)分子量150,000。
(1)20g膠原凝膠溶于300ml 0.5M乙酸溶液中，緩慢滴加16.5ml 1mol/lCa(NO3)2和11ml 1mol/l H3PO4，滴加的同時用磁力攪拌器攪拌；(2)繼續攪拌，同時緩慢滴加0.5mol/l的NaOH溶液至PH值為7；(3)靜置溶液1天，除去上清，離心分離出沉淀用去離子水反復清洗三次后放入凍干機內進行冰凍干燥，研磨后制得干粉備用；(4)40℃下取0.6克PLGA溶于15ml氯仿中，充分溶解后加入第(3)步制備的干粉0.4克以及3g尺寸在100～300微米之間的NaCl晶體。
(5)溶液在此溫度下攪拌至溶劑快揮發完畢時將剩余物注模成型，隨后用真空烘箱在40℃烘烤1天，除去未揮發溶劑。
(6)烘烤后用去離子水在25℃條件下浸泡此材料48小時除去造孔劑，隨后再用真空烘箱在37℃，真空度-0.1MPa,烘干3天除去水分。
(7)使用環氧乙烷蒸氣消毒4小時。
實施例5所用材料為益而康公司購買的Ⅰ型膠原凝膠(濃度固含量1％，所含膠原為純化的牛皮膠原)、分析純CaCl26H2O、分析純Na2HPO4、分析純二甲基亞砜，PLGA(PLA∶PGA 85∶15)分子量150,000。
(1)30g膠原凝膠溶于300ml 0.5M乙酸溶液中，緩慢滴加18.3ml 1mol/l CaCl2和11ml 1mol/l Na2HPO4，滴加的同時用磁力攪拌器攪拌；(2)繼續攪拌，同時緩慢滴加0.5mol/l的NaOH溶液至PH值為7；(3)靜置溶液5天，除去上清，離心分離出沉淀用去離子水反復清洗三次后放入凍干機內進行冰凍干燥，研磨后制得干粉備用；(4)60℃下取0.6克PLGA溶于15ml二甲基亞砜中，初步溶解后加入第(3)步制備的干粉0.4克以及0.6g尺寸在100～300微米之間的蔗糖晶體。
(5)溶液在60℃下攪拌10小時后補足揮發的溶劑量，繼續攪拌10分鐘。
(6)將(4)中的溶液倒入聚四氟乙烯模具中，于4℃冷凍2小時。
(7)將冷凍成型的材料轉移到凍干機中冷凍干燥48小時除去二甲基亞砜。
(8)隨后用去離子水在25℃條件下浸泡此材料48小時除去蔗糖，隨后再用真空烘箱在37℃，真空度-0.1MPa，烘烤3天除去水分。
(9)使用環氧乙烷蒸氣消毒2小時后收存。
權利要求
1.一種用于骨修復的納米相鈣磷鹽/膠原/高分子骨復合多孔材料的制備方法，其特征在于該方法包括下列各步驟(1)在酸溶的膠原溶液中緩慢滴加含有鈣離子的溶液，滴加量為每克膠原滴加鈣離子0.01～0.16mol，滴加的同時攪拌，其中的酸為鹽酸、硝酸或乙酸中的任何一種，膠原溶液的濃度為5.0×10-5～5.0×10-3g/ml；(2)在上述第一步的溶液中邊攪拌邊緩慢滴加含磷酸根離子的水溶液，加入的磷酸根離子的量與加入的鈣離子的量的摩爾比為Ca∶P=1～2∶1；(3)在上述第一步的溶液中邊攪拌邊緩慢滴加NaOH溶液至pH值為6～8,PH值用試紙或pH計測定，在pH值為5～6時開始出現沉淀，pH值為7時出現白色懸濁液；(4)將溶液靜置1～5天，除去上清，離心分離出沉淀，用去離子水清洗后，放入凍干機內冰凍干燥，隨后研磨制得干粉備用；(5)將PLA∶PGA=50∶50～90∶10、分子量為50,000～150,000的PLGA置于燒瓶中，加入溶劑，在40～70℃的溫度下配制質量體積濃度為0.02～0.15g/ml的溶液，其中的溶劑為1,4-二氧六環、氯仿或二甲基亞砜中的任何一種；(6)在第(5)步的溶液中加入第(4)步制得的干粉，并混合均勻，干粉與PLGA的質量比為1∶2～3∶2，制得PLGA/鈣磷鹽/膠原混合溶液；(7)將篩分過的100～400微米的NaCl晶體或蔗糖晶體加到PLGA/鈣磷鹽/膠原混合溶液中，加入的比例為NaCl/蔗糖∶PLGA/鈣磷鹽/膠原混合物=1～5∶1，在40～70℃下攪拌均勻，待溶劑快蒸干時將剩余物注模成型，隨后用真空處理除去未揮發溶劑，用去離子水在25℃條件下浸泡48小時除去造孔劑，最后用真空除去水；(8)將上述第七步的制品用環氧乙烷蒸氣消毒2～4小時，或參照相關國標用Co60照射消毒后保存，即得骨修復的納米相鈣磷鹽/膠原/高分子骨復合多孔材料。
2.一種用于骨修復的納米相鈣磷鹽/膠原/高分子骨復合多孔材料的制備方法，其特征在于該方法包括下列各步驟(1)在酸溶的膠原溶液中緩慢滴加含有鈣離子的溶液，滴加量為每克膠原滴加鈣離子0.01～0.16mol，滴加的同時攪拌，其中的酸為鹽酸、硝酸或乙酸中的任何一種，膠原溶液的濃度為5.0×10-5～5.0×10-3g/ml；(2)在上述第一步的溶液中邊攪拌邊緩慢滴加含磷酸根離子的水溶液，加入的磷酸根離子的量與加入的鈣離子的量的摩爾比為Ca∶P=1～2∶1；(3)在上述第一步的溶液中邊攪拌邊緩慢滴加NaOH溶液至pH值為6～8,PH值用試紙或pH計測定，在pH值為5～6時開始出現沉淀，pH值為7時出現白色懸濁液；(4)將溶液靜置1～5天，除去上清，離心分離出沉淀，用去離子水清洗后，放入凍干機內冰凍干燥，隨后研磨制得干粉備用；(5)將PLA∶PGA=50∶50～90∶10、分子量為50,000～150,000的PLGA置于燒瓶中，加入溶劑，在40～70℃的溫度下配制質量體積濃度為0.02～0.15g/ml的溶液，其中的溶劑為1,4-二氧六環、氯仿或二甲基亞砜中的任何一種；(6)在第(5)步的溶液中加入第(4)步制得的干粉，并混合均勻，干粉與PLGA的質量比為1∶2～3∶2，制得PLGA/鈣磷鹽/膠原混合溶液；(7)將上述第六步中配成的溶液倒入模具中冷凍，溫度為-20℃～4℃，充分冷凍后，將模具轉移到冰凍干燥機中進行冷凍干燥除去溶劑晶體，為了將徹底清除溶劑，冷凍干燥兩天以后材料放入真空烘箱中三天；(8)將上述第七步的制品用環氧乙烷蒸氣消毒2～4小時，或參照相關國標用Co60照射消毒后保存，即得骨修復的納米相鈣磷鹽/膠原/高分子骨復合多孔材料。
全文摘要
本發明涉及一種用于骨修復的納米相鈣磷鹽/膠原/高分子骨復合多孔材料的制備方法,首先在酸溶的膠原溶液中緩慢滴加含鈣離子溶液和含磷酸根離子的水溶液,滴加NaOH溶液調pH值,冰凍干燥后研磨制得干粉備用,將PLGA置于燒瓶中,加入溶劑,與干粉混合均勻,采用溶鹽法或熱致分相并凍干溶劑的方法制備PLGA/鈣磷鹽/膠原復合多孔框架材料。本發明制備的骨復合多孔材料,具有優異的生物相容性,結構具有仿骨性。
文檔編號A61K38/39GK1325734SQ01129699
公開日2001年12月12日 申請日期2001年6月29日 優先權日2001年6月29日
發明者崔福齋, 張曙明, 廖素三, 馮慶玲, 李恒德 申請人:清華大學