專利名稱：肝靶向重組p的制作方法
技術領域：
本發明與基因藥物有關，尤其與治療肝癌的基因藥物納米粒制劑有關。
背景技術：
惡性腫瘤是當今世界威脅人類生命健康的主要殺手。傳統的放療化療及手術治療等方法存在著毒副作用大，對中晚期癌癥患者療效差等缺陷，九十年代以來腫瘤基因治療作為一種全新的生物療法已蓬勃興起，它是一種具有巨大潛力和生命力的方法。
單純皰疹病毒胸苷激酶基因(HSV-TK)是一種藥物敏感基因，又稱自殺基因，該基因與某些核苷酸類似物如GCV作用時，HSV-TK能夠催化其磷酸化，從而抑制細胞DNA聚合的活性或作為底物摻入新合成的DNA中，導致DNA合成中止，細胞死亡，因此把HSV-TK導入腫瘤細胞，利用GCV誘導細胞死亡已成為腫瘤基因治療的重要方法之一。
但普通的基因藥物不具有特異的組織器官靶向性，對正常細胞組織也會造成損害，此外普通的基因藥物不含報告基因，不便于在治療過程中的檢測。
發明內容
本發明的目的是提供一種具有肝臟靶向性，具有緩釋性，對肝癌治療效果良好，便于檢測的肝靶向重組pEGFP-ATK質粒納米粒制劑。本發明是這樣實現的一種肝靶向重組pEGFP-ATK質粒納米粒制劑，以質粒pUC-AFPlb，pEGFP和pNGVL-TK為原料，先用常規法大抽三種質粒，然后分別用限制性內切酶HindIII和EcoRI消化pUC-AFPlb分離純化得800bp的AFP-Alb增強子-啟動子片段，用限制性內切酶HindIII-SmaI消化pNGVL-TK，分離純化得1125bp的TK片段，用限制性內切酶HindIII-SmaI消化真核表達載體pEGFP，分離純化得線性化載體片段，然后將該消化載體片段與AFP-Alb啟動子片段進行5′端定向連接，酚抽提，乙醇沉淀后再用此連接產物與HindIII-SmaI消化TK片段進行3′端定向連接，再次，酚抽提，純化，然后用綠豆芽核酸酶MB處理5′突出端后，再進行平端連接，得重組質粒，將聚酯載體，吐溫80用有機溶劑溶解，再加入上述重組質粒，勻化后加入聚乙烯醇溶液，再次勻化，所得產物攪拌后冷凍干燥而制成。
納米粒制劑中質粒pUC-AFPlb，pEGFP和pNGVL-TK＝1∶1∶1分子比。
納米粒制劑勻化用旋渦混合器或探頭超聲儀或細胞粉碎機，攪拌用攪拌器。
納米粒制劑中聚酯載體為50～200毫克，吐溫為10～100毫克，有機溶劑為1～5毫升，重組質粒為50～200毫克，聚乙烯醇溶液濃度為3～9％。
納米粒制劑所用聚乙烯醇溶液中溶解了二氯化鈣，二氯化鈣的溶解濃度為0.5～1.5％。
納米粒制劑用探頭式超聲儀或細胞粉碎機勻化，第一次勻化時再為3～7秒，第2次勻化時間為3～7秒，所得產物用磁力攪拌器攪拌4-6小時。
納米粒制劑用旋渦混合器勻化，第一次勻化時間為2-4分鐘，第二次勻化時間為1-3分鐘，所得產物用磁力攪拌器攪拌4-6小時。
納米粒(Nanoparticle，NP)是一類由天然高分子物質或合成高分子物質制成的10-1000nm的載藥小球，大量的研究證明NP具有明顯的靶向性和體內延效作用。本發明使用的是低毒的和生物相容性好的聚酯類載體材料。
本發明首先制備了以TK基因作為治療基因，增強綠色熒光蛋白(Enhanced green flueorescent protein，EGFP)作為報告基因，并以α-甲胎蛋白(α-Fetoprotein，AFP)啟動子/增強子作為目的基因調控序列的新型重組質粒(pEGFP-ATK)，再以納米粒包裹此重組質粒。
這種納米粒靜注后不僅可保護所載基因不被核酸酶降解還可通過控制納米粒大小使所載基因首先濃集于肝臟，所攜自殺基因只在特異性產生AFP的未分化和低分化的肝癌細胞中表達，加入誘導藥物后只選擇性殺死肝癌細胞，而不影響正常細胞，EGFP因其本身具熒光發光特性，作為重組質粒的報告基因，適合以流式細胞儀和熒光顯微鏡檢測。綜上所述，本發明有如下優點本質粒由TK治療基因，EGFP報告基因和AFP啟動子/增強子調控序列組成，本質粒只在特異性產生AFP的未分化和低分化肝癌細胞中表達，具有更好的特異性，且能被方便檢測。
用納米粒包裹上述重組質粒后，制成具有雙重靶向性的納米粒制劑，使所載基因濃集于肝臟，并特異性地在肝癌細胞中表達，肝臟分布量可達80％，還可保護所載基因不被核酸酶降，包封率可達90％以上。
該重組質粒納米粒可克服重組質粒作用時間短的缺點。
該重組質粒納米粒制劑可克服傳統化療，放療治療肝癌毒副作用大的缺點，并有望使基因治療走向簡便，臨床化的道路，具有廣闊的應用前景。本發明的測定和實驗如下納米粒粒徑的測定取適量目標物加適量生理鹽水溶散后，取此膠體溶液滴至專用銅網上，2.0％磷鎢酸染色，在透射電子顯微鏡下觀察粒子的大小和形態，另取適量以激光粒度分析儀測定粒徑及分布。納米粒形態的電鏡圖見附圖2。納米粒中DNA的包封率測定取膠體溶液，45000r.min-1(4℃)條件下離心1小時，精取上清液1ml于比色杯中，加入2ml溴化乙錠分析液，于熒光分光光度計上測定熒光強度，用標準曲線方程計算上清液中DNA的濃度，按下式計算包封率包封率(％)＝[(xt-xc)/xt]×100％，其中xt為未經包封前DNA的總濃度，xc為上清液中DNA的濃度。質粒DNA制成NP后抗核酸酶能力的考察將超速冷凍離心后的NP沉淀四份分別用適量含50mM Tris-HCl(pH8.0)，10mM MgCl2及50mM NaCl((包含0.1個單位的核酸酶)的混合溶液重新分散，于37℃分別振蕩1、4、8、16h后離心，沉淀用二氯甲烷溶解后，用等量的PBS旋渦混合10分鐘后，離心(15000r/min)15分鐘，取上清液加入等量冰冷的異丙醇，混勻，離心，傾去上清液，用70％乙醇洗滌三次，用少量PBS液(pH7.4)溶解后作凝膠電泳，觀察質粒DNA降解情況，并與裸DNA進行比較。NP可使所載質粒DNA具有抵抗核酸酶酶降解的能力。NP中的DNA在37℃，核酸酶存在下振蕩16小時，仍然保持結構的完整，而裸DNA在同樣條件下1小時已被完全降解(見附圖3)。質粒DNA制成NP后抗超聲能力的考察將超速冷凍離心后的NP沉淀兩份分別用適量PBS液(pH7.4)分散，分別超聲10s后，離心，同上提取沉淀中的DNA作凝膠電泳，觀察質粒DNA降解情況并與裸DNA進行比較。NP使所載質粒DNA具有一定抵抗超聲剪切的能力。NP中的DNA在100w功率下分別超聲10s后仍能保持結構的完整，而裸DNA在同樣條件下已降解(見附圖3)小鼠體內分布實驗將重組質粒用32P標記后，用PLGA包裹制成納米粒，將此納米粒和未用納米粒包裹的32P標記的重組質粒分別注入各組小鼠靜脈，定時處死小鼠，解剖并完整收集各臟器，測定各臟器中的放射量，計算其占各器官和血液總放射量的百分率，結果見表1，表2。結果表明重組質粒制成納米粒制劑后，具有明顯的旰靶向性。
表132P-PEGFP-ATK的小鼠體內分布實驗結果(n＝3，％)時間心肝脾肺 腎 血5min 3.14 36.67 3.56 16.3223.5216.7915min 3.15 41.26 5.25 14.1620.6115.5730min 6.94 58.59 10.46 7.95 13.102.951h 6.11 54.62 14.85 7.82 13.503.102h 3.56 50.34 14.46 9.65 14.037.966h 4.12 48.66 13.15 9.66 15.269.1512h5.48 44.52 11.32 12.3621.834.4924h3.93 43.31 12.48 10.1225.015.1648h3.43 36.75 11.56 13.3628.526.38表232P-PEGFP-ATK-NP的小鼠體內分布實驗結果(％)時間 心 肝脾肺 腎 血5min 2.22 57.32 2.96 8.29 16.5812.6315min 3.52 69.69 3.19 5.77 13.873.9630min 2.38 73.37 7.55 3.64 11.281.781h 2.38 80.14 3.37 3.08 9.56 1.472h 2.24 78.45 3.73 5.35 8.24 1.996h 3.18 75.03 7.38 3.74 9.61 1.0612h2.21 69.34 6.17 7.88 10.174.2224h1.94 65.59 6.46 7.95 12.105.9648h2.21 60.18 7.01 10.2713.876.4
圖1為本發明的凍干針劑的電鏡顯示圖。
圖2為重組PEGFP-ATK質粒限制酶分析圖。
圖3為本發明經DNaseI和超聲處理后的電泳圖。
圖4為本發明的粒度分析圖之一。
圖5為本發明的粒度分析圖之二。
圖6為本發明的粒度分析圖之三。
具體實施例方式實施例1 取50-200mg的聚丙交酯乙交酯(75∶25，分子量3萬)[poly(D，L-Lactic-co-glycolic acid)，PLGA]，吐溫80 10-100mg，加1-5ml二氯甲烷溶解，加入50-200mg重組質粒，用探頭式超聲儀超聲3-7秒，加入2-10ml3-9％聚乙烯醇(內含CaCl20.5-1.5％)，再超聲3-7秒，所得溶液再轉移到含3-10ml的3-9％聚乙烯醇(內含CaCl20.5-1.5％)的溶液中，室溫下攪拌4-6小時，加入1-5％的乳糖，冷凍干燥。所制得的納米粒粒徑分布圖見附圖4，包封率94.5％。
實施例2 取50-200mg的聚乙二醇-聚丙交酯嵌段共聚物(PELA)，吐溫80 10-100mg，加1-5ml二氯甲烷溶解，加入50-200mg重組質粒，用探頭式超聲儀超聲3-7秒，加入2-10ml 3-9％聚乙烯醇(內含CaCl20.5-1.5％)，再超聲3-7秒，所得溶液再轉移到含3-10ml的3-9％聚乙烯醇(內含CaCl20.5-1.5％)的溶液中，室溫下攪拌4-6小時，加入1-5％的乳糖，冷凍干燥。所制得的納米粒粒徑分布圖見附圖5，包封率93.3％實施例3 取50-200mg的聚丙交酯乙交酯(50∶50，分子量8100)，吐溫8010-100mg，加1-5ml二氯甲烷溶解，加入50-200mg重組質粒，旋渦混合2-4分鐘，加入2-10ml 3-9％聚乙烯醇(內含CaCl20.5-1.5％)，再次旋渦混合1-3分鐘，所得溶液再轉移到含3-10ml的3-9％聚乙烯醇(內含CaCl20.5-1.5％)的溶液中，室溫下攪拌4-6小時，加入1-5％的乳糖，冷凍干燥。所制得的納米粒粒徑分布圖見附圖6，包封率92.6％。
本例中二氯甲烷可用三氯甲烷代替。
權利要求
1.一種肝靶向重組pEGFP-ATK質粒納米粒制劑，其特征在于以質粒pUC-AFPlb，pEGFP和PNGVL-TK為原料，先用常規法大抽三種質粒，然后分別用限制性內切酶HindIII和EcoRI消化PUC-AFPlb分離純化得800bp的AFP-Alb增強子-啟動子片段，用限制性內切酶HindIII-SmaI消化PNGVL-TK，分離純化得1125bp的TK片段，用限制性內切酶HindIII-SmaI消化真核表達載體pEGFP，分離純化得線性化載體片段，然后將該消化載體片段與AFP-Alb啟動子片段進行5′端定向連接，酚抽提，乙醇沉淀后再用此連接產物與HindIII-SmaI消化TK片段進行3′端定向連接，再次酚抽提，純化，然后用綠豆芽核酸酶MB處理5′突出端后，再進行平端連接，得重組質粒，將聚酯載體，吐溫80用有機溶劑溶解，再加入上述重組質粒，勻化后加入聚乙烯醇溶液，再次勻化，所得產物攪拌后冷凍干燥而制成。
2.根據權利要求1所述的納米粒制劑，其特征在于質粒pUC-AFPlb，pEGFP和pNGVL-TK＝1∶1∶1分子比。
3.根據權利要求1所述的納米粒制劑，其特征在于勻化用旋渦混合器或探頭超聲儀或細胞粉碎機，攪拌用攪拌器。
4.根據權利要求1所述的納米粒制劑，其特征在于聚酯載體為50～200毫克，吐溫為10～100毫克，有機溶劑為1～5毫升，重組質粒為50～200毫克，聚乙烯醇溶液濃度為3～9％。
5.根據權利要求1所述的納米粒制劑，其特征在于聚乙烯醇溶液中溶解了二氯化鈣，二氯化鈣的溶解濃度為0.5～1.5％。
6.根據權利要求1所述的納米粒制劑，，其特征在于用探頭式超聲儀或細胞粉碎機勻化，第一次勻化時再為3～7秒，第2次勻化時間為3～7秒，所得產物用磁力攪拌器攪拌4-6小時。
7.根據權利要求1所述的納米粒制劑，其特征在于用旋渦混合器勻化，第一次勻化時間為2-4分鐘，第二次勻化時間為1-3分鐘，所得產物用磁力攪拌器攪拌4-6小時。
全文摘要
本發明為肝靶向重組p
文檔編號A61K48/00GK1338311SQ0112891
公開日2002年3月6日 申請日期2001年9月29日 優先權日2001年9月29日
發明者張志榮, 何勤, 劉戟 申請人:四川大學華西藥學院