專利名稱：一種人胰島素重組基因、制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種人胰島素重組基因、制備方法和作為治療糖尿病藥物的應用，屬于生物制藥技術領域。
自1980年人胰島素基因序列解明以后，有許多關于人胰島素基因作為治療糖尿病藥物研究的報道，但現在所稱的人胰島素基因，實際為人胰島素原基因，直接表達產物是活性較低的胰島素原，由B鏈、C肽、A鏈86個氨基酸的單鏈多肽組成，而胰島素原只有在胰島β細胞內，被羧肽酶切掉C肽部分，才能成為成熟的活性很高的胰島素及C肽，1992年由日本的Masahiro與Yanagita等人，對大鼠I型胰島素基因進行了定點突變，以使胰島素原的C肽部分可以被動物體內，普通細胞內存在的一種蛋白水解酶Furin或PACE切掉，成為成熟的胰島素及C肽。此后亦有很多關于人胰島素基因定點突變的研究報道，但他們所進行的定點突變多是在靠近C肽部分的B鏈或A鏈氨基酸上完成的。
本發明的目的在于提供一種在C肽氨基酸上完成的定點突變人胰島素基因，并添加第一內含子重組改建，這樣第一可避免改變胰島素B、A鏈的氨基酸成分，保證與正常胰島素的氨基酸成分一樣，提高效用降低由不同于正常胰島素氨基酸組成成分的不良作用。第二可以提高表達量，增加表達產物的調控作用，這對利用體細胞基因制備治療糖尿病藥物有重要的應用前景。本發明的技術方案是這樣實現的這種人胰島素重組基因序列(見附
圖1)，序列長度1789個堿基，重組序列特征為第669-674堿基是密碼子AAG、密碼子CGC；第1536-1538堿基是密碼子GGA；第1542-1544堿基是密碼子CGG；第305-483個堿基是擴增的第一內含子。
所述的人胰島素重組基因制備方法，包括a.制備突變載體和突變模板用限制性內切酶NcoI和SphI將人胰島素基因組基因DNA片段取下，克隆進M13mp18噬菌體內，作為突變用載體，該噬菌體內含尿嘧啶的單鏈DNA作為突變用模板；b.定點突變利用定點突變引物15′-CTGCAGGTCCTCGCGCTTCCGGCGGGTC-3＇、定點突變引物25＇-CACGCTTCTGCCGGGATCCCTC-3＇與T4DNA聚合酶進行寡核苷酸介導的定點突變，并克隆該噬菌體及其提取DNA；突變位點第669-674、1536-1538、1542-1544個堿基；c.構建成表達載體將突變后的人胰島素基因組基因DNA1.3kb片段，經DNA限制性內切酶ApaI切下回收，克隆進質粒PRC/CMV的多克隆位點上，構建成定點突變人胰島素基因組基因質粒(pCMV/mhINS質粒)；d.補平酶切后質粒斷端定點突變人胰島素基因組基因質粒(pCMV/mhINS質粒)經DNA限制性內切酶XbaI、BamHI、NcoI、SacI、ApaI酶切后，70℃加熱10分鐘滅活DNA限制性內切酶，并補加核苷三磷酸和大片段酶，以補平酶切后定點突變人胰島素基因組基因質粒斷端；e.擴增連接利用第一內含子特異性引物15′-GTTCTAGACAGGCTGCATCAG-3＇、第一內含子特異性引物25＇-TACCATGGCAGAAGGACAGTG-3＇從人胰島素基因組基因DNA中將第一內含子擴增0.23kb的DNA片段；經DNA連接酶(Ligase)與pCMV/mhINS質粒連接構建成含第一內含子的定點突變人胰島素基因組基因重組質粒(pCMV/ImhINS)，第一內含子位點第305-483個堿基；f.重組質粒pCMV/ImhINS的克隆擴增重組質粒DNA轉化入大腸桿菌DH5a后，進行細菌培養擴增；g.重組Pcmv/ImhINS質粒DNA的提取在大腸桿菌中復制的重組質粒經分離抽提、沉淀冷凍干燥制成人胰島素重組基因。3、根據權利要求2所述的一種人胰島素重組基因方法，其特征在于所述的構建突變用載體的方法a.包括混合人胰島素基因組DNA 1μL(0.1-0.4μg)、酶切緩沖液2μL，限制性內切酶NcoI和SphI 1U/μgDNA、加水至20μL，37℃反應1小時；0.4％瓊脂糖凝膠電泳回收1.3kb酶切產物；將M13mp18用限制性內切酶SmaI和SphI雙酶切，用連接酶將1.3kb酶切產物與M13mp18連接，構建成突變用載體M13mp18/INS；提取該噬菌體的單鏈含尿嘧啶的DNA，作為定點突變用“U”模板。
所述的一種人胰島素重組基因制備方法中所述基因定點突變方法b包括(1)、突變引物的5’端引物OH磷酸化；(2)、突變引物與單鏈DNA“U”模板雜交和延伸反應；(3)、對JM109F＇大腸桿菌的轉染和突變體的篩選。
所述的一種人胰島素重組基因制備方法中所述的突變引物的5’端引物OH磷酸化方法包括將突變引物1或2取100-200pmol、加入T4多核苷酸激酶緩沖液2μL、10mmol/L的腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)1μL、T4多核苷酸激酶4U，加水至20Ml，37℃水浴反應1小時，68℃水浴加熱10分鐘滅活酶。
所述的一種人胰島素重組基因制備方法中所述的突變引物與單鏈DNA“U”模板雜交和延伸反應方法包括a.退火反應單鏈DNA“U”模板0.5pmol與磷酸化的“引物1”10pmol、磷酸化的“引物2”10pmol、T4DNA聚合酶緩沖液1μl、加水至10μl，置68℃水浴5分鐘，緩慢冷卻至室溫，短暫離心以收集管壁上水滴；b.延伸反應混合T4DNA聚合酶緩沖液1μl、4種脫氧核苷磷酸(dNTP要達到500μmol/L)每種1μl、10mmol/L的腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)1μl、T4DNA連接酶緩沖液2μl、T4DNA聚合酶3U、T4DNA連接酶4U、加水至10μl；向a退火反應收集的溶液中加入10μl延伸反應混合液，首先冰浴放置5分鐘，室溫放置5分鐘，然后于37℃水浴1-2小時，最后將反應產物置于10-16℃過夜。
所述的一種人胰島素重組基因制備方法中所述的對JM109F＇大腸桿菌的轉染和突變體的篩選方法包括接種JM109F＇大腸桿菌單菌落于10ml LB液種，37℃振蕩培養至OD600＝0.3時，于4℃離心收集細胞，加入20ml冰冷的75mmolCaCl2溶液，懸浮后冰浴20分鐘，離心收集細胞，將細胞溶于冰冷的4ml 75mmolCaCl2、15％甘油溶液中，使菌體成為感受態細胞，取2管100μl感受態JM109F＇大腸桿菌，分別加入過夜的延伸反應物1μl、5μl，混勻后冰浴30分鐘，42℃熱沖擊2分鐘，再冰浴5分鐘。與100μl對數生長期的JM109F＇大腸桿菌及4ml溶化的頂層瓊脂培養基混合均勻，鋪于LB固體培養基上，37℃培養6小時后，待噬菌斑出現，用EcoRI和BamHI對突變后的噬菌體M13mp18/INS RF DNA進行酶切鑒定、DNA序列分析，證實兩個位置都突變成功，該基因的其它序列完全正確。
所述的一種人胰島素重組基因方法中所述的重組質粒pCMV/ImhINS的克隆擴增方法f包括將大腸桿菌DH5a(含第一內含子的定點突變人胰島素基因組基因質粒)單菌落加入含氨芐青霉素的50mg/L的細菌液體選擇培養基，37℃振蕩培養8小時，作為種子培養液；按1/100比例將種子培養液加入細菌液體選擇培養基，37℃振蕩培養12-16小時，至OD600＝1.8-2.0，于4℃離心收集菌體；加入預冷的溶液懸浮菌體，再加入NaOH 0.2mol/L，1％十二烷基磺酸鈉裂解溶液裂解菌體，室溫放置5分鐘，加入KAc-HAc緩沖溶液，冰浴30分鐘，于4℃離心20分鐘，取上清液，重復離心一次，至上清液澄清。
所述的一種人胰島素重組基因制備方法中所述的重組質粒(pCMV/ImhINS)DNA的提取方法g包括將擴增所得上清液加入0.6倍體積異丙醇室溫放置30分鐘，離心，70％乙醇洗滌沉淀，冷凍干燥；將所得DNA溶于TE緩沖液中，加等量5mol/L LiCl，于4℃離心取上清；加等體積異丙醇室溫放置30分鐘，室溫離心，70％乙醇洗滌沉淀，冷凍干燥；加入1mlTE緩沖液溶解沉淀，加入核糖核酸酶(Rnase)至其終濃度為20μg/ml，于37℃放置1小時，加等體積飽和重蒸苯酚∶氯仿∶異戊醇＝25∶24∶1抽提，于4℃離心取上清；加等體積氯仿抽提，取上清；加1/10體積3mol/L NaAc、2倍體積無水乙醇，4℃放置30分鐘以上；于4℃離心取沉淀；用70％乙醇洗滌沉淀，冷凍干燥，所得DNA于-20℃下保存備用。
所述的一種人胰島素重組基因方法中所述的重組質粒(pCMV/ImhINS)DNA的提取方法g還包括將擴增所得上清液加入0.6倍體積異丙醇室溫放置30分鐘，離心，70％乙醇洗滌沉淀，冷凍干燥；加等體積飽和重蒸苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)抽提上層水相，加入1/10體積3mol/L NaAc、2倍體積無水乙醇或異丙醇，室溫放置30分鐘，室溫離心，70％乙醇洗滌沉淀，冷凍干燥；將所得DNA溶于TE緩沖液中，加入核糖核酸酶(Rnase)至其終濃度為20μg/ml，37℃放置30分鐘，加等體積飽和重蒸苯酚∶氯仿∶異戊醇＝25∶24∶1抽提，上層水相進行Sepharose CL4B柱層析，檢測洗脫液OD260，收集第一峰，收集液加入1/10體積3mol/L NaAc、2倍體積無水乙醇，4℃放置30分鐘以上，離心，70％乙醇洗滌沉淀，冷凍干燥所得DNA于-20℃下保存備用。
本發明所述的人胰島素重組基因作為治療糖尿病藥物的應用，其特征在于人胰島素重組基因可以作為臨床上治療糖尿病的藥物原料，制成臨床上治療糖尿病的凍干粉末制劑形式/靜脈及肌肉注射溶液制劑形式、脂質體制劑形式、微膠囊制劑形式。
本發明的人胰島素重組基因在體內外轉染實驗中取得了良好結果，提高了胰島素和C肽表達量。本發明的技術進步意義是利用人胰島素重組基因可直接制備制備治療糖尿病的藥物制劑或者用于合成人胰島素。
下面結合附圖和實施例詳細說明本發明的技術內容圖1是本發明人胰島素重組基因制備流程2是本發明人胰島素重組基因全序列圖2中人胰島素重組基因序列長度為1789個堿基，501-590堿基為決定胰島素的B鏈氨基酸，1557-1616堿基為決定胰島素的A鏈氨基酸，591-687、1474-1544堿基為決定胰島素的C肽氨基酸，如圖所示突變堿基AAG CGC位于第669-674堿基，突變堿基GGA位于第1536-1538堿基，突變堿基CGG位于1542-1544堿基，即突變堿基都位于C肽上，圖中的定點突變堿基密碼子用下劃線表示，原堿基密碼子寫在突變堿基下方。添加的第一內含子部分位于第305-483堿基，用括號括出(GTCTGT……CAG)。
本發明的制備方法實施例人胰島素DNA定點突變引物15＇-CTGCAGGTCCTCGCGCTTCCGGCGGGTC-3＇人胰島素DNA定點突變引物25＇-CACGCTTCTGCCGGGATCCCTC-3＇定點突變引物1和2由北京大學用ABI381A DNA合成儀合成。第一內含子特異性引物15＇-GTTCTAGACAGGCTGCATCAG-3＇第一內含子特異性引物25＇-TACCATGGCAGAAGGACAGTG-3＇第一內含子特異性引物1和2委托由TAKARA公司合成。1、制備突變載體和突變模板用NcoI和SphI DNA限制性內切酶(購自promega公司，美國)將人胰島素基因組基因DNA片段取下，克隆進M13mp18噬菌體(由中國農大生物學院動物生化室提供)內，作為突變用載體，該噬菌體內含尿嘧啶的單鏈DNA為突變用“U”模板。方法在無菌微量離心管內混合人胰島素基因組DNA 1μL(0.1-0.4μg)酶切緩沖液2μL(購自promega公司，美國)NcoI和SphI 1U/μg DNA加水至20μL37℃反應1小時，0.4％瓊脂糖凝膠電泳回收1.3kb酶切產物，將M13mp18用SmaI和SphI(購自promega公司，美國)雙酶切，用連接酶將1.3kb酶切產物與M13mp18連接，構建成突變用載體M13mp18/INS，提取該噬菌體的單鏈含尿嘧啶的DNA，即為定點突變用“U”模板。2、定點突變利用突變引物1、2與T4 DNA聚合酶(購自promega公司，美國) 進行寡核苷酸介導的定點突變，并克隆該噬菌體及其提取DNA，方法(1)、突變引物的5’端引物OH磷酸化引物(1或2)100至200pmol加入T4多核苷酸激酶緩沖液2μL(購自promega公司，美國)10mmol/L的腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)1μL(購自promega公司，美國)T4多核苷酸激酶4U(購自promega公司，美國)加水至20μL37℃水浴反應1小時，68℃水浴加熱10分鐘滅活酶。(2)、突變引物與單鏈DNA“U”模板雜交和延伸反應a.退火反應(在1.5ml小管中進行)單鏈DNA“U”模板0.5pmol磷酸化的引物1 10pmol磷酸化的引物2 10pmolT4DNA聚合酶緩沖液1μl(購自promega公司，美國)加水至 10μl將小離心管置68℃水浴5分鐘，然后放入一個100ml燒杯中，燒杯內含溫度為60℃的水，置燒杯于室溫，使小管內反應緩慢冷卻至室溫(需1-2小時)，短暫離心5秒以收集管壁上水滴。b.延伸反應I、將一新離心管置冰上，準備下面延伸反應混合液T4DNA聚合酶緩沖液1μl(購自promega公司，美國)4種脫氧核苷三磷酸(dNTP要達到500μmol/L)每種 1μl10mmol/L的腺嘌呤核苷三磷酸(ATP) 1μlT4DNA連接酶緩沖液 2μl(購自promega公司，美國)T4DNA聚合酶3 U(購自promega公司，美國)T4DNA連接酶4 U(購自promega公司，美國)加水至 10μlII、向a退火反應管中加入10μl延伸反應混合液，首先冰浴放置5分鐘，室溫放置5分鐘，37℃水浴1-2小時，最后將反應管置于10-16℃過夜。(3)、對JM109F＇大腸桿菌的轉染和突變體的篩選接種JM109F＇大腸桿菌(由中國農大生物學院動物生化室提供)單菌落于10ml LB液種，37℃振蕩培養至OD600＝0.3時，于4℃，離心力3500g離心收集細胞，加入20ml冰冷的75mM CaCl2溶液，懸浮后冰浴20分鐘。離心力3000g離心收集細胞，將細胞溶于冰冷的4ml 75mM CaCl2、15％甘油溶液中，使菌體成為感受態細胞。取2管100μl感受態JM109F＇大腸桿菌，分別加入過夜的延伸反應物1μl、5μl，混勻后冰浴30分鐘，42℃熱沖擊2分鐘，再冰浴5分鐘。與100μl對數生長期的JM109F＇大腸桿菌及4ml溶化的頂層瓊脂(購于Promega公司，美國)培養基混合均勻，鋪于LB固體培養基上。37℃培養6小時后，待噬菌斑出現，用EcoRI和BamHI(購于Promega公司，美國)對突變后的噬菌體M13mp18/INS RF DNA(定點突變人胰島素基因的M13mp18復制型DNA)進行酶切鑒定，若切出1kb的片段，即認為是陽性克隆，對該陽性克隆進一步做DNA序列分析，證實兩個位置都突變成功，該基因的其它序列完全正確。3、構建表達載體將突變后的人胰島素基因組基因DNA約1.3kb片段，經ApaI DNA限制性內切酶(購自promega公司，美國)切下回收，克隆進質粒PRC/CMV(由中國農大生物學院動物生化室提供)的多克隆位點上，構建成定點突變人胰島素基因組基因質粒表達載體(pCMV/mhINS質粒)。方法混合下列溶液于一無菌微量離心管內定點突變人胰島素基因組DNA1μL(0.1-4μg)酶切緩沖液2μL加限制性內切酶ApaI(購自promega公司，美國)1U/μg DNA加水至 20μL37℃反應1小時，0.4％瓊脂糖凝膠電泳回收1.3kb酶切產物，將pRC/CMV用ApaI酶切，用連接酶將1.3kb酶切產物與pRC/CMV連接，構建成定點突變人胰島素基因組基因質粒(pCMV/mhINS質粒)；4、擴增連接方法利用第一內含子特異性引物1、2從人胰島素基因組基因DNA中將第一內含子擴增約0.23kb的DNA片段；定點突變人胰島素基因組基因質粒(pCMV/mhINS質粒)經XbaI、BamHI、NcoI、SacI、ApaI等DNA限制性內切酶(購自promega公司，美國)進行酶切后，70℃加熱10分鐘滅活DNA限制性內切酶，并補加脫氧核苷三磷酸(dNTP)和Klenow(大片段酶)，以補平酶切后定點突變人胰島素基因組基因質粒斷端；經T4 DNA連接酶(Ligase購自promega公司，美國)與第一內含子DNA片段連接構建成含第一內含子的定點突變人胰島素基因組基因重組質粒(pCMV/ImhINS)。5、重組質粒(pCMV/ImhINS)的克隆擴增重組質粒DNA轉化入大腸桿菌DH5a(由中國農大生物學院動物生化室提供)后，進行細菌培養擴增。方法將大腸桿菌DH5a(含第一內含子的定點突變人胰島素基因組基因質粒)單菌落加入含氨芐青霉素50mg/L的細菌液體選擇培養基5ml(蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，pH7.0購自北京化學試劑公司)37℃振蕩培養8小時，作為種子培養液；按1/100比例將種子培養液加入500ml細菌液體選擇培養基(配方同上，另含50mg/L氨芐青霉素)37℃振蕩培養12-16小時，至OD600＝1.8-2.0，于4℃，離心力6000g離心10分鐘收集菌體。裂解菌體方法將離心收集的菌體加50ml預冷溶液(葡萄糖50mmol/L，Tris-HCl 25mmol/L，EDTA10mmol/L，pH8.0購自北京化學試劑公司)懸浮菌體，加50ml新配置的裂解溶液裂解菌體(NaOH 0.2mol/L，1％十二烷基磺酸鈉購自北京化學試劑公司)室溫放置5分鐘，每管加50ml緩沖溶液(3mol/L KAc，5mol/L HAc，購自北京化學試劑公司)，冰浴30分鐘，于4℃，離心力20000g，離心20分鐘取上清液，重復離心一次，至上清液澄清。7、重組Pcmv/ImhINS質粒DNA的提取方法1將所得上清液加入0.6倍體積異丙醇室溫放置30分鐘，室溫離心力20000g離心20分鐘，70％乙醇洗滌沉淀，冷凍干燥；將所得DNA溶于15mlTE緩沖液中(三羥甲基胺基甲烷(Tris)10mmol/L，EDTA1mmol/L，pH8.0購自北京化學試劑公司)，加等量5mol/L LiCl，于4℃、離心力15000g離心10分鐘，取上清；加等體積異丙醇室溫放置30分鐘，室溫離心力20000g離心20分鐘，70％乙醇洗滌沉淀，冷凍干燥；加入1mlTE緩沖液溶解沉淀，加入核糖核酸酶(Rnase購自Sigma公司)至其終濃度為20ug/ml，于37℃放置1小時，加等體積飽和重蒸苯酚∶氯仿∶異戊醇＝25∶24∶1抽提，于4℃，離心力10000g，離心5分鐘，取上清；加等體積氯仿抽提，取上清；重復以上抽提步驟一次；加1/10體積3mol/L NaAc、2倍體積無水乙醇，4℃放置30分鐘以上；于4℃，離心力10000g離心10分鐘，取沉淀；用70％乙醇洗滌沉淀，冷凍干燥，所得DNA于-20℃下保存備用。方法2將所得上清液加入0.6倍體積異丙醇室溫放置30分鐘，室溫離心力20000g離心15分鐘，取上清液，加等體積飽和重蒸苯酚∶氯仿∶異戊醇＝25∶24∶1抽提上層水相，加入1/10體積3mol/L NaAc、2倍體積無水乙醇或異丙醇，室溫放置30分鐘，室溫離心力20000g離心20分鐘，70％乙醇洗滌沉淀，冷凍干燥；將所得DNA溶于15ml TE緩沖液中(Tris 10mmol/L，EDTA 1mmol/L，pH8.0)，加入核糖核酸酶(Rnase購自Sigma公司)至其終濃度為20ug/ml，37℃放置30分鐘，加等體積飽和重蒸苯酚∶氯仿∶異戊醇＝25∶24∶1抽提，上層水相進行Sepharose CL4B柱層析(購于promega公司)，檢測洗脫液OD260，收集第一峰，收集液加入1/10體積3mol/L NaAc、2倍體積無水乙醇，4℃放置30分鐘以上；于4℃，離心力10000g離心10分鐘，取沉淀；70％乙醇洗滌沉淀，冷凍干燥所得DNA于-20℃下保存備用。
重組質粒pCMV/ImhINS(含第一內含子的定點突變人胰島素基因組基因質粒)的體外轉染實驗直接選擇大白鼠體內肝細胞和骨骼肌細胞作為靶細胞，進行體外細胞培養體外培養細胞，含第一內含子的定點突變人胰島素基因組基因質粒轉染載體選擇陽性離子脂質體Lipofectamine(購自GIBCO-BRL公司，美國)作轉染載體。實驗方法按Lipofectamine產品說明書執行，獲得了較好的轉染效果。經測定培養液中胰島素濃度為10.45μIu/ml，C肽為0.67ng/ml，而不含第一內含子的培養液中胰島素濃度為5.5μIu/ml，C肽未測出。
本發明的人胰島素重組基因作為治療糖尿病藥物的應用，可以作為臨床上治療糖尿病的藥物原料，如合成胰島素等，或者直接制成臨床上治療糖尿病的凍干粉末制劑形式靜脈及肌肉注射溶液制劑形式、脂質體制劑形式、微膠囊制劑形式等。
權利要求
1.一種人胰島素重組基因序列(見附圖1)，序列長度1789個堿基，重組序列特征為第669-674堿基是密碼子AAG、密碼子CGC；第1536-1538堿基是密碼子GGA；第1542-1544堿基是密碼子CGG；第305-483個堿基是擴增的第一內含子。
2.一種人胰島素重組基因制備方法，包括a.制備突變載體和突變模板用限制性內切酶NcoI和SphI將人胰島素基因組基因DNA片段取下，克隆進M13mp18噬菌體內，作為突變用載體，該噬菌體內含尿嘧啶的單鏈DNA作為突變用模板；b.定點突變利用定點突變引物15′-CTGCAGGTCCTCGCGCTTCCGGCGGGTC-3＇、定點突變引物25′-CACGCTTCTGCCGGGATCCCTC-3＇與T4DNA聚合酶進行寡核苷酸介導的定點突變，并克隆該噬菌體及其提取DNA；突變位點第669-674、1536-1538、1542-1544個堿基；c.構建成表達載體將突變后的人胰島素基因組基因DNA 1.3kb片段，經DNA限制性內切酶ApaI切下回收，克隆進質粒PRC/CMV的多克隆位點上，構建成定點突變人胰島素基因組基因質粒(pCMV/mhINS質粒)；d.補平酶切后質粒斷端定點突變人胰島素基因組基因質粒(pCMV/mhINS質粒)經DNA限制性內切酶XbaI、BamHI、NcoI、SacI、ApaI酶切后，70℃加熱10分鐘滅活DNA限制性內切酶，并補加核苷三磷酸和大片段酶，以補平酶切后定點突變人胰島素基因組基因質粒斷端；e.擴增連接利用第一內含子特異性引物15＇-GTTCTAGACAGGCTGCATCAG-3＇、第一內含子特異性引物25＇-TACCATGGCAGAAGGACAGTG-3＇從人胰島素基因組基因DNA中將第一內含子擴增0.23kb的DNA片段；經DNA連接酶(Ligase)與pCMV/mhINS質粒連接構建成含第一內含子的定點突變人胰島素基因組基因重組質粒(pCMV/ImhINS)，第一內含子位點第305-483個堿基；f.重組質粒pCMV/ImhINS的克隆擴增重組質粒DNA轉化入大腸桿菌DH5a后，進行細菌培養擴增；g.重組Pcmv/ImhINS質粒DNA的提取在大腸桿菌中復制的重組質粒經分離抽提、沉淀冷凍干燥制成人胰島素重組基因。
3.根據權利要求2所述的一種人胰島素重組基因制備方法，其特征在于所述的構建突變用載體的方法a.包括混合人胰島素基因組DNA 1μL(0.1-0.4μg)、酶切緩沖液2μL，限制性內切酶NcoI和SphI 1U/μgDNA、加水至20μL，37℃反應1小時；0.4％瓊脂糖凝膠電泳回收1.3kb酶切產物；將M13mp18用限制性內切酶SmaI和SphI雙酶切，用連接酶將1.3kb酶切產物與M13mp18連接，構建成突變用載體M13mp18/INS；提取該噬菌體的單鏈含尿嘧啶的DNA，作為定點突變用“U”模板。
4.根據權利要求2所述的一種人胰島素重組基因制備方法，其特征在于所述的基因定點突變方法b包括(1)、突變引物的5’端引物OH磷酸化；(2)、突變引物與單鏈DNA“U”模板雜交和延伸反應；(3)、對JM109F＇大腸桿菌的轉染和突變體的篩選。
5.根據權利要求4所述的一種人胰島素重組基因制備方法，其特征在于所述的突變引物的5’端引物OH磷酸化方法包括將突變引物1或2取100-200pmol、加入T4多核苷酸激酶緩沖液2μL、10mmol/L的腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)1μL、T4多核苷酸激酶4U，加水至20Ml，37℃水浴反應1小時，68℃水浴加熱10分鐘滅活酶。
6.根據權利要求4所述的一種人胰島素重組基因制備方法，其特征在于所述的突變引物與單鏈DNA“U”模板雜交和延伸反應方法包括a.退火反應單鏈DNA“U”模板0.5pmol與磷酸化的“引物1”10pmol、磷酸化的“引物2”10pmol、T4DNA聚合酶緩沖液1μl、加水至10μl，置68℃水浴5分鐘，緩慢冷卻至室溫，短暫離心以收集管壁上水滴；b.延伸反應混合T4DNA聚合酶緩沖液1μl、4種脫氧核苷磷酸(dNTP要達到500μmol/L)每種1μl、10mmol/L的腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)1μl、T4DNA連接酶緩沖液2μl、T4DNA聚合酶3U、T4DNA連接酶4U、加水至10μl；向a退火反應收集的溶液中加入10μl延伸反應混合液，首先冰浴放置5分鐘，室溫放置5分鐘，然后于37℃水浴1-2小時，最后將反應產物置于10-16℃過夜。
7.根據權利要求4所述的一種人胰島素重組基因制備方法，其特征在于所述的對JM109F＇大腸桿菌的轉染和突變體的篩選方法包括接種JM109F＇大腸桿菌單菌落于10ml LB液種，37℃振蕩培養至OD600＝0.3時，于4℃離心收集細胞，加入20ml冰冷的75mmolCaCl2溶液，懸浮后冰浴20分鐘，離心收集細胞，將細胞溶于冰冷的4ml 75mmolCaCl2、15％甘油溶液中，使菌體成為感受態細胞，取2管100μl感受態JM109F＇大腸桿菌，分別加入過夜的延伸反應物1μl、5μl，混勻后冰浴30分鐘，42℃熱沖擊2分鐘，再冰浴5分鐘。與100μl對數生長期的JM109F＇大腸桿菌及4ml溶化的頂層瓊脂培養基混合均勻，鋪于LB固體培養基上，37℃培養6小時后，待噬菌斑出現，用EcoRI和BamHI對突變后的噬菌體M13mp18/INS RF DNA進行酶切鑒定、DNA序列分析，證實兩個位置都突變成功，該基因的其它序列完全正確。
8.根據權利要求2所述的一種人胰島素重組基因制備方法，其特征在于所述的重組質粒pCMV/ImhINS的克隆擴增方法f包括將大腸桿菌DH5a(含第一內含子的定點突變人胰島素基因組基因質粒)單菌落加入含氨芐青霉素的50mg/L的細菌液體選擇培養基，37℃振蕩培養8小時，作為種子培養液；按1/100比例將種子培養液加入細菌液體選擇培養基，37℃振蕩培養12-16小時，至OD600＝1.8-2.0，于4℃離心收集菌體；加入預冷的溶液懸浮菌體，再加入NaOH 0.2mol/L，1％十二烷基磺酸鈉裂解溶液裂解菌體，室溫放置5分鐘，加入KAc-HAc緩沖溶液，冰浴30分鐘，于4℃離心20分鐘，取上清液，重復離心一次，至上清液澄清。
9.根據權利要求2所述的一種人胰島素重組基因制備方法，其特征在于所述的重組質粒(pCMV/ImhINS)DNA的提取方法g包括將擴增所得上清液加入0.6倍體積異丙醇室溫放置30分鐘，離心，70％乙醇洗滌沉淀，冷凍干燥；將所得DNA溶于TE緩沖液中，加等量5mol/L LiCl，于4℃離心取上清；加等體積異丙醇室溫放置30分鐘，室溫離心，70％乙醇洗滌沉淀，冷凍干燥；加入1mlTE緩沖液溶解沉淀，加入核糖核酸酶(Rnase)至其終濃度為20ug/ml，于37℃放置1小時，加等體積飽和重蒸苯酚∶氯仿∶異戊醇＝25∶24∶1抽提，于4℃離心取上清；加等體積氯仿抽提，取上清；加1/10體積3mol/L NaAc、2倍體積無水乙醇，4℃放置30分鐘以上；于4℃離心取沉淀；用70％乙醇洗滌沉淀，冷凍干燥，所得DNA于-20℃下保存備用。
10.根據權利要求9所述的一種人胰島素重組基因制備方法，其特征在于所述的重組質粒(pCMV/ImhINS)DNA的提取方法g還包括將擴增所得上清液加入0.6倍體積異丙醇室溫放置30分鐘，離心，70％乙醇洗滌沉淀，冷凍干燥；加等體積飽和重蒸苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)抽提上層水相，加入1/10體積3mol/L NaAc、2倍體積無水乙醇或異丙醇，室溫放置30分鐘，室溫離心，70％乙醇洗滌沉淀，冷凍干燥；將所得DNA溶于TE緩沖液中，加入核糖核酸酶(Rnase)至其終濃度為20ug/ml，37℃放置30分鐘，加等體積飽和重蒸苯酚∶氯仿∶異戊醇＝25∶24∶1抽提，上層水相進行Sepharose CL4B柱層析，檢測洗脫液OD260，收集第一峰，收集液加入1/10體積3mol/L NaAc、2倍體積無水乙醇，4℃放置30分鐘以上，離心，70％乙醇洗滌沉淀，冷凍干燥所得DNA于-20℃下保存備用。
11.一種人胰島素重組基因作為治療糖尿病藥物的應用，其特征在于人胰島素重組基因作為臨床上治療糖尿病的藥物原料，制成治療糖尿病的凍干粉末制劑形式、注射溶液制劑形式、脂質體制劑形式、微膠囊制劑形式。
全文摘要
本發明提供提供一種在C肽氨基酸上完成的定點突變人胰島素基因,并添加第一內含子重組改建,重組序列特征為第669－674堿基是密碼子AAG、密碼子CGC;第1536－1538堿基是密碼子GGA;第1542－1544堿基是密碼子CGG;第305－483個堿基是擴增的第一內含子。本發明的人胰島素重組基因作為治療糖尿病藥物的應用,可以作為臨床上治療糖尿病的藥物原料或者直接制成臨床上治療糖尿病的各種制劑形式。
文檔編號A61P3/00GK1321746SQ01110268
公開日2001年11月14日 申請日期2001年4月5日 優先權日2001年4月5日
發明者姚文彬, 吳以嶺, 田書彥, 曹月青, 胡建立 申請人:河北以嶺醫藥研究院