用于胰島素依賴型糖尿病基因治療中的重組載體及治療性組合物的制作方法

專利名稱：用于胰島素依賴型糖尿病基因治療中的重組載體及治療性組合物的制作方法
技術領域：
本發明涉及適用于胰島素依賴型糖尿病基因治療中的重組載體，及包含作為有效成分的重組載體的藥物組合物。尤其地，本發明涉及一種有效且安全地治療胰島依賴型糖尿病的基因治療系統，其利用了果蠅P-轉座子的基因輸送能力及K14啟動子的組織特異性和表達增強性。
基因治療為治療人體疾病提供了一個新范例。確切而言與利用與基因產物相互作用或其自身是基因產物的制劑改變疾病表型不同的是，基因治療理論上可修飾特異的基因，因而在單次施用之后即可治愈疾病。開始時，基因治療預想用于治療遺傳疾病，但目前研究其用于治療廣譜疾病，包括癌癥，周圍血管病，關節炎，神經退化性疾病及其它后天的疾病。另外，與人類基因組計劃組合，基因治療期望在更多的疾病治療中起重大作用。對基因治療而言，基因輸送至細胞及其在細胞中的表達可人為調節，以便患者的突變的基因可通過基因重組而校正。
現有一些揭示基因治療的專利，例如，PCT公開號1997-27310要求了一種能用于基因治療的反轉錄病毒載體，PCT公開號1997-34009揭示了一種用于通過基因治療治療人體腫瘤的重組腺病毒載體。然而病毒載體只限于治療遺傳性疾病，這是從其安全角度及高度復雜的程序而考慮的。對這種患者利用病毒載體的基因治療耗時較長且花費較高。現有技術中沒有揭示非病毒胰島素載體。
作為所利用的燃料被肝臟過量產生及被其它器官利用的葡萄糖的不正常，糖尿病是一種由胰島素缺少所引起的代謝疾病。在各種糖尿病類型中，胰島素依賴型糖尿病(IDDM)稱為I型糖尿病，是由于胰腺產生胰島素的β細胞自身免疫破壞所致。目前，每年每7,000名兒童中就發生1起糖尿病，IDDM占所有新發生的糖尿病的3％。
目前用于治療IDDM的方法包括監測血糖，多次注射胰島素，特殊的飲食及鍛煉。盡管嚴格根據這種深入細致的糖尿病管理措施，僅能期望糖尿病情加重的患者有50-70％減輕。因此，需要開發更好的治療方法。
作為自我更新組織的表皮及其附屬物具有干細胞的區室，每個區室具有充分增殖能力以覆蓋機體表面，Greer等(1983)的先驅研究證實人皮膚角質形成細胞可在培養基中連續增殖至幾百代，因而用培養的皮膚角質形成細胞進行燒傷植皮手術，該手術目前廣泛用于醫院外傷科。利用各種不同的能驅動各種分泌產物表達的外源啟動子，已證實基因轉移至培養的角質形成細胞中。表皮中的角質形成細胞通過復制屬于以下兩類細胞的細胞而自我更新(1)能延長或無限制地生長的干細胞；及(2)干細胞后代的瞬時擴增細胞，其在經歷終末分化之前復制有限次數。干細胞呈緩慢細胞周期且很少能被核苷酸類似物標記，但一旦標記，可保持長期標記。干細胞和瞬時擴增細胞位于表皮基底層的區室中，終末分化的細胞形成分層的基底層上層。干細胞及其后代擴增和終末分化的細胞在稱為“表皮增殖單位”的獨立空間列陣中簇集。角蛋白14(K14)及其配偶體K5是由表皮及其附屬物的活性細胞表達的主要蛋白，且編碼這些角蛋白的基因高豐度地在培養的人角質形成細胞中轉錄。因此，K14與K5啟動子是用于角質形成細胞介導的基因治療的特別感興趣的候選物。
自從70年代首次發現P轉座子包括在雜種敗育中，果蠅的P-因子已經被充分研究。報道了一種技術，其中克隆的基因通過用P-轉座子可轉移至果蠅的胚胎中(Rubin，G.M.，等，科學，1982，218328-353)。但是此技術甚至不能用于同一系的物種。另外，也未報道如本發明所述的將果蠅的轉座子導入哺乳動物中。
根據本發明，本發明人對基因治療進行了深入細致及全面研究，目的在于提供治療I型糖尿病的更有效，更安全，更簡便的基因治療，從而導致如下發現，即設計用于控制人體胰島素基因表達的K14啟動子基因呈現如下這種組織特異性增強活性，即人胰島素基因借助于果蠅的轉座酶可整合入角質形成細胞染色體中，且胰島素可由角質形成細胞以足夠保持正常血糖水平的量產生。
因而，本發明一個目的在于提供適用于糖尿病基因治療的非病毒重組胰島素表達載體。
本發明另一目的在于提供適用于基因治療的含有編碼果蠅的P-轉座子的DNA序列的非病毒載體。
本發明另一目的在于提供非病毒重組胰島素表達載體在治療糖尿病中的應用。
本發明另一目的在于提了含有編碼果蠅的P-轉座子的DNA序列的非病毒載體在將基因整合入哺乳動物染色體中的應用。
本發明另一目的在于提供含有編碼果蠅的P-轉座子的DNA序列的非病毒載體在治療糖尿病中的應用。
本發明另一目的在于提供一種通過基因治療治療糖尿病的方法。
本發明另一目的在于提供一種組合物，其用于胰島素依賴型糖尿病的基因治療，其是安全且便于用于人體的。
附圖簡述

圖1a示出具有完整lacZ基因及具有K14啟動子(左側，pUC KZ)和不具有K14啟動子(右側，pUC 4.3Z)的β-半乳糖苷酶表達質粒載體的示意圖。
圖1b示出能表達果蠅P-轉座酶的輔助質粒載體(pπ25.7wcΔ2-3)的示意圖。
圖2示出在共注射pUC KZ及輔助質粒載體之前及之后，鼠皮膚組織的顯微照片。隨著注射后的時間(1天至20周)，鼠皮膚組織呈現不同的藍色，這是皮膚組織中表達自質粒的β-半乳糖苷酶與X-gal反應的結果。
圖3示出在共注射pUC KZ及輔助質粒載體之前及之后，鼠皮膚組織的顯微照片，組織用X-gal(左欄A，C，E，G)或用蘇未精/伊紅(右欄B，D，F，H)染色。與正常皮膚組織(上面一組)相對比，共注射后隨著時間，共注射的皮膚組織觀測到有更多的β-半乳糖苷酶積累(1天第二組，1周第三組，4周底部一組)，如由X-gal染色所證實。H/E染色清楚地闡明表達β-半乳酶基因的細胞是角質形成細胞。在照片中，箭頭表示β-半乳糖苷酶的表達。
圖4是PCR產物在瓊脂糖凝膠上電泳的照片。PCR產物擴增自基因組DNAs，該DNAs是在共注射pUC KZ及輔助載體之后的第5天(3泳道)，1周(4泳道)，2周(5泳道)，3周(6泳道)及4周(7泳道)制備的。將PCR產物與作為陽性對照的pUC KZ(1泳道)，作為陰性對照的基因組DNA(2泳道)，及標記(M)一起電泳，以證實通過轉座酶的酶促作用，β-乳糖苷酶基因整合入染色體中。
圖5是Southern印跡放射自顯影圖，示出靶鼠組織中β-半乳糖苷酶基因的染色體整合。基因組DNAs從共注射pUC KZ和輔助質粒載體之后第5天(3泳道)，1周(4泳道)，2周(5泳道)，3周(6泳道)，4周(7泳道)，5周(8泳道)，及6周(9泳道)的皮膚樣品中制備。為了對比，加樣200ng的pUC KZ作為陽性對照(1泳道)，制各自未注射的正常小鼠皮膚樣品的基因組DNA用作陰性對照(2泳道)。
圖6是示出本發明胰島素表達質粒載體pUCK14-INS的示意圖。
圖7是編碼包含在胰島素表達質粒載體pUCK14-INS中的K14啟動子和人胰島素的堿基序列。
圖8示出直方圖，其中小鼠血糖水平是根據在用65mg/kg(a)和200mg/kg(b)的鏈脲菌素處理誘導的糖尿病小鼠中pUCK14-INS的給藥劑量而測定的。
圖9中示出放大12.5倍(上面一組A，B，C)，40倍(D)，200倍(E)，和400倍(F)的小鼠胰腺顯微照片，在正常胰腺(A)中，觀測到郎氏(Langerhans)胰島分布在血管周圍。在放大倍數更高的照片中(D，E，F)正常郎氏胰島可看得更清楚。相反，在糖尿病小鼠的胰腺(B)中郎氏胰島減少或消失。在另一小鼠的胰腺(C)中，觀測到郎氏胰島被破壞，該小鼠在誘導為糖尿病之后，其血糖水平通過注射胰島素表達載體(pUCK14-INS)降至正常范圍。
圖10示出未處理的正常小鼠(最左側)，糖尿病小鼠(中間)，及注射載體的正常小鼠(最右側)的郎氏胰島顯微照片，它們均用抗胰島素抗體(上面一組)，抗胰高血糖素抗體(中間一組)及抗促生長素抑制素抗體(下面一組)免疫染色。
本發明涉及一種基因治療系統，其能向哺乳動物染色體輸送相應的基因。特別地，此基因治療系統用于治療胰島素依賴型糖尿病，為此利用的K14啟動子在整合相應基因至靶組織的染色體中的組織特異性及增強活性。同樣，根據本發明，果蠅的P-轉座子也用于基因的染色體整合。
因此，通過K14啟動子的組織特異性與轉座酶的酶促活性的協同作用，可將基因整合入靶組織的染色體中。為證實染色體整合，選擇β-半乳糖苷酶作為報道基因，因為β-半乳糖苷酶基因的表達可通過X-gal染色而輕易可見。
首先，構建兩個哺乳動物表達質粒一個含有與人K14啟動子基因相連的lac Z基因；另一個含有lac Z基因而無K14啟動子基因，如圖1a所示。為此，將人K14啟動子基因插入pUChsneo中的EcoRI位點，然后得自cpwβ-22的4.3kb的lac Z基因插入相同質粒的BamHI和SalI之間。所得質粒稱為pUC KZ。另外，將等長lac Z基因插入pUChsneo中，此重組質粒稱為pUC 4.3Z。通過電穿孔轉染入E.coli后，制備質粒DNAs并用限制酶酶切以證實基因亞克隆。同樣，P-因子轉座酶基因插入pπ25.7wcΔ2-3的ORF2和ORF3之間的內含子中，如圖1b所示，以構建能使相應基因整合入染色體中的輔助載體。
接下來，哺乳動物轉染要求大量濃縮的高純度的質粒DNA。一可商購的質粒DNA制備試劑盒，例如QIAGEN質粒最大試劑盒(QIAGEN GmbH，德國)，用于此目的。在本發明中，哺乳動物轉染通過脂質體介導而達到，適于脂質體介導的基因輸送的試劑也可購買，例如GenePORTERTM轉染試劑(GTS公司，San Diego，CA，美國)。在使用之前，此試劑用0.75ml的水合緩沖液在室溫水合并旋動。將各種濃度的質粒DNAs與各種體積的試劑組合以制備DNA/脂質體復合物。向此復合物中加入輔助載體的40％(w/v)稀釋的DNA溶液，隨后加入1體積的GenePORTERTM。所得溶液加入PBS至終體積為130μl，并在使用前在室溫培養30分鐘。
用無針噴射注射器如Mada Medical Products公司生產的注射器，通過加壓注射對10-12周齡的小鼠施用各種濃度的DNA/脂質體復合物。被給藥的小鼠在應用DNA之后的第1天至20周通過頸部關切錯位處死，并從注射DNA的皮膚區域立即取樣品。
為評定lac Z基因在皮膚組織中的表達，將組織樣品浸泡在X-gal溶液中，在X-gal染色之前，此組織樣品用PBS洗滌并在固定劑中固定。X-gal溶液優選在即將使用前制備。
接下來，將由于在X-gal中染色而呈不同深淺的藍色的皮膚樣品用PBS洗滌2次，隨后在福爾馬林中固定。此固定物能保持活組織的形態以進行H/E染色。福爾馬林，最常用的固定劑之一，使核酸與蛋白質交聯，由此使分子呈剛性且可被機械剪切。固定的持續時間優選16小時至3天。然后，對固定的組織樣品進行常規H/E染色。為此，進行組織樣品的石蠟包理，切片及封固。優選地，將此組織樣品近可能地封固在玻片的中心。切片要求薄于10μm，因為較厚的切片難以觀測。
lacZ基因整合入靶組織的染色體可通過PCR篩選及Southerm印跡分析證實。
為此，基因組DNA首先從注射載體處的鼠皮膚(直徑2cm)中制備。用彎剪將鼠皮膚剪成碎片并在tail tip緩沖液(60mM Tris PH8.0，100mM EDTA，0.5％ SDS)中充分切碎。在用RNase A和蛋白酶K處理后，將鼠皮膚樣品離心。應用苯酚提取法從上清中沉淀基因組DNA。
用此基因組DNA作模板進行PCR。為檢測lacZ區，可從包括lacZ基因的E.coli HB101中產生引物。PCR產物長度期望是3110bp。
以如上相同方式，從注射載體的腹部皮膚處制備基因組DNA，該處皮膚在應用載體時被標記。此基因組DNA在1×TAE緩沖液中于瓊脂糖凝膠上電泳，并移至膜上，接著在80℃干燥2小時。使轉移的DNAs與[α-32P]dCTP-標記的探針在雜交緩沖液(5×SSC，1/20稀釋的液體封阻劑，0.1％SDS，5％硫酸右旋糖酐)中雜交。然后，用洗滌緩沖劑將此膜洗多次并進行放射自顯影分析。
在以上驗中，發現lacZ基因穩固地整合入角質形成細胞的染色體中，并通過果蠅的P-轉座酶和K14啟動子的協同作用而強表達。
當研究人胰島素基因時，發現這些結果也是如此。
為構建含有K14啟動子基因的胰島素表達質粒載體，用人前胰島素原基因和K14啟動子區的已知堿基序列產生兩對PCR引物，并用于用人基因組DNA作模板經PCR擴增基因。這兩個PCR產物，前胰島素原基因和K14啟動子基因串聯插入pUChsneo中的Sal I位點。所得胰島素表達載體稱為pUCK14-INS。
此胰島素表達重組載體pUCK14-INS在2001年1月5日保藏在韓國生物科學及生物技術研究所(KRIBB)的韓國典型培養物保藏中心，保藏號KCTC 0928BP。
為證實基因的克隆，擴增胰島素表達載體并用ABI Prism 377XL(PE，美國)進行堿基測序。
為使小鼠糖尿病化，將鏈脲菌素(STZ)以總劑量為65mg/kg和200mg/kg分10次施用于小鼠。用Super GlucocardTM試劑盒(Arkary KDK Corp.，Kyoto，日本)確定血糖水平。將一滴得自尾部的血液樣品置于Glucocard試條頂部。此試條的反應室自動通過毛細管作用將血液吸入試條內部。當反應室充滿時，該Glucocard試劑盒開始測定血糖水平。樣品中的葡萄糖和試條中葡萄糖氧化酶及鐵氰化鉀反應，產生與血液樣品中的葡萄糖濃度成比例的鐵氰化鉀。鐵氰化鉀的氧化產生電流，其然后用儀表轉換以顯示葡萄糖濃度。
為免疫染色胰腺β細胞，將6只小鼠通過頸關節錯位處死，收集其胰腺并在10％福爾馬林固定劑中固定，這6只小鼠中1只是正常的，2只糖尿病小鼠分別注射了65mg/kg和200mg/kg STZ，另3只小鼠注射了1μg，50μg和100μg胰島素表達載體。為觀測正常胰腺及糖尿病胰腺中郎氏胰島的分布情況，如上所述對組織樣品進行H/E染色，石蠟包埋，切片及封固。用抗體，包括抗胰島素抗體，抗胰高血糖素抗體，及抗促生長素抑制素抗體，對β細胞產生胰島素的能力進行定量分析。
通過以下實施例對本發明可有一步理解，以下實施例只是舉例說明本發明，而非限制本發明。
實驗實施例1在鼠皮膚中的β-半乳糖苷酶基因表達第一步構建β-半乳糖苷酶表達載體將人K14啟動子基因插入pUChsneo的EcoRI位點，隨后在緊鄰克隆的K14啟動子位點的該質粒BamHI和SalI位點之間加入得自cpwβ-22的4.3kb的lacZ基因。所得質粒稱為pUC KZ，如圖1a(左側)所示。另外，只將全長lacZ基因克隆入pUChxsheo中以制備pUC 4.3Z，如圖1a(右側)所示。在轉染入E.coli之后，通過苯酚/氯仿/異戊醇純化這個兩個質粒DNAs，并通過限制酶切作圖證實。測試含有lacZ基因的這兩個質粒DNAs的K14啟動子活性。
第二步構建輔助載體為補償pUCshneo不能自我轉座入染色體中，構建輔助載體，該載體錨定P-因子轉座酶基因。為此，在輔助質粒pπ25.7wcΔ2-3的ORF2和ORF3之間的內含子進行操作，以便具有產生轉座酶的能力，如圖1b所示。
第三步制備DNA/脂質體復合物將在第一步制備的β-半乳糖苷酶表達載體用QIAGEN質粒大試劑盒(QIAGEN GmbH，德國)純化，并將GenePORTERTM轉染試劑與0.75ml水合緩沖液在室溫水合。將各2μg，5μg，10μg，50μg和100μg純化的質粒DNA與各5μl，10μl，20μl的脂質體組合，以制備DNA/脂質體復合物。向這些稀釋的DNA溶液中，加入能表達果蠅的P-轉座酶的輔助質粒，加入量為40％(w/v)純化的質粒DNA，隨后加相同體積的GenePORTERTM轉染試劑。在用PBS試劑稀釋后，所得溶液在室溫培養30分鐘。
第四步將DNA注射至小鼠中用無針噴射注射器(Madajet XL)將在第三步制備的DNA/脂質體復合物注射入小鼠的后腿，小鼠是平均體重大約為26g的10-12周齡小鼠。在施用DNA后第1天到第20周的預定時間，將小鼠以頸關節錯位處死，剔凈處理區域的外皮，用無菌外科剪剪下而收集樣品。
第五步X-gal染色在第四步獲得的皮膚樣品用PBC洗2次，并在固定劑(含有2％低聚甲醛，0.2％戊二醛的0.1M磷酸鈉緩沖洗，pH7.3)中在4℃固定30分鐘，將樣品在37℃在X-gal溶液(1.3mM MgCl2，3mMK4Fe(CN)6，3mM Fe3(CN)6，1mg/ml X-gal，0.1M磷酸鈉緩沖劑，PH7.3)中浸泡3小時，該溶液在即將使用前制備。為進行對比，以相同方式制備注射只含脂質體的PBS溶液的對照鼠樣品，分析lacZ在皮膚組織中的表達。
在顯微鏡下觀察到lacZ在注射無K14啟動子的質粒載體之后第5天僅低水平表達，如在X-gal染色中的微弱的藍色所示。相反，共注射具有K14啟動子區域的pUC KZ載體，發現能使β-半乳糖苷酶基因強表達，如在X-gal染色后20周的樣品中發現深藍色，如圖2所示，另外，在注射pUC KZ之后，發現K14啟動子的組織特異性增強。
第六步H/E(蘇木精/伊紅)染色在X-gal溶液中反應表達藍斑點的皮膚樣品用PBS洗2次并在福爾馬林中固定以進行H/E(蘇木精/伊紅)染色，在固定16小時至3天后，用常規H/E染色法對厚度低于10μm的切片進行染色。
結果示于圖3，發現X-gal反應物以藍斑點或擴散形式圍繞在核周圍。圖3還示出，由于組織特異性所致，β-半乳糖苷酶基因在角質形成細胞層中表達強烈，并在注射后第4天至5～6周持續表達。
第七步制備鼠基因組DNA把鼠皮膚切成碎片并充分切碎在少量tail tip緩沖液(60mM TrisPH8.0，100mM EDTA，0.5％ SDS)中形成漿狀。在加入600μl tailtip緩沖液并用RNase A(20m/ml)處理后，在37℃培養30分鐘，加入500μg/ml濃度的蛋白酶K，在50-55℃反應。將此反應物以1200rpm在20℃離心15分鐘。在再次離心之前將所得三層中的中間層除去。在用苯酚/氯仿提取3次及用氯仿提取1次之后，將上清在20℃以10000rpm離心15分鐘。向分離的水相中加入1/10體積的3MNaOAc，PH5.2，及等體積的95％EtoH以沉淀DNA。將干燥的沉淀物再溶于TE緩沖液(pH7.4)中，并測定此TE溶液的1/5000稀釋液在260nm的O.D。
第八步進行PCR篩選證實β-半乳糖苷酶基因的染色體整合如第七步所述相同方式，從取自注射后第5天至4周的注射區域(直徑2cm)的鼠皮膚樣品中純化基因組DNA。為證實在注射后β-半乳糖苷酶基因在染色體中的整合，合成以下引物，設計產生3110bp的PCR產物。在下表1所述條件下進行PCR。
LacZ正向引物-5’TCACTCTAGAAACAGCTATGA 3’LacZ反向引物-5’TCGACCCGGTTATTATTA 3’表1在基因組DNA中擴增lacZ的PCR條件
擴增的5個樣品分別取自注射含有β-半乳糖苷酶基因的載體后第5天，1周，2周，2周，3周及4周的皮膚樣品，這5個PCR產物通過凝膠電泳均發現大約3100bp長。示于圖4的電泳數據表明β-半乳糖苷酶基因插入染色體。
第九步進行Southern印跡分析證實β-半乳糖苷酶基因的染色體整合為用于Southern印跡分析，以如第七步所述相同方式得自注射β-半乳糖苷酶表達載體后的鼠皮膚的基因組DNA被純化。為進行對照，制備自未處理的小鼠及注射pUC KZ的小鼠的基因組DNA樣品分別用作陰性及陽性對照。
這些基因組DNAs在1×TAE緩沖液中在0.8％瓊脂糖凝膠上電泳，并將各個分離的DNAs移至Hybond N+膜上。在80℃烘干2小時，印跡的DNAs與[α-32p]dcTP標記的探針在雜交緩沖液(5×SSC，1/20稀釋的液體封阻劑，0.1％SDS，5％硫酸右旋糖酐)中雜交。接下來，將此膜用洗滌緩沖液(2×SSC，0.1％SDS)在42℃洗10分鐘，最后用緩沖液(1×SSC，0.1％SDS)在65℃洗二次，每次10分鐘。
圖5示出放射自顯影分析。如放射自顯影所示，盡管在得自給藥第5天及1周后處死的小鼠的樣品的泳道中條帶不清晰，但通過共注射輔助載體2～5周后得到的基因組DNAs的清晰條帶示出的表達的轉座酶的酶促活性表明β-半乳糖苷酶成功整合入鼠染色體中。
實施例1構建胰島素載體通過人前胰島素原基因和K14啟動子區的已知堿基序列，設計兩對PCR引物，如下表2所示，并用于通過PCR擴增基因。將兩個PCR產物，前胰島素原基因及K14啟動子基因，分別亞克隆入pUChsneo和pGEM T-easy中，隨后將它們串聯插入pUChsneo中的Sal I位點。所得胰島素表達載體稱作pUCK14-INS。
表2 胰島素基因及K14啟動子的PCR引物
胰島素表達重組載體pUCK14-INS2001年1月10日保藏在韓國生物科學及生物技術研究所(KRIBB)的韓國典型培養物保藏中心，保藏號KCTC 0928P。
實施例2胰島素表達載體的堿基序列分析實施例1中制備的胰島素表達載體用QIAGEN質粒mini(QIAGEN，Valencia，CA，美國)純化，并用ABI Prism 377 XL(PE，美國)進行序列分析。K14啟動子及前胰島素原基因的堿基序列見于圖7所示。如圖所示，K14啟動子區在Sac I位點與胰島素基因相連，該胰島素基因由3個胰島素肽部分，即胰島素原肽B、胰島素原肽C及胰島素原肽A，和C鏈中790bp的內含子組成。
實施例3誘導小鼠糖尿病及給予胰島素表達載體后血糖變化將總劑量為65mg/kg和200mg/kg的鏈脲菌素(STZ)分10次經皮下注射施用于小鼠誘導糖尿病。在即將注射之前，將STZ溶于冷0.1M檸檬酸緩沖液(PH4.5)中。在注射STZ 4天后，將胰島素表達載體以1μg，2μg，3μg，10μg，50μg和100μg的劑量注射入每組誘導的糖尿病小鼠，每組有4只小鼠。每4天交替注射一次STZ和胰島素表達載體。監測糖尿病小鼠的血糖水平。
用Super GlucocardTMII試劑盒(Arkary KDK Corp.Kyoto，日本)測定血糖水平。其中，血液樣品取自尾部，并將一滴血置于Glucocard試條的頂部。
每2小時監測血糖的結果顯示，測定的正常血糖水平在65mg/dl至145mg/dl范圍，一天之內平均值為105mg/dl。在每次注射及給藥后測定的血糖水平見表3至表5所示，并如圖8a和8b所示。
如上所述，胰島素表達載體以劑量依賴方式降低血糖水平。用胰島素及STZ交替處理方法導致血糖水平的波動。然而，血糖水平增加值在后幾輪交替用65mg/kg的STZ及胰島素表達載體的處理中比初始幾輪處理的要低，而胰島素表達載體降低血糖水平的作用在全部處理中持續保持。以200mg/kg的劑量施用STZ的一組小鼠在相對短的一段時間內呈高血糖癥。在這種情況下，注射胰島素表達載體也導致以劑量依賴型降低血糖。
表3.由STZ導致的糖尿病小鼠的血糖水平
表4.由65mg/kg STZ處理的糖尿病小鼠血糖水平變化
表5.由200mg/kg STZ處理的糖尿病小鼠血糖水平變化
*血糖水平保持在85-120mg/dl，且不超過320mg/dl。
實施例5郎氏胰島的免疫組織化學一只正常小鼠，2只注射65mg/kg和200mg/kg的STZ的糖尿病小鼠，及3只注射1μg，50μg和100μg胰島素表達載體的小鼠通過頸關節錯位處死，并收集它們的胰腺在10％福爾馬林固定劑中固定。為定量分析β細胞產生胰島素的能力，用抗體對固定的胰腺進行免疫染色及H/E(蘇木精/伊紅)染色，所用抗體包括抗胰島素抗體，抗胰高血糖素抗體，及抗促生長素抑制素抗體。
在染色之后，對胰腺進行照相，結果示于圖9。如圖9所示，在正常小鼠胰腺中平均10個郎氏胰島分布在血管周圍，而在糖尿病小鼠中，它們幾乎完全消失，或者如果發現有的話，是以非常收縮的形式存在。對血糖水平在注射胰島素表達載體之后恢復到正常水平的小鼠而言，在其胰腺中發現極少或未發現郎氏胰島。另外，它們的胰腺形態被破壞。為測試三種胰腺細胞-α，β，和δ細胞中的哪一種組成胰島，用抗胰島素抗體，抗胰高血糖素抗體及抗促生長素抑制素抗體對胰腺進行免疫分析。如圖10所示，在顯微鏡下觀察到幾乎沒有β細胞存在，反而是α細胞主要占據糖尿病小鼠胰腺中的β細胞的空間，δ細胞位于周邊。因而可總結出在用STZ誘導糖尿病后通過注射胰島素表達載體而使其血糖水平正常化的小鼠中，從其中注射的載體表達胰島素基因的角質形成細胞負責保持正常血糖水平，取代了胰腺產生胰島素的細胞行使作用。
總而言之，得自以上實施例的數據表明含有果蠅的P-因子序列的輔助載體，能輔助胰島素基因有效地整合入角質形成細胞的染色體中。另外，當與K14啟動子基因一起摻入染色體中時，發現胰島素基因在體內強表達，從而發揮其保持正常血糖水平的激素活性。進一步地，與常規逆轉錄病毒輸送系統相反，本發明的非病毒胰島素載體是安全及簡便的。因而，本發明非常有用于治療糖尿病，對基因治療領域起巨大推進作用。
本發明以例證方式闡述，且應知所用術語是描述性而非限制性的。根據以上教導可對本發明做一些修改及變化。因而應知在所附權利要求范圍內，本發明可以與本文不同方式實施。
權利要求
1.一種制備胰島素表達載體的方法，其中將胰島素基因和K14啟動子基因一起插入pUChsneo，該胰島素基因通過使用以下序列I代表的一對胰島素引物從人基因組DNA中擴增，該K14啟動子基因通過以下序列II代表的一對K14啟動子引物擴增胰島素正向引物5′CCTGCCTGTCTCCCAGAGCTCTGTCCTTCT 3′胰島素反向引物5′GCAGGGCTGGTTCTAGAGCTTTATTCCATC 3′(I)K14啟動子正向引物5′ATTGCTGAAGTTTTGATCTAGACACCTCCA 3′K14啟動子反向引物5′CTGAGTGAAGAGAAGGAGCTCGGGTAAATT 3′ (II)
2.根據權利要求1的方法構建的一種非病毒胰島素表達載體pUCK14-INS，保藏號KCTC 0928BP。
3.編碼胰島素表達載體pUCK14-INS的K14啟動子和人胰島素基因的堿基序列，由以下序列代表K14 啟動子 5′---------→ATTGCTGAAG TTTTGATATA CACACCTCCA AAGCAGGACC AAGTGGACTC------------------------------------------------------CTAGAAATGT CCCCTGACCC TTGGGGCTTC AGGAGTCAGG GACCCTCGTG------------------------------------------------------TCCACCTCAG CCTTGCCCTT GCACAGCCCA GCTCCACTCC AGCCTCTACT------------------------------------------------------CCTCCCCAGA ACATCTCCTG GGCCAGTTCC ACAAGGGGCT CAAACGAGGG------------------------------------------------------CACCTGAGCT GCCCACACTA GGGATGTTCT GGGGGTCTGA GAAGATATCT------------------------------------------------------GGGGCTGGAA GAATAAAAGG CCCCCCTAGG CCTGTTCCTG GATGCAGCTC------------------------------------------------------CAGCCACTTT GGGGCTAAGC CTGGGCAATA ACAATGCCAA CGAGGCTTCT------------------------------------------------------TGCCATACTC GGTTTACAAA ACCCTTTACA TACATTGTCG CATTGGATTC------------------------------------------------------TCAGAGCTGA CTGCACTAAG CAGAATAGAT GGTATGACTC CCACTTTGCA------------------------------------------------------GATGAGAACA CTGAGGCTCA GAGAAGTGCG AAGCCCTGGG TCACAGAGGC------------------------------------------------------GTAAATGCAG AGCCAGGACC CACCTGAAGA CCCACCTGAC TCCAGGATGT------------------------------------------------------TTCCTGCCTC CATGAGGCCA CCTGCCCTAT GGTGTGGTGG ATGTGAGATC------------------------------------------------------CTCACCATAG GGAGGAGATT AGGGTCTGTG CTCAGGGCTG GGGAGAGGTG------------------------------------------------------CCTGGATTTC TCTTTGATGG GGATGTTGGG GTGGGAATCA CGATACACCT------------------------------------------------------GATCAGCTGG GTGTATTTCA GGGATGGGGC AGACTTCTCA GCACAGCACG------------------------------------------------------GCAGGTCAGG CCTGGGAGGG CCCCCCAGAC CTCCTTGTCT CTAATAGAGG------------------------------------------------------GTCATGGTGA GGGAGGCCTG TCTGTGCCCA AGGTGACCTT GCCATGCCGG------------------------------------------------------TGCTTTCCAG CCGGGTATCC ATCCCCTGCA GCAGCAGGCT TCCTCTACGT------------------------------------------------------GGATGTTAAA GGCCCATTCA GTTCATGGAG AGCTAGCAGG AAACTAGGTT------------------------------------------------------TAAGGTGCAG AGGCCCTGCT CTCTGTCACC CTGGCTAAGC CCAGTGCGTG------------------------------------------------------GGTTCCTGAG GGCTGGGACT CCCAGGGTCC GATGGGAAAG TGTAGCCTGC------------------------------------------------------AGGCCCACAC CTCCCCCTGT GAATCACGCC TGGCGGGACA AGAAAGCCCA------------------------------------------------------AAACACTCCA AACAATGAGT TTCCAGTAAA ATATGACAGA CATGATGAGG------------------------------------------------------CGGATGAGAG GAGGGACCTG CCTGGGAGTT GGCGCTAGCC TGTGGGTGAT------------------------------------------------------GAAAGCCAAG GGGAATGGAA AGTGCCAGAC CCGCCCCCTA CCCATGAGTA------------------------------------------------------TAAAGCACTC GCATCCCTTT GCAATTTACC CGAGCTCTGT CCTTCTGCCA----------------------------------Sac I --------------TGGCCCTGTG GATGCGCCTC CTGCCCCTGC TGGCGCTGCT GGCCCTCTGG------------------------------------------------------GGACCTGACC CAGCCGCAGC CTTTGTGAAC CAACACCTGT GCGGCTCACA---------------------------- B chain ----------------CCTGGTGAAG CTCTCTACCT AGTGTGCGGG GAACGAGGCT TCTTCTACAC------------------------------------------------------ACCCAAGACC CGCCGGGAGG CAGAGGACCT GCAGGGTGAG CCAACCGCCC-------------- C chain -------------------------------ATTGCTGCCC CTGGCCGCCC CCAGCCACCC CCTGCTCCTG GCGCTCCCAC------------------------------------------------------CCAGCATGGG CAGAAGGGGG CAGGAGGCTG CCACCCAGCA GGGGGTCAGG------------------------------------------------------TGCACTTTTT TAAAAAGAAG TTCTCTTGGT CACGTCCTAA AAGTGACCAG------------------------------------------------------CTCCCTGTGG CCCAGTCAGA ATCTCAGCCT GAGGACGGTG TTGGCTTCCG-----------------------------------------------------GGCAGCCCCGA GATACATTAG AGGGTGGGCA CGCTCCTCCC TCCACTCGCC------------------------------------------------------CCCCTCAAAC AAATGCCCCG CAGCCCATTT CTCCACCCTC ATTTGATGAC------------------------------------------------------CGCAGATTCA AGTGTTTTGT TAAGTAAAGT CCTGGGTGAC CTGGGGTCAC------------------------------------------------------AGGGTGCCCC ACGCTGCCTG CCTCTGGGCG AACACCCCAT CACGCCCGGA------------------------------------------------------GGAGGGCGTG GCTGCCTGCC TGAGTGGGCC AGACCCCTGT CGCCAGGCCT------------------------------------------------------CACGGCAGCT CCATAGTCAG GAGATGGGGA AGATGCTGGG GACAGGCCCT------------------------------------------------------GGGGAGAAGT ACTGGGATCA CCTGTTCAGG CTCCCACTGT GACGCTGCCC------------------------------------------------------CGGGGCGGGG GAAGGAGGTG GGACATGTGG GCGTTGGGGC CTGTAGGTCC------------------------------------------------------ACACCCAGTG TGGGTGACCC TCCCTCTAAC CTGGGTCCAG CCCGGCTGGA------------------------------------------------------GATGGGTGGG AGTGCGACCT AGGGCTGGCG GGCAGGCGGG CACTGTGTCT------------------------------------------------------CCCTGACTGT GTCCTCCTGT GTCCCTCTGC CTCGCCGCTG TTCCGGAACC------------------------------------------------------TGCTCTGCGC GGCACGTCCT GGCAGTGGGG CAGGTGGAGC TGGGCGGGGG---------------------------------- C chain -----------CCCTGGTGCA GGCAGCCTGC AGCCCTTGGC CCTGGAGGGG TCCCTGCAGA------------------------------------------------------AGCGTGGCAT TGTGGAACAA TGCTGTACCA GCATCTGCTC CCTCTACCAG------ A chain ---------------------------------------CTGGAGAACT ACTGCAACTA GACGCAGCCT GCAGGCAGCC CCACACCCGC------------------------------------------------------CGCCTCCTGC ACCGAGAGAG ATGGAATAAAGCCCTTGAACCAGCCCTGC---------------------------------------------------←--------- 胰島素 3′引物
4.一種適用于治療胰島素依賴型糖尿病的治療性組合物，包括一種作為治療有效成分的混合物，該混合物由權利要求2的非病毒胰島素表達載體與脂質體的復合物及含有果蠅的P-因子序列的輔助載體組成。
5.一種將基因整合入哺乳動物染色體中的方法，其中使用果蠅的P轉座酶。
全文摘要
本發明公開了用于胰島素依賴型糖尿病的基因治療中的重組載體和治療性組合物。以脂質體介導方式將具有K14啟動子基因的β－半乳糖苷酶表達載體與果蠅P轉座酶表達輔助載體一起注射進鼠皮膚后,測得該酶基因在角質形成細胞層表達。因具有增強效果和組織特異性,K14啟動子用于在角質形成細胞中表達人胰島素基因,提示了胰島素依賴型糖尿病的新基因治療方法。當與P－因子表達輔助載體組合將具有K14啟動子的人胰島素表達載體注射進缺少胰腺β－細胞的糖尿病小鼠皮膚中時,小鼠血糖水平保持在正常范圍。
文檔編號A61K35/56GK1366062SQ01104370
公開日2002年8月28日 申請日期2001年2月28日 優先權日2001年1月15日
發明者徐東祥 申請人:徐東祥