專利名稱：褐藻膠寡糖在抗衰老和抗癡呆中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種褐藻膠寡糖，特別是涉及一種褐藻膠寡糖在抗衰老和抗癡呆中的應用。
本申請人在申請號為01107952.5的中國專利中披露了一種褐藻膠寡糖的制造方法，用該方法制造出來的褐藻膠寡糖包括甘露糖醛酸寡糖(MO)和古羅糖醛酸寡糖(GO)，這些寡糖均能大規模生產，價格低。經進一步研究得知，褐藻膠寡糖具有抗衰老和預防因東莨菪堿所致癡呆的作用，而目前在治療這些疾病方面尚未見到有效的藥物。
本發明的目的是提供一種褐藻膠寡糖在抗衰老和抗癡呆中的應用，它能彌補現有技術上的上述不足。
一種褐藻膠寡糖，其特征是把它用作抗衰老和抗癡呆的藥物。
本發明的藥物能大規模生產，價格低廉，能有效地抗衰老和抗癡呆。
下面通過實施例說明本發明。
采用東莨菪堿皮下注射的方法建立抗癡呆的小鼠模型。東莨菪堿水溶液的濃度為5mg/kg，將MO和GO按1∶1和1∶5的重量比分別配制成H1和H2的混合物，并將它們分別配制成水溶液，濃度均為120mg/kg，0.4ml/只/天灌胃給藥。經檢查，連續服用上述寡糖7天后，和模型組比較，小鼠的空間學習記憶水平(Morris水迷宮實驗)提高，大腦皮層膽堿乙酰化酶(ChAT)活性提高了2.3倍，腦內抗氧化酶SOD活性提高了15％，單胺氧化酶MAO-B的活性降低到49％，NMDA受體活性降低1.17倍，這些結果表明褐藻膠寡糖可提高腦內抗氧化酶的活性，降低單胺氧化酶B的活性，促進乙酰膽堿合成，從而減少神經遞質的氧化滅活，消除自由基對神經元的損傷，具有抗衰老和抗癡呆作用。
本實施例中的褐藻膠寡糖包括甘露糖醛酸寡糖和古落糖醛酸寡糖以及它們的混合物。本發明的藥物為海洋多糖類藥物，亦簡稱海洋藥物。
下面對實驗材料和方法以及實驗結果做詳細說明。材料和方法1.實驗動物及分組選用健康昆明種雄性小鼠，體重20±1.6克，由中國軍事醫學科學院實驗動物中心提供。按隨機方法將小鼠分為六組，每組8只。第一組為對照組；第二組為單獨H1給藥組；第三組為單獨H2給藥組；第四組為東莨菪堿給藥模型組；第五組為模型加H1給藥組；第六組為模型加H2給藥組。2.給藥劑量及方法兩種藥物由青島海洋大學華海制藥廠提供。藥物為乳白色粉末，各取1.12g溶于100ml生理鹽水中。用時稀釋為11.2mg/ml，按140mg/kg，0.3ml/只/d灌胃給藥，連續7天；對照組和模型組灌服等量蒸餾水。于開始灌胃后的第八天，第四、五、六組一次性皮下注射東莨菪堿5mg/kg。3.Morris水迷宮實驗動物于造模前1天及造模后30min和24h共3次進行Morris水迷宮學習和檢測試驗。水迷宮主要由一圓柱型水池和一可移動位置的站臺組成。水池高70cm，直徑80cm，站臺直徑8cm，水池上空通過一個數字攝相機與計算機相連接。預先在水池中注入清水，水深15cm，加入炭素墨水使池水變為不透明的黑色，站臺表面為黑色，使小鼠不能看到，水面高出站臺表面0.5cm。水溫控制在22±0.5℃，在水池上標定相同一點作為每次實驗小鼠的入水點。站臺置于離入水點較遠的象限中間，實驗過程保持站臺位置不變。每次實驗以120s為限，紀錄動物從入水點到達站臺所需時間(潛伏期作為學習記憶成績，若設定時間內未找到站臺，計算機停止跟蹤，記錄時間為120s。4.酶活性檢測(1)過氧化物歧化酶(SOD)測定于行為測試后將小鼠斷頭取腦，在冰浴中迅速勻漿，4000g離心20分鐘，取3μl進行SOD活性測定。樣品中氧自由基氧化羥胺形成亞硝酸鹽，在顯色劑作用下呈現紫色。當SOD活力較高時，超氧陰離子自由基被專一性的抑制，使形成的亞硝酸鹽減少，用可見分光光度計測其吸光度，在550nm處比色測定SOD活力。
(2)膽堿乙酰化轉移酶(ChAT)活性測定采用同位素標記合成法。取腦勻漿上清20μl加入50μl反應液(含氯化膽堿10mmol/L，硫酸毒扁豆堿1mmol/L，乙二胺四乙酸10mmol/L，溶于300mmol/L PBS，pH7.4)和10μl3H-乙酰輔酶A(3H-CoA，終濃度0.1mmol/L)，于37℃反應30min后，用3ml冷的PBS(含氯化乙酰膽堿35.7mg/L)終止反應。并加入含有10mg四苯硼鈉的乙腈2ml，再加入6ml甲苯閃爍液，輕輕振搖1min，使生成的3H-Ach移向有機溶媒層，10min后在液體閃爍記數儀上測定CPM值。結果以每分鐘每毫克蛋白生成的3H-Ach的克分子數表示。
(3)單胺氧化酶B(MAO-B)活性測定取10ul腦勻漿上清加40ul PBS，10ul含同位素的底物混勻后在37℃水浴中孵育20min，用0.1ml 2mol/L的HCl終止反應，用甲苯6ml萃取反應物離心吸取上清夜4ml移入閃爍瓶，每杯加5ml甲苯閃爍液，在液體閃爍記數儀上測定cpm值。5.受體結合實驗(1)腦突觸粗膜制備大鼠斷頭取腦后以1∶20倍容積加入Tris-醋酸緩沖液(50mmol/L，pH7.4)，在冰浴中用玻璃勻漿器研磨1min，勻漿于4℃ 15000g離心30min，重復4遍，棄上清，將沉淀凍于-70℃備用，此即為腦突觸粗膜。
(2)M受體測定取100μl突觸粗膜加入M受體的配基3H-QNB(二苯羥乙酸奎寧酯)10μl(終濃度0.1nmol/L)，非特異結合管中加入0.1mmol/L阿托品，于25℃水浴振蕩孵育60min后，加入預冷的0.05M PBS 5ml，抽濾在玻璃纖維素膜上，再用15ml PBS淋洗。玻璃纖維素膜移入液閃杯中，加入含triton的甲苯閃爍液7ml，于液閃計數儀上測放射活性。
(3)NMDA受體測定取100μl突觸粗膜，加入NMDA受體的配基3H-MK801 10μl(終濃度0.5nmol/L)。非特異結合管中加入非標記的MK801，于30℃水浴振蕩孵育30min后，加入預冷的Tris-醋酸緩沖液5ml，抽濾在纖維素膜上，再用20ml緩沖液淋洗。濾膜移入液閃杯中，加入含Triton的甲苯閃爍液7ml，于液閃計數儀上測放射活性。6.蛋白測定采用Bradford法。用考馬斯亮藍G-250與蛋白質相互作用后的光吸收值測定樣品中的蛋白濃度，用牛血清白蛋白作為標準蛋白。7.統計學處理數據輸入計算機，用Microsoft公司的Excel 2000進行統計學處理，實驗結果均以“均值±標準誤”(Means±SE)表示，組間比較用Student’st檢驗。實驗結果1.水迷宮試驗結果以Morris水迷宮法檢測小鼠空間學習記憶能力。從第一次學習測試可以看到各組間尋找到站臺的潛伏期無明顯差異。但造模30min后，未注射東莨菪堿的三組小鼠中，服用H1、H2的小鼠其潛伏期)縮短到對照組的73％和72％，說明給正常小鼠單獨服用海洋藥H1、H2有增強學習記憶的作用，24h后的也看到同樣效果。但藥物對模型鼠的作用在24h后比較明顯，此時模型鼠的潛伏期最長，H1、H2給藥組分別是其81％和76％，有改善作用(表1)。
表1.海洋多糖類藥H1、H2對小鼠Morris水迷宮實驗的影響組別劑量n尋找平臺潛伏期(秒)(mg/kg) 第1次第2次 第3次對照組 等量生理鹽水8 87.1±15.4 78.5±15.8 46.3±12.3海洋多糖H1 140 8 81.9±15.5 57.3±15.2 35.0±10.3海洋多糖H2 140 8 103.9±13.2 56.4±13.6 37.9±10.9東莨菪堿(Sco) 5 8 87.9±14.0 84.3±14.0 55.5±15.0Sco+H1 5+140 8 102.5±10.7 75.8±13.1 45.0±11.9Sco+H2 5+140 8 57.4±16.1 92.0±12.8 42.4±11.52.過氧化物歧化酶(SOD)活性對照組與模型組未見明顯差異，可能與模型類型有關。但所有給予海洋藥物的小鼠SOD活性均明顯高于未給藥組。H1、H2單獨給藥與對照組比有顯著差異，p＜0.001；H2對模型組SOD有明顯增強作用，p＜0.05，H1的作用更顯著，p＜0.001。見表2。
表2.海洋多糖類藥H1、H2對小鼠腦SOD活性的影響組別 劑量(mg/kg) n SOD活性(UN/mg prot.)對照組 等量生理鹽水8 61.20±1.05海洋多糖H1 140 8 68.86±1.58 *海洋多糖H2 140 8 68.65±0.86 *東莨菪堿(Sco) 5 8 62.93±2.71Sco+H1 5+140 8 69.71±1.71 #Sco+H2 5+140 8 72.30±1.95 ##*p＜0.001，與對照組比較；#p＜0.05；##p＜0.001，與模型組比較3.膽堿乙酰轉移酶(ChAT)活性模型組ChAT活性低于對照組，但無明顯統計學意義。在給藥組，只有模型H2給藥組其ChAT活性提高了2.23倍，有極顯著性差異。其它給藥組變化不明顯，見表3。
表3.海洋多糖類藥H1、H2對小鼠腦ChAT活性的影響組別劑量(mg/kg) nChAT活性(pmol/mg prot./min)對照組 等量生理鹽水 822.72±2.29海洋多糖H1 140 818.55±0.75海洋多糖H2 140 816.88±2.04東莨菪堿(Sco) 5818.96±1.79Sco+H1 5+140818.05±1.00Sco+H2 5+140842.31±5.67##p＜0.001，與模型組比較4.單胺氧化酶B(MAOB)活性MAO-B是代謝腦內單胺類介質的氧化酶，其活性隨年齡增長而增高，是腦老化的重要指標之一。本實驗觀察到模型組小鼠腦內MAO-B高于其它任何組，但經過H1和H2給藥的兩組小鼠MAO-B活性明顯下降，均有明顯統計學差異，H1的抑制效果更強(見表4)。
表4.海洋多糖類藥H1、H2對小鼠腦MAO-B活性的影響組別劑量(mg/kg) n MAO-B活性(pmol/mg prot./min)對照組 等量生理鹽水 8 358.7±33.6海洋多糖H1 140 8 331.2±25.7海洋多糖H2 140 8 358.8±33.4東莨菪堿(Sco) 58 402.4±26.6Sco+H1 5+1408 306.8±20.5#Sco+H2 5+1408 281.2±19.9###p＜0.05；##p＜0.001，與模型組比較5.膽堿能毒蕈堿M受體結合活性模型組在經東莨菪堿5mg皮下注射后，M受體結合活性代償性增高了，對照組和H1、H2給藥組之間無明顯差異，說明兩藥物可以維持該受體在一個正常范圍內。見表5。
表5.海洋多糖類藥H1、H2對小鼠腦內膽堿能M受體結合活性的影響組別 劑量(mg/kg) n3H-QNB binding(pmol/mg prot.)對照組 等量生理鹽水 8 7.59±0.34海洋多糖H1 140 8 7.07±0.42海洋多糖H2 140 8 7.91±0.23東莨菪堿(Sco) 5 8 8.04±0.20Sco+H1 5+140 8 7.75±0.17Sco+H2 5+140 8 7.83±0.226.谷氨酸NMDA受體結合活性谷氨酸是腦內含量最高的興奮性神經傳導介質。其受體的重要亞型NMDA受體與突觸可塑性及學習記憶功能密切相關。本實驗模型鼠的該受體結合活性最低，但服用H1、H2后可見顯著提高，并具有明顯統計學意義(p＜0.05)，見表5。
表6.海洋多糖類藥H1、H2對小鼠腦內膽堿能NMDA受體結合活性的影響組別 劑量(mg/kg) n3H-MK801 binding(fmol/mg prot.)對照組 等量生理鹽水 8 289.45±19.25海洋多糖H1 140 8 287.70±20.30海洋多糖H2 140 8 307.65±10.50東莨菪堿(Sco) 5 8 252.35±16.45Sco+H1 5+140 8 292.60±21.35Sco+H2 5+140 8 294.35±11.55##p＜0.05，與模型組比
權利要求
1.一種褐藻膠寡糖，其特征是把它用作抗衰老和抗癡呆的藥物。
全文摘要
一種褐藻膠寡糖，其特征是把它用作抗衰老和抗癡呆的藥物。小鼠服藥后空間學習記憶水平提高，大腦皮層膽堿乙酰化酶活性提高2.3倍，腦內抗氧化酶SOD活性提高15％，單胺氧化酶B的活性降低到49％，NMDA受體活性降低1.17倍，結果表明褐藻膠寡糖可提高腦內抗氧化酶的活性，降低單胺氧化酶B的活性，促進乙酰膽堿合成，從而減少神經遞質的氧化滅活，消除自由基對神經元的損傷，具有抗衰老和抗癡呆作用。
文檔編號A61K31/702GK1408360SQ0112753
公開日2003年4月9日 申請日期2001年10月1日 優先權日2001年10月1日
發明者管華詩, 李桂玲, 于廣利, 蔣新 申請人:青島海洋大學