專利名稱：魚類用的虹彩病毒或鏈球菌感染癥及其并發癥的混合滅活菌苗的制作方法
技術領域：
本發明涉及有效預防已確認的，由魚類、例如鱸形目、鲀形目、鰈形目等魚類、如黃鯛、鋤齒鯛、條石鯛、斑石鯛、鱸形魚、鰤魚、紫鰤魚、黃條鰤魚、大甲鲹、鯖魚、紅鰭圓鲀魚、石斑魚、比目魚、草鮨魚等感染和引發癥的由虹彩病毒及鏈球菌產生的兩種感染癥、及這些并發癥的混合滅活菌苗，及其制造方法。
關于魚類的虹彩病毒感染癥和它的菌苗已在特開平9-176043號中詳細論述，而對于魚類的鏈球菌感染癥的預防在特開平8-231408號中作了論述。對于這些感染癥的菌苗市場上已有出售，但對兩種感染癥有效免疫原性譜廣的混合菌苗的完成還仍未知。
近10年來，伴隨著養殖業的興盛和養殖魚種的多樣化，魚類的感染癥，例如，黃鯛、鰤魚、紫鰤魚等虹彩病毒(Iridovirus)感染，由Lactococcus garvieae引發的鏈球菌感染癥、由Pasteurella piscicida引發的類結節癥，及孤菌屬感染癥等，及它們的并發癥頻頻發生。結果，越發造成經營危機，常常造成極大的損害，養殖魚的死亡和因質量不合格引發的病魚廢棄等。這樣，在與養殖業相關的產業中，至今形成一個預防魚類感染癥的最重要課題。進而，在這種狀況下，使用化學劑療法又衍生出耐藥性菌，難以對感染癥形成對策。同時，其肢體的選擇也很狹窄，由于提高了養殖費用，所以，魚類用作預防劑的菌苗越發受到重視。雖說是虹彩病毒感染癥和鏈球菌感染癥等菌苗已實際應用，但是，這些的各種菌苗免疫原性還沒有涉及到這些的并發癥。就宏觀上看，這種并發癥是降低菌苗預防效果的重要原因。因此，當今迫切的課題是，不僅僅對這些的各種感染癥，而且對于并發癥，也期望一種有效的免疫原性譜廣的菌苗，及其實用化。
該發明為解決上述課題，而提出一種對預防已確認的由魚類，例如鱸形目、鲀形目、鰈形目等魚種，如黃鯛、鋤齒鯛、條石鯛、斑石鯛、鱸形魚、鰤魚、紫鰤魚、黃條鰤魚、大甲鲹、鯖魚、紅鰭圓鲀、石斑魚、比目魚、草鮨魚等感染和引發癥的由虹彩病毒和鏈球菌引發的兩種感染癥以及這些的并發癥是有效且安全的、而且對病原體免疫原性是特異的混合滅活菌苗，及其制造方法。即，根據本發明分別提供(1)混合滅活菌苗的制造方法，其特征是將來自魚類虹彩病毒感染癥病原體的滅活抗原和來自鏈球菌感染癥病原體的滅活抗原，至少2種進行混合；和(2)一種混合滅活菌苗，通過將來自魚類虹彩病毒感染癥病原體的滅活抗原和來自鏈球菌感染癥病原體的滅活抗原，至少2種進行混合制備。
該發明可達到快速、省力地預防虹彩病毒感染癥、鏈球菌感染癥以及這兩種的并發癥，而且費用低廉。
(1)來自虹彩病毒感染癥病原體的抗原可以使用從因魚類虹彩病毒的感染而發病或死亡的魚類，例如鱸形目、鲀形目、鰈形目等魚類，如黃鯛、鋤齒鯛、條石鯛、斑石鯛、鱸形魚、鰤魚、紫鰤魚、黃條鰤、大甲鲹、鯖魚、紅鰭圓鲀、石斑魚、比目魚、草鮨魚等切割或摘取的器官，例如從脾臟、心臟、腎臟、鰓、肝臟等分離出的虹彩病毒株，例如以黃鯛虹彩病毒Ehime-1株作為病原體。作為來自這種病原體的抗原，可以使用完全病毒粒子的成病毒粒子、不完全病毒粒子、成病毒粒子構成成分和它的翻譯后修飾體、成病毒粒子構成成分MCP(majorcapsid protein)，成病毒粒子非構造蛋白和它的翻譯后修飾體，防御感染抗原、中和反應的表位等。作為大量生產抗原的虹彩病毒培養宿主可使用公知的細胞殊，例如BF-2(ATCC No.CCL58)，FHM、CHSE-214，JSKG，KRE-3，RTG-2，YTF，GF(ATCC No.CCL91)等。另外，特開平9-176043中詳細講述了對虹彩病毒感染癥的菌苗和它的制造方法。
(2)來自鏈球菌感染癥病原體的抗原作為魚類鏈球菌感染癥的病原體，現在利用DNA-DNA雜交，已知有至少以下5種，Streptococcus iniae(與S.Shiloi意義相同)，Streptococcus difficile，Lactoccus garvieae(與Enterococcus Selioricida意義相同，α溶血性鏈球菌感染癥的病原體)，Lactococcus Piscium，及Vagococus Salmoninarum(Development ofBiological Standardozation，Vol，90，pp.153-160，1997)。在本發明中，這些病原體，例如可使用NCDO 2155(ATCC No.43921)，YT-3(ATCC No.49156)，S-1477(ATCC No.49157)，α溶血性鏈球菌No.43株等。作為來自這些病原體的抗原，可使用各種表現型的全菌體，防御感染抗原、中和反應的表位等。關于表現型，例如已知Lactococus garvieae中，KG-(非凝集性，有莢膜)及KG+(凝集性，沒有莢膜)的2種表現型，作為免疫原是有用的(Diseases of AquaticOrganism，Vol.37，pp.121-126，1999)，在本發明中可將這些表現型的菌體用作抗原。將來，來自從鏈球菌感染癥的魚類分離出的病原體的抗原，也可和上述一樣使用。作為大量生產這種抗原的病原菌體培養基，可以使用培養細菌用的公知固體培養基和液體培養基，例如，瓊脂培養基、肉湯培養基等。
(3)滅活抗原的調制在本發明中，對于來自上述病原體的抗原，以滅活形抗原使用。調制滅活抗原，例如，用滅活劑對成病毒粒子和菌體等作用，使這些的感染能力失去活性。為了使抗原固定化，使其立體結構穩定化，也使用這種滅活工序。作為滅活劑，例如，將甲醛、戊二醛、β-丙內酯等，在菌苗原液的調制前或調制后添加混合后使用。使用甲醛時，其添加量約為0.0004-0.7％(V/V)，滅活溫度約為2-37℃，滅活時間約為5-180天。但是，在由滅活損害了抗原性或免疫原性時，需要想辦法緩和滅活條件。例如，通過減少滅活劑的量，添加混合中性氨基酸或堿性氨基酸等，降低滅活溫度等，達到這種緩和。在滅活工序中殘留的游離甲醛，并不需要，可以添加等量的亞硫酸氫鈉，將其中和，或利用透析將其去除。
(4)混合滅活菌苗的調制關于滅活抗原的量，例如，病原體為虹彩病毒時，用鹽類溶液或培養基等，例如，Dulbecco的PBS(phosphate-bufferedSaline)，BME(Basal Medium Eagle)等，將菌苗進行稀釋，使滅活前的感染病毒量TCID50(Median Tissue Culture Infective Dose)換算成對數值log(TCID50/ml)約為4-8。病原體為Lactococcus garvieae時，將菌苗原液和上述一樣進行稀釋，使滅活前的感染菌體量CFU(Colony Forming Unit)換算成對數值log(CFU/ml)約為4-9。即，通過這種稀釋，將滅活抗原的量調整成誘導免疫所需要的量。接著，將這樣得到的滅活抗原，即，來自虹彩病毒感染癥病原體至少1種的滅活抗原和來自鏈球菌感染癥病原體至少1種的滅活抗原進行混合，調制成混合滅活菌苗。
在混合2種以上滅活抗原時，特別注意的是由這種混合引起菌苗副作用的增強或增幅，及抗原相互的干涉，例如，在混合前各種抗原中特異的抗原性和免疫原性的降低或消失，這些諸現象任何一個必須確認在混合后完全沒有。在不能確認時，其混合或組合是不適合的。在將來自虹彩感染癥和鏈球菌感染癥各種病原體的滅活抗原混合中，確保了上述的抗原性和免疫原性，而且沒有見到副作用，這樣的2種混合適于作菌苗，根據這樣的見解才完成了本發明。
進而，在菌苗調制中，也可添加混合用于增強其耐熱性的穩定化劑，和作為提高免疫原性的輔助劑的佐劑。例如，作為穩定化劑，可用糖類或氨基酸類，作為佐劑，可使用礦物油、植物油、硫酸鋁鉀、磷酸鋁、膨潤土、硅石、氨基縮二氨酸衍生物、胸腺素、中間白氨酸等。接著分別注入到適當容積，例如10-500ml的小玻璃瓶內，用塞子塞住或密封后，供作菌苗使用。這種菌苗，不僅以液狀使用，也可分注后進行冷凍干燥，作為干燥制劑使用。干燥制劑，在使用前，用添加滅菌液將干燥物質完全溶解后再用。
調制的菌苗制劑，在使用或向市場出售之前，為保證其質量，必須進行安全性和有效性的檢定。有關檢定的各種試驗，可按照藥事法(昭和35年法律第145號)「動物用生物學的制劑基準」中規定的「黃鯛虹彩病毒感染癥滅活菌苗」，「鰤魚α溶血性鏈球菌癥滅活經口菌苗」等「動物用生物學的制劑檢定基準」進行檢定。
(5)混合滅活菌苗的用法可用具有感染危險性的任意年齡的魚類。但是，從養魚保方的角度考慮，最好使用小魚或魚菌。作為使用方法，例如可采用腹腔內，筋肉內、或皮下接種，浸漬法，經口服用等，在利用接種免疫中，每1個劑量的菌苗，最好使用0.05-1.0ml，在利用浸漬免疫中，可用飼育水或低注飼育水將菌苗稀釋10-10000倍后再用，該菌苗在冷凍或冷溫下，約2-8℃的冷暗處保存。
本發明的混合滅活菌苗對于同時免疫魚類的虹彩病毒感染癥和鏈球菌感染癥二者或預防它們的并發癥極為有效。
以下利用參考例和實施例具體地說明本發明的形態及構成和效果。但是，本發明不限于這些例證。
參考例1虹彩病毒的大量生產將黃鯛虹彩病毒Ehime-1/GF14株用作種子，大量生產虹彩病毒(菌苗用抗原)。
將BME(Basal Medium Eagle)用作培養基，對在5個1升容積瓶內培養的GF細胞單片上接種上述種子病毒(感染多重度MOI＝0.01)，25℃下靜置培養14天，從開始培養第3天進行更換新培養基。但是，培養到第10-14天期間不再更換培養基。在第14天，CPE(Cytopathogenic effect)細胞單片約達80％，采取培養液。低速離心(3000rpm，20分鐘)后，回收上清液得到500ml病毒浮游液。
虹彩病毒量的測定對GF細胞接種培養稀釋10倍(以及10倍的倍數)的病毒浮游液。判定各稀釋點有無CPE，測定病毒感染值，log(TCID50/ml)，結果，病毒量(抗原量)為6.0。
滅活虹彩病毒抗原和菌苗原液的調制在300ml病毒浮游液中添加混合甲醛，使最終濃度為0.03％(V/V)，6℃下，進行25天滅活。滅活結束后，作為滅活菌苗原液保存在4℃的冷暗室中。
滅活菌苗原液的檢測分取100ml滅活菌苗原液，按照藥事法(昭和35年法律第145號)「動物用生物學的制劑基準」規定的「黃鯛虹彩病毒感染癥滅活菌苗」檢測基準，進行滅活試驗、染色試驗、甲醛含量試驗、無菌試驗等。結果可以確認這種菌苗原液適合于作為滅活菌苗原液。
參考例2鏈球菌的大量生產使用α溶血性鏈球菌No.43株作菌種，大量生產鏈球菌(菌苗用抗原)。
在2升容積的培養容器中，500ml的肉湯培養基(在1升中分別含有17.0g胰化胨、3.0g大豆胨，2.5g葡萄糖，2.5g磷酸氫二鉀和5.0g氯化鈉)中，植入0.5ml上述種菌后，30℃下培養24小時。
上述培養結束后，分取培養液，用Dulbecco的PBS稀釋10倍(或10倍的倍數)，將其接種到內徑6cm的瓊脂板上后，30℃下培養24小時，對生成的α溶血性菌落進行計數，并計算菌數。結果，感染菌體數(抗原量)log(CFU/ml)為8。7。對于瓊脂板，使用血液瓊脂培養基(在1升中分別含有14.5g胨，5.0g大豆胨，5.0g氯化鈉、1.5g成長因子、14.og瓊脂和50ml綿羊脫纖維血液)。
滅活鏈球菌抗原和菌苗原液的調制在300ml上述鏈球菌培養液中添加混合甲醛，使最終濃度為0.1％(V/V)，30℃下進行5天滅活。滅活結束后，作為滅活菌苗原液，保存在4℃的暗室中。
滅活菌苗原液的檢測取100ml滅活菌苗原液，按照藥事法(昭和35年法律第145號)「動物用生物學的制劑基準」中規定的「鰤魚α溶血性鏈球菌感染癥滅活經口菌苗」的檢測基準，進行滅活試驗、染色試驗、甲醛含量試驗、無菌試驗等。結果可以確認這種菌苗原液，作為滅活菌苗原液是適合的。
實施例1混合滅活菌苗的調制分別取50ml參考例1和參考例2中得到的兩種菌苗原液，將兩者混合，調制成混合滅活菌苗，將其命名為虹彩·鏈混合滅活菌苗(以下稱作「2混」)。
在上述各菌苗原液50ml中分別添加混合50ml PBS，調制成虹彩滅活菌苗(以下稱作「虹彩」)，和鏈滅活菌苗(以下稱作「鏈」)。
將這些菌苗向每個20ml容積玻璃瓶內注入10ml用塞子堵住，密封后，提供給實施例2中記載的安全性和有效性試驗，實施例3和實施例4中記載的試驗。
實施例22混的安全性和有效性為了確認實施例1中調制的2混菌苗的安全性和有效性，每次分別使用200條鰤魚(體重18.65～28.34g，體長12.0-13.3cm)和紫鰤魚(體重17.83-29.52g，體長10.6-12.5cm)。采用直接攻擊法進行試驗。即，首先，將上述兩種小魚以每試驗區25條隨意地分配到8個試驗區內后，將接種了2混菌苗的試驗區，作為它的對照比較，與接種了實施例1中調制的虹彩和鏈各菌苗的試驗區，及沒有接種菌苗的未處理試驗區進行比較。接著，在各小魚的腹腔內接種0.1ml菌苗后，在第11天，向各小魚的腹腔內接種0.1ml虹彩病毒(106T CID 50/條)或鏈球菌(106CFU/條)，進行直接攻擊，在飼育下觀察有無引發癥狀。飼育是在水溫25±1℃的隔離水槽內進行(向容積60升的水槽內裝入40升海水，以2升/分鐘向其內流入新鮮海水，并以等量排出舊海水，進行連續更換飼育海水)。結果示于表1。
本發明的虹彩·鏈混合滅活菌苗，既安全又有效，作為其效果的免疫原性是各病原體特異的。
根據下式計算出表中的RPS(relative percent Survival)RPS＝[(未處理區死亡率-接種區死亡率)/未處理區死亡率]×100表1魚名試驗區/接種菌苗 攻擊 累積死亡魚數 死亡率RPS鰤魚2混 虹彩 2/258 902混鏈 1/254 95虹彩 虹彩 1/254 95虹彩鏈22/25 88-鏈 虹彩18/25 72 14鏈鏈 0/250 100未處理 無 虹彩21/25 84-未處理 無鏈23/25 92-紫鰤魚2混 虹彩 1/254 952混鏈 0/250 100虹彩 虹彩 2/258 90虹彩鏈19/25 765鏈 虹彩21/25 84-鏈鏈 0/250 100未處理 無 虹彩20/25 80-未處理 無鏈20/25 80-實施例32混的接種部位對安全性和有效性的影響為了確認實施例1調制的2混菌苗不同的接種部位與安全性、有效性的關系，使用350條小鰤魚(體重17.28-26.54g，體長11.8-13.1cm)，進行直接攻擊試驗。將這些小魚以每試驗區25條隨意地分配在14個試驗區內后，向各小魚的腹腔內，或筋肉內接種0.1ml菌苗。對接種2混菌苗的試驗區設定時照比較，利用直接攻擊的試驗方法，和實施例2記載的一樣進行飼育觀察、及計算出RPS。
結果示于表2。本發明的虹彩·鏈混合滅活菌苗，即使采用腹腔內和筋肉內任何一種接種，都具有安全性有效性。表2接種 試驗區/接種菌苗攻擊 累積死亡魚數死亡率 RPS腹控內 2混 虹彩 1/25 4952混鏈 0/25 0 100虹彩 虹彩 2/25 891虹彩 鏈24/2596 4鏈 虹彩19/257614鏈 鏈 0/25 0 100筋肉內 2混 虹彩 0/25 0 1002混鏈 1/25 495虹彩 虹彩 1/25 495虹彩 鏈23/2592 8鏈 虹彩21/2584 8鏈 鏈 0/25 0 100未處理 無 虹彩22/2588 -無 鏈25/25 100 -實施例42混菌苗對虹彩·鏈混合感染的預防效果除以下幾點外，其他和實施例2記載的一樣。將50條小鰤魚(體重17.13-26.67g，體長11.6-13.2cm)，每區25條隨意分配到試驗區和對照比較區(未處理區)的合計2個區內后，向試驗區中的各小魚腹腔內接種0.1ml 2混菌苗，未處理區中的小魚不進行接種菌苗。混合感染的直接攻擊是在接種菌苗后的第11天，分別向小魚腹腔內接種0.1ml的虹彩病毒(106 TCID 50/條)和鏈球菌(106 CFU/條)。隨后，觀察結果是死亡率，未處理區為96％·接種菌苗的試驗區為4％，RPS為96，從而可以斷定本發明的2混對預防虹彩，鏈的混合感染是有效的。
本發明對于預防虹彩病毒感染癥，鏈球菌感染癥，及兩者的并發癥，從地理，時間觀點考慮都達到了迅速，省力的效果，而且勞力，經費等成本都很低廉。因此，在養殖業及其相關產業中，提高了生產率和質量，并大大改善了養殖中的環境衛生，同時也給這些產業帶來了福音。
權利要求
1.一種混合滅活菌苗的制造方法，其特征是將來自魚類虹彩病毒感染癥病原體的滅活抗原和來自鏈球菌感染癥病原體的滅活抗原，至少2種進行混合。
2.一種混合滅活菌苗，其特征是將來自魚類虹彩病毒感染癥病原體的滅活抗原和來自鏈球菌感染癥病原體的滅活抗原，至少2種進行混合調制而成。
全文摘要
伴隨著養殖魚種的多樣化,魚類頻頻發生各種感染癥及其并發癥,由于頻繁使用化學劑療法,從而出現了耐藥劑性病菌,導致養殖魚的質量降低,因死魚、病魚的大量廢棄,導致生產成本的增高,作為這種感染癥的對策,至今仍是養殖業中的最重要課題。本發明提供一種能有效安全預防魚類的虹彩感染癥和鏈球菌感染癥,及其兩者并發癥的混合滅活菌苗,及其制造方法。根據本發明,可預防上述兩種感染癥及其并發癥,從地理、時間觀點考慮,也極為迅速省力,而且獲得降低勞力、成本的效果,費用低廉。
文檔編號A61P31/04GK1345603SQ0112218
公開日2002年4月24日 申請日期2001年4月18日 優先權日2000年4月18日
發明者真鍋貞夫, 通山哲郎, 青井由美子 申請人:財團法人阪大微生物病研究會