環腺苷酸－特異性磷酸二酯酶抑制劑的制作方法

專利名稱：環腺苷酸－特異性磷酸二酯酶抑制劑的制作方法
相關申請的相互參考本申請要求1999年12月23日遞交的美國臨時申請順序號60/173,019的優先權益。
本發明的領域本發明涉及一系列為有效和選擇性的環腺苷酸特異性磷酸二酯酶(cAMP特異性PDE)抑制劑的化合物。本發明尤其涉及一系列用于抑制cAMP特異性PDE功能，尤其是PDE4功能的新的吲唑化合物以及制備它們的方法、含有它們的藥用組合物和它們作為例如治療炎性疾病和其它涉及細胞因子和促炎介質水平升高的疾病的治療藥的用途。
本發明背景慢性炎癥為一種多因素并發癥，其特征為激活多種類型的炎性細胞，尤其是淋巴系細胞(包括T淋巴細胞)和骨髓系細胞(包括有粒自細胞、巨噬細胞和單核細胞)。包括細胞因子例如腫瘤壞死因子(TNF)和白介素-1(IL-1)的促炎介質由這些激活的細胞產生。因此，抑制這些細胞的激活或抑制它們產生促炎細胞因子的藥物將用于治療性治療炎性疾病和其它涉及細胞因子水平升高的疾病。
環腺苷酸(cAMP)為一種介導細胞對于廣泛的胞外刺激的生物應答的第二信使。當合適的激動劑與特異性細胞表面受體結合時，激活腺苷酸環化酶，使腺苷三磷酸(ATP)轉化為cAMP。理論上在細胞內誘導cAMP作用的所述激動劑主要由cAMP-依賴性蛋白激酶的作用介導。cAMP的細胞內作用因為cAMP轉運到細胞外或由環核苷酸磷酸二酯酶(PDEs)的酶促裂解作用而中止，PDEs水解3’-磷酸二酯鍵以形成5’-腺苷酸(5’-AMP)。5’-AMP為一種失活的代謝物。以下圖示說明cAMP和5’-AMP的結構。 在人骨髓系細胞和淋巴系細胞中cAMP水平的升高與抑制細胞激活有關。因此，細胞內PDEs酶家族調節細胞內cAMP的水平。PDE4為這些細胞中的主要的PDE同種型并且主要影響cAMP降解。因此，抑制PDE的功能將防止cAMP轉化為失活的代謝物5’-AMP，從而維持較高的cAMP水平，因而抑制細胞激活(參見Beavo等，“CyclicNucleotide PhosphodiesterasesStructure，Regulation and Drug Action”，Wiley and Sons，Chichester，第3-14頁(1990))；Torphy等，Drug Newsand Perspectives，6，第203-214頁(1993)；Giembycz等，Clin.Exp.Allergy，22，第337-344頁(1992))。
具體地說，已證明PDE4抑制劑例如咯利普蘭抑制TNFα的產生并且部分抑制單核細胞釋放IL-1β(參見Semmler等，Int.J.Immunopharmacol.，15，第409-413頁(1993)；Molnar-Kimber等，Mediators of Inflammation，1，第411-417頁(1992))。還證明了PDE4抑制劑抑制由人多形核白細胞產生超氧化物自由基(參見Verghese等，J.Mol.Cell.Cardiol.，21(增補2)，S61(1989)；Nielson等，J.AllergyImmunol.，86，第801-808頁(1990))；抑制血管活性胺和前列腺素類由人嗜堿性粒細胞的釋放(參見Peachell等，J.Immunol.，148，第2503-2510頁(1992))；抑制嗜酸性白細胞的呼吸爆發(參見Dent等，J.Pharmacol.，103，第1339-1346頁(1991))；以及抑制人T-淋巴細胞的激活(參見Robicsek等，Biochem.Pharmacol.，42，第869-877頁(1991))。
炎性細胞的激活和過量的或非調節性細胞因子(例如TNFα和IL-1β)的產生與以下變應性、自身免疫和炎性疾病有關如類風濕性關節炎、骨關節炎、痛風性關節炎、脊椎炎、與甲狀腺有關的眼病、貝赫切特病、膿毒病、敗血癥性休克、內毒素性休克、革蘭氏陰性膿毒病、革蘭氏陽性膿毒病、中毒性休克綜合征、哮喘、慢性支氣管炎、成人呼吸窘迫綜合征、慢性肺炎例如慢性阻塞性肺炎、硅肺、肺結節病、心肌、腦和肢端再灌注損傷、纖維變性、胰囊性纖維變性、瘢痕疙瘩形成、疤痕形成、動脈粥樣硬化、移植排斥反應例如移植物抗宿主的反應和同種移植排斥反應、慢性腎小球性腎炎、紅斑狼瘡、炎性腸疾病例如局限性回腸炎和潰瘍性結腸炎、增生性淋巴細胞疾病例如白血病以及炎性皮膚疾病例如特應性皮炎、牛皮癬和蕁麻疹。
特征在于細胞因子水平升高的其它疾病包括由于中度的外傷引起的腦損傷(參見Dhillon等，J.Neurotrauma，12，第1035-1043頁(1995)；Suttorp等，J.Clin.Invest.，91，第1421-1428頁(1993))、心肌病例如充血性心力衰竭(參見Bristow等，Circulation，97，第1340-1341頁(1998))、惡病質、感染或惡性腫瘤繼發的惡病質、獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)繼發惡病質、ARC(AIDS相關復癥)繼發的惡病質、由于感染引起的發燒和肌痛、腦型瘧、骨質疏松和骨吸收疾病、瘢痕疙瘩形成、疤痕組織形成和發熱。
尤其是，已經證實TNFα對于人獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)具有作用。AIDS是由于T-淋巴細胞感染人免疫缺陷病毒(HIV)引起的。盡管HIV也感染并存在于骨髓系細胞中，已經證實TNF上調T-淋巴細胞和單核細胞中的HIV感染(參見Poli等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87，第782-785頁(1990))。
TNFα的幾種性質例如刺激膠原酶、刺激體內血管生成、刺激骨吸收和能夠增加腫瘤細胞與內皮的附著的性質與TNF對腫瘤在宿主體內形成和轉移擴散的作用是一致的。最近，已顯示TNFα直接參與促進腫瘤細胞的生長和轉移(參見Orosz等，J.Exp.Med.，177，第1391-1398(1993))。
PDE4具有廣泛的組織分布。對于PDE4具有至少4種基因，來自任一給定基因的PDE4的多種轉錄物能夠產生共有相同催化位點的幾種不同的蛋白。在4種可能的催化位點之間氨基酸的同一性大于85％。它們對抑制劑的同樣敏感性和它們的動力學相似性反映了這個水平的氨基酸的同一性的功能方面作用。推測這些可變表達的PDE4蛋白的作用在于細胞通過這種作用可以區別性細胞內定位這些酶和/或通過翻譯后修飾調節催化效率。表達PDE4酶的任一給定的細胞類型通常表達編碼這些蛋白的4種可能的基因中的至少一種。
研究者已經表現出對使用PDE4抑制劑作為抗炎藥物的極大興趣。早期的證據顯示，抑制PDE4對于各種炎性細胞例如單核細胞、巨噬細胞、所述Th-1系的T-細胞和有粒白細胞具有有益的作用。許多促炎介質例如細胞因子、脂質介質、超氧化物和生物胺例如組胺的合成和/或釋放通過PDE4抑制劑的作用在這些細胞中已經減弱。PDE4抑制劑也影響其它細胞功能包括T-細胞增殖、有粒白細胞化學毒性物質作用下的移行和微管結構內內皮細胞連接的完整性。
已經報告了各種PDE4抑制劑的設計、合成和篩選。甲基黃嘌呤例如咖啡因、茶堿是最初被發現的PDE抑制劑，但是，這些化合物對于被抑制的PDE是非特異性的。藥物咯利普蘭(抗抑郁藥)是最初報道的特異性PDE4抑制劑之一。已經報道，具有以下結構式的咯利普蘭抑制重組人PDE4的50％抑制濃度(IC50)約200 nM(納摩爾)。 咯利普蘭研究者一直在繼續尋找PDE4抑制劑，它們對于抑制PDE4更有效，它們具有比咯利普蘭更低的IC50值，它們避免了與給予咯利普蘭有關的不需要中樞神經系統(CNS)的副作用例如干嘔、嘔吐和鎮靜作用。在Feldman等的美國專利號5,665,754中公開了一類化合物。其中所公開的化合物為具有與咯利普蘭結構類似的取代的吡咯烷。一種具有結構式(I)的具體的化合物具有對于人重組PDE4的IC50為約2nM。由于觀察到可有利地將催吐副作用與效果分開，這些化合物沒有顯示降低不需要的中樞神經系統作用。 此外，有幾家公司正在進行其它PDE4抑制劑的臨床試驗。然而，涉及效果和不利的副作用例如嘔吐和中樞神經系統紊亂的問題仍未解決。
因此，選擇性抑制PDE4并降低或消除與在先的PDE4抑制劑有關的不利的中樞神經系統副作用的化合物將用于治療變應性和炎性疾病以及其它與細胞因子例如TNF過度或非調節性產生有關的疾病。此外，選擇性PDE4抑制劑將用于治療與在具體靶組織中cAMP水平升高或PDE4功能增強有關的疾病。
本發明概述本發明涉及用于治療其中抑制PDE4活性是非常有益的疾病和病癥的有效和選擇性的PDE4抑制劑。本發明的PDE4抑制劑出人意料地降低或消除與在先的PDE4抑制劑有關的不利的中樞神經系統副作用。
本發明尤其涉及具有結構式(II)的化合物
其中，R1為氫、低級烷基、橋連的烷基(例如降冰片基)、芳基(例如苯基)、雜芳基、環烷基、5-或6-元飽和雜環基(例如3-四氫呋喃基)、C1-3亞烷基環烷基(例如環戊基甲基)、芳基-或雜芳基-取代的炔丙基(例如-CH2C≡C-C6H5)、芳基-或雜芳基-取代的烯丙基(例如-CH2CH＝CH-C6H5)或鹵代環烷基(例如氟代環戊基)；R2為氫、低級烷基、橋連的烷基、環烷基、鹵代烷基、鹵代環烷基、C13亞烷基環烷基、5-或6-元飽和雜環基、芳基、雜芳基、芳基烷基、烷基芳基、雜芳基烷基或雜烷基芳基；R3為C(＝O)OR7、C(＝O)R7、C(＝NH)NR8R9、C(＝O)-NR8R9、低級烷基、橋連的烷基、環烷基、鹵代烷基、鹵代環烷基、C1-3亞烷基環烷基、5-或6-元飽和雜環基、芳基、雜芳基、雜芳基SO2、芳基烷基、烷基芳基、雜芳基烷基、雜烷基芳基、C1-3亞烷基C(＝O)OR7、C(＝O)C1-3亞烷基-C(＝O)OR7、C1-3亞烷基雜芳基、C(＝O)C(＝O)OR7、C(＝O)C1-3亞烷基C(＝O)OR7、C(＝O)C1-3亞烷基NH(C＝O)OR7、C(＝O)C1-3亞烷基NH2或NHC(＝O)OR7；R4為氫、低級烷基、鹵代烷基、環烷基或芳基；R5為氫、低級烷基、炔基、鹵代烷基、環烷基或芳基；R6為氫、低級烷基或C(＝O)R7；R7為支鏈或直鏈的低級烷基或芳基，其中任何一個任選被一個或更多個OR8、NR8R9或SR8取代；R8和R9相同或不同，選自氫、低級烷基、環烷基、芳基、雜芳基、烷芳基、雜芳烷基、雜烷芳基和芳烷基，或者R8和R9一起形成4-元-7-元環；R10為氫、烷基、鹵代烷基、環烷基、芳基、C(＝O)烷基、C(＝O)環烷基、C(＝O)芳基、C(＝O)O烷基、C(＝O)O環烷基、C(＝O)芳基、CH2OH、CH2O烷基、CHO、CN、NO2或SO2R11；和R11為烷基、環烷基、三氟甲基、芳基、芳烷基或NR8R9。
本發明也涉及含有一種或更多種結構式(II)的化合物的藥用組合物，涉及所述化合物和含有所述化合物的組合物在治療疾病中的用途以及涉及制備化合物和在參與合成結構式(II)的化合物的中間體的方法。
本發明也涉及通過給予哺乳動物治療有效量的結構式(II)的化合物或含有結構式(II)的化合物的組合物，治療所述哺乳動物的疾病的方法，其中所述哺乳動物患有的疾病如果抑制PDE4，可有益地調節哺乳動物體內cAMP水平、降低哺乳動物體內的TNFα水平、抑制哺乳動物體內炎性細胞的激活和抑制哺乳動物體內的PDE4功能。
優選實施方案的詳述本發明涉及具有結構式(II)的化合物 其中，R1為氫、低級烷基、橋連的烷基(例如降冰片基)、芳基(例如苯基)、環烷基、5-或6-元飽和雜環基(例如3-四氫呋喃基)、C1-3亞烷基環烷基(例如環戊基甲基)、芳基-或雜芳基-取代的炔丙基(例如-CH2C≡C-C6H5)、芳基-或雜芳基-取代的烯丙基(例如-CH2CH＝CH-C6H5)或鹵代環烷基(例如氟代環戊基)；R2為氫、低級烷基、橋連的烷基、環烷基、鹵代烷基、鹵代環烷基、C1-3亞烷基環烷基、5-或6-元飽和雜環基、芳基、雜芳基、芳基烷基、烷基芳基、雜芳基烷基或雜烷基芳基；R3為C(＝O)OR7、C(＝O)R7、C(＝NH)NR8R9、C(＝O)-NR8R9、低級烷基、橋連的烷基、環烷基、鹵代烷基、鹵代環烷基、C1-3亞烷基環烷基、5-或6-元飽和雜環基、芳基、雜芳基、雜芳基SO2、芳基烷基、烷基芳基、雜芳基烷基、雜烷基芳基、C1-3亞烷基C(＝O)OR7、C(＝O)C1-3亞烷基-C(＝O)OR7、C1-3亞烷基雜芳基、C(＝O)C(＝O)OR7、C(＝O)C1-3亞烷基C(＝O)OR7、C(＝O)C1-3亞烷基NH(C＝O)OR7、C(＝O)C1-3亞烷基NH2或NHC(＝O)OR7；R4為氫、低級烷基、鹵代烷基、環烷基或芳基；R5為氫、低級烷基、炔基、鹵代烷基、環烷基或芳基；R6為氫、低級烷基或C(＝O)R7；R7為支鏈或直鏈的低級烷基或芳基，其中任何一個任選被一個或更多個OR8、NR8R9或SR8取代；和R8和R9相同或不同，選自氫、低級烷基、環烷基、芳基、雜芳基、烷芳基、雜芳烷基、雜烷芳基和芳烷基，或者R8和R9一起形成4-元-7-元環；R10為氫、烷基、鹵代烷基、環烷基、芳基、C(＝O)烷基、C(＝O)環烷基、C(＝O)芳基、C(＝O)O烷基、C(＝O)O環烷基、C(＝O)芳基、CH2OH、CH2O烷基、CHO、CN、NO2或SO2R11；和R11為烷基、環烷基、三氟甲基、芳基、芳烷基或NR8R9。
如在此所使用的，術語“烷基”，單獨或者結合，定義為包括直鏈和支鏈、以及橋連的、含1-16個碳原子的飽和烴基。術語“低級烷基”此處定義為具有1-6個碳原子的烷基(C1-C6)。低級烷基的實例包括，但不限于甲基、乙基、正丙基、異丙基、異丁基、正丁基、新戊基、正己基等。術語“炔基”指含有碳-碳三鍵的不飽和烷基。
術語“橋連的烷基”此處定義為C6-C16的雙環或多環烴基，例如降冰片基、金剛烷基、雙環[2.2.2]辛基、雙環[2.2.1]庚基、雙環[3.2.1]辛基或十氫萘基。
術語“環烷基”此處定義為包括環C3-C7烴基。環烷基的實例包括，但不限于環丙基、環丁基、環己基和環戊基。
術語“亞烷基”指具有取代基的烷基。例如術語“C1-3亞烷基環烷基”指含有1-3個碳原子并被環烷基取代的烷基。
術語“鹵代烷基”此處定義為被一個或更多個鹵代取代基例如氟代基、氯代基、溴代基、碘代基或者其組合取代的烷基。類似地，“鹵代環烷基”定義為具有一個或更多個鹵代取代基的環烷基。
術語“芳基”，單獨或結合，此處定義為單環或多環的芳族基團，優選單環或雙環的芳族基團，例如苯基或萘基，所述芳基可以為未取代的或者例如被一個或更多個，尤其一個或三個選自以下的取代基取代鹵代基、烷基、羥基、羥基烷基、烷氧基、烷氧基烷基、鹵代烷基、硝基、氨基、烷基氨基、酰基氨基、烷硫基、烷基亞磺酰基和烷基磺酰基。實例性的芳基包括苯基、萘基、四氫萘基、2-氯代苯基、3-氯代苯基、4-氯代苯基、2-甲基苯基、4-甲氧基苯基、3-三氟甲基苯基、4-硝基苯基等。
術語“雜芳基”此處定義為含有一個或者兩個芳族環并且在芳環上含有至少一個氮、氧或硫原子的單環或雙環系，該環系可以為未取代的或者例如被一個或更多個，尤其1-3個如下的取代基取代鹵代基、烷基、羥基、羥基烷基、烷氧基、烷氧基烷基、鹵代烷基、硝基、氨基、烷基氨基、酰基氨基、烷硫基、烷基亞磺酰基和烷基磺酰基。雜芳基的實例包括噻吩基、呋喃基、吡啶基、噁唑基、喹啉基、異喹啉基、吲哚基、三唑基、異噻唑基、異噁唑基、咪唑基、苯并噻唑基、吡嗪基、嘧啶基、噻唑基和噻二唑基。
術語“芳基烷基”此處定義為在先定義的烷基，其中所述烷基的氫原子之一被如此處定義的芳基取代，所述芳基例如為任選具有一個或更多個取代基例如鹵代基、烷基、烷氧基等的苯基。芳基烷基的實例是芐基。
術語“烷基芳基”此處定義為在先定義的芳基，其中所述芳基的氫原子之一被烷基、環烷基、鹵代烷基或鹵代環烷基置換。
術語“雜芳基烷基”和“雜烷基芳基”類似如術語“芳基烷基”和“烷基芳基”所定義，然而，所述芳基被如在先定義的雜芳基置換。
術語“雜環基”定義為具有一個或更多個存在于環中的選自氧、氮和硫原子的雜原子的5-或6-元非芳族環。非限制性的實例包括四氫呋喃、哌啶、哌嗪、環丁砜、嗎啉、四氫吡喃、二氧六環等。
術語“鹵素”或“鹵代基”此處定義為包括氟、氯、溴和碘。
術語“烷氧基”、“芳基氧基”和“芳基烷氧基”分別定義為-OR，其中R為烷基、芳基和芳基烷基。
術語“烷氧基烷基”定義為連接烷基的烷氧基。術語“芳基氧基烷基”和“芳基烷氧基烷基”類似地定義為連接烷基的芳基氧基或芳基烷氧基。
術語“羥基”定義為-OH。
術語“羥基烷基”定義為連接烷基的羥基。
術語“氨基”定義為-NH2。
術語“烷基氨基”定義為-NR2，其中至少一個R為烷基，第二個R為烷基或氫。
術語“酰基氨基”定義為RC(＝O)N，其中R為烷基或芳基。
術語“硝基”定義為-NO2。
術語“烷硫基”定義為-SR，其中R為烷基。
術語“烷基亞磺酰基”定義為R-SO2，其中R為烷基。
術語“烷基磺酰基”定義為R-SO3，其中R為烷基。
在優選的實施方案中，R5為氫或甲基；R7為甲基；R2為烷基、環烷基、芳基或雜芳基；R4選自氫、甲基、三氟甲基和環丙基；R6選自氫、乙酰基和苯甲酰基；R1選自氫、烷基、環烷基、C1-3亞烷基環烷基、鹵代環烷基、芳基和雜芳基；R3選自C(＝O)OR7、芳基烷基、烷基芳基、雜芳基烷基、雜烷基芳基、低級烷基、環烷基、雜環基和芳基，尤其選自 或 在最優選的實施方案中，R1選自環戊基、四氫呋喃基、茚滿基、降冰片基、苯乙基和苯基丁基；R2選自氫、乙基、甲基和二氟甲基；R3選自芐基、CO2CH3、C(＝O)CH2OH、C(＝O)CH(CH3)OH、C(＝O)C(CH3)2OH和 R4為氫；R5為氫或甲基；R6為氫；R7為甲基；和R10為氫。
本發明包括結構式(II)化合物的所有可能的立體異構體和幾何異構體，并且不僅包括外消旋化合物而且也包括光學活性異構體。當需要結構式(II)化合物的單一的對映體時，通過拆分終產物或者通過由異構體純的原料或者使用手性輔助劑(例如參見Z.Ma等，TetrahedronAsymmetry，8(6)，第883-888頁(1997))立體有擇合成可以得到該單一的對映體。終產物、中間體或者原料的拆分可以通過本領域已知的任何合適的方法完成。此外，在其中結構式(II)化合物的互變異構體可能存在的情況下，本發明意欲包括所述化合物的所有互變異構形式。如此后所證明的，特定的立體異構體顯示抑制PDE4的優越的能力，并且不顯示通常與PDE4抑制劑有關的不利的中樞神經系統副作用。
尤其是，普遍接受生物系統可以顯示對于化合物的絕對立體化學性質非常敏感的活性的觀點(參見E.J.Ariens，Medicinal ResearchReviews，6451-466(1986)；E.J.Ariens，Medicinal Research Reviews，7367-387(1987)；K.W.Fowler，Handbook of StereoisomersTherapeuticDrugs，CRC Press，Donald P.Smith編輯，第35-63頁(1989)；和S.C.Stinson，Chemical and Engineering News，7538-70(1997))。
例如，咯利普蘭為含有一個手性中心的立體特異性PDE4抑制劑。咯利普蘭的(-)-對映體比其(+)-對映體在涉及其潛在的抗抑郁作用方面具有更高的藥理學效能(Schultz等，Naunyn-Schmiedeberg’s ArchPharmacol，33323-30(1986))。此外，咯利普蘭的代謝作用似乎是立體特異性的，(+)-對映體顯示比(-)-對映體更快的清除率(Krause等，Xenobiotica，18561-571(1988))。最后，最新的觀察顯示咯利普蘭的(-)-對映體(R-咯利普蘭)比其(+)-對映體(S-咯利普蘭)的催吐作用強大約十倍(A.Robichaud等，Neuropharmacology，38289-297(1999))。這個觀察結果不容易與試驗動物對咯利普蘭異構體的反應和咯利普蘭抑制PDE4酶的能力方面的差異一致。本發明化合物可以具有三個手性中心。特定立體化學取向的化合物能夠顯示類似的PDE4抑制活性和藥理學活性，但是改變中樞神經系統毒性和催吐的潛能。
因此，本發明的優選的化合物具有結構式(III) 結構式(III)的化合物為有效和選擇性的PDE4抑制劑并且不顯示由結構式(III)的化合物的立體異構體所顯示的不利的中樞神經系統作用和催吐潛能。
含有酸性基團的結構式(II)化合物可以與合適的陽離子形成藥學上可接受的鹽。合適的藥學上可接受的陽離子包括堿金屬(例如鈉或鉀)和堿土金屬(例如鈣或鎂)陽離子。含有堿性中心的結構式(II)化合物的藥學上可接受的鹽為與藥學上可接受的酸形成的酸加成鹽。實例為鹽酸鹽、氫溴酸鹽、硫酸鹽或硫酸氫鹽、磷酸鹽或磷酸氫鹽、乙酸鹽、苯甲酸鹽、琥珀酸鹽、富馬酸鹽、馬來酸鹽、乳酸鹽、檸檬酸鹽、酒石酸鹽、葡糖酸鹽、甲磺酸鹽、苯磺酸鹽和對甲苯磺酸鹽。根據前文所述，任何本文中提到的本發明化合物意欲包括結構式(II)化合物以及其藥學上可接受的鹽和溶劑合物。
本發明的化合物可以作為純的化學品在治療上給藥，但是優選作為藥用組合物或制劑給予結構式(II)化合物。因此，本發明還提供含有結構式(II)化合物或其藥學上可接受的鹽以及一種或更多種藥學上可接受的載體并任選其它治療和/或預防成分的藥用制劑。所述載體在與所述制劑中的其它成分相容并且不損害其接受者的意義上為“可接受的”。
尤其是，本發明的選擇性PDE4抑制劑單獨或與第二種抗炎治療藥聯合使用，例如所述第二種抗炎治療藥為治療類風濕性關節炎的靶向TNFα的治療藥如ENBREL或REMICADE。同樣，IL-1的拮抗作用的治療用途在類風濕性關節炎的動物模型中也已經得到證明。因此，想象IL-1的拮抗作用與減弱TNFα的PDE4抑制作用結合將是有效的。
本發明的PDE4抑制劑用于治療各種變應性、自身免疫和炎性疾病。
術語“治療”包括預防、降低、阻止或逆轉所治療疾病或癥狀嚴重的進程。如此，術語“治療”包括適當地醫學治療和/或預防給藥。
炎癥尤其是一種局部、保護性反應，它是由組織的損傷或破壞引起的，它可以破壞、稀釋或隔絕(即隔離)損傷因子和受損的組織。如此處所用的術語“炎性疾病”，指任何其中過量或非調節性炎性反應導致過量的炎性癥狀、宿主組織損傷或喪失組織功能的疾病。此外，如此處所用的術語“自身免疫疾病”指任何種類的其中組織損傷與對于身體自身成分的體液或細胞調節反應有關的疾病。如此處所用的術語“變應性疾病”指由變態反應產生的任何癥狀、組織損傷或組織功能喪失。如此處所用的術語“關節疾病”指特征在于各種病因引起的關節炎性損傷的一大類疾病。如此處所用的術語“皮炎”指特征在于各種病因引起的皮膚炎癥的一大類皮膚疾病。如此處所用的術語“移植排斥”指特征在于移植的組織和周圍的組織功能喪失、疼痛、腫脹、白細胞增多和血小板減少的直接針對移植組織(包括器官和細胞(例如骨髓))的任何免疫反應。
本發明也提供調節哺乳動物體內cAMP水平的方法以及治療特征為細胞因子水平升高的疾病的方法。
如此處所用的術語“細胞因子”指任何分泌的多肽，該多肽影響其它細胞的功能并調節所述免疫或炎性反應中細胞之間的相互作用。細胞因子包括，但不限于單核因子、淋巴因子和趨化因子而不管是那些細胞產生它們。例如，單核因子通常指由單核細胞產生和分泌的，然而，許多其它細胞產生單核因子例如天然殺傷細胞、成纖維細胞、嗜堿性粒細胞、中性粒細胞、內皮細胞、腦星形膠質細胞、骨髓基質細胞、表皮角質細胞和B-淋巴細胞。淋巴因子通常指由淋巴細胞產生的因子。細胞因子的實例包括，但不限于白介素-1(IL-1)、白介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子α(TNFα)和腫瘤壞死因子β(TNFβ)。
本發明還提供降低哺乳動物體內TNF水平的方法，該方法包括給予所述哺乳動物有效量的結構式(II)的化合物。如此處所用的術語“降低TNF水平”指以下情況之一a)通過抑制所有細胞包括，但不限于單核細胞或巨噬細胞體內釋放TNF，降低哺乳動物體內過量的TNF水平到正常水平或者低于正常水平；或b)在翻譯或轉錄水平誘導哺乳動物體內過量TNF水平下調到正常水平或者低于正常水平；或c)通過抑制作為翻譯后事件的直接合成TNF誘導下調。
此外，本發明化合物用于抑制炎性細胞激活。如此處所用的術語“炎性細胞激活”指由刺激(包括，但不限于細胞因子、抗原或自身抗體)誘導的增殖性細胞反應，產生可溶性的介質(包括，但不限于細胞因子、氧自由基、酶、前列腺素類或血管活性胺)或者在炎性細胞(包括但不限于單核細胞、巨噬細胞、T淋巴細胞、B淋巴細胞、有粒白細胞、多形核白細胞、肥大細胞、嗜堿性粒細胞、嗜酸性粒細胞、樹突細胞和內皮細胞)中，新的或增加數量的介質(包括，但不限于主要組織相容性抗原或細胞粘著分子)的細胞表面表達。本領域技術人員可以理解這些細胞的這類表型中的一種或其組合的激活可引起炎癥的發生、延長或惡化。
本發明化合物也用于引起氣道平滑肌松弛、支氣管擴張和防止支氣管收縮。
因此，本發明化合物用于治療以下疾病例如關節疾病(類風濕性關節炎)、骨關節炎、痛風性關節炎、脊椎炎、與甲狀腺有關的眼病、貝赫切特病、膿毒病、敗血癥性休克、內毒素性休克、革蘭氏陰性膿毒病、革蘭氏陽性膿毒病、中毒性休克綜合征、哮喘、慢性支氣管炎、變應性鼻炎、過敏性結膜炎、春季結膜炎、朗格斯細胞肉芽腫病、成人(急性)呼吸窘迫綜合征(ARDS)、慢性肺炎(例如慢性阻塞性肺炎)、硅肺、肺結節病、心肌、腦或肢端再灌注損傷、由于輕度外傷引起的腦或脊柱損傷、包括胰囊性纖維變性的纖維變性、瘢痕疙瘩形成、疤痕組織形成、動脈粥樣硬化、自身免疫疾病例如系統性紅斑狼瘡(SLE)和移植排斥反應(例如移植物抗宿主(GvH)的反應和同種移植排斥反應)、慢性腎小球性腎炎、炎性腸疾病例如局限性回腸炎和潰瘍性結腸炎、增生性淋巴細胞疾病如白血病(例如慢性淋巴細胞白血病；CLL)(參見Mentz等，Blood 88，第2172-2182(1996))以及炎性皮膚疾病例如特應性皮炎、牛皮癬或蕁麻疹。
這類疾病或有關癥狀的其它實例包括心肌病例如充血性心力衰竭、發熱、惡病質、感染或惡性腫瘤繼發的惡病質、獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)繼發惡病質、ARC(AIDS相關復癥)、腦型瘧、骨質疏松和骨吸收疾病以及由于感染引起的發燒和肌痛。此外本發明化合物用于治療尿崩癥和中樞神經系統疾病例如抑郁癥和多梗死性癡呆。
本發明化合物也具有通常稱作治療藥以外的用途。例如，本發明化合物也可以用作器官移植的保存劑(參見Pinsky等，J.Clin.Invest.，92，第2994-3002頁(1993))。
選擇性的PDE4抑制劑也可以用于治療尿崩癥(Kidney Int.，37，第362頁，(1990)；Kidney Int.，35，第494頁，(1989))和中樞神經系統疾病例如多梗死性癡呆(Nicholson，Psychopharmacology，101，第147頁(1990))、抑郁癥(Eckman等，Curr.Ther.Res.，43，第291頁(1988))、焦慮癥和應激反應(Neuropharmacology，38，第1831頁(1991))、腦局部缺血(Eur.J.Pharmacol.，272，第107頁(1995))、遲發性運動障礙(J.Clin.Pharmocol.，16，第304頁(1976))、帕金森氏病(參見Neurology，25，第722頁(1975)；Clin.Exp.Pharmal.Physiol.，26，第421頁(1999))和經前綜合征。對于抑郁癥而言，PDE4選擇性抑制劑在各種抑郁癥的動物模型例如“行為絕望”或Porsolt試驗(Eur.J.Pharmacol.，47，第379頁(1978)；Eur.J.Pharmacol.，57，第431頁(1979)；Antidepressantsneurochemical，behavioral and clinical prospectives，Enna，Malick，andRichelson，eds.，Raven Press，第121頁(1981))和“尾懸浮試驗”(Psychopharmacology，85，第367頁(1985))中顯示有效。最新的研究成果顯示通過各種抗抑郁藥長期體內治療增加PDE4的腦性表達(J.Neuroscience，19，第610頁(1999))。因此，選擇性的PDE4抑制劑可以單獨使用或者與第二種治療結合使用，四種主要的抗抑郁治療為電驚厥方法、單胺氧化酶抑制劑和5-羥色胺或去甲腎上腺素的選擇性重攝取抑制劑。選擇性的PDE4抑制劑也可以用于借助直接作用于支氣管平滑肌細胞來調節支氣管擴張活性用于治療哮喘。
適用于本發明中的化合物和藥用組合物包括其中以有效量給予哺乳動物所述活性成分以便達到其預定治療目的的化合物和藥用組合物。更準確地說，“治療有效量”指有效防止所治療患者已有癥狀發展或者緩解該癥狀的量。該有效量的確定完全在本領域技術人員的知識范圍內(特別是參照本發明所公開的細節)。
如此處所用的術語“哺乳動物”包括雄性和雌性，并且包括人、家養動物(例如貓、狗)、家畜(例如牛、馬、豬)和野生生物(例如靈長類、大型貓科動物、動物園動物)。
“治療有效劑量”指達到所需的作用的所述化合物的量。這類化合物的毒性和治療效果可以在細胞培養中或者實驗動物中通過標準藥學方法確定，例如確定LD50(群體的50％致死的劑量)和ED50(群體的50％治療有效劑量)。毒性和治療效果之間的劑量比例為治療指數，它表示為LD50和ED50間的比值。優選顯示高的治療指數的化合物。由這類數據得出的資料可以用于計算用于人的劑量范圍。這類化合物的劑量優選在包括幾乎沒有或者沒有毒性的ED50的循環濃度范圍內。根據所使用的劑型和所用的給藥途徑，所述劑量可以在該范圍內變化。
精確的處方、給藥途徑和劑量可以由每個醫生根據患者的病情來選擇。可以個別調整劑量和間隔時間以便提供足以維持治療效果的活性部分的血藥濃度。
如本領域技術人員可以理解的，此處所述的治療可以延伸到預防以及治療已確診的疾病或者癥狀。還可以理解，所需用于治療的本發明的化合物的量根據所治療疾病的性質、患者的年齡和狀況而變化，并且最終由主治醫生或獸醫決定。然而，一般來說用于成人治療的常用劑量在每日0.001mg/kg至約100mg/kg。所需劑量可以方便地以單一劑量給予或以合適的間隔時間，以多劑量給予，例如每日兩個、三個、四個或更多個亞劑量給予。在實踐當中，醫生決定最適合于每個患者的實際給藥方案，所述劑量根據具體患者的年齡、體重和反應而改變。以上劑量為平均情況下的實例，但可能有個別情況，其中需要較高或較低的劑量，這也在本發明的范圍內。
本發明的制劑可以以用于治療所指定疾病的標準方式給予，例如口服、非腸道、經粘膜(例如舌下或者口含給藥)、局部、經皮、直腸、經吸入(例如鼻或者肺深部吸入)。非腸道給藥包括，但不限于靜脈內、動脈內、腹膜內、皮下、肌內、鞘內和關節內。胃腸外給藥也可以使用高壓技術象POWDERJECTTM完成。
對于口含給藥而言，所述組合物可以是以常規方式配制的片劑或者錠劑形式。例如，用于口服給予的片劑和膠囊可以含有常規的賦形劑例如粘合劑(例如糖漿、阿拉伯膠、明膠、山梨糖醇、黃蓍膠、淀粉漿或者聚乙烯吡咯烷酮)、填充劑(例如乳糖、蔗糖、微晶纖維素、纖維素、玉米淀粉、磷酸鈣或者山梨糖醇)、潤滑劑(例如硬脂酸鎂、硬脂酸、滑石、聚乙二醇或者二氧化硅)、崩解劑(例如馬鈴薯淀粉或者羥基乙酸淀粉鈉)或者潤濕劑(例如月桂基硫酸鈉)。可以根據本領域熟知的方法將所述片劑包衣。
或者，本發明的化合物可以摻入口服液體制劑例如水性或者油性懸浮液、溶液、乳劑、糖漿或者酏劑中。而且，含有這些化合物的制劑可以作為用水或者其它合適的溶媒在使用前構成的干燥產品提供。這類液體制劑可以含有常規的添加劑例如懸浮劑，如山梨糖醇糖漿、甲基纖維素、葡萄糖/蔗糖糖漿、明膠、羥乙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羧甲基纖維素、硬脂酸鋁凝膠和氫化食用脂肪；乳化劑，例如卵磷脂、脫水山梨糖醇單油酸酯或者阿拉伯膠；非水性溶媒(它們可以包括食用油)，例如杏仁油、分級分離的椰子油、油性酯、丙二醇和乙醇；和防腐劑，例如對羥基苯甲酸甲酯或者丙酯和山梨酸。
這類制劑也可以配制為栓劑，例如含有常規的栓劑基質如可可脂或者其它甘油酯。用于吸入的組合物一般可以以溶液、懸浮液或者乳液的形式提供，它們可以以干粉或者以使用常規拋射劑(例如二氯二氟甲烷或者三氯氟甲烷)的氣溶膠的形式給予。典型的局部和經皮制劑含有常規含水或者非水介質，例如為滴眼劑、霜劑、軟膏、洗劑和糊劑或者為加藥的膏藥、貼劑或者膜劑的形式。
此外，本發明的組合物可以配制用于經注射或者連續輸注非腸道給予。注射劑可以是在油性或者水性溶媒中的懸浮劑、溶液劑或者乳劑形式并且可以含有組方劑例如懸浮劑、穩定劑和/或分散劑。或者，所述活性成分可以是在使用前用合適的溶媒(例如無菌、無熱源水)構成的粉末形式。
本發明的組合物也可以配制為儲庫型制劑。這類長效制劑可以植入給予(例如皮下或者經粘膜)或者通過肌內注射給予。因此，本發明的化合物可以與合適的聚合物或者疏水性物質(例如在可接受的油中的乳劑)、離子交換樹脂一起或者作為微溶的衍生物(例如微溶的鹽)配制。
對于獸醫使用而言，式(II)化合物或其非毒性鹽作為根據常規獸醫實踐的可合適接受的制劑給予。獸醫可以容易地確定最適合具體動物的給藥方案和給藥途徑。
因此，本發明另一方面提供含有式(II)化合物以及藥學上可接受的稀釋劑或者載體的藥用組合物。本發明進一步提供制備含有式(II)化合物的藥用組合物的方法，該方法包括將式(II)化合物與藥學上可接受的稀釋劑或者載體混合。
以下提供結構式(II)化合物的具體的、非限制性實施例，其合成根據以下給出的方法進行。
一般而言，結構式(II)的化合物可以根據以下合成方案制備。在下述方案中，本領域內可以理解，當需要時，根據合成化學的一般原理可以使用保護基團。這些保護基團在合成的最終步驟中可以在堿性、酸性或者本領域技術人員顯而易見的氫解條件下除去。通過使用合適地處理和保護任何化學官能團，未在本文中專門提到的結構式(II)的化合物的合成可以通過與以下提出的方案類似的方法完成。
除非另外指出，所有的原料均從供應商處獲得并且未經進一步純化而使用。所有反應物和層析流分通過薄層層析，在250mm硅膠板上分析，用UV(紫外)光或者I2(碘)染色目測觀察。產物和中間體經快速層析或者反相用PLC純化。
如以下所提出的合成方案可以制備通用結構式(II)的化合物。其它的合成途徑對于本領域技術人員也是已知的。以下反應方案提供結構式(II)化合物，其中R1和R2即乙基和環戊基由原料所決定。合適的選擇其它原料或者進行中間體和實施例的轉化反應提供具有其它所述R1-R11取代基的通用結構式(II)的化合物。
以下說明結構式(II)的不同中間體和化合物的合成方法。提供下列說明性的實施例，不應該視為對本發明的限制。
吲唑化合物的通用合成方法 中間體11-(2，4-二溴苯基)丙-1-腙的制備于室溫、氮氣氛下，將肼(18.4ml，58.9mmol)加入到1-(2，4-二溴苯基)丙-1-酮(17.2g，58.9mmol)(得自Aldrich Chemical Co.，Milwaukee，WI)的無水乙醇(400ml)的攪拌的溶液中。于80℃下將生成的溶液加熱過夜。將所述反應物冷卻到室溫，然后減壓濃縮。將所得的油狀物溶于二氯甲烷(400ml)中，經硫酸鈉干燥，過濾，然后真空濃縮得到所述腙(16.5g，92％)。該化合物未經進一步純化或鑒定而使用。中間體26-溴-3-乙基-1H-吲唑的制備氫化鈉方法于室溫、氮氣氛下，將氫化鈉(60％油中的分散體；5.72g；108mmol)加入到中間體1(16.5g；54mmol)的干燥二甲基甲酰胺(350ml)的攪拌溶液中。于79℃，將所形成的混合物加熱2.5小時，然后冷卻到室溫。通過減壓濃縮除去大約一半的溶劑，然后用水(800ml)稀釋該反應混合物。攪拌1小時后，用乙酸乙酯(3×300ml)萃取所形成的混合物，用鹽水(2×200ml)洗滌和合并的有機層，經硫酸鈉干燥，過濾并且真空濃縮。將殘留的油狀物通過硅膠墊(plug)，用己烷/乙酸乙酯(1∶1)洗脫，得到所述吲唑(12.26g，99％)。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ9.98(br s，1H)，7.60(d，1H)，7.57(d，1H)，7.24(dd，1H)，2.99(q，2H)，1.40(t，3H)。中間體36-溴代-1-環戊基-3-乙基-1H-吲唑的制備于0℃、氮氣氛下，向中間體2(130mg，0.58mmol)的干燥二甲基甲酰胺(5.8ml)的攪拌溶液中加入氫化鈉(60％的油分散體；26mg；0.64mmol)。將該反應混合物溫熱至室溫30分鐘，然后用環戊基溴(68μl；0.63mmol)處理。攪拌過夜后，將該反應混合物分配在乙酸乙酯(50ml)和水(50ml)之間，然后分離有機層，用水(4×50ml)洗滌。經硫酸鎂干燥反應物，過濾，真空濃縮。薄層層析(5/95乙酸乙酯/己烷)顯示形成區域異構體的5∶1的混合物，其中所需的、較高Rf的N-1烷基化產物為主產物。快速層析(5/95乙酸乙酯/己烷)得到為黃色油狀物的中間體3(133mg，78％)。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ7.56(d，1H)，7.52(d，1H)，7.17(dd，1H)，4.83(c，1H)，2.95(q，2H)，2.28-2.07(m，4H)，2.00-1.93(m，2H)，1.76-1.66(m，2H)，1.36(t，3H)。中間體41-環戊基-3-乙基-1H-吲唑-6-甲醛的制備在氮氣氛下，借助于注射器中間體3(4.34g，14.9mmol)的干燥四氫呋喃(80ml)的冷卻(-78℃)的攪拌溶液中加入正丁基鋰(7.51ml的1.98M在己烷中的溶液；14.9mmol)。于-78℃下，將得到的深色溶液攪拌0.5小時，然后，借助于注射器加入二甲基甲酰胺(4.61ml，59.6mmol)。用1小時溫熱至0℃后，通過加入水猝滅該反應化合物，用鹽水稀釋，用乙酸乙酯(3×100ml)萃取。經硫酸鈉干燥，過濾并且濃縮合并的有機層，得到粗品中間體4。經硅膠快速層析(5％乙酸乙酯的己烷溶液)純化得到所述醛(2.55g，71％)。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ10.13(s，1H)，7.93(s，1H)，7.78(d，1H)，7.61(d，1H)，5.01(c，1H)，3.01(q，2H)，2.21-2.13(m，4H)，2.01-1.93(m，2H)，1.81-1.70(m，2H)，1.39(t，3H)。中間體5(2E)-3-(1-環戊基-3-乙基(1H-吲唑-6-基))-2-甲基丙-2-烯酸乙酯通過Horner Emmons烯化方法制備。
在氮氣氛下，借助于注射器向膦酸丙酸三乙酯(364μl，1.70mmol；1.2當量)的干燥四氫呋喃(14ml)的冷卻(0℃)的攪拌溶液中加入六甲基二甲硅烷基氨化鋰的四氫呋喃溶液(1.56ml的1.0M溶液；1.1當量)。于0℃下，將得到的黃色溶液攪拌0.5小時，然后，用5分鐘，借助于加料漏斗滴加入中間體4(344mg，1.42mmol)的干燥四氫呋喃(1.0ml)溶液。于0℃，將所得溶液攪拌2小時，然后溫熱至室溫并且攪拌過夜。然后，通過加入水(30ml)猝滅反應，用乙酸乙酯(2×20ml)萃取。經硫酸鎂干燥合并的有機層，過濾并且真空濃縮。經硅膠快速層析(6∶1己烷∶乙酸乙酯)純化粗品產物得到為澄清無色液體的所述酯(418.6mg，90％)。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ7.83(s，1H)，7.67(d，1H)，7.40(s，1H)，7.13(d，1H)，4.91(c，1H)，4.29(q，2H)，2.99(q，2H)，2.18(s，3H)，2.17-2.10(m，4H)，1.99-1.92(m，2H)，1.78-1.70(m，2H)，1.42-1.33(m，6H)。中間體6(2E)-3-(1-環戊基-3-乙基(1H-吲唑-6-基))-2-甲基丙-2-烯酸的制備通過氫氧化鋰水解方法制備。
于室溫、氮氣氛下，向中間體5(1.05g，3.22mmol)的四氫呋喃(10ml)的攪拌的溶液中加入氫氧化鋰一水合物(676mg，16.1mmol；5.0當量)的水(10ml)溶液。發生稍微放熱。于65℃(油浴)加熱所得到的渾濁的黃色溶液過夜。加熱半小時后，該反應物變為澄清，但是如薄層層析所證明需要1.5小時完成反應。將所得的溶液冷卻至室溫，用二氯甲烷(30ml)稀釋，用1.0M鹽酸水溶液洗滌。用鹽水(30ml)洗滌合并的有機層，經硫酸鈉干燥，過濾，真空濃縮得到為固體的所述羧酸(890mg，93％)。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ8.20(s，1H)，7.72(d，1H)，7.48(s，1H)，7.18(dd，1H)，4.94(p，1H)，3.00(q，2H)，2.26(s，3H)，2.25-2.13(m，4H)，2.03-1.93(m，2H)，1.80-1.72(m，2H)，1.40(t，3H)。中間體7(2E)-3-(1-環戊基-3-乙基(1H-吲唑-6-基))-2-甲基丙-2-烯酰氯的制備通過酰氯方法的制備。
向中間體6(240mg，0.804mmol)的無水二氯甲烷(6ml)的冷卻(0℃)的攪拌淤漿中，用10分鐘，在經氯化鈣干燥的氣氛中，借助于注射器加入草酰氯的二氯甲烷溶液(0.484ml的2.0M溶液；0.964mmol；1.2當量)。劇烈產生泡沫。于0℃，將所得深色溶液攪拌15分鐘，然后借助于注射器加入催化量的二甲基甲酰胺(17μl)。于0℃，將該得到的溶液攪拌半小時直到發泡停止，然后，使其溫熱至室溫，并且攪拌過夜(17小時)。用二氯甲烷(15ml)稀釋該反應物，小心地以用水(20ml)猝滅。劇烈攪拌所得到的混合物1小時后，分離各層，用水(20ml)和鹽水(20ml)洗滌有機層，經硫酸鎂干燥，過濾并且真空濃縮得到為棕色固體的酰氯(258mg，100％)。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ8.22(s，1H)，7.80(d，1H)，7.55(s，1H)，7.22(dd，1H)，4.99(p，1H)，3.00(q，2H)，2.29(s，3H)，2.26-2.19(m，4H)，2.06-1.94(m，2H)，1.82-1.75(m，2H)，1.41(t，3H)。中間體83-[(2E)-3-(1-環戊基-3-乙基(1H-吲唑-6-基))-2-甲基丙-2-烯酰基](4R)-4-苯基-1，3-噁唑烷-2-酮的制備通過噁唑烷酮酰化方法制備。
在氮氣氛下，借助于注射器，將正丁基鋰的己烷溶液(0.429ml的1.98M溶液；1.1當量)加入R-苯基噁唑烷酮(138.5mg，0.850mmol)的無水四氫呋喃(7.7ml)的冷卻(-78℃)的攪拌的溶液中。于-78℃，將所得的溶液攪拌0.8小時，然后，借助于導管，將中間體7(269mg，0.85mmol；1.1當量)的四氫呋喃(1.5ml)溶液加入到該溶液中。于-78℃攪拌15分鐘后，用40分鐘，使所得的反應混合物緩慢溫熱至0℃，在此期間，反應物變為粘稠的淤漿。于0℃攪拌2.5小時后，用乙酸乙酯(30ml)稀釋該反應混合物，并且用鹽水(2×30ml)洗滌。經硫酸鈉干燥有機層，真空濃縮得到為白色固體的中間體8(426mg，100％)。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ7.65(d，1H)，7.43-7.30(m，7H)，7.11(d，1H)，5.56(dd，1H)，4.90(p，1H)，4.77(t，1H)，4.31(dd，1H)，2.98(q，2H)，2.20(d，3H)，2.18-2.13(m，4H)，1.98-1.91(m，2H)，1.76-1.69(m，2H)，1.38(t，3H)。中間體9(4R)-3-{[(3S，4S)-4-(1-環戊基-3-乙基(1H-吲唑-6-基))-3-甲基-1-芐基吡咯烷-3-基]羰基}-4-苯基-1，3-噁唑烷-2-酮的制備通過環加成方法制備在氮氣氛下，通過注射器將三氟乙酸的氯仿溶液(0.16ml的1.0M溶液；0.17mmol；0.2當量)加入到中間體8(375mg，0.85mmol)和N-(甲氧基甲基)-N-(三甲基甲硅烷基甲基)芐胺(334mg，1.70mmol；2當量)的氯仿(2.5ml)的攪拌淤漿中。于大約0℃將所得的淤漿攪拌4小時，然后于大約15℃(水浴)攪拌過夜。然后，將所得的渾濁溶液冷卻到-4℃，借助于注射器加入N-(甲氧基甲基)-N-(三甲基甲硅烷基甲基)芐胺(330mg，1.70mmol；2當量)處理并且攪拌5小時，在此期間所述反應混合物變為均勻的溶液。薄層層析(4∶1己烷∶乙酸乙酯)顯示反應完成。減壓除去大部分的氯仿，用二氯甲烷(30ml)稀釋殘余物。用鹽水(20ml)洗滌所得的混合物。經硫酸鈉干燥有機層，過濾，真空濃縮得到半固體。經硅膠快速層析(4∶1己烷∶乙酸乙酯)純化該半固體得到無色泡沫狀物的主要的非對映體(275mg，56％)。主要非對映體1H NMR(CDCl3，400MHz)δ7.53(d，1H)，7.45-7.24(m，11H)，7.17(d，1H)，5.55(dd，1H)，4.87(p，1H)，4.70(t，1H)，4.31(t，1H)，4.22(dd，1H)，3.78(d，1H)，3.65(d，1H)，3.53(d，1H)，2.98-2.86(m，5H)，2.20-2.09(m，4H)，2.02-1.92(m，2H)，1.78-1.68(m，2H)，1.35(t，3H)，1.11(s，3H)。中間體10(3S，4S)-4-(1-環戊基-3-乙基(1H-吲唑-6-基))-3-甲基-1-芐基吡咯烷-3-甲醛的制備通過還原/氧化方法制備。
在氮氣氛下，借助于注射器，將氫化鋰鋁的四氫呋喃溶液(0.229ml的1.0M溶液；0.229mmol；0.6當量)加入到中間體9(220mg，0.382mmol)的甲苯(4.2ml)的冷卻(-78℃)的攪拌的溶液中。于-78℃下，將所得到的溶液攪拌2小時，通過連續加入甲醇(50μl)、15％氫氧化鈉水溶液(50μl)和附加量的水(200μl)猝滅該反應。使所得的混合物溫熱至室溫，然后攪拌30分鐘，再用乙醚(8ml)稀釋，經硫酸鈉干燥。過濾并且真空濃縮濾液得到為半固體的醇(存在少量醛)(242mg)。該物質未經進一步純化直接使用。
在氮氣氛下，借助于注射器，向草酰氯的二氯甲烷溶液(95μl的2.0M溶液；0.19mmol；0.5當量)在附加量的二氯甲烷(0.40ml)中的冷卻(-78℃)的攪拌溶液中加入二甲基亞砜(160μl；0.38mmol；1.0當量)。觀察到劇烈發泡。于-78℃下，攪拌20分鐘后，通過導管加入所述粗品醇的二氯甲烷溶液(0.6ml)。于-78℃下，將所得到的黃色溶液攪拌20分鐘，然后，通過注射器加入三乙胺(119μl；0.85mmol；2.2當量)。于-78℃下，將所得到的反應混合物攪拌20分鐘，然后溫熱至室溫并且再攪拌1小時。再通過加入鹽水(10ml)猝滅該反應混合物，用二氯甲烷(2×10ml)萃取。經硫酸鈉干燥合并的有機層，過濾，真空濃縮得到所述粗品醛。經硅膠快速層析(20％乙酸乙酯的己烷溶液洗脫)純化得到為澄清、無色油狀物的所述醛(101mg，兩步共63％)。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ9.68(s，1H)，7.57(d，1H)，7.41-7.21(m，6H)，6.94(dd，1H)，4.87(p，1H)，3.89(t，1H)，3.81(d，1H)，3.68(d，1H)，3.26-3.20(m，2H)，3.01-2.92(m，3H)，2.48(d，1H)，2.22-2.08(m，4H)，2.01-1.92(m，2H)，1.78-1.71(m，2H)，1.37(t，3H)，0.76(s，3H)。實施例1和2的制備通過Grignard加成方法制備在氮氣氛下，借助于注射器，將碘化甲基鎂的乙醚溶液(184μl的3.0M溶液；0.55mmol；3當量)加入到中間體10(76.8mg；0.185mmol)的無水乙醚(2.8ml)的攪拌的溶液中。于0℃下，攪拌15分鐘后，使所述反應混合物溫熱至室溫并且攪拌2小時。然后，用飽和氯化銨水溶液(10ml)小心地猝滅該反應混合物，用乙酸乙酯(3×10ml)萃取。用鹽水洗滌合并的有機部分，經硫酸鈉干燥，過濾并且真空濃縮得到油狀物。經快速硅膠層析(1.5∶2.5∶0.6乙酸乙酯∶己烷∶甲醇)純化得到為無色油狀物的較低極性的非對映體(22mg；27％)和較高極性的非對映體(30mg；38％)。
向溶于無水四氫呋喃(0.8ml)中的中間體10(38.8mg，0.0844mmol)的冷卻(0℃)的攪拌的溶液中加入氫化鋰鋁(84.4μl；1.0M的四氫呋喃溶液；0.084mmol；1.0當量)。在早期放熱后，將該反應混合物溫熱至室溫1小時。將1N鹽酸水溶液(1ml)加入到該反應混合物中并且繼續攪拌另外5分鐘。用1M的氫氧化鈉將該反應混合物堿化至pH為8。用乙酸乙酯(2×10ml)萃取含水層，用鹽水(10ml)洗滌合并的有機層，然后經硫酸鈉干燥，真空濃縮得到所述醇(31mg；88％)。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ7.59(d，1H)，7.39-7.28(m，6H)，6.98(d，1H)，3.58-2.80(m，8H)，4.04-3.92(m，3H)，2.76(t，1H)，2.45(d，1H)，2.25-1.66(m，8H)，1.37(s，3H)。LRMS(電噴霧，陽離子)Da/e 418.3(m+1)。中間體11[(3S，4S)-4-(1-環戊基-3-乙基(1H-吲唑-6-基))-3-甲基吡咯烷-3-基]甲-1-醇(游離吡咯烷)的制備通過披鈀碳調節的氫化方法制備。
向在190規定乙醇(2.0ml)中的實施例3化合物(25.5mg；0.0611mmol)的攪拌的溶液中加入10％的披鈀碳(5mg；20％重量的催化劑)。使氫氣劇烈冒泡通過所述溶液5分鐘。將該反應物于室溫下攪拌2小時，然后，通過硅藻土過濾除去催化劑。真空除去溶劑得到所述吡咯烷(14mg；71％)。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ7.59(d，1H)，7.20(d，1H)，6.92(d，1H)，4.92(c，1H)，3.82(m，1H)，3.14-2.95(m，3H)，3.42(d，0.5H)，3.36(d，0.5H)，3.01(q，2H)，2.20-2.08(m，4H)，2.00-1.90(m，2H)，1.79-1.62(m，2H)，1.40(t，3H)，0.78(s，3H)。LRMS(電噴霧，陽離子)Da/e 428.4(m+1)。
向在干燥二氯甲烷(1.0ml)中的中間體11(14.2mg；0.043mmol)的冷卻(0℃)、攪拌的溶液中加入二異丙基乙胺(5.6mg；0.043mmol；1.0當量)。滴加氯代甲酸甲酯(4.1mg；0.043mmol；1.0當量)并且將該反應物溫熱至室溫過夜(14小時)。真空濃縮該反應物并且用乙酸乙酯(1.5ml)稀釋。用鹽水(2×10ml)洗滌有機相，經硫酸鈉干燥，真空濃縮。經硅膠快速層析(15％乙酸乙酯的己烷溶液洗脫)純化粗品油狀物得到實施例4化合物(8.9mg；53％)。1H MR(CDCl3，400MHz；旋轉異構體的混合物)δ7.61(d，1H)，7.18(d，1H)，6.92(d，1H)，4.88(c，1H)，3.96-3.71(m，4H)，3.65-3.49(m，3H)，3.40(d，0.5H)，3.32(d，0.5H)，2.97(q，2H)，2.20-2.08(m，4H)，2.00-1.90(m，2H)，1.78-1.63(m，2H)，1.38(t，3H)，0.78(s，3H)。LRMS(電噴霧，陽離子)Da/e 386.4(m+1)。
測試了結構式(II)化合物抑制PDE4的能力。一種化合物抑制PDE4活性的能力與該化合物的IC50值即抑制50％的酶活性所需抑制劑的濃度有關。使用重組人PDE4測定結構式(II)化合物的IC50值。
本發明化合物一般顯示抑制重組人PDE4的IC50值為低于約100μM，優選低于約50μM，更優選低于約約25μM。本發明化合物一般顯示抑制重組人PDE4的IC50值為低于約1μM，優選低于約0.10μM。為充分體現本發明的優點，本發明的PDE4抑制劑具有的IC50值為約0.001μM-約0.3μM。
由一般使用在0.1pM-500μM范圍內的濃度的濃度-反應曲線，確定所述化合物的IC50值。使用如Loughney等，J.Biol.Chem.，271，第796-806頁(1996)中所述的標準方法的針對其它PDE酶的試驗也表明本發明的化合物對于cAMP特異性PDE4酶具有高度選擇性。
通過本領域眾所周知的方法可以完成重組人PDEs的產生和IC50值的測定。以下介紹典型的方法人PDEs的表達在桿狀病毒感染的草地貪夜蛾(Spodoptera fugiperda)(Sf9)細胞中的表達使用pBlueBacIII(Invitrogen)或者pFastBac(BRL-Gibco)構建桿狀病毒轉移質粒。通過跨越所述載體接點進行測序并且通過對由PCR產生的所有區進行完全測序，證實所有質粒的結構。質粒pBB-PDE1A3/6在pBlueBacIII中含有PDE1A3的完整的可讀框(Loughney等，J.Biol.Chem.，271，第796-806頁(1996))。質粒Hcam3aBB在pBlueBacIII中含有PDE1C3的完整的可讀框(Loughney等(1996))。質粒pBB-PDE3A在pBlueBacIII中含有PDE3A的完整的可讀框(Meacci等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，89，第3721-3725頁(1992))。
根據制造商的方案，使用MaxBac系統(Invitrogen)或者FastBac系統(Gibco-BRL)產生重組病毒原液。在這兩種情況下，在所得到的病毒中重組人PDEs的表達由病毒多角體啟動子驅動。當使用MaxBac系統時，為了確保在制劑中不污染有野生型(occ+)病毒，將病毒噬斑純化兩次。如下進行蛋白表達。使Sf9細胞于27℃下在補充如下成分的Grace’s昆蟲培養基(Gibco-BRL)中生長10％胎牛血清、0.33％TC yeastolate、0.33％水解乳白蛋白、4.2mM的碳酸氫鈉、10μg/ml慶大霉素、100單位/ml的青霉素和100μg/ml鏈霉素。以每個細胞大約2-3病毒顆粒的感染復數感染指數生長的細胞并且孵育48小時。通過離心收集所述細胞，用未經補充的Grace’s培養基洗滌并且快速冷凍保存。在釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(酵母)中的表達人PDE1B、PDE2、PDE4A、PDE4B、PDE4C、PDE4D、PDE5和PDE7的重組產生類似于美國專利第5,702,936號(在此結合到本發明中作為參考)的實施例7中所述進行，除了使用酵母轉化載體，該酵母轉化載體衍生自Price等Methods in Enzymology，185，第308-318頁(1990)介紹的基本ADH2質粒，該質粒中加入酵母ADH2啟動子和終止子序列，所述釀酒酵母宿主為蛋白酶缺陷性菌株BJ2-54，BJ2-54于1998年8月31日保藏在美國典型培養物中心(Manassas，Virginia)，保藏號為ATCC74465。使轉化宿主細胞在2xSC-leu培養基(pH6.2，含有微量金屬和維生素)中生長。24小時后，加入含有甘油的YEP培養基到終濃度為2x YET/3％甘油。大約24小時后，收獲細胞，洗滌并且于-70℃下保存。人磷酸二酯酶制劑磷酸二酯酶活性的測定如下測定所述制劑的磷酸二酯酶活性。利用活性炭分離技術的PDE測試基本如Loughney等(1996)所述進行。在該測試中，按照存在的PDE活性的量的比例，PDE活性將[32P]cAMP或者[32P]cGMP轉化為相應的[32P]5’-AMP或者[32P]5’GMP。然后，[32P]5’-AMP或者[32P]5’-GMP通過蛇毒5’-核苷酸酶的作用被定量地轉化為游離的[32P]磷酸和未標記的腺苷或者鳥苷。因此，釋放的[32P]磷酸的量與酶活性成正比。該測試于30℃下，在含有(終濃度)40mM Tris HCl(pH8.0)、1μM硫酸鋅、5mM氯化鎂和0.1mg/ml牛血清白蛋白(BSA)的100μl反應混合物中進行。或者，在評估PDE1-比活性的測試中，孵育混合物還包括使用0.1mM氯化鈣和10μg/ml鈣調蛋白。PDE酶以產生＜30％總的底物水解的量存在(線性測試條件)。通過加入底物(1mM[32P]cAMP或者cGMP)引發所述測試，將該混合物孵育12分鐘。然后，加入75μg大響尾蛇(Crotalus atrox)毒素，繼續孵育3分鐘(總共15分鐘)。通過加入200μl活性炭(在每毫升0.1M磷酸二氫鈉的懸浮液(pH4)中25毫克)終止反應。離心(750Xg 3分鐘)沉淀所述活性炭后，取出上清液樣品用于在閃爍計數器中的放射活性的測定并且計算PDE活性。
類似于Loughney等，J.Biol.Chem.，271，第796-806頁(1996)所述的方法進行抑制劑的分析，只是同時使用cGMP和cAMP，底物濃度保持在低于32nM，該值遠低于所測試PDEs的Km。人PDE4A、4B、4C、4D制劑由釀酒酵母制備PDE4A通過與50ml的裂解緩沖液(50mM MOPS pH7.5，10μM硫酸鋅，2mM氯化鎂，14.2mM 2-巰基乙醇，各5μg/ml的抑胃酶肽、亮抑蛋白酶肽、抑蛋白酶肽，各20μg/ml的鈣蛋白酶抑制劑I和II，以及2mM芐脒鹽酸鹽)混合，于室溫下，解凍酵母細胞(50g帶有HDUN1.46的酵母菌株YI26)。于10℃，將細胞在French壓碎器(SLM-Aminco，Spectronic Instruments)中溶解。于4℃，在Beckman JA-10轉子中，以9000rpm將所述提取物離心22分鐘。轉移上清液并且在BeckmanTI45轉子中，以36000rpm，于4℃，離心45分鐘。
通過加入固體硫酸銨(0.26g/ml上清液)，同時在冰浴中攪拌并且維持pH在7.0-7.5之間，由高速上清液沉淀PDE4A。經在BeckmanJA-10轉子中，以9000rpm離心22分鐘，收集沉淀的含有PDE4A的蛋白。將所述沉淀再次懸浮在50ml緩沖液G(50mM MOPS pH7.5，10μM硫酸鋅，5mM氯化鎂，100mM氯化鈉，14.2mM 2-巰基乙醇，2mM芐脒鹽酸鹽，各5μg/ml的亮抑蛋白酶肽、抑胃酶肽、抑蛋白酶肽，以及各20μg/ml的鈣蛋白酶抑制劑I和II)中并且通過0.45μm濾膜。
將所述懸浮樣品(50-100ml)上樣到在緩沖液G中平衡后的5×100cm的Pharmacia SEPHACRYLS-300柱中。以2ml/min的流速洗脫酶活性并且收集以供以后分離。
將經凝膠過濾層析分離的PDE4A上樣到在緩沖液A(50mMMOPS pH7.5，10μM硫酸鋅，5mM氯化鎂，14.2mM 2-巰基乙醇以及100mM芐脒鹽酸鹽)中平衡后的1.6×20cm的Sigma Cibacron BlueAgarose-300型(10ml)柱中。連續用50-100ml緩沖液A、20-30ml含有20mM 5’-AMP的緩沖液A、50-100ml含有1.5M氯化鈉的緩沖液A和10-20ml緩沖液C(50mM Tris HCl pH8，10μM硫酸鋅，14.2mM 2-巰基乙醇以及2mM芐脒鹽酸鹽)洗滌柱。用20-30ml含有20mM cAMP的緩沖液C洗脫所述酶。
收集PDE活性峰并且用硫酸銨沉淀(0.33g/ml酶收集液)以便除去過量的環核苷酸。將沉淀的蛋白再懸浮在緩沖液X(25mM MOPSpH7.5，5μM硫酸鋅，50mM氯化鈉，1mM DTT以及1mM芐脒鹽酸鹽)中，并且按照制造商的指示，經在Pharmacia PD-10柱上凝膠過濾脫鹽。將所述酶在干冰/乙醇浴中快速冷凍并且于-70℃保存。
所得的制劑為約＞80％純度(經SDS-PAGE)。這些制劑具有每分鐘每毫克蛋白水解的約10-40μmol cAMP的比活性。由釀酒酵母制備PDE4B于室溫下，通過與100ml玻璃珠(0.5mM，酸洗)和150ml的裂解緩沖液(50mM MOPS pH7.2，2mM EDTA，2mM EGTA，1mM DTT，2mM芐脒鹽酸鹽，以及各5μg/ml的抑胃酶肽、亮抑蛋白酶肽、抑蛋白酶肽、鈣蛋白酶抑制劑I和II)混合，解凍酵母細胞(150g帶有HDUN2.32的酵母菌株YI23)。將所述混合物冷卻到4℃，轉移至Bead-Beater中并且快速混合6個周期(每個周期30秒)溶解所述細胞。于4℃，在Beckman J2-21M離心機中，使用JA-10轉子，以9000rpm將所述勻漿離心22分鐘。回收上清液并且于4℃，在BeckmanXL-80超速離心機中，使用TI45轉子，以36000rpm離心45分鐘。回收上清液并且通過加入固體硫酸銨(0.26g/ml上清液)，同時在冰浴中攪拌并且維持pH在7.0-7.5的范圍內，沉淀PDE4B。然后，在Beckman J2離心機中，使用JA-10轉子，以9000rpm(12000Xg)將該混合物離心22分鐘。棄去上清液，將沉淀溶于200ml緩沖液A(50mM MOPS pH7.5，5mM氯化鎂，1mM DTT，1mM芐脒鹽酸鹽，以及各5μg/ml的亮抑蛋白酶肽、抑胃酶肽和抑蛋白酶肽)中。將其pH和電導率分別校正為7.5和15-20mS。
將所述再懸浮的樣品上樣到在緩沖液A中平衡后的1.6×200cmSigma Cibacron Blue Agarose-300型(25ml)柱中。將所述樣品在12個小時內，循環通過所述柱4-6次。將所述柱連續用125-250ml緩沖液A、125-250ml含有1.5M氯化鈉的緩沖液A和25-50ml緩沖液A洗滌。用50-75ml緩沖液E(50mM Tris HCl pH8，2mM EDTA，2mMEGTA，1mM DTT，2mM芐脒鹽酸鹽，以及20mM cAMP)和50-75ml含有1M氯化鈉的緩沖液E洗脫所述酶。收集PDE活性峰并且用硫酸銨(0.4g/ml酶收集液)沉淀以便除去過量的環核苷酸。將沉淀的蛋白再懸浮在緩沖液X(25mM MOPS pH7.5，5μM硫酸鋅，50mM氯化鈉，1mM DTT以及1mM芐脒鹽酸鹽)中，并且按照制造商的指示，經在Pharmacia PD-10柱上凝膠過濾脫鹽。將該酶收集液對含有50％甘油的緩沖液X透析過夜。將所述酶在干冰/乙醇浴中快速冷凍并且于-70℃保存。
所得的制劑為約＞90％純度(經SDS-PAGE)。這些制劑具有每分鐘每毫克蛋白水解的約10-50μmol cAMP的比活性。由釀酒酵母制備PDE4C于室溫下，通過與100ml玻璃珠(0.5mM，酸洗)和150ml的裂解緩沖液(50mM MOPS pH7.2，2mM EDTA，2mM EGTA，1mM DTT，2mM芐脒鹽酸鹽，以及各5μg/ml的抑胃酶肽、亮抑蛋白酶肽、抑蛋白酶肽、鈣蛋白酶抑制劑I和II)混合，解凍酵母細胞(150g帶有HDUN3.48的酵母菌株YI30)。將所述混合物冷卻到4℃，轉移至BEAD-BEATER中并且快速混合6個周期(每個周期30秒)溶解所述細胞。于4℃，在Beckman J2-21M離心機中，使用JA-10轉子，以9000rpm將所述勻漿離心22分鐘。回收上清液并且于4℃，在BeckmanXL-80超速離心機中，使用TI45轉子，以36000rpm離心45分鐘。
回收上清液并且通過加入固體硫酸銨(0.26g/ml上清液)，同時在冰浴中攪拌并且維持pH在7.0-7.5的范圍內，沉淀PDE4C。30分鐘后，在Beckman J2離心機中，使用JA-10轉子，以9000rpm(12000Xg)將該混合物離心22分鐘。棄去上清液，將沉淀溶于200ml緩沖液A(50mM MOPS pH7.5，5mM氯化鎂，1mM DTT，2mM芐脒鹽酸鹽，以及各5μg/ml的亮抑蛋白酶肽、抑胃酶肽和抑蛋白酶肽)中。將其pH和電導率分別校正為7.5和15-20mS。
將所述再懸浮的樣品上樣到在緩沖液A中平衡后的1.6×20cmSigma Cibacron Blue Agarose-300型(25ml)柱中。將所述樣品在12個小時內，循環通過所述柱4-6次。將所述柱連續用125-250ml緩沖液A、125-250ml含有1.5M氯化鈉的緩沖液A和25-50ml緩沖液A洗滌。用50-75ml緩沖液E(50mM Tris HCl pH8，2mM EDTA，2mMEGTA，1mM DTT，2mM芐脒鹽酸鹽，以及20mM cAMP)和50-75ml含有1M氯化鈉的緩沖液E洗脫所述酶。收集PDE4C活性峰并且用硫酸銨(0.4g/ml酶收集液)沉淀以便除去過量的環核苷酸。將沉淀的蛋白再懸浮在緩沖液X(25mM MOPS pH7.2，5μM硫酸鋅，50mM氯化鈉，1mM DTT以及1mM芐脒鹽酸鹽)中，并且按照制造商的指示，經在Pharmacia PD-10柱上凝膠過濾脫鹽。將該酶收集液對含有50％甘油的緩沖液X透析過夜。將所述酶在干冰/乙醇浴中快速冷凍并且于-70℃保存。
所得的制劑為約＞80％純度(經SDS-PAGE)。這些制劑具有每分鐘每毫克蛋白水解的約10-20μmol cAMP的比活性。由釀酒酵母制備PDE4D于室溫下，通過與150ml玻璃珠(0.5mM，酸洗)和150ml的裂解緩沖液(50mM MOPS pH7.2，10μM硫酸鋅，2mM氯化鎂，14.2mM 2-巰基乙醇，2mM芐脒鹽酸鹽，各5μg/ml的抑胃酶肽、亮抑蛋白酶肽、抑蛋白酶肽、鈣蛋白酶抑制劑I和II)混合，解凍酵母細胞(100g帶有HDUN4.11的酵母菌株YI29)。將所述混合物冷卻到4℃，轉移至Bead-Beater中并且快速混合6個周期(每個周期30秒)溶解所述細胞。于4℃，在Beckman J2-21M離心機中，使用JA-10轉子，以9000rpm將所述勻漿離心22分鐘。回收上清液并且于4℃，在BeckmanXL-80超速離心機中，使用TI45轉子，以36000rpm離心45分鐘。回收上清液并且通過加入固體硫酸銨(0.33g/ml上清液)，同時在冰浴中攪拌并且維持pH在7.0-7.5的范圍內，沉淀PDE4D。30分鐘后，在Beckman J2離心機中，使用JA-10轉子，以9000rpm(12000Xg)將該混合物離心22分鐘。棄去上清液，將沉淀溶于100ml緩沖液A(50mM MOPS pH7.5，10μM硫酸鋅，5mM氯化鎂，14.2mM 2-巰基乙醇，100mM芐脒鹽酸鹽，以及各5μg/ml的亮抑蛋白酶肽、抑胃酶肽和抑蛋白酶肽、鈣蛋白酶抑制劑I和II)中。將其pH和電導率分別校正為7.5和15-20mS。
以0.67ml/min的流速，將所述再懸浮的樣品上樣到在緩沖液A中平衡后的1.6×20cm Sigma Cibacron Blue Agarose-300型(10ml)柱中。將所述柱連續用50-100ml緩沖液A、20-30ml含有20mM 5’-AMP的緩沖液A、50-100ml含有1.5M氯化鈉的緩沖液A和10-20ml緩沖液C(50mM Tris HCl pH8，10μM硫酸鋅，14.2mM 2-巰基乙醇，2mM芐脒鹽酸鹽)洗滌。用20-30ml含有20mM cAMP的緩沖液C洗脫所述酶。
收集PDE4D活性峰并且用硫酸銨(0.4g/ml酶收集液)沉淀以便除去過量的環核苷酸。將沉淀的蛋白再懸浮在緩沖液X(25mM MOPSpH7.2，5μM硫酸鋅，50mM氯化鈉，1mM DTT以及1mM芐脒鹽酸鹽)中，并且按照制造商的指示，經在Pharmacia PD-10柱上凝膠過濾脫鹽。將該酶收集液對含有50％甘油的緩沖液X透析過夜。將所述酶的制劑在干冰/乙醇浴中快速冷凍并且于-70℃保存。
所得的制劑為約＞80％純度(經SDS-PAGE)。這些制劑具有每分鐘每毫克蛋白水解的約20-50μmol cAMP的比活性。
以上提供的數據顯示本發明的化合物為有效的PDE4抑制劑，例如所述化合物具有對于人重組PDE4的IC50為約0.001μM-0.3μM。優選的化合物具有的IC50為約100nM或以下，特別優選的化合物具有的IC50為約50nM或以下。
本發明的化合物用于選擇性地抑制哺乳動物體內PDE4的活性，而不顯示與在先PDE4抑制劑有關的不利的中樞神經系統作用和催吐作用。
顯而易見，在不背離本發明的精神和范圍的條件下，可以對此前提出的本發明內容作各種修飾和改進，因此，只有所附帶的權利要求書才是對本發明的唯一的限定。
權利要求
1.一種具有下式的化合物 其中，R1為氫、低級烷基、橋連的烷基、芳基、雜芳基、環烷基、5-或6-元飽和雜環基、C1-3亞烷基環烷基、芳基-或雜芳基-取代的炔丙基、芳基-或雜芳基-取代的烯丙基或鹵代環烷基；R2為氫、低級烷基、橋連的烷基、環烷基、鹵代烷基、鹵代環烷基、C1-3亞烷基環烷基、5-或6-元飽和雜環基、芳基、雜芳基、芳基烷基、烷基芳基、雜芳基烷基或雜烷基芳基；R3為C(＝O)OR7、C(＝O)R7、C(＝NH)NR8R9、C(＝O)-NR8R9、低級烷基、橋連的烷基、環烷基、鹵代烷基、鹵代環烷基、C1-3亞烷基環烷基、5-或6-元飽和雜環基、芳基、雜芳基、雜芳基SO2、芳基烷基、烷基芳基、雜芳基烷基、雜烷基芳基、C1-3亞烷基C(＝O)OR7、C(＝O)C1-3亞烷基-C(＝O)OR7、C1-3亞烷基雜芳基、C(＝O)C(＝O)OR7、C(＝O)C1-3亞烷基C(＝O)OR7、C(＝O)C1-3亞烷基NH(C＝O)OR7、C(＝O)C1-3亞烷基NH2或NHC(＝O)OR7；R4為氫、低級烷基、鹵代烷基、環烷基或芳基；R5為低級烷基、炔基、鹵代烷基、環烷基或芳基；R6為氫、低級烷基或C(＝O)R7；R7為支鏈或直鏈的低級烷基或芳基，其中任何一個任選被一個或更多個OR8、NR8R9或SR8取代；和R8和R9相同或不同，選自氫、低級烷基、環烷基、芳基、雜芳基、烷芳基、雜芳烷基、雜烷芳基和芳烷基，或者R8和R9一起形成4-元至7-元環；R10為氫、烷基、鹵代烷基、環烷基、芳基、C(＝O)烷基、C(＝O)環烷基、C(＝O)芳基、C(＝O)O烷基、C(＝O)O環烷基、C(＝O)芳基、CH2OH、CH2O烷基、CHO、CN、NO2或SO2R11；和R11為烷基、環烷基、三氟甲基、芳基、芳烷基或NR8R9。
2.權利要求1的化合物，它具有以下結構式
3.權利要求1的化合物，其中R1選自氫、烷基、環烷基、C1-3亞烷基環烷基、鹵代環烷基、芳基和雜芳基。
4.權利要求1的化合物，其中R2選自烷基、環烷基、芳基和雜芳基。
5.權利要求1的化合物，其中R3選自C(＝O)OR7、芳烷基、烷芳基、雜芳烷基、雜烷芳基、低級烷基、環烷基、雜環基和芳基。
6.權利要求5的化合物，其中R3選自 或
7.權利要求1的化合物，其中R5為氫或甲基。
8.權利要求1的化合物，其中R6選自氫、乙酰基和苯甲酰基。
9.權利要求1的化合物，其中R7為甲基。
10.權利要求1的化合物，其中R1選自環戊基、四氫呋喃基、茚滿基、降冰片基、苯乙基和苯基丁基；R2選自氫、乙基、甲基和二氟甲基；R3選自芐基、CO2CH3、C(＝O)CH2OH、C(＝O)CH(CH3)OH、C(＝O)C(CH3)2OH、C(＝O)CH(NH2)CH2OH、C(＝O)CH(OH)CH2OH，和 R4為氫；R5為氫或甲基；R6為氫；R7為甲基；和R10為氫。
11.權利要求1的化合物，它具有以下結構式 或
12.權利要求1的化合物，它具有以下結構式
13.權利要求1的化合物，它具有對于人重組PDE4的IC50值為約0.001μM-0.3μM。
14.權利要求1的化合物，它具有對于人重組PDE4的IC50值為約100×109M或更低。
15.權利要求1的化合物，它具有對于人重組PDE4的IC50值為約50×109M或更低。
16.一種含有權利要求1的化合物、藥學上可接受的載體和任選的第二種抗炎治療藥的藥用組合物。
17.權利要求16的組合物，其中所述第二種抗炎治療藥能夠針對TNFα。
18.一種治療患有其中抑制cAMP-特異性PDE具有治療益處的疾病的哺乳動物的方法，所述方法包括給予所述哺乳動物治療有效量的權利要求1的化合物。
19.一種調節哺乳動物體內cAMP水平的方法，該方法包括給予所述哺乳動物有效量的權利要求1的化合物。
20.一種治療患有其中抑制cAMP-特異性PDE具有治療益處的疾病的哺乳動物的方法，所述方法包括給予所述哺乳動物有效量的一種包含權利要求1的化合物和藥學上可接受的載體的藥用組合物。
21.權利要求20的方法，其中所述疾病為變應性疾病、自身免疫性疾病、炎性疾病、關節炎性疾病或皮炎。
22.權利要求20的方法，其中所述疾病為類風濕性關節炎、骨關節炎、痛風性關節炎或脊椎炎。
23.權利要求20的方法，其中所述疾病為與甲狀腺有關的眼病、貝赫切特病、膿毒病、敗血癥性休克、內毒素性休克、革蘭氏陰性膿毒病、革蘭氏陽性膿毒病、中毒性休克綜合征、過敏性結膜炎、春季結膜炎或朗格斯細胞肉芽腫病。
24.權利要求20的方法，其中所述疾病為哮喘、慢性支氣管炎、變應性鼻炎、成人呼吸窘迫綜合征、慢性肺炎、慢性阻塞性肺炎、硅肺或肺結節病。
25.權利要求20的方法，其中所述疾病為由于腦或脊髓的創傷性損傷引起的心肌、腦或肢端再灌注損傷。
26.權利要求20的方法，其中所述疾病為纖維變性、瘢痕疙瘩形成或疤痕形成。
27.權利要求20的方法，其中所述疾病為系統性紅斑狼瘡、移植排斥反應、移植物抗宿主反應或同種移植排斥反應。
28.權利要求20的方法，其中所述疾病為慢性腎小球性腎炎、炎性腸疾病、局限性回腸炎或潰瘍性結腸炎。
29.權利要求20的方法，其中所述疾病為增生性淋巴細胞疾病或白血病。
30.權利要求20的方法，其中所述疾病為炎性皮膚病、特應性皮炎、牛皮癬或蕁麻疹。
31.權利要求20的方法，其中所述疾病為心肌病、充血性心力衰竭、動脈粥樣硬化、發熱、惡病質、感染或惡性腫瘤繼發的惡病質、獲得性免疫缺陷綜合征繼發的惡病質、ARC、腦型瘧、骨質疏松、骨吸收疾病、由于感染引起的發燒和肌痛、尿崩癥、中樞神經系統疾病、抑郁癥、多梗死性癡呆、焦慮癥或應激反應、腦局部缺血、遲發性運動障礙、帕金森氏病和經前期綜合征。
32.權利要求20的方法，其中所述哺乳動物顯示最低的催吐反應。
33.權利要求20的方法，其中所述哺乳動物沒有催吐反應。
34.權利要求20的方法，其中所述哺乳動物顯示最低的不利的中樞神經系統副作用。
35.權利要求20的方法，其中所述哺乳動物沒有不利的中樞神經系統副作用。
36.一種降低哺乳動物體內TNFα水平的方法，該方法包括給予所述哺乳動物治療有效量的權利要求1的化合物。
37.一種抑制哺乳動物體內炎性細胞激活的方法，該方法包括給予所述哺乳動物治療有效量的權利要求1的化合物。
38.一種抑制哺乳動物體內PDE4功能的方法，該方法包括給予所述哺乳動物治療有效量的權利要求1的化合物。
全文摘要
本發明公開為PDE4的有效和選擇性抑制劑的新的化合物以及制備它們的方法。也同時公開所述化合物在治療炎性疾病和其它涉及細胞因子水平升高的疾病以及中樞神經系統(CNS)疾病中的用途。
文檔編號A61P19/02GK1434820SQ00819103
公開日2003年8月6日 申請日期2000年12月15日 優先權日1999年12月23日
發明者J·J·高蒂諾 申請人:艾科斯有限公司