專利名稱：狄喬治氏綜合癥的相關新基因及其蛋白的制作方法
技術領域：
本發明屬于分子生物學領域，涉及采用酵母雙雜交系統和EST-PCR-RACE克隆技術尋找小兒先天性心臟病的相關基因以及在狄喬治氏綜合癥(DGS-DiGeorge syndrome)的診斷和治療中的應用。
先天性心臟病(CHD-congenital heart disease)是所有人類生育缺陷中最常見的疾病。每年約有3萬多新生兒患有CHD病，它是出生后第一年引起死亡的最主要原因。狄喬治氏綜合癥是先天性心臟病的典型代表之一。在新生兒其發病率是四千分之一[Pediatric Research 48:717-724,2000]。該綜合癥主要表現在耳朵畸形、腭裂、副甲狀腺發育不足、胸腺-T細胞缺損、間斷性主動脈弓、溢出徑畸形以及胸腺發育不全。絕大多數(90％)狄喬治氏綜合癥患者具有染色體22q11.2區域的缺失，其長度達3百萬堿基對(3-Mb)[Current protocols in molecular biology1996；J Endocrinology 1998,139:4870-4880；Am J Hum Genet,61:620-629,1997]。也有部分病人存在約2百萬堿基對(2-Mb)的缺失，但缺失的部位與常見缺失部位僅有部分區域相同，如圖1所示。另有報道稱，染色體17p13位點的缺失也能引起類似DGS癥狀[Am.J.Med.Genet.31:1-4,1988]雖然，狄喬治氏綜合癥已經研究了三十多年，并且證明染色體22q11.2和17p13缺失與該疾病有關，可是到目前為止沒有任何單一基因被證明能引起該綜合癥。某些基因，例如HIRA和UFDIL存在于22q11.2部位，并且是在DGS患者受到影響的組織中得到表達[Circ Res 84:127-135,1999,Science 283:1158-1161]。然而，鼠單缺失HIRA或UFDIL顯然屬于正常情況[Nature 401:379-383,1999]。由于大部分病人被檢測到的缺失達幾百萬堿基對，越來越多的證據表明，這一綜合癥可能是由多基因聯合控制的[Pediatric Research 48:717-724,2000]。
本發明闡明了三個與DGS相關的基因FKSG1、FKSG3和FKSG4的克隆、表達產物的鑒定和制備。其目的是提供三種新的多核苷酸序列，提供三種新的蛋白以及利用重組技術生產所述新蛋白的方法，同時還提供這些新基因和蛋白在診斷和治療狄喬治氏綜合癥中的應用。
本發明的內容與技術方案如下1 DGS相關基因FKSG1的克隆為了鑒別存在于DGS病人經常缺失的22q11.2區域內的新基因，本發明采用了一種特殊的cDNA克隆方法[Life Sciences63(17):1555-1562,1998]。該方法綜合采用了cDNA選擇、EST(expressed sequence tag)定位、基因組DNA序列分析、PCR反應以及克隆末端延展(RACE-Rapid amplification of cDNA ends)等技術。本發明根據所涉及的幾個要素的組合從NCBI的EST數據庫進行檢索，結果表明存在217個陽性克隆片段，用來自每一個陽性克隆的cDNA片段與NCBI的GenBank中所報道的已知基因進行比較，進一步分析比較結果，發現有一個EST克隆(AA312178)含有328個堿基對，該序列與任何已知的序列均不相同，但存在于基因組序列片段(AC000089)。如圖1所示，AC000089存在于DGS病人常缺失區域。AA312178在AC000089片段中存在于3個不同的部位。AA312178中的頭96個堿基與AC000089片段中37192-37094部位的堿基完全相同；AC312178中的97-259堿基與AC000089片段中28946-28783部位的堿基一樣；而AA312178中的最后部位260-328與AC000089中23255-23228區域的堿基相吻合。這些結果表明，EST AA312178克隆含有1個未知新基因的部分片段，用AA312178的核苷酸序列進一步查詢EST數據庫發現，AI870670克隆與AA312178部分相重疊。
繼而合成了兩個引物引物A5’-TCGGTCTCTGGACGCTGCGCGGCG-3’來自AA312178(SEQ IDNO.1)引物B5’-CGTCTTGGAGGGCATCTCCAGAAT-3’來自AI870670(SEQ IDNO.2)以人體心臟cDNA文庫(pGAD10作為文庫載體，購自Clontech公司)為模板，采用(SEQ ID NO.1)和(SEQ ID NO.2)進行PCR反應。PCR條件為93℃2分鐘，隨之以93℃30秒、62℃30秒和72℃1分鐘進行30個循環，最后72℃延伸4分鐘，瓊脂糖電泳顯示獲得了一個0.6kb的PCR產物，進一步用RACE方法，首先合成引物C、D、E、F。引物C5’-ACTACAATGGATGATGTATATAACT-3’(SEQ ID NO.3)來自
pGAD10第761-785核苷酸(基因庫查詢編號U13188)，引物D5’-GACCTCGGCGATCCCGGGATT-3’(SEQ ID NO.4)來自0.6kb PCR產物第45-65核苷酸，引物E5’-TTCGATGATGAAGATACCCCA-3’(SEQ ID NO.5)來自文庫載體pGAD10第791-811核苷酸，引物F5’-GAGTTCATGAGTCCCACGCACC-3’(SEQ ID NO.6)來自0.6kb PCR產物第21-42核苷酸，用引物C和D以人體心臟cDNA文庫作為模板，通過PCR方法擴增5’末端產物，然后用該產物作為模板，用引物E和F再次擴增，獲得了一個1507bp的cDNA片段(SEQ ID NO.7)(圖2a)。該cDNA編碼含有327個氨基酸的蛋白(SEQ IDNO.8)(圖2b)。在編碼蛋白質起始位點前177bp處有一個終止序列(TAA)，進一步證明了這一蛋白起始位點的準確性。在cDNA的3’-末端有一個(AATAAA)序列，表明了該cDNA的完整性。所得到的cDNA序列已在NCBI基因庫注冊(編號AY007378,2000年8月25日送入，2000年9月14日公布)。本發明命名這一新基因為FKSG1(豐科盛公司一號基因)(圖3)。2000年11月2日NCBI給予FKSG1新編號NM021169(NM-常用于確認新基因的首創者)；2001年2月10日NCBI染色體注釋項目組給予FKSG1編號XM009843(XM-用以確認在染色體圖定位的新基因)，繼而給予FKSG1編號NT100519(NT-用以表示組成人類染色體圖的基因序列)，同時確認FKSG1存在于第22條染色體22q11并在HIRA和ARVCF基因之間(圖4)。該區域在90％DGS病人中表現為缺失。FKSG1存在于兩條基因組序列(AC000076和AC000089)中，并且由7個不同的外顯子(exon)所組成(圖5)。該基因主要表達于人體心臟組織，也在肝臟、肌肉以及腎組織中存在(圖6)。同源性序列比較表明，FKSG1與人體G蛋白中的β亞基結構具有21％的相同性和47％的相似性(圖7)。2 FKSG1在大腸桿菌中的表達本發明首先合成了含有BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位點的引物。引物G5’-ATCCGGATCCGCATGACGGCCCCCTGC-3’(SEQ ID NO.9)，引物H5’-TGCTGAATTCTCATGCGCGTGGGTAGAG-3’(SEQ ID NO.10)，用引物G和H，以及克隆的FKSG1 cDNA作為模板，通過PCR方法擴增了含BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位點的FKSG1 PCR產物，克隆的PCR片段經酶切后，連接到pGEX-5X載體上，連接后的重組質粒pGEX-5X/FKSG1轉入到大腸桿菌BL21細胞，含pGEX-5X/FKSG1的陽性轉化子在補加氨芐青霉素(Amp)100μg/ml的LB液體培養基中過夜培養。過夜培養物以1∶100稀釋后，接種到大體積培養基中，培養細胞至光密度600nm(OD600)為0.5-0.8，隨后加入IPTG(異丙基硫代-β-D半乳糖苷)至終濃度為1mM。通過使lacⅠ阻遏物失活，IPTG誘導啟動子導致基因表達水平提高，繼續培養細胞3小時，隨后離心(6000×g20分鐘)，收集細胞，用液氮處理，然后用超聲裂解包含體，離心除去不溶物，于上清液中加入50％谷胱甘肽-瓊脂糖珠，4℃反應1小時，離心收集瓊脂糖珠，用PBS緩沖液洗脫多次之后，從瓊脂糖珠中回收谷胱甘肽S轉移酶(GST)融合蛋白GST-FKSG1。用10％的SDS-PAGE膠進行電泳，鑒定表達蛋白的分子量大小約為65kDa(圖8)。因為GST的分子量約為28kDa，所以FKSG1的分子量推測為37kDa，從FKSG1序列(SEQ ID NO.8)進行推測，其理論值約為35.5kDa，因而表明大腸桿菌中表達的FKSGl與理論推測值基本一致。3 FKSG1在真核細胞(Hela細胞株)中的表達為了檢測FKSG1在真核細胞內的表達，本發明合成了一條含18個氨基酸的多肽PQFVLRGTQSPVHALHFC(SEQ ID NO.11)，其序列與FKSG1中的第12-28氨基酸完全相同。用純化的多肽來免疫家兔，從而獲得抗FKSG1的抗體，所產生的抗體可特異性地與合成的多肽以及細菌中分離得到的GST-FKSG1重組蛋白相結合。
本發明構建了在真核細胞表達FKSG1的載體，首先合成了二個引物用于PCR反應，使用的5’寡核苷酸引物序列為引物I5’-TTGAGAATTCATGACGGCCCCCTGCCCGCCG(SEQ ID NO.12)該引物含有EcoRⅠ酶切位點，在該酶切位點之后是包含起始密碼子的FKSG1編碼序列的21個核苷酸，3’端引物序列為引物J5’-CGATCTCGAGTCAGTCGCGTGGGTAGAGTGA(SEQ ID NO.13)該引物含有XhoⅠ限制性內切酶的酶切位點，一個翻譯終止子和FKSG1的部分編碼序列。用這二個引物通過PCR反應，從人體心臟cDNA中獲得編碼FKSG1的cDNA。這一cDNA片段插入到真核表達載體pcDNA3的EcoRⅠ-XhoⅠ位點。測序驗證，FKSG1的cDNA片段已正確地插入pcDNA3載體。用Lipofectamine的試劑將pcDNA3/FKSG1轉染到Hela細胞中，培養16小時之后，收集細胞，用PBS洗脫，然后用液氮處理5分鐘，加入3％SDS裂解液，在12％聚丙酰胺凝膠中電泳分離，電轉移至硝酸纖維膜，用TBS-T溶液(20ml 1M Tris HCl pH7.5；26.7ml 5M NaCl；1ml Tween20；1L dH2O)浸洗，用20ml封閉液(2.5g脫脂奶粉；50ml TBS-T)封閉1小時，然后用抗FKSG1抗體處理1小時(室溫)，經洗脫液(6g脫脂奶粉；600ml TBS-T)洗脫后，加入二抗體(抗兔HRP)處理1小時，洗膜3次之后，加入ECL試劑(Amersham Pharmacia Biotech公司產品)顯色(圖9)。FKSG1的分子量約為37kDa。
為了進一步定位FKSG1，將FKSG1/pcDNA3重組質粒轉染到Hela細胞之后，含有細胞的薄片用PBS緩沖液洗脫、干燥1小時后，用含有4％paraformadehyde的PBS液固定30分鐘，經PBS-T淋洗1次后，用抗FKSG1抗體檢測蛋白(圖10)。結果表明，FKSG1既存在于細胞質內，也存在于細胞核中。4 DGS相關基因FKSG3的克隆為了進一步了解FKSG1的作用機理，本發明采用了酵母雙雜交系統來尋找與FKSG1相互作用的蛋白。酵母雙雜交系統是一種以酵母的遺傳學分析為基礎，研究蛋白質與蛋白質相互作用的實驗體系。該體系是根據下述原理建立的酵母中半乳糖代謝通常是被GAL4和GAL80調節蛋白所控制，GAL4蛋白與其相關的上游激活序列(UAS)結合，即能激活參與半乳糖代謝的一系列基因的轉錄。在經詳細設計構建的酵母雙雜交系統中，酵母轉錄因子的DNA結合功能區(BD)和轉錄激活功能區(AD)在物理上和功能上均分別處于相對獨立的結構域中，單獨與BD結合的蛋白BD-X或與AD結合的AD-Y都不能啟動下游報告基因的轉錄，但BD-X與AD-Y相互作用可以重新形成有功能的轉錄因子，從而激活含有BD結合位點的啟動子下游報告基因(lacZ)的表達，表現為β-半乳糖苷酶的活性。如果在表達性基因文庫中存在AD-Y，則用BD-X可直接從該文庫中篩選與之相互作用的AD-Y基因序列。
本發明用FKSG1作為酵母雙雜交系統中的誘餌蛋白，從人胎兒心臟cDNA文庫(美國Clontech公司產品)篩選與之相互作用的蛋白。含有EcoRⅠ位點(N-末端)和XhoⅠ位點(C-末端)的FKSG1編碼片段插入到酵母雙雜交載體pGBT9相應位點，所構建的載體用來轉化酵母菌，利用科隆技術公司的酵母雙雜交系統-2在缺乏組氨酸、亮氨酸及色氨酸的SD培養基上，篩選約4×106酵母Y190轉化子，共得到34個陽性克隆，將陽性克隆轉移到濾紙上，在液氮罐中速凍、解凍，使細胞透化。將含有酵母細胞的濾紙浸泡在Z緩沖液(60mMNa2HPO4、40mMNaH2PO4、10mMKCl、10mM MgSO4、50mMβ-巰基乙醇和0.33mg/mlX-gal)中，然后將濾紙在30-37℃溫育2-24小時，有6個克隆呈藍色表型，表明其中β-半乳糖苷酶基因表達為陽性。提取陽性克隆中的DNA，經酶切分析表明，其中有一個克隆重組質粒含有615bp插入片段(圖11)。DNA測序以及氨基酸序列分析顯示，該片段含有114個氨基酸以及3′-末端未編碼區。用所獲得的氨基酸序列檢索NCBⅠ基因庫，結果表明，克隆得到的DNA片段座落在第22條染色體22q11.2(圖1)，分布在四個exon(NCBⅠ基因庫，AP000553)(圖12)。
所分離得到與AD區域相連接的cDNA缺失了N末端的頭5個氨基酸。完整的cDNA編碼一種含有119個氨基酸的蛋白(NCBⅠ基因庫，AF060862)。根據基因組序列信息，本發明設計了2個特定的引物引物K5’-CAGCTGTGTGGACAGTGCCAC-3’(SEQ ID NO.14)引物L5’-TTTAAGTCATCAGTTGGTTAA-3’(SEQ ID NO.15)用這兩個引物，從人體胎兒心臟cDNA文庫中通過PCR方法，成功地克隆出一段完整的cDNA序列(SEQ ID NO.16)(圖13a)，現己送交NCBⅠ基因庫(2000年9月12目，登錄號AF305069，將于2001年10月1日公開)。該cDNA編碼的蛋白質能與FKSG1發生相互作用，該蛋白質被命名為FKSG3(SEQ ID NO.17)(圖13b)。FKSG3距FKSG1約1.5百萬堿基對。FKSG1和FKSG3都處于大多數DGS病人所缺失的部位。特別值得注意的是，FKSG3存在于常見缺失片段(約3Mb)與少見缺失片段(約2Mb)相交界的區域(見圖1)。5 DGS相關基因FKSG4的克隆在研究與FKSG3結構相似的蛋白質過程中，本發明注意到有一段94kb長的基因組序列來自第17條人體染色體(NCBⅠ基因庫登錄號AC005667)，在該片段中含有與FKSG3幾乎完全相同的氨基酸序列。利用這一基因組序列進一步檢索所公布的染色體定位數據，結果表明，該94kb片段位于染色體17p13位點上。同一相似蛋白家族的一個成員(FKSG3)位于22q11.2，而另一成員(94kb中的基因組序列)位于17p13，這一發現對文獻報道的有些DGS患者在第22條染色體上有缺損，而另一些忠者在第17條染色體上有異常的現象，從基因水平提供了解釋。
根據FKSG3及AC005667提供的17p13基因組序列信息，本發明設計了二個引物引物M5’-CATCACCAGTGTGTGGAGCCT-3’(SEQ ID NO.18)引物N5’-TTGTTTTCAGCCAAAAACTAG-3’(SEQ ID NO.19)用引物M和N通過PCR方法，從人體胎兒心臟cDNA文庫中克隆了一段755bp的cDNA序列(SEQ ID NO.20)(圖14a)。該片段編碼一個含有119個氨基酸的蛋白(SEQ ID NO.21)(圖14b)，本發明將其命名為FKSG4(2000年9月12日遞交NCBⅠ基因庫，登錄號AF305195，將于2001年10月公布)。6 FKSG3和FKSG4在真核細胞內的表達和定位為了觀察FKSG3和FKSG4這一家族成員在細胞內的表達情況以及功能分析，本發明首先將HA標簽肽(MYPYDVPDYA)基因與編碼FKSG3和FKSG4的基因相連，然后構建到真核表達載體(pcDNA3)中，從而能夠通過檢測HA標簽肽來觀察FKSG3和FKSG4在體內的表達。Hela細胞培養是在含有10％胎牛血清的Dulbecco’s培養基平皿中進行。當細胞生長分布至50-80％平皿時，將5μg質粒DNA(pcDNA3/HA-FKSG3或pcDNA3/HA-FKSG4)加入500μl無抗生素和無血清的Dulbecco’s培養基，加入30μl Lipofectamine試劑(美國生命技術公司)室溫保持20-40分鐘，再用培養基(含10％胎牛血清，1％抗生素)稀釋5倍，將DNA/脂質體直接加在所培養的Hela細胞上，繼續培養16小時，收集細胞，加入裂解緩沖液(德國寶靈曼公司產品)，在10-15％聚丙酰胺凝膠中電泳分離，電轉移至硝酸纖維膜，用20ml封閉液[30％BSA 1ml加TBS(Tris-HCL1M pH7.5 50ml；5MNaCL 30ml；H2O 920ml)19ml]封閉1小時，加20μg HA抗體(Santa Crus Biotech公司)，保溫1-2小時，用TBST緩沖液(0.5MNaCL,20mMTris pH8.0,0.01％Tween20)洗滌3-5次，再加羊抗鼠二抗辣根過氧化物酶溫育1-2小時，洗膜3次，加ECL試劑(Amersham Pharmacia Biotech公司產品)顯色(圖15)。FKSG3和FKSG4具有相同大小的蛋白產物。從理論上判斷FKSG3和FKSG4的分子量約為15kDa。本發明所觀察到的產物與理論判斷值基本一致。FKSG3在細胞中比FKSG4有更強的表達。
為了進一步將FKSG3和FKSG4在細胞中定位，本發明用pcDNA3/HA-FKSG3或pcDNA/HA-FKSG4轉染Hela細胞，16小時培養之后，用PBS緩沖液洗滌，然后干燥1小時，再用含有4％paraformaldehyde的PBS固定30分鐘。固定細胞之后，用PBS洗滌5次，用10％羊血清+PBST封閉30分鐘，再用PBST淋洗一次，用抗HA羊克隆抗體檢測蛋白，結果顯示，FKSG3和FKSG4既存在于細胞質內，也存在于細胞核中(圖16)。7 FKSG3和FKSG4在大腸桿菌中的表達為使FKSG3和FKSG4在細菌中表達并能分離純化重組蛋白，本發明采用GST融合蛋白表達載體pGEX-5X-1，首先合成了含有BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位點的4個引物，引物O5’-GCGGGGATCCAGATGGTGAAAATGACAAAG-3’含有BamHⅠ酶切位點(SEQ ID NO.22)；引物P5’-CCAGGAATTCTTACTCCCAGCCATTGTCTTT-3’含有EcoRⅠ酶切位點(SEQ ID NO.23)；引物Q5’-TCAGGGATCCCAATGGTGAAGATGACAAGATCG-3’含有BamHⅠ酶切位點(SEQ ID NO.24)；引物R5’-TGCTGAATTCTCAGTCCCAGCCATTGTC-3’含有EcoRⅠ酶切位點(SEQ ID NO.25)。
用克隆的FKSG3 cDNA作為模板，用引物O和引物P，擴增了含BamHⅠ-EcoRⅠ酶切位點的FKSG3產物。用克隆的FKSG4 cDNA作為模板，用引物Q和引物R，擴增了含BamHⅠ-EcoRⅠ酶切位點的FKSG4產物。克隆的PCR片段經酶切后，連接到pGEX-5X-1載體上，組成pGEX-5X-1/FKSG3和pGEX-5X-1/FKSG4重組質粒。
分別將pGEX-5X-1/FKSG3和pGEX-5X-1/FKSG4轉化至大腸桿菌BL21細胞，在含有Amp(100μg/ml)的LB液體培養基中過夜培養，然后稀釋1∶100接種到大體積培養基中(500ml)，培養細胞至光密度600nm(OD600)為0.5-0.8，再加入IPTG至終濃度為1mM,3小時后離心(6000×g 20分鐘)收集細胞，經液氮處理后用超聲裂解包涵體，離心除去不溶物，于上清中加入50％谷胱甘肽-瓊脂糖珠，4℃處理60分鐘，離心收集瓊脂糖株，經PBS緩沖液洗滌多次后，從瓊脂糖珠中回收GST融合蛋白GST-FKSG3和GST-FKSG4，在12％的SDS-PAGE膠中電泳，結果顯示，GST蛋白分子量為～28kDa(第2行)，而GST-FKSG3(第3行)和GST-FKSG4(第4行)的分子量相同約為42kDa(圖17)，表明FKSG3和FKSG4的分子量約為14kDa，與理論推測值(13.5kDa)相一致。8 FKSG1與FKSG3和FKSG4相互作用的證實為證實FKSG1與FKSG3和FKSG4蛋白之間的相互作用，本發明將FKSG1編碼基因進行體外翻譯表達，并通過放射性同位素標記蛋白產物，檢測與FKSG3和FKSG4的結合情況。為此將含有FKSG1的pcDNA重組載體作為模板，用T7RNA聚合酶在TNT T7偶聯兔網狀細胞裂解液(Promega公司)中進行體外翻譯表達，用35S蛋氨酸標己FKSG1產物，所獲得的35S標記的FKSG1產物與含GST-FKSG3或GST-FKSG4或GST的Glutathione SepharoseTM4B相混合，在含150mMNaCl,1MmDTT,10mMTris-HCl,pH8.0溶液中溫育(30℃)60分鐘，離心后用緩沖液洗脫數次，能與GSF-FKSG3或GSF-FKSG4相結合的35S-FKSG1將留在Glutathione Sepharose上而不被洗脫，不能與GST相結合的35S-FKSG1將被洗脫。當最終產物經煮沸后用12％SDS-PAGE膠進行電泳，放射自顯影得到圖18結果。這些數據表明，35S-FKSG1能與GST-FKSG3或GST-KSG4結合，但不能與GST結合。
本發明的有益效果在于1．利用本發明設計的引物通過PCR方法可以制備FKSG1、FKSG3和FKSG4基因亦可通過含本發明的基因載體轉入宿主細胞，經對宿主細胞的大量培養增殖和提取、純化DNA獲得；同時亦可采用人工合成的方法得到有關核苷酸序列，經適當處理后，可實施其對基因缺失的DGS患者的基因治療或輔以其它方式的基因治療。
2．本發明提供的DGS相關基因產物可以在原核細胞及真核細胞中表達和制備，利用本發明所提供的含有SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.20所述核苷酸序列或其突變體重組質粒，轉入宿主細胞，在適合的培養條件和基因表達操作步驟中，分離、純化蛋白質，使之形成DGS的治療藥物或其組合藥物。
3．本發明還包含可用作探針的核苷酸序列，如編碼SEQ ID NO.11所述氨基酸序列的核苷酸序列，該探針可用于檢測樣品中是否存在編碼FKSG1的基因序列，以此來診斷DGS病。
4．本發明還以FKSG1部分片段免疫家兔為例，闡述了抗FKSG1特異性抗體的制備。采用同樣的方法，也可制備抗FKSG3和FKSG4的抗體。本發明涉及的抗體也可采用雜交瘤技術制備單克隆抗體。本發明的抗體可以用多肽合成儀合成，也可通過原核細胞或真核細胞得到基因產物免疫動物來制備，所獲得的抗體可以用來制備DGS病的診斷試劑。
圖1 狄喬治氏綜合癥患者染色體22q11.2區域缺失示意圖其中，標示了本發明FKSG1和FKSG3基因的所在部位及相對應的基因組序列片段圖2 FKSG1基因的核苷酸序列及氨基酸序列其中2a-FKSG1基因的核苷酸序列2b-FKSG1基因的氨基酸序列圖3 美國生物技術信息中心(NCBI)基因庫收錄的FKSG1基因信息圖4 FKSG1基因被NCBI確認并編入人體染色體圖的定位圖5 FKSG1基因的外顯子(exon)組成圖其中，1、2、3、4、5、6、7分別表示7個外顯子，FKSG1 cDNA來自基因組序列片段AC000076和AC000089圖6 FKSG1基因在人體不同組織中的表達(Northern blot)其中1-心臟2-腦3-胎盤4-肺5-肝6-骨骼肌
7-腎8-胰腺圖7 FKSG1與人體G蛋白β亞基的同源性比較其中-相同性·-相似性圖8 FKSG1與谷胱甘肽S轉移酶(GST)融合蛋白在大腸桿菌中的表達(12％SDS-PAGE)其中1-FKSG1與谷胱甘肽S轉移酶(GST)融合蛋白(65kDa)2-GST蛋白(～28kDa)圖9 FKSG1在真核細胞中的表達(Western blot)其中1-FKSG1/載體pcDNA3(37kDa)2-載體pcDNA3圖10 FKSG1在真核細胞中的定位其中1-FKSG1-HA在細胞質中的定位2-FKSG1-DAPI(4’,6’-diamidine-2-phenylindoledihydrochloride)在細胞核中的定位圖11酵母雙雜交實驗中與FKSG1呈陽性克隆的重組質粒酶切電泳圖，其中1-DNA分子量標準2-重組質粒-1BglⅡ酶切3-重組質粒-2BglⅡ酶切4-重組質粒-3BglⅡ酶切5-重組質粒-4BglⅡ酶切圖12 FKSG3基因在第22條染色體上的定位及外顯子(exon)組成13 FKSG3基因的核苷酸序列及氨基酸序列其中2a-FKSG3基因的核苷酸序列2b-FKSG3基因的氨基酸序列圖14 FKSG4基因的核苷酸序列及氨基酸序列其中2a-FKSG4基因的核苷酸序列2b-FKSG4基因的氨基酸序列圖15 FKSG3和FKSG4在真核細胞中的表達(Western blot)其中1-標簽肽(HA)-FKSG32-標簽肽(HA)-FKSG4圖16 FKSG3和FKSG4在真核細胞(Hela)中的定位其中1-FKSG3-HA在細胞質中的定位2-FKSG3-DAPI在細胞核中的定位3-FKSG4-HA在細胞質中的定位4-FKSG4-DAP1在細胞核中的定位圖17 FKSG3、FKSG4與谷胱甘肽S轉移酶(GST)融合蛋白在大腸桿菌中的表達(SDS-PAGE)其中1-蛋白質分子量標準2-GST蛋白3-GST-FKSG34-GST-FKSG4圖18 FKSG1與FKSG3和FKSG4蛋白相互作用(12％SDS-PAGE)其中1-35S蛋氨酸標記的FKSG1產物2-35S-FKSG1與GST反應后的產物3-35S-FKSG1與GST-FKSG3反應后的產物4-35S-FKSG1與GST-FKSG4反應后的產物
權利要求
1．狄喬治氏綜合癥(DGS)相關新基因及其蛋白，其特征在于所說的新基因FKSG1、FKSG3和FKSG4是從DGS患者染色體缺失區克隆、鑒定出來的；其編碼的蛋白之間具有相互作用；基因及其產物在原核細胞和真核細胞中均能進行表達和制備。
2．如權利要求1所述的DGS相關新基因及其蛋白，其特征是FKSG1含有如SEQ ID NO.7所說的核苷酸序列及SEQ ID NO.8所說的氨基酸序列。
3．如權利要求1所述的DGS相關新基因及其蛋白，其特征是FKSG3含有如SEQ ID NO.16所說的核苷酸序列及SEQ ID NO.17所說的氨基酸序列。
4．如權利要求1所述的DGS相關新基因及其蛋白，其特征是FKSG4含有如SEQ ID NO.20所說的核苷酸序列及SEQ ID NO.21所說的氨基酸序列。
5．如權利要求1或2所述的DGS相關新基因及其蛋白，其特征包括FKSG1所編碼的蛋白質，或其活性片段，或其活性突變體。
6．如權利要求1或3所述的DGS相關新基因及其蛋白，其特征包括FKSG3所編碼的蛋白質，或其活性片段，或其活性突變體。
7．如權利要求1或4所述的DGS相關新基因及其蛋白，其特征包括FKSG4所編碼的蛋白質，或其活性片段，或其活性突變體。
8．一組原核表達載體和真核表達載體，其特征是它們含有權利要求1所說的DNA分子。
9．如權利要求8所述載體轉化的宿主細胞。
10．如權利要求9所述宿主細胞包含大腸桿菌和真核細胞。
11．如權利要求5或6或7所述蛋白質的制備方法。
12．一組能與權利要求5或6或7所述蛋白質特異性結合的抗體。
13．用權利要求12所述抗體制備的DGS病的診斷試劑或治療藥物或藥物組合物。
14．權利要求1或2或3或4所述的新基因FKSG1、FKSG3和FKSG4，或其片段或其突變體，經過適當處理可直接用作DGS病的基因治療制劑。
全文摘要
本發明涉及小兒先天性心臟病狄喬治氏綜合癥(DGS)的相關新基因FKSG1、FKSG3和FKSG4及其新蛋白,所說的基因是從DGS患者染色體缺失區克隆、鑒定出來的,其編碼的蛋白之間具有相互作用,基因及其產物能在原核細胞和真核細胞中進行表達和制備,本發明還闡述了這些新基因和蛋白在診斷和治療狄喬治氏綜合癥中的應用。
文檔編號A61K38/17GK1314468SQ0110987
公開日2001年9月26日 申請日期2001年3月22日 優先權日2001年3月22日
發明者王以光, 龔利民, 葉冰冰 申請人:北京豐科盛功能基因技術有限公司