專利名稱：人重組乙型干擾素的高效表達及其應用的制作方法
技術領域：
本發明重組人乙型干擾素的高效表達涉及采用生物基因工程的方法在真核細胞系統中表達并生產了一種重組人乙型干擾素，所采用的真核細胞表達系統包括昆蟲桿狀病毒表達系統和酵母菌表達系統，以及重組人乙型干擾素的用途。
免疫干擾素是一族由病毒和其它一些生物引物所誘導的自然蛋白質，在病毒感染過程中具有抗病毒，抗分化和免疫調節作用。干擾素共分三種，甲型、乙型和丙型干擾素。三種干擾素有共同特點，但有明顯不同的生物作用。甲型干擾素主要功能是抗病毒感染，用于治療病毒性疾病如甲型，乙型和丙型肝炎等；丙型干擾素是體內主要的Th1型細胞炎癥因子，主要由體內淋巴細胞產生，參與體內炎癥免疫反應；乙型干擾素由體內纖維細胞和巨噬細胞產生，近年來發現它具有抗炎癥功能，是體內很強的抗炎癥因子之一。乙型干擾素是一種具有抗病毒，抗增殖以及免疫調節活性的細胞因子。它是一種糖蛋白，含166個氨基酸，分子量約為20500D。乙型干擾素基因曾被克隆在E.coli(Taniguchi,et al.,Gene 10,11-15,1980))和中國倉鼠卵巢癌細胞中進行表達(McComick et al,Mol Cell Biol Jan:4(1):166-72,1984)。然而,由這些系統所表達和生產的蛋白量相對很少，另外，研究證明乙型干擾素是一種糖基化蛋白(Knight Jr.PNAS 73:520,1972；Knight Jr.,J Interferon Res 2:421,1982)，但原核細胞如E.Coli缺乏糖基化功能，由其表達的重組蛋白缺乏糖基，在生物活性和生物功能上具有一定局限性。
本發明的目的是通過應用不同的真核細胞基因表達載體在真核細胞系統中獲得高產量的與自然人乙型干擾素結構和功能相似的重組人乙型干擾素。
一種生產重組人乙型干擾素的方法，其特征在于該方法是通過真核細胞表達載體來轉化宿主細胞使之生產重組人乙型干擾素。
所述真核細胞表達載體是昆蟲桿狀病毒表達載體，宿主細胞是昆蟲細胞。
本發明提供了一種使用桿狀病毒表達系統在昆蟲細胞中表達制備重組人乙型干擾素的方法。該法獲得的成熟，全長的蛋白可以在非變性條件下純化到95％，或更高的純度。同時，也給出了一種使用特別設計的寡核苷酸探針和聚合酶鏈反應(PCR)技術從人成纖維細胞中克隆乙型干擾素的步驟。克隆的乙型干擾素通過去除天然的疏水性信號肽序列，代之以新的桿狀病毒信號肽來進行修飾。這些嵌合基因被引入桿狀病毒表達載體后，桿狀病毒多角體蛋白啟動子指導被感染的昆蟲細胞中重組乙型干擾素的表達，而由18個氨基酸組成的桿狀病毒信號肽僅指導乙型干擾素的翻譯進入昆蟲細胞的糖基化途徑，其本身并不出現在成熟的乙型干擾素糖蛋白上。
所述的真核細胞表達載體可以是酵母菌表達載體，宿主細胞是酵母菌。
本發明還提供了一種使用酵母菌表達系統通過發酵表達制備重組人乙型干擾素的方法。同時，也給出了一種使用特別設計的寡核苷酸探針和聚合酶鏈反應(PCR)技術從人成纖維細胞中克隆乙型干擾素的步驟。克隆的乙型干擾素基因通過去除天然的疏水性信號肽序列，代之以新的分泌型酵母菌信號肽來進行修飾。這些嵌合基因被引入酵母菌表達載體后被轉化到酵母菌中進行發酵，同時生產重組乙型干擾素。分泌型信號肽指導乙型干擾素的翻譯進入酵母細胞的糖基化途徑并分泌至培養上清中，其本身并不出現在成熟的乙型干擾素糖蛋白上。由于酵母菌本身產生極少的分泌蛋白，所以絕大多數產生的分泌型蛋白是乙型干擾素。
重組人乙型干擾素因結構、功能與自然人乙型干擾素結構和功能相似，因此可用于治療自身免疫病，包括多發性硬化病，類風濕關節炎，牛皮癬，糖尿病等，可用于治療多種腫瘤和病毒性疾病如肝炎等疾病。
制得的重組人乙型干擾素制成可以通過吸入、肌肉注射、靜脈注射給藥的制劑。使用方便。重組人乙型干擾素可以單劑量形式包裝，可用作肌肉注射(即肌內，皮內或皮下)或吸入(即鼻內)。由下述實例來決定其有效劑量。該蛋白可被凍干，用時再重懸，或制成溶液。
重組人乙型干擾素的功能活性可以通過分析抗病毒，抗增殖及免疫調節活性的試驗來進行測定。
重組人乙型干擾素的結構和生物學特性SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析時表明該蛋白表現為單個條帶，分子量為20500道而頓。重組人乙型干擾素是一種多功能的蛋白，抗病毒活性是其中已知功能之一，它同時也顯示抗增殖和免疫調節活性的功能。
本發明的優越性在于利用具有糖基化功能的昆蟲桿狀病毒表達系統和酵母菌表達系統等真核細胞系統來表達人乙型干擾素基因，這些系統所表達和生產的蛋白量相對量大、純度高，可利用昆蟲細胞和酵母菌大量制備與自然人乙型干擾素結構和功能相似的重組人乙型干擾素。制備成本大為降低。本發明中所描述的表達高產量重組人乙型干擾素的方法可以使臨床應用所需要的重組蛋白藥物的制備簡單化和廉價化。
通過附圖及下述實施例詳述本發明，然而本發明并不只限于采用昆蟲桿狀病毒表達系統和酵母菌表達系統制備高產量的重組人乙型干擾素。
附
圖1重組人乙型干擾素在昆蟲細胞中的表達流程圖。
附圖2重組人乙型干擾素在酵母菌中的表達流程圖。
附圖3人重組乙型干擾素對細胞病變的抑制效果圖。
附圖4人重組乙型干擾素對細胞病變的抗分化圖表。
實施例1，克隆人乙型干擾素基因圖1重組人乙型干擾素在昆蟲細胞中的表達流程圖和圖2重組人乙型干擾素在酵母菌中的表達流程圖給出了人乙型干擾素基因克隆步驟的例子。如上所述，從來自于ATCC中得到的人成纖維細胞中抽提病毒RNA，使用生命技術公司提供的第一鏈cDNA合成試劑盒里的M-MuLV逆轉錄酶，以純化的總RNA或mRNA(5μg)作模板合成cDNA。逆轉錄成cDNA所用的引物是試劑盒中所提供的合成的寡聚核苷酸dT引物。使用標準的聚合酶鏈反應(PCR)步驟從cNDA中擴增β-IFN基因。PCR反應混合液(50μL)含20pmol的乙型干擾素基因5’和3’末端特異性的引物，該基因序列由GenBank DNA文件中查到的共有序列所決定。擴增30圈，每圈循環包括94℃變性1分鐘，56℃退火1分鐘，72℃延伸2分鐘。在克隆前，用1％瓊脂糖電泳分析PCR產物片段大小的正確性。PCR的5’端引物是按照人成熟干擾素基因的5’端而設計的從5’端的信號肽序列后開始，序列為5’ATCCCGGGCTACAACTTGCTTGGA-3’；(SEQ ID NO.1)，PCR的3’端引物是按照人乙型干擾素基因的3’端來設計，序列為3’-TACCTCCGAAACTGAAGGATCCAT-5’(SEQ ID NO.1)。在PCR中用這些引物擴增摸板基因，以產生無信號肽序列的成熟乙型干擾素基因。該基因可用于插入昆蟲桿狀病毒載體或酵母菌載體。
實施例2重組人乙型干擾素在昆蟲細胞中的表達如圖1，重組人乙型干擾素在昆蟲細胞中的表達流程圖。上述成熟乙型干擾素基因經限制性內切酶ECORⅠ消化后，將它插入含mellitin分泌信號肽的pM/bac昆蟲桿狀病毒載體中，所得到的重組載體是含有多角體蛋白啟動子，mellitin分泌信號肽和人乙型干擾素基因的嵌合重組質粒。接著混合純化的人乙型干擾素基因的嵌合轉移質粒DNA與AcNPV野生型DNA，通過鈣共沉淀，轉染至S.frugiperda昆蟲細胞中。在噬菌斑形態學以及通過幾輪噬菌斑進一步純化的基礎上選擇重組桿狀病毒。篩選好的重組桿狀病毒克隆以表達乙型干擾素，選擇單個桿狀病毒表達載體繼續進行下一步表達。
用含干擾素基因的桿狀病毒載體感染S.frugiperda細胞。感染72小時后，收集上清液。重組β-IFN在感染AcNPV-IFN-β載體的S.frugiperda細胞中高效表達，最初的基因產物是在強多角體蛋白啟動子下轉錄的融合蛋白。當這一融合蛋白被信號肽引導進入宿主昆蟲細胞的分泌途徑后，信號肽序列被信號肽酶剪切去除，而成熟的重組人乙型干擾素被分泌至培養液的上清中。感染72小時后，將細胞培養液經3400g離心15分鐘后收獲上清液，儲存在-70℃中。鑒定時用含0.1％SDS的12％聚丙烯酰胺凝膠分離蛋白，考馬斯亮藍染色。以標準蛋白質的大小(Kd表示)與位置指示表明重組人乙型干擾素是感染后72小時細胞合成的主要蛋白之一、大小為20.5Kd，在N端有甘露糖多糖糖基化的蛋白。
實施例3重組人乙型干擾素在酵母菌中的表達如圖2，重組人乙型干擾素在酵母菌中的表達流程圖。酵母菌具有很多高等真核細胞的優點如蛋白折疊和翻譯后修飾等功能，但又如原核細胞一樣容易操作。就產生異種蛋白而言，卻比哺乳類細胞迅捷、方便和價廉，且產量高出十至百倍。酵母菌酒精氧化酶啟動子基因的表達在甲醇誘導和嚴格控制下可達到非常高量的水平。由于酵母菌本身產生極少的分泌蛋白，所以絕大多數產生的分泌型蛋白是乙型干擾素。
在實施例1中所獲得的成熟乙型干擾素基因也可經特定的限制性內切酶ECORⅠ消化后，將它插入酵母菌載體中，所得到的重組酵母菌載體是含有受甲醇誘導和嚴密控制的AOX1啟動子，α因子分泌信號肽和人乙型干擾素基因的嵌合重組質粒。該嵌合重組質粒由內切酶切成線型后再被轉化至酵母菌中。這些嵌合基因被引入酵母菌表達載體后被轉化到酵母菌中進行發酵，同時生產重組乙型干擾素。分泌型信號肽指導乙型干擾素的翻譯和進入酵母細胞的糖基化途徑并分泌至培養上清中，其本身被切除因此并不出現在成熟的乙型干擾素糖蛋白上。含有重組乙型干擾素的上清經3400g離心15分鐘后收獲并儲存在-70℃中。
實施例4，重組人乙型干擾素的制備和純化上述收集的含重組人乙型干擾素上清，可通過大小排阻層析，抗體親和層析和(或)其它常用的純化技術來純化其中的重組人乙型干擾素。純化后的重組人乙型干擾素重懸于等滲壓的緩沖液中。該蛋白是非變性的，可以被制成在治療和藥理學方面都能接受的載體介質中，如蒸餾水，生理鹽水，Ringer′s溶液，Hank′s溶液及其它類似物，可口服或腸胃使用。所得到的重組人乙型干擾素可以通過不同的途徑用于治療疾病。不同途徑可以是吸入，肌肉注射和皮下注射。
本發明重組人乙型干擾素抗病毒活性成熟人乙型干擾素以二聚體形式存在，可以抵抗許多病毒的感染，包括人皰疹病毒-6(HHV-6)。因而對病毒感染的抵抗能力可用于評價乙型干擾素抗病毒的功能活性。
重組人乙型干擾素樣品的抗病毒活性是用Jurkat細胞來進行檢測的。把Jurkat細胞(5000個細胞/100μL/孔)加入96孔培養板中。然后，加入連續稀釋的乙型干擾素。24小時后，用HHV6病毒對細胞進行攻擊。病毒攻擊后兩天用臺盼藍染色來計數存活的細胞或測定胸腺嘧啶核苷酸的吸收率。一個實驗單位定義為保護50％細胞免于病毒殺傷的β-IFN的濃度。如圖3，重組乙型干擾素對細胞病變的抑制效果所示，表明了本發明重組人乙型干擾素有較大的抗病毒活性。
本發明重組人乙型干擾素抗腫瘤細胞增殖活性在增殖實驗中，使用人Jurkat細胞株來評價重組人乙型干擾素的抗腫瘤細胞增殖活性。在96孔平底板上接種Jurkat細胞，每孔5000個細胞。加或者不加連續稀釋的重組人乙型干擾素。培養細胞48小時。最后6小時加3H-胸腺嘧啶核苷酸(1μCi/孔)。然后用LKB WallacMackⅡ96自動細胞收獲儀收取細胞。用閃爍計數來測定胸腺嘧啶核苷酸的吸收率。數據以CPM表示。見圖4，重組乙型干擾素對細胞病變的抗分化作用。
本發明重組人乙型干擾素免疫調節功能借助Jurkat細胞來檢測β-IFN誘導MHCⅠ類分子的情況。用連續稀釋的重組人乙型干擾素孵育105個細胞48小時。然后，收獲培養的細胞，分別加入MHCⅠ類分子單抗(Mab W6/32)標記。簡言之，用特定抗體孵育細胞30分鐘，再用FACS緩沖液(含5％胎牛血清的PBS)洗三遍后，2000rpm離心。隨后再用FITC標記的二抗(羊抗鼠Ig)進行結合，重復上述步驟。用流式細胞儀測定陽性細胞的百分數。乙型干擾素誘導的MHCⅠ分子的表達達50％左右。
獲得的純化的重組人乙型干擾素可單獨或混合使用，不僅可作為免疫調節劑，控制多發性硬化病、類風關、牛皮癬和糖尿病，而且還可用于腫瘤和病毒性感染疾病(如肝炎)的治療。
應用例1，乙型干擾素治療自身免疫性腦多發性硬化病腦多發性硬化癥(Multiple Sclerosis)是常見的中樞神經系統自身免疫性脫髓鞘病變，是青壯年中最常見的導致癱瘓性神經病變的疾病。致病原因至今不清，可能與病毒和細菌感染，環境污染及遺傳基因有關。在中國的發病率正逐年增加。據不完全統計，國內現有病人數約為30萬。腦多發性硬化癥發病率在美國約為人口的千分之二到八，約36萬病人，在全世界共有450萬病人。乙型干擾素是由體內纖維細胞和巨噬細胞產生的多肽蛋白，近年發現它不但能抗病毒，而且具有抗炎癥功能，是體內很強的抗炎癥因子之一。最近用于治療自身免疫性多發性硬化病，有顯著療效。經多年研究及臨床鑒定，在1993年通過美國FDA鑒定，正式用于腦多發性硬化病的治療。現已在歐美及日本作為治療自身免疫性腦多發性硬化病的首選藥物廣泛使用。
應用例2，乙型干擾素治療類風濕關節炎類風濕關節炎病理特點主要是關節滑膜自身免疫性炎癥炎癥。病理機制與多發性硬化病很相似，也是由T細胞自身免疫機理所致，只是病灶部位不同(多發性硬化是腦內炎癥)。基于類風濕關節炎與多發性硬化病的發病機制的共同性，乙型干擾素將成為一個治療類風濕關節炎的有效藥物。
應用例3，乙型干擾素治療牛皮癬及自身免疫性糖尿病牛皮癬及自身免疫性糖尿病也屬T細胞介導的自身免疫性疾病，在致病機理上類似于多發性硬化病和類風濕關節炎。牛皮癬是皮膚的自身免疫性疾病，臨床表現為反復發作，至今無有效的治療方法。自身免疫性糖尿病是一型免疫反應性糖尿病，多發于青少年，病情很難控制，絕大多數病人需終身使于胰島素，部分病人可發展成酮血癥昏迷。基于發病機制的共同性，乙型干擾素將成為一個治療的牛皮癬及自身免疫性糖尿病有效藥物。
應用例4，乙型干擾素治療乙型和丙型肝炎乙型干擾素具有類似于甲型干擾素的抗病毒作用，其抗病毒作用不亞于甲型干擾素。近年來已有采用乙型干擾素治療乙型和丙型肝炎的成功例子。
應用例5，乙型干擾素治療腫瘤乙型干擾素有特異性的抗腫瘤作用，其抗腫瘤作用已經體內和體外實驗證實，并有動物實驗證實乙型干擾素可治療實體腫瘤和白血病。
下面給出1，人乙干素的氨基酸序例MSYNLLGFLQRSSNCQCQKLLWQLNGRLEYCLKDRRNFDIPEEIKQLQQFQKEDAAVTIYEMLQNIFAIFRQDSSSTGWNETIVENLLANVYHQRNHLKTVLEEKLEKEDFTRGKRMSSLHLKRYYGRILHYLKAKEDSHCAWTIVRVEILRNFYVINRLTGYLRN2，人乙干擾素的DNA序例ATGAGCTACAACTTGCTTGGATTCCTACAAAGAAGCAGCAATTGTCAGTGTCAGAAGCTCCTGTGGCAATTGAATGGGAGGCTTGAATACTGCCTCAAGGACAGGAGGAACTTTGACATCCCTGAGGAGATTAAGCAGCTGCAGCAGTTCCAGAAGGAGGACGCCGCAGTGACCATCTATGAGATGCTCCAGAACATCTTTGCTATTTTCAGACAAGATTCATCGAGCACTGGCTGGAATGAGACTATTGTTGAGAACCTCCTGGCTAATGTCTATCATCAGAGAAACCATCTGAAGACAGTCCTGGAAGAAAAACTGGAGAAAGAAGATTTCACCAGGGGAAAACGCATGAGCAGTCTGCACCTGAAAAGATATTATGGGAGGATTCTGCATTACCTGAAGGCCAAGGAGGACAGTCACTGTGCCTGGACCATAGTCAGAGTGGAAATCCTAAGGAACTTTTACGTCATTAACAGACTTACAGGTTACCTCCGAAACTGAAGATCTCCTAGCCTGTGCCTCTGGGACGGGACAATTGCTTCAAGCATTCTTCAACCAGCAGATGCTGTTTAAGTGACTGATGGCGAATGTACTGCATATGAAAGGACACTAGAAGATTTTGAAATTTTTATTAAATTATGAGGTATTTTTATTTATTTAAATTTTATTTTGGAAAATAAATTATTTTTGGTGCAAAAGTC//
權利要求
1．一種人重組乙型干擾素的高效表達，其特征在于通過真核細胞表達載體來轉化宿主細胞，使之生產重組人乙型干擾素。
2．根據權利要求1所述的人重組乙型干擾素的高效表達，其特征在于人乙型干擾素基因是從人成纖維細胞中抽提的RNA，然后通過使用逆轉錄酶將其逆轉錄為cDNA，再進行PCR擴增、克隆后而獲得。
3．根據權利要求1、2所述的人重組乙型干擾素的高效表達，其特征在于所述真核細胞表達載體是昆蟲桿狀病毒表達載體。
4．根據權利要求3所述的人重組乙型干擾素的高效表達，其特征在于所述宿主細胞是昆蟲細胞。
5．根據權利要求4所述的人重組乙型干擾素的高效表達，其特征在于克隆的人乙型干擾素通過去除天然的疏水性信號肽序列，代之以新的桿狀病毒信號肽來進行修飾，這些嵌合基因被引入桿狀病毒表達載體后，桿狀病毒多角體蛋白啟動子指導被感染的昆蟲細胞中重組乙型干擾素蛋白的表達，而由18個氨基酸組成的桿狀病毒信號肽僅指導人乙型干擾素的翻譯進入昆蟲細胞的糖基化途徑，其本身并不出現在成熟的人乙型干擾素糖蛋白上。
6．根據權利要求1、2所述的人重組乙型干擾素的高效表達，其特征在于所述的真核細胞表達載體是酵母菌表達載體。
7．根據權利要求6所述的人重組乙型干擾素的高效表達，其特征在于所述宿主細胞是酵母菌。
8．根據權利要求6所述的人重組乙型干擾素的高效表達，其特征在于克隆的人乙型干擾素通過去除天然的疏水性信號肽序列，代之以新的分泌型酵母菌信號肽來進行修飾，這些嵌合基因被引入酵母菌表達載體后，被轉化到酵母菌中發酵，同時生產重組人乙型干擾素，分泌型酵母菌信號肽指導乙型干擾素的翻譯進入酵母細胞的糖基化途徑，并分泌至培養上清中，其本身并不出現在成熟的人乙型干擾素糖蛋白上。
9．人重組乙型干擾素的用途，其特征在于可用于治療自身免疫病，包括多發性硬化病，類風濕關節炎，牛皮癬，糖尿病，可用于治療多種腫瘤和病毒性疾病如肝炎等疾病的治療。
10．根據權利要求9所述的人重組乙型干擾素的用途，其特征在于所述的重組人乙型干擾素制成可以通過吸入、肌肉注射、靜脈注射、皮膚涂敷給藥的制劑。
全文摘要
本發明人重組乙型干擾素的高效表達及其應用,涉及采用生物基因工程的方法在真核細胞系統中表達并生產了一種重組人乙型干擾素,通過真核細胞表達載體來轉化宿主細胞,并生產了一種重組人乙型干擾素。由真核細胞系統表達和生產的獲得高產量的重組人乙型干擾素是經過蛋白翻譯后修飾的糖基化蛋白,與自然人乙型干擾素結構和功能相似。用本發明表達系統生產的蛋白量大且純度高,并可廣泛用于臨床治療自身免疫性疾病等。
文檔編號A61P3/10GK1324951SQ0111298
公開日2001年12月5日 申請日期2001年5月24日 優先權日2001年5月24日
發明者秦瑩 申請人:大連金威基因技術有限公司