專利名稱：惡性腫瘤廣譜基因工程納米疫苗的制作方法
涉及基因工程技術。
我國惡性腫瘤在城市地區發病率居死因第一位，在農村居第二位，嚴重威脅人民健康和生命。近年，腫瘤疫苗在腫瘤防治上已顯示出一定效果，世界各國都在積極開展腫瘤疫苗研制，有的已進入臨床試驗，但由于種種原因，如腫瘤疫苗中的核心部分-抗原不理想、腫瘤疫苗中的輔助部分-免疫佐劑不理想、由于MHC限制及腫瘤異質性及長期以來，腫瘤疫苗制備工藝缺乏現代工程技術(例如納米技術)的滲透和開拓，致使一些困難問題，例如，疫苗的靶向性問題，抗原的有效遞呈問題，疫苗的緩釋問題等尚未得到解決。
本發明應用基因工程技術，制備MAGE1-Hsp-MAGE3融合蛋白和SEA的組合物，再以納米技術構建腫瘤納米疫苗可達到使用安全，抗瘤廣譜，免疫持久，活化CD4+T細胞、CD8+T細胞，共同參與免疫反應，有效殺傷腫瘤細胞，最終實現惡性腫瘤患者手術切除腫瘤后控制復發和轉移，降低死亡率的目的。
本發明的優點(1)使用安全；(2)抗瘤廣譜；(3)殺瘤效果強；(4)有一定靶向性；(5)使用簡便(皮下注射)。
本發明的技術方案選用腫瘤特異性共有抗原基因(黑色素瘤抗原1:MAGE1、黑色素瘤抗原3:MAGE3)與生物免疫佐劑熱休克蛋白(Hsp)基因，將兩種基因連接，構成融合基因(MAGE1-Hsp-MAGE3)，通過細菌表達，獲得其融合蛋白，經最新復性、純化技術，得到良好活性的蛋白，然后，將此蛋白與超抗原SEA(葡萄球菌腸毒素A)以一定比例組合，形成復合抗原物，最后，應用納米技術，制備納米脂質體，包裹復合抗原物，再通過N-羧基琥珀酰亞胺脂與Hsp連接，形成N-Hsp，將其插入納米脂質體磷脂膜外層，即構成腫瘤納米疫苗。
本發明的具體實施步驟1．腫瘤特異性共有抗原基因的選擇，克隆，質粒構建和原核表達抗原基因1:MAGE-1。
抗原基因2:MAGE-3。
根據MAGE-1、MAGE-3核苷酸序列，設計加酶切位點的引物，利用RT-PCR從腫瘤細胞內分別擴增MAGE-1和MAGE-3 cDNA，克隆入測序載體和表達載體，分別進行測序和原核表達，分別提取表達產物，親和層析純化，SDS-PAGE鑒定。2．Hsp70表達載體的構建及表達產物鑒定從Hsp70質粒(Hsp70)中PCR擴增Hsp cDNA，構建Hsp表達載體，常規方法原核表達，提取表達產物，親和層析純化，SDS-PAGE鑒定。3．選擇可活化CD4+T細胞抗原，已有SEA純品，可供使用。4．融合基因的構建根據文獻及計算機軟件分析，設計MAGE-1、MAGE-3、Hsp70三片段連接方式，分析柔性、疏水性、抗原性和表位狀況。
設計引物，PCR擴增，連接，獲得MAGE1-Hsp70-MAGE3片段，克隆入測序載體，測序，篩選核苷酸正確的陽性克隆備用。5．融合基因表達載體的構建測序載體中酶切出MAGE1-Hsp70-MAGE3，克隆入表達載體質粒，測序。6． 融合基因的表達及鑒定7． 蛋白表達產物的純化、變性、復性及蛋白水平檢測8． 融合蛋白功能分析以親和印跡分析或免疫斑點分析融合蛋白免疫學特征；以融合蛋白與相關腫瘤患者外周血單個核細胞(PBMC)共同培養，誘導CTL，以FACS或免疫細胞化學法檢測特異性CTL表面標志；M51Cr釋放試驗檢測殺傷狀況。9 ．MAGE1-Hsp70-MAGE3與SEA的組合；從產SEA標準菌株FRI100提取SEA或購得SEA純品，以融合蛋白與SEA混合，構成融合蛋白/SEA組合物，即復合抗原。10．腫瘤納米疫苗的構建；應用超聲技術制備空白脂質體；利用空白脂質體包裹MAGE-1、MAGE-3和SEA復合抗原物，形成納米脂質體疫苗。檢測納米脂質體的粒徑。
本發明惡性腫瘤廣譜基因工程納米疫苗的體內外免疫學特性實驗；(1) 體外試驗靶向性a．連續排除法分離外周血樹突狀細胞(DC)體外培養，獲得DC；b．分組試驗DC+納米疫苗DC+融合蛋白，DC+培養液以上培養30分鐘，應用FACS和免疫細胞化學方法觀察納米疫苗的靶向性。殺傷性a．DC+納米疫苗，培養4h；b．將該DC+PBMC，培養10～4d，得CTL；c．以相關腫瘤細胞(如肝癌HHCC等)為靶細胞+CTL，應用51Cr釋放法，觀察殺傷狀況。(2)體內試驗a．荷人腫瘤鼠模型的建立應用移植人HLA-A2配型外周血單個核細胞技術建立人化SCID鼠(SCID-hu)。
(注我國HLA-A2陽性人群達50％以上。)b．分組(a)SCID鼠皮下移植肝癌細胞SCID鼠皮下移植胃癌細胞SCID鼠皮下移植乳腺癌細胞(b)SCID-hu鼠皮下移植肝癌細胞SCID-hu鼠皮下移植胃癌細胞SCID-hu鼠皮下移植乳腺癌細胞(c)先分別給若干SCID-hu鼠一側皮下注射納米疫苗，兩周后在同一區域及對側皮下各移植肝癌細胞、胃癌細胞及乳腺癌細胞。
權利要求
1．惡性腫瘤廣譜基因工程納米疫苗，其特征是選用腫瘤特異性共有抗原基因(黑色素瘤抗原1:MAGE1、黑色素瘤抗原3:MAGE3)與生物免疫佐劑熱休克蛋白(Hsp)基因，將兩種基因連接，構成融合基因(MAGE1-Hsp-MAGE3)，通過細菌表達，獲得其融合蛋白，經最新復性、純化技術，得到良好活性的蛋白，然后，將此蛋白與超抗原SEA(葡萄球菌腸毒素A)以一定比例組合，形成復合抗原物，最后，應用納米技術，制備納米脂質體，包裹復合抗原物，再通過N-羧基琥珀酰亞胺脂與Hsp連接，形成N-Hsp，將其插入納米脂質體磷脂膜外層，即構成腫瘤納米疫苗。
全文摘要
惡性腫瘤廣譜基因工程納米疫苗,涉及基因工程技術,腫瘤疫苗在腫瘤防治上已顯示出一定效果。本發明選用腫瘤特異性共有抗原基因(黑色素瘤抗原1:MAGE1、黑色素瘤抗原3:MAGE3)與生物免疫佐劑熱休克蛋白(Hsp)基因,將兩種基因連接,制備MAGE1－Hsp－MAGE3融合蛋白和SEA的組合物,再以納米技術構建成腫瘤納米疫苗,可達到使用安全、簡便,抗腫瘤廣譜、免疫持久,有效殺傷腫瘤細胞,降低死亡率的目的。
文檔編號A61K39/085GK1319432SQ0110677
公開日2001年10月31日 申請日期2001年2月28日 優先權日2001年2月28日
發明者隋延仿 申請人:中國人民解放軍第四軍醫大學