專利名稱：治療腦血栓的針劑及其制法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有生物活性物質(zhì)，用于治療腦血栓的溶栓針劑及其制備方法。
背景技術(shù)：
隨著社會(huì)的進(jìn)步，生活水平的提高，社會(huì)上得血栓病的患者也越來越多，并且越趨于年輕化。國內(nèi)外出現(xiàn)的幾種治療血栓病的藥物都不十分理想。如丹參注射液，其主要成份是丹參，治高血脂有效率為80％，價(jià)格便宜，但效果不顯著。東菱克栓酶治腦血栓，有效率90％，但價(jià)格高400元/支，效果好，不能長期使用。消栓通絡(luò)片主要成份為川芎、丹參、黃芪等，起活血化瘀，溫經(jīng)通絡(luò)作用，治療效果不好。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是針對(duì)治療腦血栓病人而提出的一種含生物活性物質(zhì)具有溶栓、抗凝、抗血小板聚集，改善微循環(huán)的治療腦血栓的針劑及其制法。
治療腦血栓的針劑的制備方法為分兩次層析和包裝工藝。
第一步G75層析柱層析，經(jīng)0.15～0.3M NaOH處理后裝柱，用0.15～0.3M磷酸鹽緩沖液平衡PH6.8，取蝮蛇毒溶于0.15～0.3M磷酸鹽緩沖液中，離心上樣，上柱，以0.01～0.03M磷酸鹽緩沖液洗脫，用分部收集器收集，收集酶活峰，濃縮凍干。
第二步Sephadex-A25層析柱層析，用0.01M Tris-HCl緩沖液，PH7.0浸泡凝膠，然后裝入柱中，用0.01 M Tris-HCl緩沖液平衡。將第一步層析的樣品溶于0.01M Tris-HCl緩沖液中上柱，緩沖液平衡，用0.01M NaCl的緩沖液洗去雜蛋白，換0.45～0.8M NaCl的緩沖液洗脫，收集酶活峰，濃縮凍干，得干粉。
第三步取上述干粉，分瓶包裝得粉針劑。取上述干粉加生理鹽水，以0.22μm微孔濾膜過濾，以1ml/支灌封于1ml安瓶中得水針劑。
經(jīng)上述的方法制備的治療腦血栓的針劑含有精氨酸脂酶活性成份，凝血酶、激肽釋放酶與神經(jīng)生長因子，其中精氨酸脂酶活性成份占總重量不低于70％。
鑒別方法取本品5ml于試管中，加0.4mol/l碳酸鈉溶液1ml，再加磷鎢酸鉬-硫酸鋰試液1ml，置水浴中加熱，溶液應(yīng)呈藍(lán)色。
檢查結(jié)果酸堿度，取本品依法檢查，中國醫(yī)典90版二部附錄44，PH值應(yīng)為6.0-7.5。
熱原，取本品4支加滅菌生理鹽水96ml，按每公斤家兔靜脈注射10ml的劑量，應(yīng)符合規(guī)定。
無菌，按無菌檢查，中國醫(yī)典90版二部附錄169，應(yīng)符合規(guī)定。
活性測定方法采取TAME法，①取試管六支，編號(hào)后依次加入TAME標(biāo)準(zhǔn)溶液0ml，0.2ml，0.4ml，0.6ml，0.8ml，1.0ml，再依次加入Tris-NaCl緩沖溶液2ml，1.8ml，1.6ml，1.4ml，1.2ml，1.0ml，使總體積為2ml，置37℃水浴中保溫15分鐘，各加堿性羥胺液2.0ml，繼續(xù)保溫20分鐘，混勻，按分光度法，在500nm波長處于15-30分鐘內(nèi)測定吸收度A，以TAME濃度為橫座標(biāo)，以A值為縱座標(biāo)，繪制A-C曲線，得出回歸方程。②取本品10支，加入少量Tris-HCl緩沖液溶解，定量轉(zhuǎn)移至10ml容量瓶中。取供試品溶液0.5毫升加Tris-HCl緩沖液0.5ml，加TAME標(biāo)準(zhǔn)液1.0ml，混勻，在另一支試管中加供試品溶液0.5ml，Tris-HCl緩沖液1.5ml，做空白，照標(biāo)準(zhǔn)曲線測定A值，供試品的A值減空白A值后從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得供試品溶液剩余TAME的微克分子數(shù)(X)，按(5－X)×15×0.5＝酶活力單位(U)算出，用得到的酶活除以標(biāo)示量0.5u，即為標(biāo)示酶的含量。
本發(fā)明的有益效果是主要治療腦血栓形成各期、腦萎縮、冠心病、心機(jī)梗塞、血栓閉塞性脈管炎、血栓性靜脈炎、雷諾氏病、大動(dòng)脈炎、高粘血癥等血管血栓性疾病。具有抗凝溶栓、去纖、抗血小板粘附聚集、降脂、擴(kuò)張血管、促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞恢復(fù)等多種功效，是一種預(yù)防和治療血管血栓性疾病的理想藥物。
用法與用量(1)本品每支為1ml，0.25單位。
(2)常規(guī)治療每日一次，每次4～8支，溶于生理鹽水250ml靜脈滴注，每分鐘45滴為宜。
(3)大劑量沖擊療法每日一次，每次8～10支，先將四支溶于生理鹽水10-20ml靜脈注射，再將其余四支溶于生理鹽水250ml靜脈滴注，根據(jù)病情可在2-4小時(shí)后重復(fù)注一次。搶救病例遵醫(yī)囑。
注意事項(xiàng)(1)本品系蛋白酶制劑，用藥前需作過敏試驗(yàn)，用生理鹽水將本品稀成0.001單位/ml濃度，取0.1ml作皮試，15分鐘觀察，紅暈直徑不超過1厘米或偽足不超過三個(gè)者判為陰性。試敏陰性方可使用。用藥過程中注意過敏反應(yīng)，如遇有過敏反應(yīng)時(shí)，應(yīng)給脫敏藥物治療。
(2)用藥過程中出現(xiàn)患肢無力，多眠、頭痛等癥狀無需處理，可以自行緩解。
(3)在醫(yī)師指導(dǎo)下用藥，定期檢查血小板，每周一次，如血小板降至8萬/mm3以下時(shí)需停藥，恢復(fù)后再繼續(xù)用藥。
(4)用藥三周為一療程，如需繼續(xù)用藥應(yīng)間隔一周左右為宜，或根據(jù)病情連續(xù)給藥。
禁忌癥出凝血機(jī)理障礙，低纖維蛋白血癥，腦出血二周內(nèi)者，活動(dòng)性肺結(jié)核和潰瘍病，重癥高血壓，亞急性細(xì)菌性心內(nèi)膜炎，嚴(yán)重肝、腎功能不全者禁用，婦女月經(jīng)期慎用。
藥理學(xué)研究通過大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床實(shí)踐發(fā)現(xiàn)對(duì)心率、血壓、血流量等血液動(dòng)力學(xué)指標(biāo)的影響，均屬良性，在血液流變學(xué)方面，紅細(xì)胞壓積，血中膽固醇，甘油三脂，纖維蛋白及血小板均有明顯降低。用125碘標(biāo)記觀察其在體內(nèi)的分布，血液中濃度的變化及自體內(nèi)排泄，微量元素測定，抗栓酶抗凝及血塊溶解作用等均表明具有抗凝，溶栓，去纖，降脂，降低血液粘度，改善微循環(huán)，增加血流量，促進(jìn)冠脈血液供應(yīng)及腦和肢體血液循環(huán)的作用。
毒理學(xué)方面的研究主要包括急、慢性毒性學(xué)研究。對(duì)動(dòng)物的一般狀況，肝，腎功能以及血常規(guī)等進(jìn)行了病理，生化學(xué)觀察，證明在劑量高于成人每次用量的10-40倍情況下亦未見毒性反應(yīng)，說明按衛(wèi)生部暫定標(biāo)準(zhǔn)均屬低毒性物質(zhì)。
微核試驗(yàn)，小白鼠睪丸染色體畸變試驗(yàn)，Ames致突變試驗(yàn)均未發(fā)現(xiàn)有致突變和致畸變作用。
為證明本發(fā)明的治療效果，例舉臨床治療腦梗塞136病例觀察。
(1)臨床資料273例中男性172例，女性101例，年齡55～84歲，平均62.34±7.82歲。均於發(fā)病48h內(nèi)入院。於發(fā)病24～72h內(nèi)作頭顱CT掃描。CT掃描證實(shí)內(nèi)囊后肢梗塞者22例，內(nèi)囊前肢梗塞者36例，丘腦梗塞者12例，基底節(jié)區(qū)多發(fā)性腔隙性梗塞者12例，基底節(jié)區(qū)多發(fā)性腔隙性梗塞者25例。273例均有高血壓動(dòng)脈硬化癥；其中有糖尿病史者81例，高血脂癥123例，均無心律紊亂和心肌梗塞史。
(2)方法入院次晨及治療一個(gè)療程后次晨各抽血檢測全血比粘度、血漿比粘度、紅細(xì)胞電泳和血球壓積，血小板粘附率。
273例按病灶分布隨機(jī)配對(duì)分治療組，其中136例應(yīng)用本品治療，為治療組。同期137例應(yīng)用低分子右旋糖酐丹參注射液治療，為對(duì)照組。具體實(shí)施為治療組患者入院次日本品2.5u＋生理鹽水20ml，iv，即刻一次；然后3h，6h和12h各本品2u＋生理鹽水250ml，ivgtt一次，次日起本品2u＋生理鹽水250ml ivgtt每日一次，12天為一個(gè)療程。對(duì)照組入院次日低分子右旋糖酐500ml＋丹參注射液16ml，ivgtt每日一次，13天為一個(gè)療程。
(3)結(jié)果臨床療效按1981年全國腦血管病會(huì)議制定標(biāo)準(zhǔn)判定。治療組痊愈顯效為91.91％(125/136)；對(duì)照組為75.18％(103/137)，兩組對(duì)比男女兩組治療組較對(duì)照組顯著優(yōu)(P＜0.05)，但男女總和的比較則治療組較對(duì)照組為非常顯著優(yōu)(P＜0.01)。見表1。血液流變學(xué)兩組治療前后對(duì)比，除血小板粘附率治療后較治療前顯著下降外(P＜0.05)，余四項(xiàng)指標(biāo)均治療后較治療前有非常顯著粘度下降(P＜0.01)，治療組與對(duì)照組比較，本品在降低血球壓積和增加紅細(xì)胞電泳速度上均優(yōu)于對(duì)照組(P＜0.05)，見表2。
表1 273例急性腦梗塞療效觀察治療組對(duì)照組項(xiàng)目痊愈 顯效 好轉(zhuǎn) 無效 痊愈 顯效 好轉(zhuǎn) 無效男172 32476 1363117 2女101 28184 0191710 5男 X2＝5.47 P＜0.05P值 女 X2＝6.42 P＜0.05總體 X2＝12.69P＜0.01表2 273例急性腦梗塞血液流變學(xué)治療前后對(duì)比治療組 對(duì)照組項(xiàng)目治療前治療后P值治療前治療后P值HCT41.69±5.78 37.63±6.12 T＝5.6241.21±4.7 38.47±5.49T＝4.43P＜0.01P＜0.01全血 高切 5.34±1.01T＝5.186.38±1.32 5.64±1.21 T＝4.846.01±1.02 P＜0.01P＜0.01粘度 低切 11.73±0.89 T＝12.60 12.98±1.02 11.11±0.91T＝16.0113.15±0.97 P＜0.01P＜0.01血漿比 1.72±0.711.49±0.23T＝3.591.69±0.58 1.52±0.32 T＝3.00粘度 P＜0.01P＜0.01紅細(xì)胞 20.18±1.59 17.23±1.24 T＝17.06 21.28±1.62 18.99±1.78T＝11.14電泳S P＜0.01P＜0.01血小板 0.38±0.370.30±0.21T＝2.190.38±0.43 0.28±0.37 T＝2.06粘附率 P＜0.05P＜0.05經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)本品具有降低血漿纖維蛋白原濃度，降低血粘度70％，血膽固醇14％、甘油三脂23.8％，并使血栓素(TXB2)略有降低，PGI2升高53.8％的作用，因此在用藥10h后使栓子表面及橫切面纖維變細(xì)，變短和部分栓子斷裂，在蝮蛇毒中發(fā)現(xiàn)神經(jīng)生長因子。
為證明本發(fā)明的治療效果，例舉臨床治療冠心病心絞痛84病例觀察。
(1)研究對(duì)象分治療組和自身隨機(jī)對(duì)照組。冠心病治療組84例中男49例，女35例，年齡39～82歲，平均50.6歲，病程一年之內(nèi)19例，1～5年44例，5～10年11例，10年以上10例。發(fā)作次數(shù)每日3次以上，最多7次。其中穩(wěn)定型心絞痛45例，不穩(wěn)定性心絞痛39例。以上病例符合1979年全國冠心病防治診斷參考標(biāo)準(zhǔn)。自身對(duì)照組服消心痛50例，男39例，女11例。
(2)研究方法分本品治療冠心病心絞痛治療組，消心痛對(duì)照組。給藥方法本品治療組1.5u加入0.9％生理鹽水250ml，靜滴每分鐘30～50滴，21天為一療程。對(duì)照組給消心痛每次10mg，一日3次，4周為一療程。
(3)結(jié)果心絞痛止痛療效顯效 ％ 有效 ％ 無效％總有效率％本品 23 27.38 57 61.71 1011.9 74 88.09消心痛19 3825 506 1244 88P值 70.05心電圖療效顯效 ％ 有效 ％ 無效％總有效率％本品 16 19.04 23 27.38 4553.57 39 46.42消心痛15 30.0 7 142856.0 22 44.0P值 70.05治療前后血液流變學(xué)變化
本品治療冠心病心絞痛研究觀察，心絞痛癥狀療效為88.09％，心電圖療效46.42％，說明對(duì)冠心病心絞痛有一定療效。有一定的擴(kuò)冠和改善冠脈循環(huán)解除冠脈痙攣的作用?？蓽p少TXA2含量，增加前列腺環(huán)素，降低血中大分子物質(zhì)，降低血中纖維蛋白原含量，從而降低了血液粘稠度，減輕冠脈阻力，改善了冠脈循環(huán)。副作用除一例輕度牙齦出血外，無其它副作用，肝腎功能無變化。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1第一步G75層析柱層析，經(jīng)0.2M NaOH處理后裝柱，用0.2M磷酸氫二鈉緩沖液平衡PH6.8，取蝮蛇毒溶于0.2M磷酸氫二鈉緩沖液10ml中，離心上樣，上柱，以0.02M磷酸氫二鈉緩沖液洗脫，用分部收集器收集，收集酶活峰濃縮凍干。蝮蛇毒為江浙蝮蛇蛇毒凍干粉。
第二步Sephadex-A25層析柱層析，用0.01M Tris-HCl緩沖液，PH7.0浸泡凝膠，Tris(三羥甲基氨基甲烷)-HCl緩沖液中(三羥甲基氨基甲烷在緩沖液中的濃度為0.01M～0.05M，PH值為7.5)，Sephadex(交聯(lián)葡萄聚糖)。然后裝入柱中，用0.01 M Tris-HCl緩沖液平衡。將第一步層析的樣品溶于0.01M Tris-HCl緩沖液中上柱，緩沖液平衡，用0.01M NaCl的緩沖液洗去雜蛋白，換0.5M NaCl的緩沖液洗脫，收集酶活峰，濃縮凍干。
第三步取上述干粉，測定該干粉10.5單位/mg。分瓶包裝，得粉針劑，0.25u/支。取上述干粉，加生理鹽水，1000ml生理鹽水中加入23.8mg干粉，以0.22μm微孔濾膜過濾，以1ml/支灌封于1ml安瓶中得水針劑，0.25u/支。操作溫度10～14℃。
經(jīng)上述的方法制備的治療腦血栓的針劑含有精氨酸脂酶活性成份，凝血酶、激肽釋放酶與神經(jīng)生長因子，其中精氨酸脂酶活性成份占總重量的70％。
實(shí)施例2第一步G75柱層析，經(jīng)0.15MNaOH處理后裝柱，用0.15M磷酸二氫鈉緩沖液平衡PH6.8，取蝮蛇毒溶于10ml上述緩沖液中，離心上樣，上柱，以0.01M磷酸二氫鈉緩沖液洗脫，用分部收集器收集，收集酶活峰濃縮凍干。
第二步Sephadex-A25層析柱層析，用0.01M Tris-HCl緩沖液，PH7.0浸泡凝膠，然后裝入柱中，用0.01M Tris-HCl緩沖液平衡。將第一步層析的樣品溶于0.01M Tris-HCl緩沖液中上柱，緩沖液平衡，用0.01M NaCl的緩沖液洗去雜蛋白，換0.45M NaCl的緩沖液洗脫，收集酶活峰，濃縮凍干。第三步同實(shí)施例1，包裝得粉針劑或水針劑。
經(jīng)上述的方法制備的治療腦血栓的針劑含有精氨酸脂酶活性成份，凝血酶、激肽釋放酶與神經(jīng)生長因子，其中精氨酸脂酶活性成份占總重量的71％。
實(shí)施例3第一步G75柱層析，經(jīng)0.3M NaOH處理后裝柱，用0.3M磷酸氫二鈉緩沖液平衡PH6.8，取蝮蛇毒溶于10ml上述緩沖液中，離心上樣，上柱，以0.03M磷酸氫二鈉緩沖液洗脫，用分部收集器收集，收集酶活峰濃縮凍干。
第二步Sephadex-A25層析柱層析，用0.01M Tris-HCl緩沖液，PH7.0浸泡凝膠，然后裝入柱中，用0.01 M Tris-HCl緩沖液平衡。將第一步層析的樣品溶于0.01 M Tris-HCl緩沖液中上柱，緩沖液平衡，用0.01M NaCl的緩沖液洗去雜蛋白，換0.8M NaCl的緩沖液洗脫，收集酶活峰，濃縮凍干。第三步同實(shí)施例1，包裝得粉針劑或水針劑。
經(jīng)上述的方法制備的治療腦血栓的針劑含有精氨酸脂酶活性成份，凝血酶、激肽釋放酶與神經(jīng)生長因子，其中精氨酸脂酶活性成份占總重量的70.5％。
權(quán)利要求
1.治療腦血栓的針劑制法，分兩次層析和包裝工藝，其特征是第一步G75層析柱層析，取蝮蛇毒溶于0.15～0.3M磷酸鹽緩沖液中，離心上樣，上柱，以0.01～0.03M磷酸鹽緩沖液洗脫，用分部收集器收集，收集酶活峰，濃縮凍干；第二步Sephadex-A25層析柱層析，用0.01M Tris-HCl緩沖液，PH7.0浸泡凝膠，然后裝入柱中，用0.01 M Tris-HCl緩沖液平衡，將第一步層析的樣品溶于0.01M Tris-HCl緩沖液中上柱，緩沖液平衡，用0.01M NaCl的緩沖液洗去雜蛋白，換0.45～0.8M NaCl的緩沖液洗脫，收集酶活峰，濃縮凍干，得干粉。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的治療腦血栓的針劑制法，其特征是G75層析柱是經(jīng)0.15～0.3M NaOH處理后裝柱，用0.15～0.3M磷酸鹽緩沖液平衡PH6.8。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的治療腦血栓的針劑制法，其特征是磷酸鹽為磷酸氫二鈉或磷酸二氫鈉。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的治療腦血栓的針劑制法，其特征是取上述干粉，包裝得粉針劑；取上述干粉加生理鹽水，以0.22μm微孔濾膜過濾，以1ml/支灌封于1ml安瓶中得水針劑；0.25u/支。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的治療腦血栓的針劑制法，其特征是操作溫度10～14℃。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的治療腦血栓的針劑制法，其特征是原料凍干蝮蛇毒為江浙蝮蛇蛇毒凍干粉。
7.如權(quán)利要求1所述的制法治療腦血栓的針劑，其特征是含有精氨酸脂酶活性成份，凝血酶、激肽釋放酶與神經(jīng)生長因子，其中精氨酸脂酶活性成份占總重量不低于70％。
全文摘要
治療腦血栓的針劑及其制法,是針對(duì)治療腦血栓病人而提出的一種含生物活性物質(zhì)具有溶栓、抗凝、抗血小板聚集,改善微循環(huán)的治療腦血栓的針劑及其制法。制備方法為:G75層析柱層析,取蝮蛇毒溶于磷酸鹽緩沖液中,離心上樣,上柱,以磷酸鹽緩沖液洗脫,收集酶活峰,濃縮凍干。Sephadex－A25層析柱層析,用Tris－HCl緩沖液,PH7.0浸泡凝膠,然后裝入柱中,將層析的樣品溶于Tris－HCl緩沖液中上柱,用NaCl的緩沖液洗脫,收集酶活峰,濃縮凍干,得干粉。針劑含有精氨酸脂酶活性成份占總重量不低于70%。主要治療腦血栓形成各期、腦萎縮、冠心病、心機(jī)梗塞、血栓閉塞性脈管炎、血栓性靜脈炎、雷諾氏病、大動(dòng)脈炎、高粘血癥等血管血栓性疾病。
文檔編號(hào)A61K38/43GK1333057SQ0112798
公開日2002年1月30日 申請(qǐng)日期2001年7月25日 優(yōu)先權(quán)日2001年7月25日
發(fā)明者郝文學(xué) 申請(qǐng)人:郝文學(xué)