專利名稱：組織工程用復合結構細胞支架及其制法和用途的制作方法
組織工程的核心是構建由細胞與生物材料結合而成的復合體。組織工程中，組織細胞依附于由生物材料所制備、與所需修復的組織或器官具有相同形狀的支架上，在先經過體外培養擴增后、再植入體內的病損部位，使之最終達到修復重建組織或器官、恢復功能目的。因此，細胞、生物材料所構成的細胞支架，以及組織和器官的形成和再生是組織工程的三大要素。組織工程的三維多孔細胞支架不但起著決定新生組織、器官形狀大小的作用，更重要的是為細胞增殖起著提供營養、進行氣體交換、排除廢物，為細胞增殖、繁衍提供場所的重要作用，因此組織工程的細胞支架必須滿足一定的要求由于細胞支架在組織工程中起著為細胞增殖營造環境的作用，因此它必須隨著細胞在支架上的繁殖和生長而逐漸消失，從而將空間讓給細胞，使最終生成的組織和器官具有同支架相同的形狀和大小。由此細胞支架不但必須具有對細胞良好的親和性和特定的三維形態結構，使細胞能在其上生長和繁殖；同時必須具有生物降解性，保證在生理和機體的環境下支架材料能自動降解、由大分子變成小分子，并最終被機體代謝或吸收。為了保證細胞的生長繁殖不受支架存在的影響，還要求細胞支架的降解速度能同細胞的增殖速度相匹配、并且其降解產物不會對細胞的生長和繁殖產生不利的影響。
從臨床實用要求考慮，細胞支架還必須能夠耐受消毒滅菌的操作，要保證在消毒滅菌、細胞培養和手術操作中能保持原有的形狀和結構；并且具有一定的柔韌性、能同機體組織相縫合和能同機體組織相貼合，能經受手術操作而不破碎、并不對機體組織造成機械損傷的力學性能。因此作為組織工程的細胞支架必須同時滿足生物相容性、細胞親和性、生物降解性、可消毒性，以及力學性能和形態結構等性能要求。
由于不同組織和器官的細胞不但在形狀和大小上不同，在細胞生長時的取向及結構密度上也不甚相同，細胞支架必須具有與所培養的組織細胞要求相一致的三維形態結構。此外，由于如皮膚組織工程、血管組織工程、關節組織工程、食道組織工程、氣管組織工程等多種細胞的組織工程必須在細胞支架上同時培養兩種細胞，細胞支架必須同時滿足這兩種大小和生長繁殖速度相同或不同細胞的要求。因此根據組織和器官的不同以及所培養的兩種細胞種類的不同，細胞支架必須在力學性能、降解速度和三維形態結構上同時滿足這兩種細胞生長繁殖的要求，即根據具體的組織工程對象，用相同或不同的材料、制備呈相同或不同三維形態結構、且兩種結構的孔間是互相相通或是互相不通的復合結構細胞支架來與此相適應。
然而，如今的細胞支架都只是由同一種材料所制備、呈單一三維形態結構的細胞支架，例如由天然高分子材料甲殼素、殼聚糖、海藻酸鹽、膠原蛋白、葡聚糖、透明質酸、明膠和瓊脂所制備的細胞支架、由天然無機材料羥基磷灰石、磷酸鈣和珊瑚礁所制備的細胞支架，以及由合成高分子材料脂肪族聚酯、聚酸酐、聚膦腈、聚原酸酯和聚醚制備的細胞支架(王身國等，中國創傷骨科雜志，2000，16(6)328-330.)；王身國等，中國發明專利99105984.0)；王身國等，中國發明專利ZL 92 1 13100.3；王身國等，中國發明專利98102212.X)。這樣的細胞支架雖然各有不同的力學性能、降解速度和三維形態結構，可以適用于骨、軟骨等不同組織工程的要求，但是由于它們的力學性能、降解速度和三維形態結構都很單一，因此只適用于作為單一細胞組織工程的細胞支架，而不能適用于作為多種細胞組織工程的細胞支架。
本發明的目的在于提供一種適用于作為多種細胞組織工程細胞支架的復合結構細胞支架。
本發明的另一目的在于提供一種適用于作為多種細胞組織工程細胞支架的復合結構細胞支架的制法。
本發明的目的還在于提供一種適用于作為多種細胞組織工程細胞支架的復合結構細胞支架的用途。
本發明提出了一種適用于作為多種細胞組織工程細胞支架的復合結構細胞支架，其結構如下(1)由結構1和結構2兩部分組成，結構1和結構2直接相接、結構1和結構2的孔互相相通；或(2)由結構1和結構2及兩者間的一層由材料3所構成的致密層組成，使結構1和結構2的孔互不相通；其中構成結構1的材料1和構成結構2的材料2可以是降解速度和力學性能相同的同一材料，也可以是降解速度和力學性能不同的兩種材料；結構1和結構2可以是呈相同的三維形態結構(孔徑、孔隙率和孔形態結構)，也可以呈不同的三維形態結構，其中一種結構的孔徑可以在5納米～600微米范圍、孔隙率在30～95％范圍，另一種結構的孔徑也可以在5納米～600微米范圍、孔隙率在30～95％范圍，兩個結構的厚度都在0.2～10mm范圍；兩種結構可以是相同的開放孔結構，也可以是不同的開放孔結構。由材料3所構成的致密層厚度在0.05～1.0mm范圍。本發明中結構1、結構2和材料3可以由相同材料構成，也可以由不同材料構成。三種材料的降解速度都在3天到3年的范圍；本發明結構1所使用的材料1和結構2所使用的材料2可以分別是由天然高分子材料甲殼素、殼聚糖、海藻酸鹽、膠原蛋白、葡聚糖、透明質酸、明膠和瓊脂，或天然無機材料羥基磷灰石、磷酸鈣和珊瑚礁，或合成高分子材料脂肪族聚酯、聚酸酐、聚膦腈、聚原酸酯和聚醚中的一種或它們間的共混物，也可以都由合成高分子材料組成。其中合成高分子材料中以脂肪族聚酯為主，其中有聚L-乳酸(PLLA)、聚DL-乳酸(PDLLA)、共聚(L-乳酸/DL-乳酸)(PLLA-co-PDLLA)、聚乙醇酸(PGA)、共聚(乳酸/乙醇酸)二元共聚物(PLGA)、共聚(乳酸/己內酯)二元共聚物(PLC)、聚己內酯(PCL)、共聚(乙醇酸/乳酸/己內酯)三元共聚物(PLGC)、聚己內酯/聚醚嵌段共聚物(PCE)、聚己內酯/聚醚/聚乳酸三元共聚物(PCEL)、聚乳酸/聚醚二元共聚物(PLE)，以及其它聚羥基酸(PHA)中的一種或它們間的共混物。
所述材料3可以是天然高分子材料甲殼素、殼聚糖、海藻酸鹽、膠原蛋白、葡聚糖、透明質酸、明膠和瓊脂，或合成高分子材料脂肪族聚酯中的聚L-乳酸(PLLA)、聚DL-乳酸(PDLLA)、共聚(L-乳酸/DL-乳酸)(PLLA-co-PDLLA)、聚乙醇酸(PGA)、共聚(乳酸/乙醇酸)二元共聚物(PLGA)、共聚(乳酸/己內酯)二元共聚物(PLC)、聚己內酯(PCL)、共聚(乙醇酸/乳酸/己內酯)三元共聚物(PLGC)、聚己內酯/聚醚嵌段共聚物(PCE)、聚己內酯/聚醚/聚乳酸三元共聚物(PCEL)、聚乳酸/聚醚二元共聚物(PLE)，以及其它聚羥基酸(PHA)中的一種或它們間的共混物。
本發明所制備的復合結構細胞支架可以呈棒狀、板狀、膜狀、管狀或特定的形狀。
本發明中結構1或結構2的三維形態結構可以是天然無機材料的結構，也可以由通常的冷凍干燥法、溶液澆鑄法、熱塑成型法、模壓成型法、控制蒸發法、激光刻蝕法、噴射冷凍法、機械加工法、纖維編織法(D.W.Hatmacher等，Biomaterials，2000，212529-2543)中的一種或兩種方法制得。
本發明中結構1、結構2和材料3之間可以采用通常的粘合法、熔合法或壓合法接合。
采用溶液澆鑄法制備本發明復合結構細胞支架的具體方法是材料1和材料2各1～50份溶于各自的溶劑，所述溶劑為二氯甲烷、二氯乙烷、三氯甲烷、四氫呋喃、二氧六環或蒸餾水、稀酸、稀堿溶液，配成1～20％的溶液后，分別以0.5g/1.0g～1.0g/20.0g的比例同5～300目的鹽粒混合均勻，再分別澆鑄于模具中。揮發溶劑5～72小時后再真空干燥12～72小時，然后把所得到的含鹽材料1和材料2塊浸入去離子水中脫鹽，每1～10小時換一次水，直至洗滌液中檢測不到鹽的殘留離子為止，把脫了鹽的材料1和材料2多孔支架在空氣中干燥5～72小時，制得材料1和材料2多孔支架。當材料1和材料2的一種或兩種是天然無機材料時，可不進行以上的處理而直接使用。
把材料1和材料2多孔支架用0.5～10％的材料3的溶液粘合，再真空干燥12～72小時，得到材料1和材料2平均孔徑為5納米～600微米范圍、孔隙率在30～95％范圍，材料1和材料2厚度在0.2～10mm范圍，材料3的厚度在厚度在0.05～1.0mm范圍、由材料1、材料2和材料3三層組成的復合結構細胞支架。
將上述制得的脫了鹽的材料1和材料2多孔支架的一個面涂以極少量的共溶劑后立即直接接合，所述共溶劑為二氯甲烷、二氯乙烷、三氯甲烷、四氫呋喃、二氧六環或蒸餾水、稀酸、稀堿溶液，再真空干燥12～72小時；或材料1和材料2多孔支架的一個面與溫度為55～200℃的熱板接觸后再立即壓合；或將材料1和材料2多孔支架面面相對加壓12～72小時，則得到只由材料1和材料2兩層組成的復合結構細胞支架。
用本發明所制備的復合結構細胞支架適宜于作為皮膚、血管、骨/軟骨、食道、氣管等多種細胞組織工程的細胞支架，用于進行皮膚、血管、臏骨、食道、氣管等組織和器官的修復和構建。
圖1為本發明的組織工程用復合結構細胞支架結構示意圖。
1為結構1，2為結構2，3為材料3。
下面結合實施例對本發明做進一步詳細的描述。
實施例1把共聚(乳酸/乙醇酸)(70/30)(PLGA730)(分子量5萬)和聚DL-乳酸(PDLLA)(分子量4萬)各5份溶于二氯甲烷中后，分別以1.0g/1.0g和1.0g/10.0g的比例同40-60目的鹽粒混合均勻，再分別澆鑄于模具中。揮發溶劑24小時并真空干燥24小時，然后把所得到的含鹽PLGA/NaCl和PDLLA/NaCl塊浸入去離子水中脫鹽，每4小時換一次水，直至洗滌液中檢測不到氯離子為止。把脫了鹽的PLGA和PDLLA多孔支架在空氣中干燥24小時后用5％的PLGA二氯甲烷粘合，再真空干燥48小時，得到PDLLA層平均孔徑為200微米、孔隙率為90％，PLGA層平均孔徑為30微米、孔隙率為80％，兩層的孔互不相通的PLGA/PDLLA復合結構細胞支架。
實施例2把共聚(乳酸/乙醇酸)(85/15)(PLGA8515)(分子量6萬)各5份溶于二氯甲烷中后以1.0g/10.0g的比例分別同20-40目及120目的鹽粒混合均勻，分別澆鑄于模具中后揮發溶劑24小時并真空干燥24小時，然后把所得到的兩種含鹽PLGA/NaCl塊浸入去離子水中脫鹽，每4小時換一次水，直至洗滌液中檢測不到氯離子為止。把脫了鹽的PLGA多孔支架在空氣中干燥24小時后用含1％PLGA8515的二氯甲烷溶液粘合，再真空干燥48小時，得到平均孔徑分別為200微米和500微米、孔隙率都約為90％、兩層間的孔相互構通的PLGA復合結構細胞支架。
實施例3把共聚(乳酸/己內酯)(90/10)二元共聚物(PLC910)(分子量～5萬)5份溶于二氯甲烷中后以1.0g/10.0g的比例同60-80目的鹽粒混合均勻，同上方法澆鑄于模具中后揮發溶劑并脫去鹽分，得到平均孔徑為200微米、孔隙率約為90％的PLC910支架。再取天然無機材料羥基磷灰石，切成2毫米厚的片后，涂復一層含5％的PLC910二氯甲烷溶液后迅速覆蓋在上述的PLC910支架上，真空干燥48小時后，得到兩層間的孔互不相通的羥基磷灰石/PLC復合結構細胞支架。
實施例4同實施例3方法，但采用5份共聚(乙醇酸/乳酸/己內酯)三元共聚物(PLGC)為材料，在溶于二氯甲烷中后以1.0g/10.0g的比例同60-80目的鹽粒混合均勻后再澆鑄于模具中后揮發溶劑并脫去鹽分，得到平均孔徑為180微米、孔隙率約為90％的PLGC支架。再用含5％的PLA二氯甲烷溶液同由冷凍干燥法所制得的孔徑為80微米的殼聚糖支架粘合，真空干燥48小時后，得到兩層間的孔互不相通的殼聚糖/PLGC復合結構細胞支架。
實施例5同實施例3方法，但采用5份聚己內酯/聚醚/聚乳酸三元共聚物(PCEL)為材料，在溶于二氯甲烷中后以1.0g/5.0g的比例同120目的鹽粒混合均勻后再澆鑄于模具中后揮發溶劑并脫去鹽分，得到平均孔徑為80微米、孔隙率約為85％的PCEL支架。再用含1％的PLA二氯甲烷溶液同由冷凍干燥法所制得的孔徑為80微米的藻酸鹽支架粘合，真空干燥48小時后，得到兩層孔徑陽同、兩層間的孔又互相構通的殼聚糖/PLGC復合結構細胞支架。
實施例6將由實施例1所得到的PLGA/PDLLA復合結構細胞支架用于皮膚組織工程，其中孔小的PLGA支架部分用于表皮細胞培養、孔大的PDLLA支架部分用于成纖維細胞的培養，結果表明兩部分細胞互不接觸、都生長繁殖良好，并有膠原基質分泌。
實施例7將由實施例3所得到的羥基磷灰石/PLC復合結構細胞支架用于臏骨修復，其中羥基磷灰石支架部分用于骨細胞培養、PLC支架部分用于關節軟骨培養，結果表明兩部分的細胞都生長繁殖良好，并有膠原基質分泌。
對照例1將按實施例1所制備的脫了鹽的PLGA和PDLLA多孔支架用1％的PLGA二氯甲烷粘合，再真空干燥48小時，得到PDLLA層平均孔徑為200微米、孔隙率為90％，PLGA層平均孔徑為30微米、孔隙率為80％，兩層間的孔相互通達的PLGA/PDLLA復合結構細胞支架。然后用于皮膚組織工程，其中孔小的PLGA支架部分用于表皮細胞培養、孔大的PDLLA支架部分用于成纖維細胞的培養，結果表明由于兩層結構的孔互相通透，使表皮細胞的生長受到成纖維細胞生長的抑制，生長繁衍不正常。
對照例2把共聚(乳酸/乙醇酸)(70/30)(PLGA730)(分子量5萬)和聚乳酸(PLLA)(分子量4萬)各5份溶于二氯甲烷中后，都以1.0g/10.0g的比例同40-60目的鹽粒混合均勻，再分別澆鑄于模具中。揮發溶劑24小時并真空干燥24小時，然后把所得到的含鹽PLGA/NaCl和PLLA/NaCl塊浸入去離子水中脫鹽，每4小時換一次水，直至洗滌液中檢測不到氯離子為止。把脫了鹽的PLGA和PLLA多孔支架在空氣中干燥24小時后用5％的PLGA二氯甲烷粘合，再真空干燥48小時，得到PLLA層和PLGA層平均孔徑都為200微米、孔隙率為90％的復合結構細胞支架。將此復合結構細胞支架用于皮膚組織工程，其中PLGA支架部分用于表皮細胞培養、PLLA支架部分用于成纖維細胞的培養，結果表明PLLA支架部分的成纖維細胞生長良好，而PLGA層的表皮細胞則是細胞少、生長差。這是由于成纖維細胞和表皮細胞兩種細胞對孔徑孔結構的要求不同，200微米的細胞支架孔徑成纖維細胞比較合適，而對表皮細胞而言是孔徑太大了，因此使細胞無法貼壁和正常生長。
權利要求
1.一種組織工程用復合結構細胞支架，其結構如下(1)由結構1和結構2兩部分組成，結構1和結構2直接相接、結構1和結構2的孔互相相通；或(2)由結構1和結構2及兩者間的一層由材料3所構成的致密層組成，使結構1和結構2的孔互不相通；所述結構1所使用的材料1和結構2所使用的材料2為天然高分子材料甲殼素、殼聚糖、海藻酸鹽、膠原蛋白、葡聚糖、透明質酸、明膠和瓊脂，或天然無機材料羥基磷灰石、磷酸鈣和珊瑚礁，或合成高分子材料脂肪族聚酯、聚酸酐、聚膦腈、聚原酸酯和聚醚中的一種或它們間的共混物；所述材料3為天然高分子材料甲殼素、殼聚糖、海藻酸鹽、膠原蛋白、葡聚糖、透明質酸、明膠和瓊脂，或合成高分子材料脂肪族聚酯中的聚L-乳酸(PLLA)、聚DL-乳酸(PDLLA)、共聚(L-乳酸/DL-乳酸)(PLLA-co-PDLLA)、聚乙醇酸(PGA)、共聚(乳酸/乙醇酸)二元共聚物(PLGA)、共聚(乳酸/己內酯)二元共聚物(PLC)、聚己內酯(PCL)、共聚(乙醇酸/乳酸/己內酯)三元共聚物(PLGC)、聚己內酯/聚醚嵌段共聚物(PCE)、聚己內酯/聚醚/聚乳酸三元共聚物(PCEL)、聚乳酸/聚醚二元共聚物(PLE)，以及其它聚羥基酸(PHA)中的一種或它們間的共混物。
2.根據權利要求1的一種組織工程用復合結構細胞支架，其特征在于所述合成高分子材料為脂肪族聚酯，包括聚L-乳酸(PLLA)、聚DL-乳酸(PDLLA)、共聚(L-乳酸/DL-乳酸)(PLLA-co-PDLLA)、聚乙醇酸(PGA)、共聚(乳酸/乙醇酸)二元共聚物(PLGA)、共聚(乳酸/己內酯)二元共聚物(PLC)、聚己內酯(PCL)、共聚(乙醇酸/乳酸/己內酯)三元共聚物(PLGC)、聚己內酯/聚醚嵌段共聚物(PCE)、聚己內酯/聚醚/聚乳酸三元共聚物(PCEL)、聚乳酸/聚醚二元共聚物(PLE)，以及其它聚羥基酸(PHA)中的一種或它們間的共混物。
3.根據權利要求1的一種組織工程用復合結構細胞支架，其特征在于所述結構1和結構2的孔徑為5納米～600微米、孔隙率為30～95％，厚度為0.2～10mm；所述由材料3所構成的致密層厚度為0.05～1.0mm。
4.根據權利要求1的一種組織工程用復合結構細胞支架，其特征在于所述復合結構細胞支架呈棒狀、板狀、膜狀、管狀或特定的形狀。
5.一種組織工程用復合結構細胞支架的制備方法，按以下步驟進行材料1和材料2各1～50份溶于各自的溶劑，所述溶劑為二氯甲烷、二氯乙烷、三氯甲烷、四氫呋喃、二氧六環或蒸餾水、稀酸、稀堿溶液，配成1～20％的溶液后，分別以0.5g/1.0g～1.0g/20.0g的比例同5～300目的鹽粒混合均勻，再分別澆鑄于模具中。揮發溶劑5～72小時后再真空干燥12～72小時，然后把所得到的含鹽材料1和材料2塊浸入去離子水中脫鹽，每1～10小時換一次水，直至洗滌液中檢測不到鹽的殘留離子為止，把脫了鹽的材料1和材料2多孔支架在空氣中干燥5～72小時，制得材料1和材料2多孔支架；當材料1和材料2的一種或兩種是天然無機材料時，可不進行以上的處理而直接使用。把材料1和材料2多孔支架用0.5～10％的材料3的溶液粘合，再真空干燥12～72小時，得到材料1和材料2平均孔徑為5納米～600微米范圍、孔隙率在30～95％范圍，材料1和材料2厚度在0.2～10mm范圍，材料3的厚度在厚度在0.05～1.0mm范圍、由材料1、材料2和材料3三層組成的復合結構細胞支架。將上述制得的脫了鹽的材料1和材料2多孔支架的一個面涂以極少量的共溶劑后立即直接接合，所述共溶劑為二氯甲烷、二氯乙烷、三氯甲烷、四氫呋喃、二氧六環或蒸餾水、稀酸、稀堿溶液，再真空干燥12～72小時；或材料1和材料2多孔支架的一個面與溫度為55～200℃的熱板接觸后再立即壓合；或將材料1和材料2多孔支架面面相對加壓12～72小時，則得到只由材料1和材料2兩層組成的復合結構細胞支架；所述材料1和材料2為天然高分子材料甲殼素、殼聚糖、海藻酸鹽、膠原蛋白、葡聚糖、透明質酸、明膠和瓊脂，或天然無機材料羥基磷灰石、磷酸鈣和珊瑚礁，或合成高分子材料脂肪族聚酯、聚酸酐、聚膦腈、聚原酸酯和聚醚中的一種或它們間的共混物；所述材料3為天然高分子材料甲殼素、殼聚糖、海藻酸鹽、膠原蛋白、葡聚糖、透明質酸、明膠和瓊脂，或合成高分子材料脂肪族聚酯中的聚L-乳酸(PLLA)、聚DL-乳酸(PDLLA)、共聚(L-乳酸/DL-乳酸)(PLLA-co-PDLLA)、聚乙醇酸(PGA)、共聚(乳酸/乙醇酸)二元共聚物(PLGA)、共聚(乳酸/己內酯)二元共聚物(PLC)、聚己內酯(PCL)、共聚(乙醇酸/乳酸/己內酯)三元共聚物(PLGC)、聚己內酯/聚醚嵌段共聚物(PCE)、聚己內酯/聚醚/聚乳酸三元共聚物(PCEL)、聚乳酸/聚醚二元共聚物(PLE)，以及其它聚羥基酸(PHA)中的一種或它們間的共混物。
6.根據權利要求5的一種組織工程用復合結構細胞支架的制備方法，其特征在于所述合成高分子材料為脂肪族聚酯，包括聚L-乳酸(PLLA)、聚DL-乳酸(PDLLA)、共聚(L-乳酸/DL-乳酸) (PLLA-co-PDLLA)、聚乙醇酸(PGA)、共聚(乳酸/乙醇酸)二元共聚物(PLGA)、共聚(乳酸/己內酯)二元共聚物(PLC)、聚己內酯(PCL)、共聚(乙醇酸/乳酸/己內酯)三元共聚物(PLGC)、聚己內酯/聚醚嵌段共聚物(PCE)、聚己內酯/聚醚/聚乳酸三元共聚物(PCEL)、聚乳酸/聚醚二元共聚物(PLE)，以及其它聚羥基酸(PHA)中的一種或它們間的共混物。
7.一種組織工程用復合結構細胞支架的用途，其特征在于作為皮膚、血管、骨/軟骨、食道、氣管等多種細胞組織工程的細胞支架，用于進行皮膚、血管、臏骨、食道、氣管等組織和器官的修復和構建。
全文摘要
本發明公開了一種組織工程用復合結構細胞支架,其結構如下:(1)由結構1和結構2兩部分組成,結構1和結構2直接相接、結構1和結構2的孔互相相通;或(2)由結構1和結構2及兩者間的一層由材料3所構成的致密層組成,使結構1和結構2的孔互不相通。本發明還公開了其制備方法,可作為皮膚、血管、骨/軟骨、食道、氣管等多種細胞組織工程的細胞支架,用于進行皮膚、血管、臏骨、食道、氣管等組織和器官的修復和構建。
文檔編號A61L27/00GK1386478SQ0111831
公開日2002年12月25日 申請日期2001年5月23日 優先權日2001年5月23日
發明者王身國, 貝建中, 蔡晴, 石桂欣 申請人:中國科學院化學研究所