治療血友病b的基因藥物及其制備方法

專利名稱：治療血友病b的基因藥物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及治療血友病B的基因藥物及其制備方法。
血友病B又稱乙型血友病，是一種凝血Ⅸ因子(PⅨ)缺陷引起的X連鎖隱性遺傳的出血性疾病，在男性中發(fā)病率為1/30000。
FⅨ是內(nèi)源性凝血級聯(lián)反應(yīng)過程中必需的蛋白因子，當(dāng)FⅨ與調(diào)控蛋白FⅧ形成復(fù)合物后，使內(nèi)源性凝血級聯(lián)反應(yīng)速度成千倍增加，至使凝血過程僅在幾分鐘內(nèi)即可完成。因此，當(dāng)人體內(nèi)缺乏FⅨ時，便表現(xiàn)為自發(fā)性或微外傷后出血不止，嚴(yán)重者可因關(guān)節(jié)出血而導(dǎo)致關(guān)節(jié)變形和殘廢或因內(nèi)臟或顱內(nèi)出血而死亡。編碼FⅨ蛋白的基因于1982年被克隆，它位于Xq27.1帶，共8個外顯子，編碼區(qū)全長1.383kb，編碼415個氨基酸。(Choo KH,Gould KG,ReesDJ,et al.Nature 1982；299:178-180；Kurachi K,Davie EW.ProcNatl Acad Sci USA 1982；79:6461-6464.)成人的FⅨ蛋白分子量為56KD，在正常血漿中含量為5μg/ml(Kaufman RJ.Human GeneTherapy 1999；10:2091-2107.)。血友病B的臨床治療僅限于蛋白替代治療即靠輸血，或補(bǔ)充FⅨ濃縮制劑。但由于FⅨ在人體內(nèi)半衰期僅24小時，患者需要反復(fù)輸血或血液制品來維持生命，不僅要承受沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，而且還面臨艾滋病病毒、乙肝病毒和瘋牛朊病毒感染的威脅。
如何將正常FⅨ基因?qū)牖颊唧w內(nèi)以替代缺陷的FⅨ基因是血友病B基因治療中遇到的最關(guān)鍵的問題。目前用于FⅨ基因治療研究的載體主要為病毒性載體，如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，腺病毒載體及腺相關(guān)病毒載體。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體雖能穩(wěn)定地整合到靶細(xì)胞的基因組中，但其只能感染分裂細(xì)胞，且存在插入誘變等安全隱患；腺病毒載體體內(nèi)外感染效率高，而且能感染非分裂細(xì)胞，但其受到免疫原性的影響使導(dǎo)入的基因不能長期表達(dá)；腺相關(guān)病毒載體能有效感染體內(nèi)各種細(xì)胞，也能使導(dǎo)入的基因長期表達(dá)，但它仍未能解決插入誘變的安全性問題。因此近十年來，盡管在血友病B的基因治療方面采取了許多改進(jìn)措施，但至今仍未得到安全的、穩(wěn)定的、一次性治療的基因藥物，關(guān)鍵問題就在于還沒找到一種安全性好、無免疫原性、能高效轉(zhuǎn)化靶細(xì)胞并在靶細(xì)胞中長期穩(wěn)定表達(dá)治療基因的載體。
本發(fā)明的目的是提供一種安全、能使治療基因在靶細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)的治療血友病B的基因藥物。
本發(fā)明的另一目的是提供一種制備上述基因藥物的方法。
本發(fā)明提供的治療血友病B的基因藥物，含有以人類D、G組染色體短臂上無重要生理功能相關(guān)基因的DNA序列或與該DNA序列具有50％及50％以上同源性的DNA序列作為治療基因的引導(dǎo)序列所構(gòu)建的基因載體-FⅨ重組體，含基因載體-FⅨ重組體的菌株已于2000年9月29日(2000.9.29)向中國典型培養(yǎng)物保藏中心提出保藏(中國.武漢武漢大學(xué)校內(nèi)，郵政編碼430072)，其保藏號是CCTCCM200031。保藏人對保藏物指定的分類命名為Escherichia coli JM109/JH-4/pNS-FⅨ。
本申請人發(fā)現(xiàn)2個攜帶額外雙隨體小染色體(BM)而表型正常的家系，該小染色體分別在2個家系的2代人和3代人之間穩(wěn)定遺傳，且對人體無任何危害。因此本發(fā)明人提出了分離該小染色體原件、組裝人源基因載體的方案。國內(nèi)外至今已報(bào)導(dǎo)這類家系17個，但沒有人提出利用該小染色體作為基因載體的類似設(shè)想。在研究中申請人用FISH技術(shù)查明，該小染色體來源于人的D、G組染色體短臂即13、14、15、21、22號染色體短臂，由于D、G組染色體短臂為核仁組織區(qū)，富含核糖體DNA(rDNA)，該區(qū)域不但在人群中存在著長度不同的各種多態(tài)(即含rDNA的量有多有少)，而且在細(xì)胞分裂間期該區(qū)域基因轉(zhuǎn)錄十分活躍，因此，本發(fā)明人推測如果能從BM克隆出具有特異性的DNA片段，并以其作為治療基因的引導(dǎo)序列，將治療基因定點(diǎn)導(dǎo)入人體D、G組染色體短臂核仁組織區(qū)，應(yīng)該有較高的、穩(wěn)定的和無害的表達(dá)。后續(xù)的實(shí)施例對此作出了有力的證明。
本發(fā)明人首先利用顯微切割的方法，構(gòu)建了小染色體特異性的pUC19文庫并從中篩選得到單拷貝片段，該片段經(jīng)熒光原位雜交(FISH)證實(shí)來源于小染色體和D、G組染色體短臂，進(jìn)一步以此單拷貝片段為探針篩選人PAC基因組DNA文庫，獲得了約120kb的小染色體特異性DNA片段(BMSF)，并經(jīng)FISH證實(shí)來源于小染色體和D、G組染色體短臂(

圖1)。測序分析BMSF的序列特性，未發(fā)現(xiàn)與重要生理功能相關(guān)的基因，因此證明，以此為靶位點(diǎn)是安全的。本發(fā)明進(jìn)一步利用120kb或從中選擇更小的具有特異性的DNA片段，構(gòu)建基因載體。
因此本申請人認(rèn)為基因引導(dǎo)序列選自人類D、G組染色體短臂上無重要生理功能相關(guān)基因的DNA序列或與該DNA序列具有50％及50％以上同源性的DNA序列作為治療基因的引導(dǎo)序列是符合發(fā)明目的的。由此構(gòu)建的基因載體具有特異性，能將治療基因定點(diǎn)導(dǎo)入到人D、G組染色體短臂上，并高效穩(wěn)定表達(dá)。
在所制備的藥物中，還可含有有利于治療基因?qū)胨拗骷?xì)胞的輔助成份，如脂質(zhì)體、對宿主細(xì)胞有特異性的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明實(shí)施例中具體給出了序列表1表示的載體-FⅨ重組體，其中3.8kb引導(dǎo)序列來源于BMSF，利用TK作為負(fù)篩選基因，將正篩選基因Neo基因插入治療基因引導(dǎo)序列中的1500位，使其分為1.5kb和2.3kb兩臂，F(xiàn)Ⅸ治療基因的插入位點(diǎn)為5910位。治療基因的插入有正反向之分，本發(fā)明實(shí)施例中為反向插入。
在獲得治療基因引導(dǎo)序列的基礎(chǔ)上，按現(xiàn)有技術(shù)可構(gòu)建各種形式的載體。構(gòu)建載體和將治療基因裝入載體的方法是通常的方法。
本發(fā)明實(shí)施例中具體給出了從人D、G組染色體短臂上克隆得到的具有特異性的3.8kb DNA序列作為治療基因引導(dǎo)序列，并構(gòu)建載體的過程。
得到上述攜帶治療基因的載體后，可進(jìn)一步將其導(dǎo)入人離體細(xì)胞中，同樣可作為治療血友病B的基因藥物。
這樣，將含上述轉(zhuǎn)化后的人離體細(xì)胞或含有承載有治療基因的載體的基因藥物通過皮下包埋、電穿孔或靜脈注射等方式導(dǎo)入患者體內(nèi)或?qū)⑤d體-FⅨ重組體用脂質(zhì)體包裹直接注入患者體內(nèi)，使治療基因能在患者體內(nèi)長期穩(wěn)定表達(dá)，以糾正缺陷基因?qū)е碌呐R床癥狀。
由于本發(fā)明提供的治療血友病B的基因藥物中，以人類D、G組染色體短臂上無重要生理功能相關(guān)基因的DNA序列或與該DNA序列具有50％及50％以上同源性的DNA序列作為治療基因的引導(dǎo)序列，來構(gòu)建基因載體。毫無疑問，由其構(gòu)建的基因載體能將其上承載的治療基因定點(diǎn)導(dǎo)入宿主細(xì)胞中特定靶位，并且由于該特定靶位的DNA片段不具有重要的生理功能相關(guān)的基因，因此治療基因的導(dǎo)入是安全的。
綜上所述，本發(fā)明提供的治療血友病B的基因藥物中由于采用了人源基因引導(dǎo)序列來構(gòu)建承載治療基因的載體，因而(1)治療基因表達(dá)穩(wěn)定性好由于承載治療基因的載體能將治療基因定點(diǎn)插入到人體細(xì)胞的D組和G組染色體短臂上，所以使治療基因隨染色體而穩(wěn)定遺傳；(2)安全性好由于在治療基因?qū)氲陌形稽c(diǎn)不含有與重要生理功能相關(guān)的基因，證明該靶位點(diǎn)安全，同時FISH證實(shí)載體能將治療基因定點(diǎn)插入細(xì)胞中安全的靶位點(diǎn)(圖3)，排除了隨機(jī)插入突變，也不存在野生型病毒的危害。所以治療基因在靶位點(diǎn)的表達(dá)是安全的。雖然本發(fā)明沒有提供基因治療的臨床證明，但申請人及國內(nèi)外研究者發(fā)現(xiàn)的實(shí)例從另一角度證明了其安全性(實(shí)施例4)；(3)表達(dá)效率高第一，由于本發(fā)明承載治療基因的載體含有來源于D、G組染色體短臂的引導(dǎo)序列，因此對應(yīng)地在人體細(xì)胞中存在10個靶位點(diǎn)，插入效率比其它載體至少高5-10倍；第二，由于引導(dǎo)序列來自于基因轉(zhuǎn)錄活躍的D、G組染色體短臂，引導(dǎo)進(jìn)入靶位點(diǎn)的治療基因能得到高效表達(dá)；(4)無免疫原性由于該載體為人源性的，因此用于人體不會產(chǎn)生免疫原性。
圖1是120kb BMSF的FISH定位圖；圖2是本發(fā)明提供的一種基因載體-FⅨ重組體的結(jié)構(gòu)圖(基因載體序列全長13928bp)；其中pGEM -7(11033-13928)載體復(fù)制元件及原核篩選系統(tǒng)；TK(1-2840)真核細(xì)胞負(fù)篩選基因，該基因使用TK啟動子和TK polyA信號；Neo(4342-5910)真核細(xì)胞正篩選基因，該基因使用sv40啟動子和sv40 polyA信號；FⅨ(5911-8677)FⅨ治療基因，該基因使用CMV啟動子和BGHpolyA信號；GLS(2841-4341,8678-11032)治療基因引導(dǎo)序列；Cloning site(5910)治療基因插入位點(diǎn)。
圖3是外源性FⅨ治療基因在陽性細(xì)胞克隆中的FISH定位，證明該載體能將FⅨ定點(diǎn)導(dǎo)入D、G組染色體短臂；圖4是FⅨ陽性細(xì)胞Western結(jié)果，F(xiàn)3～F23為6個不同陽性細(xì)胞株，“一”示陰性對照。
本發(fā)明提供的實(shí)施例只是實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的一種方式，不能視為對本發(fā)明的限制。
實(shí)施例1本發(fā)明提供的基因引導(dǎo)序列的制備1．基因引導(dǎo)序列PAC克隆的獲得1.1顯微切割、PCR、微克隆構(gòu)建BM特異性pUC19文庫(DengH-X,Yoshiura K,Dirks RW,et al.Hum Genet 1992,89:13.)1.2BM特異性單拷貝DNA的獲得及鑒定(1)菌落點(diǎn)陣膜的制備在兩張尼龍膜上劃好14×14個方格，標(biāo)記為A、B，分別置于2個有固體LB的平皿中，從文庫皿中隨機(jī)挑取白色克隆分別點(diǎn)到兩張膜坐標(biāo)相同的方格內(nèi)，共挑14×12個，第13行點(diǎn)100ng單拷貝DNA做陽性對照，第14行點(diǎn)100ng gDNA做為陰性對照，兩個皿分別置37℃培養(yǎng)10～12小時，其中B膜置4℃保存，將A膜從皿中取出，分別在用以下溶液浸濕的濾紙上處理，10％SDS,5分鐘，0.5N NaOH/1.5M NaCl,3分鐘，1.5M NaCl/0.5MTris·HCl,3分鐘，2×SSC/0.2M Tris·HCl,10分鐘，80℃真空干燥2小時，37℃保存待用。
(2)gDNA探針的制備取50～75ng gDNA加無菌水至11ml,100℃煮沸變性10分鐘，以下列體系做隨機(jī)引物標(biāo)記反應(yīng)2mM dNTP(dATP-) 3μlprimer mixture 2μlKlenow酶 1μlα-32p-dATP 3μl點(diǎn)離混勻，37℃浮浴30分鐘。加8μl stopmixture，過G-50柱純化探針，取1/100測液閃值。
(3)雜交菌落點(diǎn)陣膜置于2×SSC中浸泡10分鐘，輕輕拭去膜表面的菌落碎片，65℃,5ml雜交液預(yù)雜交，30分鐘以上。根據(jù)液閃值，按1.2×106cpm/ml雜交液的量取探針液于100℃煮沸變性10分鐘，加入5ml新鮮雜交液，與菌落點(diǎn)陣膜65℃雜交12小時以上。按以下條件洗膜2×SSC/0.1％SDS，室溫10分鐘，2×SSC/0.1％SDS,65℃10分鐘，0.1×SSC/0.1％SDS,65℃10分鐘，-70℃放射自顯影，雜交信號無或弱的初步認(rèn)為是單拷貝。
(4)測序，Southern雜交鑒定在B膜上相應(yīng)位置挑取無雜交信號的克隆，小量擴(kuò)增，抽提質(zhì)粒DNA測序，與GenBank數(shù)據(jù)庫比較，無相似性的為單拷貝。最后EcoRⅠ酶切分離插入子DNA，并以隨機(jī)引物法，用α-32p-dATP標(biāo)記并與EcoRⅠ消化的gDNA轉(zhuǎn)移尼龍膜雜交，方法同上，1條或2條雜交帶的為單拷貝。
1.3BM及D、G組染色體短臂特異性PAC克隆的獲得及鑒定(1)篩選人PAC gDNA文庫獲得陽性克隆編號利用α-32p-dATP隨機(jī)引物法標(biāo)記260bp的單拷貝探針P8-7→G-50柱(中等粒度)純化→4℃待用→PAC膜7張用2×SSC浸泡10分鐘→55℃預(yù)雜交3小時→探針100℃變性10分鐘→以4.6×105cpm/ml的量加入50ml購買的雜交液中，與PAC膜于65℃雜交1小時→洗膜2×SSC，室溫10分鐘一次，2×SSC/0.1％SDS 65℃10分鐘洗2次→上X光片，-70℃放射自顯影12小時→沖洗X光片→按說明書方法讀取陽性克隆編號。
(2)從5個不同的板上隨機(jī)挑選陽性克隆編號，購買PAC克隆。
1.4 PAC DNA與中期相細(xì)胞FISH雜交，證實(shí)來源于D、G組染色體短臂，如圖1所示。
上述實(shí)驗(yàn)方法參見《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》J.薩姆布魯克等，第2版，1989冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版。(J.Sambrook et al.Molecular Cloning.Second Edition.Cold Spring Harbor Laboratory Press.1989)2．基因引導(dǎo)序列DNA的獲得主要材料β-agarose(Bio-Labs)NotⅠ Agarose①NotⅠ酶切PAC169質(zhì)粒；②通過PFGE分離約120Kb大小的插入子DNA；脈沖電泳條件電極緩沖液0.5×TBE、High stregth AnalyticalGrade Agarose:(Bio-Rad,Low Melting point Agarose LMP)1％、SwitchTime:2秒→15秒電泳時間18小時，電壓6V/cm，角度120。溫度14℃③電泳結(jié)束后，用EB染色(0.2μg/ml)30分鐘，根據(jù)Marker指示，用無菌小刀片切下約3.8kb(120kb)的條帶。
④切下的膠塊用β-agarase處理，乙醇沉淀。
實(shí)施例2本發(fā)明提供的基因載體-FⅨ重組體，即治療血友病B的基因藥物的制備1．基因載體的構(gòu)建及治療基因的導(dǎo)入1.1載體的構(gòu)建1.1.1用NsiⅠ和StuⅠ(平端酶)酶切PAC DNA，普通瓊脂糖凝膠回收3.8kbDNA片段，電洗脫純化；1.1.2用HindⅢ酶切pGEM-TK載體DNA，Klenow酶補(bǔ)平，產(chǎn)生一平頭末端；1.1.3 pGEM-TK/HindⅢ補(bǔ)平產(chǎn)物進(jìn)一步用NsiⅠ酶切；1.1.4 3.8kb/NsiⅠ+StuⅠ純化產(chǎn)物與pGEM-TK/HK+NsiⅠ酶切產(chǎn)物于16℃連接17小時；
1.1.5連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)菌，氨芐皿37℃培養(yǎng)18小時；1.1.6隨機(jī)挑取單克隆，用NsiⅠ及NheⅠ雙酶切鑒定陽性克隆。
1.1.7用XbaⅠ和NheⅠ雙酶切pCDN-GPR質(zhì)粒獲得Neo/XbaⅠ+NheⅠ1.1.8將Neo/XbaⅠ+NheⅠ與pGEM-TK-3.8kb/NheⅠ連接，構(gòu)建成pNS2基因載體。
1.2 FⅨ的導(dǎo)入1.2.1將FⅨ(CDS)克隆至pcDNA 3.1(-)；1.2.2設(shè)計(jì)引物TPCF和TPCR擴(kuò)增FⅨ基因及表達(dá)元件(CMV啟動子和BGH poly A信號)，使其兩端裝上AvrⅡ酶切位點(diǎn)；引物序列為TpcF:ATgCATCCTAggggAggTCgCTgAgTAgTgAvrⅡTpcR:TgCATgCCTAggTACCCCCTAgAgCCCAgAvrⅡ1.2.3用AvrⅡ酶切FⅨ基因及表達(dá)元件(CMV啟動子和BGHpolyA信號)并與NheⅠ酶切的pNS2載體連接。
1.2.4連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化JM109大腸桿菌，獲得含載體-FⅨ重組體的菌株(保藏號為CCTCC M200031)。
上述實(shí)驗(yàn)方法詳見《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》J.薩姆布魯克等，第2版，1989冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版。(J.Sambrook et al.Molecular Cloning.Second Edition.Cold Spring Harbor Laboratory Press.1989)2.基因載體DNA的抽提2.1材料2.1.1QIAGE Plasmid Maxi Kit2.1.2培養(yǎng)基液體LBTrypton 5gYeast extract 2.5gNacl 2.5gddH2O 定量至500ml高壓蒸汽滅菌
2.1.3氨芐青霉素(Amp)100mg/ml(1000×)2.2方法1)挑取陽性單克隆至3ml LB(Amp+)37℃,250rpm培養(yǎng)1小時2)取100μl上述初級培養(yǎng)物置100ml LB(Amp+)中，37℃，250rpm培養(yǎng)16小時3)于4℃,6000g離心15分鐘收獲細(xì)菌4)10mlBuffer Pl重懸菌體5)加入10ml Buffer P2，輕柔地倒轉(zhuǎn)6次混勻，室溫5分鐘。
6)加入10ml冰上預(yù)冷Buffer P3，輕柔倒轉(zhuǎn)6次混勻，冰上20分鐘。
7)4℃,20000g離心30分鐘。
8)迅速將上清轉(zhuǎn)移至另一40ml高速離心管，4℃,20000xg再次離心15分鐘9)10mlBufferQBT平衡QIGENtip 50010)將上清轉(zhuǎn)移至QIGAE tip 500過柱11)2×30ml Buffer QC 先柱12)15ml BufferQF洗脫，收集洗脫液13)洗脫液加(0.7倍體積)10.7ml異丙醇，混勻14)15000g,4℃，離心30分鐘15)去上清，DNA沉淀加入5ml 70％乙醇洗滌，15000g,4℃離心10分鐘16)去70％乙醇，空氣中干燥10分鐘適量TE溶解DNA沉淀實(shí)施例3利用實(shí)施例2得到的基因載體-FⅨ重組體，將FⅨ治療基因?qū)胨拗骷?xì)胞，并在宿主細(xì)胞中表達(dá)，導(dǎo)入的HT1080細(xì)胞株已于2000年8月18日向中國典型培養(yǎng)物保藏中心提出保藏(中國.武漢武漢大學(xué)校內(nèi)，郵政編碼430072)，其保藏號是CCTCC C200005。該保藏物的名稱是人纖維肉瘤細(xì)胞系，為人的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞。保藏人對保藏物指定的分類命名為人纖維肉瘤細(xì)胞系/JH-1/FⅨ。
1．材料1.1細(xì)胞HT1080培養(yǎng)基高糖DMEM+10％FBS(HT1080)EMEM+10％FBS1.2電穿孔儀Bio-Rad公司2．方法1)細(xì)胞于75cm2培養(yǎng)瓶內(nèi)傳代后長至70％～80％滿底2)收獲細(xì)胞，用HeBs緩沖液洗2次，計(jì)數(shù)細(xì)胞3)15000rpm,4℃離心10分鐘4)適量HeBS重懸，使細(xì)胞濃度為106～107/ml5)取0.4ml電擊杯，每杯加細(xì)胞懸液0.8ml，載體DNA 10μg左右6)用電穿孔儀進(jìn)行電擊，電擊條件設(shè)定為電壓260V，電容550μF，電擊時間一般為11～13毫秒。
7)電擊細(xì)胞轉(zhuǎn)入75cm2培養(yǎng)瓶中，加14ml含雙抗的培養(yǎng)基，37℃,5％CO2中培養(yǎng)，24～48小時。
8)培養(yǎng)基內(nèi)加入終濃度300μl的G418進(jìn)行篩選，2～3天換液一次，換液時重新加G3418，同時用正常細(xì)胞做對照9)約7～10天后正常細(xì)胞全部死亡，計(jì)數(shù)轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)存活克隆數(shù)，改用維持量G418 150μg/ml10)轉(zhuǎn)染細(xì)胞繼續(xù)用終濃度為500ng/ml的GCV進(jìn)行篩選11)7～10天大部分克隆死亡，剩余存活細(xì)胞改用維持量GCV250μg/ml或不加經(jīng)過篩的細(xì)胞長至70～80％滿底后，測定轉(zhuǎn)移基因的表達(dá)活性。
3．結(jié)果利用該載體將FⅨ基因用電穿孔的方法導(dǎo)入HT1080細(xì)胞，經(jīng)正、負(fù)篩選得到陽性細(xì)胞株，F(xiàn)ISH證實(shí)為定點(diǎn)插入(圖3)。
FⅨ活性由陰性對照的低于0.1μg/ml升高到4.27μg/ml，而且轉(zhuǎn)化后144天表達(dá)量仍為3.15/μg/ml，見表l。其表達(dá)產(chǎn)物通過Western雜交證實(shí)(圖4)。
表1 FⅨ活性測定(μg/ml/105細(xì)胞/24小時)
轉(zhuǎn)化后天數(shù)克隆F2335天 4.2772天 4.39100天4.6111天3.95139天4.0144天3.15實(shí)施例4在人群中存在的安全性實(shí)例從1973年夏家輝從事人類與醫(yī)學(xué)細(xì)胞遺傳學(xué)研究以來，所發(fā)現(xiàn)和鑒定的來自全國189個實(shí)驗(yàn)室的470位臨床細(xì)胞遺傳學(xué)工作者所申報(bào)的732種世界首報(bào)核型中，有41種核型涉及D、G組染色體短臂，但不論易位到D、G染色體短臂的片段來源于1-22號哪一號染色體，或源于同一號染色體的片段長短各異，所含基因從1個到上千個，而攜帶者本人的表型都是正常的，說明易位到D、G染色體短臂的基因能正常表達(dá)，據(jù)此，我們將D、G組染色體短臂作為基因治療的靶位點(diǎn)應(yīng)該是安全的。1、核型46,XX,t(1；12；22；15；11；8)(1qter→1p11::8p23→8pter；12pter→12q11::1p11→1pter；22qter→22p11::12q11→12qter；15pter→15q15::22p11→22pter；11pter→11q21::15q15→15qter；8qter→8p23::11q21→11qter)。表型女，28歲，為表型正常的攜帶者資料提供者吳素彬，廣東省廣州市，中山醫(yī)科大學(xué)附一院婦產(chǎn)科細(xì)胞遺傳室，郵政編碼5100802、核型46,XY,t(1；13)(1pter→1q32::13p11→13pter；13qter→13p11::1q32→1qter)．表型女，24歲，為表型正常的攜帶者資料提供者肖晟，哈爾濱醫(yī)科大學(xué)生物教研室，郵政編碼1500863、核型46,XX,t(2；15)(2pter→cen→15qter；2qter→cen→15pter)。表型女，26歲，為表型正常的攜帶者資料提供者郭裕萍等，江西省南昌市，江西省婦產(chǎn)科醫(yī)院細(xì)胞遺傳室，郵政編碼3300064、核型46,XY,t(2；21)(2pter→cen→21pter；2qter→cen→21qter)。表型男，32歲，為表型正常的攜帶者資料提供者康過秦等，山西省太原市，山西醫(yī)學(xué)院附二院遺傳研究室，郵政編碼0300015、核型46,XY,t(3；22)(3qter→cen→22pter；3pter→cen→22pter)。表型男，26歲，為表型正常的攜帶者資料提供者高永，山東省濱州市醫(yī)學(xué)院毒理室，郵政編碼2566036、核型46,XY,t(3；22)(3pter→cen→22qter；3qter→cen→22pter)。表型男，29歲，為表型正常的攜帶者資料提供者石化金等，遼寧錦州市婦嬰醫(yī)院遺傳室，郵政編碼1210007、核型46,XX,t(4；15)(4qter→4p13::15p13→15pter；15qter→15p13::4p13→4pter)。表型女，28歲，為表型正常的攜帶者資料提供者周玲等，湖北省武漢市，武漢市兒童醫(yī)院遺傳實(shí)驗(yàn)室，郵政編碼4300168、核型46,XY,t(4；21)(4qter→4p15::21p11→21pter；21qter→21p11::4p15→4pter)。表型男，25歲，為表型正常的攜帶者資料提供者徐競芳等，上海市第六人民醫(yī)院遺傳室，郵政編碼2000009、核型46,XY,t(4；14)(4pter→4q31::14p11→14pter；14qter→14p11::4q31→4qter)。表型男，為表型正常的攜帶者資料提供者周明君等，河志省許昌市中心醫(yī)院，郵政編碼16100010、核型46,XY,t(4；14)(4pter→4q35::14p11→14pter；14qter→14p11::4q35→4qter)。表型男，27歲，為表型正常的攜帶者資料提供者張秀泉等，廣東省佛山市，佛山市婦幼保健院，郵政編碼52800011、核型46,XX,t(5；22)(5pter→5q13::22p11→22pter；22qter→22p11::5q13→5qter)。表型女，32歲，為表型正常的攜帶者資料提供者曹建萍，河南安陽市婦幼保健院遺傳室，郵政編碼45500012、核型46,XY,t(6；22)(6pter→cen6→22qter；6qter→cen22→22pter)表型男，25歲，為表型正常的攜帶者資料提供者祝新霞等，山東省泰安市，山東泰安第88醫(yī)院婦產(chǎn)科細(xì)胞遺傳室，郵政編碼27100013、核型46,XY,t(6；22)(6qter→6p21::22p11.2→22pter；22qter→22p11.2::6p21→6pter)。表型男，33歲，為表型正常的攜帶者資料提供者楊蘭青，山東省濱州市濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，郵政編碼25660314、核型45,XX,t(7；21)(7qter→7p22::21p12→21qter)。表型女，23歲，為表型正常的攜帶者資料提供者孫吉慶等，湖北省武漢市，湖北省武漢市兒童醫(yī)院醫(yī)學(xué)遺傳實(shí)驗(yàn)室，郵政編碼43001615、核型46,XY/46,XY,t(7；14)(7pter→7q11::14p11→14pter；14qter→14p11::7q11→7qter)表型男，28歲，為表型正常的攜帶者資料提供者李麓蕓、夏家輝等，湖南省長沙市，湖南醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)研究室，郵政編碼41007816、核型46,XY,t(8；14)(8qter→8p21::14p12→14pter；14qter→14p12::8p21→8pter)表型男，27歲，為表型正常的攜帶者資料提供者石化金等，遼寧錦州市婦嬰醫(yī)院遺傳室，郵政編碼12100017、核型46,XY,t(9；14)(9pter→cen→14pter；9qter→cen→14qter)表型男，28歲，為表型正常的攜帶者資料提供者程秋云等，衡陽醫(yī)學(xué)院附一生殖醫(yī)學(xué)研究室，郵政編碼42100118、核型46,XX,t(9；22)(9pter→9p13::22p12→22pter；22qter→22p12::9p13→9pter)mat表型女，31歲，其母、1妹、1弟、1子具有相同核型，同為表型正常的攜帶者資料提供者李麓蕓，夏家輝等，湖南醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)研究室，郵政編碼41007819、核型46,XX,t(9；14)(9pter→9q12::14p12→14pter；14qter→14p12::9q12→9qter)表型女，32歲，為表型正常的攜帶者資料提供者孫艷陽等，黑龍江省哈爾濱市，哈爾濱醫(yī)科大學(xué)生物教研室，郵政編碼15008620、核型46,XX,t(9；15)(9pter→9q21::15p12→15pter；15qter→15p12::9q21→9qter)mat。表型女，36歲，為表型正常的攜帶者資料提供者朱桂珍等，山東省泰安市，山東泰安第88醫(yī)院婦產(chǎn)科細(xì)胞遺傳室，郵政編碼27100021、核型46,XX,t(10；13)(10pter→10q24::13p11→13pter；13qter→13p11::10q24→10qter)。表型女，28歲，為表型正常的攜帶者資料提供者嚴(yán)敦清，青島醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科研究室，郵政編碼26600322、核型46,XX,t(10；13)(10pter→10q24::13p12→13pter；13qter→13p12::10q24→10qter)。表型女，29歲，為表型正常的攜帶者資料提供者張影如等，廣東省廣州市，中山醫(yī)科大學(xué)附一院神經(jīng)科，郵政編碼51008023、核型46,XX,t(11；14)(11pter→cen→14pter；11qter→cen→14qter)表型女，2歲，為表型正常的攜帶者資料提供者王志勇，河南省柘城縣，柘城縣人民醫(yī)院遺傳室，郵政編碼47620024、核型46,XX,t(11；21)(11pter→11p11::21p11→21pter；21qter→21p11::11p11→11pter)。表型女，26歲，為表型正常的攜帶者資料提供者鄭軍等，陜西省西安市，陜西省婦幼保健院醫(yī)學(xué)遺傳實(shí)驗(yàn)室，郵政編碼71000325、核型46,XY,t(11；15)(11pter→11q13::15p12→15pter；15qter→15p12::11q13→11qter)表型男，23歲，為表型正常的攜帶者資料提供者楊瑞芳等，山東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)中心，郵政編碼25001226、核型46,XX,t(12；14)(12pter→cen→14pter；12qter→cen→14qter)表型女，28歲，為表型正常的攜帶者資料提供者韓維田等，遼寧省計(jì)劃生育科研所優(yōu)生研究室，郵政編碼11003127、核型46,XX,t(13；16)(13qter→13p11::16p11.2→16pter；16qter→16p11.2::13p11→13pter)。表型女，27歲，為表型正常的攜帶者資料提供者安松蘭，遼寧省大連市，大連市婦產(chǎn)醫(yī)院遺傳室，郵政編碼11007828、核型46,XY/45,XY,t(13；13)(13qter→13p12::13p12→13qter)。表型男，39歲，為表型正常的攜帶者資料提供者李麓蕓、夏家輝等，湖南省長沙市，湖南醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)研究室，郵政編碼41007829、核型46,XY,t(14；18)(14pter→cen→18pter；14qter→cen→18qter)表型男，30歲，為表型正常的攜帶者資料提供者王素桂等，北京市計(jì)劃生育技術(shù)指導(dǎo)所，郵政編碼10000630、核型46,XX,t(14；15)(14pter→14q13::15p13→15pter；15qter→15p13::14q13→14qter)表型女，28歲，為表型正常的攜帶者資料提供者李麓蕓，夏家輝等，湖南省長沙市，湖南醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)研究室，郵政編碼41007831、核型45,XX,t(15qter→cen→22qter)。表型女，27歲，為表型正常的攜帶者資料提供者夏家輝等，湖南醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，郵政編碼41007832、核型46,XY,t(15；18)(15pter→cen→18pter；15qter→cen→18qter)。表型男，30歲，為表型正常的攜帶者資料提供者任國慶等，北京市計(jì)劃生育技術(shù)指導(dǎo)所，郵政編碼10000633、核型46,XX,t(15；20)(15pter→cen→2pter；15qter→cen→2qter)表型女，26歲，為表型正常的攜帶者資料提供者王新等，湖南醫(yī)科大學(xué)附二醫(yī)院婦產(chǎn)科遺傳室，郵政編碼41001134、核型46,XX,t(15；22)(15pter→15q11::22p13→22pter；22qter→22p13::15q11→15qter)。表型女，27歲，為表型正常的攜帶者資料提供者符生苗，海南省?？谑?，海南省人民醫(yī)院遺傳室，郵政編碼57001135、核型46,XX,t(15；22)(15pter→15q22::22p11→22pter；22qter→22p11::15q22→qter)表型女，29歲，為表型正常的攜帶者資料提供者李牧堯等，新疆烏魯木齊，新疆醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)遺傳室，郵政編碼83005436、核型46,XY,t(16；21)(16pter→16q21::21p11→21pter；21qter→21p11::16q12→16qter)。表型男，29歲，為表型正常的攜帶者資料提供者張惠芳等，廣東省計(jì)劃生育科學(xué)技術(shù)研究所，郵政編碼51008037、核型46,XX,t(18；21)(18qter→cen→21qter；18pter→cen→21pter)表型女，為表型正常的攜帶者資料提供者石化金等，遼寧錦州市婦嬰醫(yī)院遺傳室，郵政編碼12100038、核型46,XX,t(18；21)(18pter→18q11::21p12→21pter；21qter→21p12::18q11→18qter)表型女，26歲，為表型正常的攜帶者資料提供者李修林等，遼寧省沈陽市，中國醫(yī)科大學(xué)附一院小兒科遺傳室，郵政編碼11000139、核型45,X,dic(Y；13)(Ypter→Yq1200::13p11→cen→13qter)表型男，4歲，為表型正常的攜帶者資料提供者夏家輝等，湖南醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，郵政編碼41007840、核型46,XY,t(Y；15)(15qter→15p12::Yq12→Ypter)pat。表型男，新生兒，為表型正常的攜帶者資料提供者夏家輝等，湖南醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，郵政編碼41007841、核型45,X,psu dic(Y；22)(Ypter→Yq1209::22p12→cen→22qter)表型男，為表型正常的攜帶者資料提供者劉希賢等，湖北武漢同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)研究室，郵政編碼430030
上述實(shí)例說明在核仁組織區(qū)不但可接受外源基因，而且能讓外源基因正常表達(dá)。這也證明了本發(fā)明提供的基因藥物治療血友病B的可行性。
序列表<110> 夏家輝<120> 治療血友病B的基因藥物<160> 1<211> 13928bp<212> DNA<213> 基因載體-FⅨ重組體<400>
1 GGGCGAATTG GGCCCGACGT CGCATGCTCC TCTAGACTCG AGGAATTCTA51 CCGGGTAGGG GAGGCGCTTT TCCCAAGGCA GTCTGGAGCA TGCGCTTAAG101 CAGCCCCGCT GGGCACTTGG CGCTACACAA GTGGCCTCTG GCCTCGCACA151 CATTCCACAT CCACCGGTAG GCGCCAACCG GCTCCGTTCT TTGGTGGCCC201 CTTCGCGCCA CCTTCTACTC CTCCCCTAGT CAGGAAGTTC CCCCCCGCCC251 CGCAGCTCGC GTCGTGCAGG ACGTGACAAA TGGAAGTAGC ACGTCTCACT301 AGTCTCGTGC AGATGGACAG CACCGCTGAG CAATGGAAGC GGGTAGGCCT351 TTGGGGCAGC GGCCAATAGC AGCTTTGCTC CTTCGCTTTC TGGGCTCAGA401 GGCTGGGAAG GGGTGGGTCC GGGGGCGGGC TCAGGGGCGG GCTCAGGGGC451 GGGGCGGGCG CCCGAAGGTC CTCCGGAGGC CCGGCATTCT GACGCTTCAA501 AAGCGCACGT CTGCCGCGCT GTTCTCCTCT TCCTCATCTC CGGCCTTTCG551 ACCTGCAGCG ACCCGCTTAA CAGCGTCAAC AGCGTGCCGC AGATCTTGGT601 GGCGTGAAAC TCCCGCACCT CTTCGGCAAG CGCCTTGTAG AAGCGCGTAT651 GGCTTCGTAC CCCTGCCATC AACACGCGTC TGCGTTCGAC CAGGCTGCGC701 GTTCTCGCGG CCATAGCAAC CGACGTACGG CGTTGCGCCC TCGCCGGCAG751 CAAGAAGCCA CGGAAGTCCG CCTGGAGCAG AAAATGCCCA CGCTACTGCG801 GGTTTATATA GACGGTCCTC ACGGGATGGG GAAAACCACC ACCACGCAAC851 TGCTGGTGGC CCTGGGTTCG CGCGACGATA TCGTCTACGT ACCCGAGCCC901 GATGACTTAC TGGCAGGTGC TGGGGGCTTC CGAGACAATC GCGAACATCT951 ACACCACACA ACACCGCCTC GACCAGGGTG AGATATCGGC CGGGGACGCG1001 GCGGTGGTAA TGACAAGCGC CCAGATAACA ATGGGCATGC CTTATGCCGT1051 GACCGACGCC GTTCTGGCTC CTCATATCGG GGGGGAGGCT GGGAGCTCAC1101 ATGCCCCGCC CCCGGCCCTC ACCCTCATCT TCGACCGCCA TCCCATCGCC1151 GCCCTCCTGT GCTACCCGGC CGCGCGATAC CTTATGGGCA GCATGACCCC1201 CCAGGCCGTG CTGGCGTTCG TGGCCCTCAT CCCGCCGACC TTGCCCGGCA1251 CAAACATCGT GTTGGGGGCC CTTCCGGAGG ACAGACACAT CGACCGCCTG1301 GCCAAACGCC AGCGCCCCGG CGAGCGGCTT GACCTGGCTA TGCTGGCCGC1351 GATTCGCCGC GTTTACGGGC TGCTTGCCAA TACGGTGCGG TATCTGCAGG1401 GCGGCGGGTC GTGGCGGGAG GATTGGGGAC AGCTTTCGGG GACGGCCGTG1451 CCCGCCCCAG GGTGCCGAGC CCCAGAGCAA CGCGGGCCCA CGACCCCATA1501 TCGGGGACAC GTTATTTACC CTGTTTCGGG CCCCCGAGTT GCTGGCCCCC1551 AACGGCGACC TGTACAACGT GTTTGCCTGG GCCTTGGACG TCTTGGCCAA1601 ACGCCTCCGT CCCATGCACG TCTTTATCCT GGATTACGAC CAATCGCCCG1651 CCGGCTGCCG GGACGCCCTG CTGCAACTTA CCTCCGGGAT GGTCCAGACC1701 CACGTCACCA CCCCCGGCTC CATACCGACG ATCTGCGACC TGGCGCGCAC1751 GTTTGCCCGG GAGATGGGGG AGGCTAACTG AAACACGGAA GGAGACAATA1801 CCGGAAGGAA CCCGCGCTAT GACGGCAATA AAAAGACAGA ATAAAACGCA1851 CGGGTGTTGG GTCGTTTGTT CATAAACGCG GGGTTCGGTC CCAGGGCTGG1901 CACTCTGTCG ATACCCCACC GAGACCCCAT TGGGGCCAAT ACGCCCGCGT1951 TTCTTCCTTT TCCCCACCCC ACCCCCCAAG TTCGGGTGAA GGCCCAGGGC2001 TCGCAGCCAA CGTCGGGGCG GCAAGCCCTG CCATAGCCAC GGGCCCCGTG2051 GGTTAGGGAC GGGGTCCCCC ATGGGGAATG GTTTATGGTT CGTGGGGGTT2101 ATTATTTTGG GCGTTGCGTG GGGTCAGGTC CACGACTGGA CTGAGCAGAC2151 AGACCCATGG TTTTTGGATG GCCTGGGCAT GGACCGCATG TACTGGCGCG2201 ACACGAACAC CGGGCGTCTG TGGCTGCCAA ACACCCCCGA CCCCCAAAAA2251 CCACCGCGCG GATTTCTGGC GCCGCCGGAC GAACTAAACC TGACTACGGC2301 ATCTCTGCCC CTTCTTCGCT GGTACGAGGA GCGCTTTTGT TTTGTATTGG2351 TCACCACGGC CGAGTTTCCG CGGGACCCCG GCCAGGACCT GCAGAAATTG2401 ATGATCTATT AAACAATAAA GATGTCCACT AAAATGGAAG TTTTTCCTGT2451 CATACTTTGT TAAGAAGGGT GAGAACAGAG TACCTACATT TTGAATGGAA2501 GGATTGGAGC TACGGGGGTG GGGGTGGGGT GGGATTAGAT AAATGCCTGC2551 TCTTTACTGA AGGCTCTTTA CTATTGCTTT ATGATAATGT TTCATAGTTG2601 GATATCATAA TTTAAACAAG CAAAACCAAA TTAAGGGCCA GCTCATTCCT2651 CCCACTCATG ATCTATAGAT CTATAGATCT CTCGTGGGAT CATTGTTTTT2701 CTCTTGATTC CCACTTTGTG GTTCTAAGTA CTGTGGTTTC CAAATGTGTC2751 AGTTTCATAG CCTGAAGAAC GAGATCAGCA GCCTCTGTTC CACATACACT2801 TCATTCTCAG TATTGTTTTG CCAAGTTCTA ATTCCATCAG AAGCTCCTTA2851 ATTTTATACC ACTGACTTAT TTTGAAGGCT GCTATAAGAA ACAGCCCTAT2901 GAAACTGGTA TTTTCCTACT GCAAGGTGGC TACTTTAAGA CAATTTTTCA2951 TTGCATTCTA TCAAGGGATG TCTTATTATT ATATCATTAT ATCAAGTGAT3001 GTTATAAATA GTAAGAATCA GATTAAGGGC TCATATGTCC TTCTTTGTAT3051 TGACTGTTGA AAAGGTATGG GGCCAAATTT GTAGTTTGTC TGGAATTACA3101 TATTTTTGGG GGTCTCTATT ATCTTCATAC TTATCCTATC TAAATTTTCC3151 ATTGCCAAAT TTCCTTACTT ATTTTTAGTT TTATCCTATT GCTCATGTAT3201 TTTTATGTCT CCATAAGTCT ATTTTGGAAA AAGGCAGAGT ACTCATAATT3251 TTAGTATATC TTTTAGCTTT ATGTTGCCAT AAACCTTTCA TTATATACAT3301 GATCAACAAC AGCAAATTAT CTCACTTCAG TATTTAGTTT ATTATTTTAC3351 AAACTGATTT ATGATTGCTA ACATGTAACT GAAGGTATAC ACTATTAGAA3401 CACAGTTTTC AGTAGAAAGT AGCACTGCCA TTGAGTAAAA AAATGTTCTA3451 ACATTAGAGC AACATTCTTA TACAAGTTTG CATGTTGTTT ACTGAGGTCT3501 AAAGCATGAC TACACAAAAG GCTGAATAAA ATTCAGATTC TTACATACAC3551 ATAAAATTGT TTTATTGAGA TGACAAAGTA TATTTATTAT GCCACCCAGA3601 ATATAATCCA CTCTGATAAC TGCCAGTGTA TGCACTTGCT GAAGTAACTC3651 AGTACATAAA TGGTAGCCAC AACAGTTGCT GTGCATGAAA GTTCTTCTCT3701 TCCAGATTGA AGAGTGTACA ATCTAAAGCA TTTTAAAACT TTAAATCCCT3751 TATTAGCTTA AATATAATTT AAAATTTTAG TTTGCCGTAC CTATAATTTG3801 TCTGTACACT AGGTTACTAA GGGTGATATG ATTACATATG TGGATACAAA3851 ATAATTTTAA TGGAAAATGA AATTAGGGTA CTCAACAAAG ATAAAGGGTA3901 ATGATCATGT ACACTAACCG TATTTGAGAT TAGTTTAAGC CTGGGGTAGC3951 TATACTTATG TTTCACAGAC CTTGAGAAGA TAGGGAAAAA AAGCTTTTAT4001 CAACATTGCT AAGGAACAGG TAAAAGCTAA CATTAGGTAA CTAAGAGGTG4051 ACATAAAAAA GACTGAATAA AATATCATGG AGGTTTCATA ATAAGATTGG4101 AAATTCCATA GACTAGGAGA GAAAAGATCC CAAAATATAC ATGCTCATTG4151 GGAAAACAGC TAGTAAGAAC AAGGAGAGAT CTCTATTTAA TGATACAATA4201 GTAGAGTTAT AATTTCCTGT ATATTGTAAA 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權(quán)利要求
1.治療血友病B的基因藥物，含有以人類D、G組染色體短臂上無重要生理功能相關(guān)基因的DNA序列或與該DNA序列具有50％及50％以上同源性的DNA序列作為治療基因的引導(dǎo)序列所構(gòu)建的基因載體-FⅨ重組體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的治療血友病B的基因藥物，其特征在于所述的載體-FⅨ重組體具有序列表1表示的DNA序列，F(xiàn)Ⅸ治療基因的插入位點(diǎn)為5910位。
3.制備權(quán)利要求1所述的治療血友病B的基因藥物的方法，其特征在于包括下列步驟(1)以人類D、G組染色體短臂上無重要生理功能相關(guān)基因的DNA序列或與該DNA序列具有50％及50％以上同源性的DNA序列作為治療基因的引導(dǎo)序列，構(gòu)建基因載體；(2)將FⅨ治療基因裝入上述基因載體，得到載體-FⅨ重組體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的治療血友病B的基因藥物的方法，其特征在于(1)治療基因引導(dǎo)序列選自人類D、G組染色體短臂上無重要生理功能相關(guān)基因的DNA序列，其長度為3.8Kb，利用TK做為負(fù)篩選基因，將正篩選基因Neo基因插入治療基因引導(dǎo)序列中的1500位，使其分為1.5kb和2.3kb兩臂，構(gòu)建成基因載體；(2)FⅨ治療基因的插入位點(diǎn)為5910位。
全文摘要
本發(fā)明涉及治療血友病B的基因藥物,它含有以人類D、G組染色體短臂上無重要生理功能相關(guān)基因的DNA序列或與該DNA序列具有50%及50%以上同源性的DNA序列作為治療基因的引導(dǎo)序列所構(gòu)建的基因載體－FIX重組體(保藏號CCTCC M200031)。該治療血友病B的基因藥物治療基因表達(dá)穩(wěn)定性好,安全性好,表達(dá)效率高,無免疫原性。
文檔編號A61K35/76GK1302664SQ01102830
公開日2001年7月11日 申請日期2001年1月19日 優(yōu)先權(quán)日2000年8月30日
發(fā)明者夏家輝 申請人:夏家輝