抗血栓形成化合物的制作方法

專利名稱：抗血栓形成化合物的制作方法
技術領域：
本發明涉及新的抗血栓形成化合物、包含該化合物為活性成分的藥物組合物及所述化合物在藥物制備中的用途。
絲氨酸蛋白酶是血凝級聯中起重要作用的酶。重要的絲氨酸蛋白酶是Xa因子，它催化凝血酶原轉化成凝血酶。凝血酶是血凝級聯中最后的絲氨酸蛋白酶。凝血酶的主要功能是裂解纖維蛋白原以產生纖維蛋白單體，纖維蛋白會交聯成不溶的凝膠。另外，凝血酶通過活化該級聯早期中的V和VIII因子來調節其自身生成。凝血酶在細胞水平也具有重要作用，它作用于特異性受體而使血小板凝聚、內皮細胞活化并使成纖維細胞增殖。因此凝血酶在止血和血栓形成中起著中樞調節作用。
在絲氨酸蛋白酶合成抑制劑的開發過程中，最近有報道，合成的NAPAP-戊糖偶聯物(conjugate)作為抗血栓形成物質具有直接抗凝血酶活性和ATIII介導的抗Xa活性(ATIII抗凝血酶III)的雙重特性(Bioorg.Med.Chem.Lett.1999，9(14)，2013-8)。雖然該報道中的抗血栓形成物質可能是一種令人感興趣的化合物，但是由于其戊糖殘基中的高硫酸鹽含量，使之與HIT交叉反應和被PF4中和有關(Thromb.Haem.增刊，1997，p363，PD1485)。
現已發現，式(I)化合物是具有優良和有益雙重特性的抗血栓形成劑。式(I)化合物具有藥理學感興趣的半衰期，可用于每天一次的治療，并且幾乎不被PF4中和。此外，出血的風險也較低。總之，式(I)化合物具有多種有吸引力的藥理學性質。
式(I)或其藥用鹽、前藥或其溶劑化物 其中R獨立地為SO3-或CH3；間隔基為鏈長為13-25個原子、優選為16-22和最優選為19個原子的柔性隔離基；戊糖殘基的電荷由荷正電的抗衡離子抵消；和戊糖殘基中硫酸鹽基團的總數為4、5或6。
本發明的化合物可用于治療和預防與凝血酶介導的以及與凝血酶有關的疾病。這包括其中血凝級聯被激活的血栓形成和前血栓形成病癥，其中包括但不限于深靜脈血栓形成、肺栓塞、血栓性靜脈炎、血栓形成或者栓塞形成的動脈阻塞、血管成形術或者血栓溶解期間或者之后的動脈再閉塞、動脈損傷或者侵入性心臟術后的再狹窄、手術后的靜脈血栓形成或者栓塞、急性或者慢性的動脈粥樣硬化、中風、心肌梗死、癌和腫瘤轉移和神經變性疾病。本發明化合物還可用作透析和手術中所需的體外血循環的抗凝血劑。
本發明化合物還可用作體外抗凝血劑。
式(I)化合物在具有動脈征兆的抗血栓形成方面特別有用。
本發明化合物優選其中戊糖殘基具有以下結構的化合物 間隔基的化學性質對本發明化合物的抗血栓形成活性并無顯著影響。然而，本發明化合物的間隔基是柔性的，即表示間隔基不含剛性元素，例如不飽和鍵或者環狀結構。本領域技術人員可容易地設計出適宜的間隔基。優選間隔基包含至少一個-(CH2CH2O)-單元。更優選間隔基包含三個-(CH2CH2O)-單元。最優選的間隔基是*-(CH2CH2O)3-(CH2)2-NH-C(O)-(CH2)3-NH-C(O)-CH2-，其中用*表示的端基與戊糖殘基鏈接。
優選式I化合物為式(Ia)化合物，其中p是1-5，n是1-5和m是1或2。最優選化合物是式(Ia)化合物，其中p是3，n是3和m是1。 荷正電抗衡離子指H+、Na+、K+、Ca2+等。優選式(I)化合物是其鈉鹽形式。
術語“前藥”，指其中脒基部分的氨基被例如羥基或者(1-6C)烷氧羰基保護的本發明化合物。
本發明溶劑化物包括水合物。
本發明中以游離堿形式出現的化合物可從其藥用鹽形式的反應混合物中分離出來。用有機或者無機酸對式(I)游離堿進行處理也可獲得可藥用鹽，所述有機或者無機酸例如氯化氫、溴化氫、碘化氫、硫酸、磷酸、醋酸、丙酸、羥基乙酸、馬來酸、丙二酸、甲磺酸、富馬酸、丁二酸、酒石酸、檸檬酸、苯甲酸和抗壞血酸等。
本發明化合物具有手性碳原子，因此可以純對映體、或對映體的混合物、或者包含非對映體的混合物的形式獲得。采用本領域中已知技術，例如對從旋光酸和外消旋混合物中得到的鹽進行結晶，或者用手性柱色譜法，均可獲得純對映體。對于非對映體，可采用正相或者反相柱。
首先，對式II NAPAP類似物的羧基進行活化，然后加入包含胺基的戊糖-間隔基殘基(式III)，再任選對脒基脫保護，即可制得本發明化合物。 式II化合物中的羧基可活化成混合酸酐或者更優選為活化的酯，例如N-羥基琥珀酰亞胺、五氟苯酚或者1-羥基苯并三唑的酯。在偶聯步驟中，式II中的芐脒基部分可以是未保護的(R’＝R″＝H)，或者任選經氨基甲酸酯基團保護，優選經烯丙氧基羰基(R’和/或R″是H2C＝CH-CH-C(O)O)或者芐氧基羰基(R’和/或R″為PhCH2-C(O)O)保護。可在相對溫和條件除去烯丙氧基羰基和芐氧基羰基保護基。在弱親核試劑例如嗎啉或者丙二酸酯存在下，可用Pd除去烯丙氧基羰基基團。可在例如氫/Pd(C)條件下，除去芐氧基羰基基團。另外，可采用芐脒的合成前體，例如N-烷氧基芐脒或者N-芐氧基芐脒(R’＝H，R″＝烷氧基或者芐氧基)。采用例如氫化的還原條件，可將所述合成前體轉變為芐脒(例如Fujii，T等，Chem.Pharm.Bull.，39，301，1991和Fujii，T等，Chem.Pharm.Bull.，42，1231，1994)。
芐脒前體優選為1，2，4-氧雜二唑啉-5-酮(1，2，4-oxadiazolin-5-one)(-R’-R”-＝-C(O)O-)。經氫化，該前體可轉變為芐脒(Bolton，R.E.等，Tetrahedron Letters，Vol 36，No25，1995，4471-4474頁)。
式II化合物可采用本領域已知的方法以許多種方式制得。EP0513543中描述了一種制備式II化合物的方法，其中R’＝R″＝H，n為3和m為1。采用本技術領域熟知的肽片段偶聯技術，從其中脒經烯丙氧基羰基或者芐氧基羰基保護的式IV化合物，即可制得其中的脒經例如烯丙氧基羰基或者芐氧基羰基保護的式II化合物。例如，式IV氨基甲酸酯可由相應的脒制得(式IV，R’＝R″＝H，如Weller，T等的描述，J.Med.Chem.39，3119，1996)。 采用化合物V(EP0513543描述)，用O-烷基羥胺或者O-芐基羥胺處理該氰基化合物，再經酸性條件除去叔丁基酯，即可制得式II的N-烷氧基芐脒和N-芐氧基芐脒化合物。或者，于酸性條件下先除去式V中的叔丁基酯得到化合物VI，再將該氰基化合物與O-烷基羥胺或者O-芐基羥胺反應，即可制得式II的N-烷氧基芐脒和N-芐氧基芐脒化合物。
采用本領域已知的肽片段偶聯技術，由其中-R’-R″-＝-C(O)O-的式IV化合物，即可制得其中-R’-R″-＝-C(O)O-(即1，2，4-氧雜二唑啉-5-酮基團)的式II化合物。
采用如EP0649854描述的方法，可合成式III的氨基-低聚糖-間隔基殘基。按本領域已知技術例如WO99/25720描述的方法，可制備本發明化合物的糖殘基。
按本領域已知的肽片段偶聯-或縮合技術，例如疊氮化方法、混合酸酐方法、活化酯方法或者優選為碳化二亞胺法，尤其是加入催化和外消旋抑制化合物例如N-羥基琥珀酰亞胺和N-羥基苯并三唑，即可采用上述方法中的一個工藝步驟肽偶聯制備本發明化合物。有關綜述參見肽的分析、合成和生物學，卷3，E.Gross和J.Meienhofer編輯(Academic出版社，紐約，1981)和Bodanszky，M.；肽合成原理，Springer-Verlag，1984。
在合成過程中，化合物中的胺官能團可用N-保護基保護，所述保護基在化學中通常用于α-氨基的保護，例如叔丁氧羰基(Boc)基團、芐氧羰基(Z)、9-芴甲氧羰基(Fmoc)基團或者鄰苯二甲酰(Phth)基團。可采用不同方法除去保護基，這取決于那些保護基的性質。通常在酸性條件和清除劑存在下進行脫保護。有關氨基保護基及其清除方法的綜述參見上述肽的分析、合成和生物學，卷3，并進一步參見Greene，T.W.和Wuts，P.G.M.在有機合成中的保護基，John Wiley & Sons公司1991中的描述。
本發明化合物可經腸內或者非腸道途徑給藥。這些化合物及其組合物所需的精確劑量和用法，取決于用藥的個體受試者對其的需要、患病程度或者臨床醫生的需要和判斷。通常，與更取決于吸收的其他給藥方法相比，非腸道給藥的劑量較低。然而，人的每日劑量優選為0.001-100毫克每公斤體重，更優選為0.01-10毫克每公斤體重。
采用本發明化合物制備的藥物，也可用于急性抗凝血療法的輔助藥物。在這種情況下，所述藥物與其他對于治療這樣的病癥是有利的化合物一起給藥。
與適當的藥用輔料混合后，可將所述藥物壓制成固體劑量單位，例如丸劑、片劑，或者加工成膠囊或者栓劑，所述輔料參見標準參考書例如Gennaro等在Remington藥物學(第18版，Mack出版社，1990，尤其是第8部分藥物制劑及其生產)中的描述。利用適當的可藥用液體，將化合物制成例如用作注射制劑的溶液、懸浮液、乳劑形式，或者是用于鼻噴入的噴霧劑。
在劑量單位例如片劑的制造中，可以考慮采用常規添加劑例如填充劑、著色劑、聚合粘合劑等。通常，可采用不干擾活性物質作用的任何藥用添加劑。
可與組合物聯用給藥的適當載體包括適量的乳糖、淀粉、纖維素衍生物等，或它們的混合物。
以下實施例將對本發明作進一步說明。
實施例1所用縮寫Ac＝乙酰基Bn＝芐基DBU＝1，8-二氮二環(diazabicyclo)[5.4.0]十一碳-7-烯DCC＝二環己基碳二亞胺DMF＝N，N-二甲基甲酰胺Su＝琥珀酰亞胺基Me＝甲基TBTU＝2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲四氟硼酸鹽TEA＝三乙胺TFA＝三氟乙酸Z＝芐氧基羰基化合物的編號指示意

圖1-7中的化合物。化合物3于50℃下，向化合物1(53.6g，143.6mmol)(R.Roy；W.K.C.Park；Q.Wu；S-N.Wang，Tetrahedron Lett.，1995，36(25)，4377-80)和化合物2(27.9g，89.3mmol)(S.J.Danishefsky；M.P.DeNinno；G.B.Philips；R.E.Zelle，Tetrahedron，EN，1986，42，11，2809-2819)在930ml的DMF中的攪拌溶液中，加入氫化鈉(7.7g 60％分散液，192.2mmol)。1小時后，將反應混合物加熱到120℃。攪拌5分鐘后將反應混合物冷卻到40℃，用水稀釋并用二氯甲烷萃取3次。合并的有機層用水洗滌并真空濃縮，得到粗產物3(54g)。TLCRf＝0.23，乙醚100％。化合物4于-30℃下，向化合物3(89.3mmol)在800ml無水甲苯和800ml乙酸酐中的攪拌溶液中，滴加361.5ml硫酸在乙酸酐中的冷卻溶液(16.5ml濃硫酸和345.0ml乙酸酐)。2小時后，反應混合物用240ml的TEA淬滅，并于室溫下攪拌。向該溶液中加入碳酸氫鈉水溶液(5％)并用乙酸乙酯萃取水層3次。合并的有機層用水洗兩次并真空濃縮。重復該操作，得到粗品化合物4(53g)。TLCRf＝0.29，乙醚100％。化合物5于0℃下，向化合物4(89.3mmol)和乙硫醇(11.1ml，150.3mmol)在370ml無水甲苯中的攪拌溶液，滴加在甲苯中的BF3-乙醚合物(23.9ml BF3-乙醚合物和190ml甲苯)。在室溫下攪拌16小時后，反應混合物用TEA和碳酸氫鈉水溶液淬滅，并用乙酸乙酯萃取三次。合并的有機層用水洗滌并真空濃縮。粗產物用柱色譜法(甲苯/乙酸乙酯＝1/1-1/1，v/v)提純，得到化合物5(21.4g)。TLCRf＝0.31，甲苯/乙酸乙酯＝4/6，v/v。化合物7在活化的4分子篩(7.6g)存在下，通氮氣流，將供體5(15.0g，30.3mmol)和受體6(23.0g，30.3mmol)(WO99/25720)在無水乙醚/二氯甲烷(232ml，3/1，v/v)中的溶液攪拌30分鐘。然后于-20℃，將1，3-二溴-5，5-二甲基乙內酰脲(5.5g，19.1mmol)和triflic酸(0.49ml，5.6mmol)在二氧雜環己烷/二氯甲烷(69.8mL，1/1，v/v)中的溶液，滴加到反應混合物中，用時75分鐘。30分鐘后，將TEA(5mL)加到反應混合物中，將反應混合物攪拌10分鐘后過濾。濾液用硫代硫酸鈉水溶液(10％)和碳酸氫鈉水溶液(10％)洗滌并真空濃縮。產品用柱色譜法(在二氯甲烷中的0-5％丙酮)提純，得到化合物7(19.6g)。TLCRf＝0.1，乙醚/庚烷＝8/2，v/v。化合物8于-26℃，向化合物7(19.5g，16.4mmol)在無水甲苯/乙酸酐(442ml，1/1，v/v)中的溶液中，滴加131.5mL硫酸在乙酸酐中的冷卻溶液(11.5mL濃硫酸和120ml乙酸酐)。75分鐘后，于-20℃加入TEA(73.5mL)。逐漸地加入水330ml，溫度維持在25-30℃之間，使乙酸酐分解。攪拌16小時后，將混合物傾入800ml水中，并用甲苯萃取兩次。合并的有機層用水洗滌并真空濃縮。粗產物經柱色譜法(甲苯/乙酸乙酯/乙醇＝96/2/2，v/v/v)提純，得到化合物8，為白色泡沫(13.2g)。
TLCRf＝0.29，甲苯/乙醇＝9/1，v/v。化合物9于32℃下，向化合物8(13.2g，11.7mmol)在無水甲苯(66ml)中的溶液中加入嗎啉(4.1ml，46.9mmol)。在32℃下攪拌42小時后，反應混合物冷卻至室溫并加入鹽酸(17.6mL，4N)。混合物用水稀釋并用乙酸乙酯萃取2次。合并的有機層用水洗滌2次，用硫酸鈉干燥并真空濃縮后，得到粗品化合物9(12.6g)。
TLCRf＝0.32，甲苯/丙酮＝7/3，v/v。化合物12向化合物9(12.6g，11.6mmol)在二氯甲烷(114m)中的溶液加入三氯乙腈(3.5mL，34.9mmol)和DBU(52.2μL，0.35mmol)。室溫下攪拌2小時后，將活化的4分子篩(24g)和受體11(8.9g，13.0mmol)(WO99/25720)在二氯甲烷(45mL)中的溶液加到反應混合物中。室溫下攪拌30分鐘后，將混合物冷卻至-20℃，并滴加三氟甲磺酸三甲硅酯(405μL，2.1mmol)在二氯甲烷(100mL)中的溶液。室溫下攪拌30分鐘后，于-20℃加入碳酸氫鈉并過濾反應混合物。將濾液傾入碳酸氫鈉水溶液中，并用二氯甲烷萃取3次。合并的有機層用水洗滌2次并真空濃縮。產物用柱色譜法(1SiO2在乙醚中0-10％的丙酮；2SiO2甲苯/丙酮＝85/15-80/20，v/v；3RP-18水/乙腈＝2/8-0/10，v/v)純化，得到純化合物12(8.9g)。TLCRf＝0.37，甲苯/丙酮＝7/3，v/v。化合物14在連續氫氣流下，攪拌化合物12(8.9g，5.1mmol)與10％的Pd/C(8.9g)在312mL的DMF和45mL水中的懸浮液。4.5小時后，過濾除去Pd/C催化劑。濾液濃縮成400mL，并在氫氣流下用10％的Pd/C(1.5g)處理5.5小時。過濾除去催化劑。向濾液(900mL)中加入氫氧化鈉水溶液(32mL，4N)。室溫下攪拌4小時后，用1N的鹽酸將化合物酸化成pH＝6.6，然后真空濃縮。粗產物在Sephadex G-25柱上用水洗脫進行脫鹽。收集適宜級分并凍干，得到化合物14(4.0g)。化合物15將戊糖14(700mg，0.61mmol)溶于水(13.2mL)和DMF(3.3mL)中，并用N-(芐氧基羰基)琥珀酰亞胺(224mg，0.90mmol)和N-乙基嗎啉(233μL，1.83mmol)處理。攪拌15分鐘后，將反應混合物直接置于RP-18柱中，用10/0-7/3的水/乙腈洗脫。收集適宜的級分并濃縮，置于在水中的Dowex 50 WX4-H+離子交換柱上。真空濃縮洗脫物，得到純的化合物15(482mg)。化合物16向化合物15(471mg，0.37mmol)在DMF(4.7mL)的溶液中加入三氧化硫-吡啶配合物(1.1g，6.6mmol)，混合物于30℃攪拌16小時。混合物冷卻至室溫，并滴入10％碳酸氫鈉的冷卻溶液中(16.7mL，19.9mmol)，然后室溫下攪拌1小時。濃縮混合物并將其置于Sephadex G-25柱上用水洗脫。收集適宜的級分并濃縮，然后經過Dowex Na+HCRW2柱，用水洗脫。濃縮洗脫物并再溶于8.3mL的0.2N鹽酸中，在4℃放置16小時。反應混合物用8mL的0.2N氫氧化鈉中和，并置于Sephadex G-25柱上用水洗脫進行脫鹽。收集適宜的級分并真空濃縮，得到純的化合物16(840mg)。化合物17在連續氫氣流下，攪拌化合物16(0.37mmol)和10％的Pd/C(820mg)在叔丁醇(85mL)和水(79mL)及幾滴醋酸中的懸浮液。3小時后，過濾除去Pd/C催化劑，濃縮濾液并凍干，得到純的化合物17(675mg)。4-[[4-[[(1R)-1-[[4-(氨基亞氨基甲基)苯基]甲基]-2-氧代-2-(1-哌啶基)乙基]氨基]-3-[[(4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯基)磺酰基]氨基]-1，4(S)-二氧丁基]氨基]-丁酸芐酯.鹽酸鹽(18)在氮氣氛下，向4-[[(1R)-1-[[4-(氨基亞氨基甲基)苯基]甲基]-2-氧代-2-(1-哌啶基)乙基]氨基]-3-[[(4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯基)磺酰]氨基]-4-氧代-(3S)-丁酸.鹽酸鹽(2.38g，3.96mmol)(Tetrahedron 51，12047-12068，1995)和芐基-(4-氨基丁酸)苯磺酸酯(1.52g，3.96mmol)(J.Am.Chem.Soc.105，5278-5284，1983)在DMF(40mL)中的溶液，加入N，N-二異丙基乙胺(0.689mL，3.96mmol)和四甲基苯并三唑基脲四氟硼酸鹽(1.91g，5.94mmol)。用N，N-二異丙基乙胺將反應混合物的pH保持為6。室溫下將反應混合物攪拌4天，濃縮后溶于乙酸乙酯中，用5％碳酸鈉和0.1N鹽酸洗滌，經硫酸鎂干燥并濃縮。所得殘余物溶于無水乙醇中(5mL)，用無水異丙醚沉淀，過濾后得到2.47g標題化合物18。
Rf＝0.8，乙酸乙酯/吡啶/醋酸/水＝88/31/18/7，v/v/v/v；Mass(ESI+)777.4[M+H]+。4-[[4-[[(1R)-1-[[4-(氨基亞氨基甲基)苯基]甲基]-2-氧代-2-(1-哌啶基)乙基]氨基]-3-[[(4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯基)磺酰]氨基]-1，4(S)-二氧丁基]氨基]-丁酸·鹽酸鹽(19)在連續氫氣流下，攪拌18(2.42g，3.11mmol)和10％的Pd/C(400mg)在甲醇/水(40mL，3/1，v/v)中的懸浮液。8小時后，過濾反應混合物，濃縮濾液并用甲醇/甲苯(1/10，v/v)共蒸發3次。殘余物溶于無水乙醇中(5mL)，用無水乙醚沉淀，過濾并干燥。將殘余物溶于水后直接加到制備HPLC DeltaPak RP-C18上，梯度洗脫洗脫為20％A/60％B/20％C至20％A/14％B/66％C，以40mL/分鐘的流速洗脫60分鐘(A0.5M的磷酸鹽緩沖液，pH為2.1；B水；C乙腈/水＝6/4)。產物為598mg。
Rt＝26.4分鐘(3-10分鐘20-43％C+20％A；10-50分鐘43-66％C+20％A)，(A磷酸鹽緩沖液pH為2.1；B水；C乙腈/水＝6/4，v/v)，分析HPLC supelcosil LC-18-DB；Mass(ESI+)687.2[M+H]+，(ESI-)685.2[M-H]。來源于化合物17和化合物19的化合物21向化合物19(40mg，58.3μmol)在DMF(800μL)中的溶液中加入N-羥基琥珀酰亞胺(9.0mg，78.1μmol)、DCC(18.5mg，89.7μmol)和1-羥基苯并三唑(8.8mg，65.1μmol)。反應混合物于室溫下攪拌40小時。反應混合物經代卡利特(Dicalite)過濾，代卡利特用DMF(284μL)洗滌4次。向濾液中加入0.1M的Na2HPO4緩沖液(1936μL，pH＝7.5)和戊糖17(94.7mg，52.6μmol)。待攪拌30分鐘后，混合物經代卡利特過濾、濃縮，并加到Sephadex G-50柱上，用乙腈/水(1/1，v/v)洗脫。收集適宜級分并濃縮，用Sephadex G-50柱色譜法(水)脫鹽2次。收集適宜級分并凍干，得到偶聯物21，為白色固體(95.8mg)。Mass(ESI+)＝2469，HPLCRt＝8.3分鐘(15分鐘，20-80％B，A＝水/乙腈8/2；B＝2M NaCl/乙腈8/2，v/v)，分析HPLC MonoQ HR 5。化合物22在氮氣流下，將(R)-N-Boc(4-氰基苯基)丙氨酸(25.0g，86.1mmol)、哌啶(21.3mL，215.3mmol)和TBTU(41.5g，129.2mmol)在無水CH2Cl2(500mL)中的溶液于室溫下攪拌2小時。反應混合物用0.2N鹽酸、水、碳酸氫鈉水溶液(飽和)及水連續洗滌。有機層經MgSO4干燥，再過濾并真空干燥。將產物溶于熱乙酸乙酯(35mL)中，用庚烷(190mL)沉淀，過濾得到化合物22(27.75g)。
TLCRf＝0.58，庚烷/乙酸乙酯＝3/7，v/v。化合物23于80℃下，將化合物22(25.6g，71.7mmol)、鹽酸羥胺(7.1g，101.8mmol)和三乙胺(16.8mL，120.5mmol)在無水乙醇(307mL)中的溶液攪拌4小時。混合物冷卻至室溫，形成晶體。濾出晶體，用乙醇和乙醚洗滌，經干燥器干燥得到化合物23(24.5g)。
TLCRf＝0.15，庚烷/乙酸乙酯＝3/7，v/v。化合物24于115℃下，將化合物23(24.5g，62.7mmol)和氯甲酸乙酯(7.2mL，75.3mmol)在無水吡啶(245mL)中的溶液攪拌2小時。反應混合物冷卻至室溫，傾入水中(1250mL)并用乙酸乙酯(500mL)萃取3次。合并的有機萃取相經MgSO4干燥，過濾并真空濃縮，得到化合物24(24.3g)。
TLCRf＝0.42，CH2Cl2/MeOH 95/5，v/v。化合物25室溫下，將化合物24(24.3g，58.4mmol)在無水CH2Cl2(122mL)和TFA(122mL)中的溶液攪拌2小時，并在甲苯存在下真空濃縮，得到化合物25(37.6g)。
TLCRf＝0.35，CH2Cl2/MeOH 8/2，v/v。化合物26于0℃下，將H-Asp-(OtBu)-OH(39g，206.35mmol)、4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯磺酰氯(62g，249.3mmol)和二異丙胺(89mL，635mmol)在DMF(950mL)及水(450mL)中的懸浮液攪拌3小時。將反應混合物傾入冰/水(5L)中，用乙醚洗滌2次，用鹽酸(72ml，4N)酸化，再用乙酸乙酯萃取3次。合并的乙酸乙酯層經MgSO4干燥，過濾并真空濃縮，得到化合物26(97.7g)。
TLCRf＝0.67，CH2Cl2/MeOH 8/2，v/v。化合物27將化合物25(33.5g)、化合物26(24.7g)、TBTU(36.8g，114.6mmol)和二異丙胺(27.2mL，194.1mmol)在無水DMF(670mL)中的溶液攪拌2小時，并真空濃縮。將殘余物溶于乙酸乙酯(750mL)，用碳酸氫鈉水溶液(5％，1250mL)和鹽酸(0.1N，1250mL)洗滌，經MgSO4干燥，過濾并真空濃縮，得到化合物27(33.8g)。
TLCRf＝0.88，CH2Cl2/MeOH 8/2，v/v。化合物28室溫下，將化合物27(33.8g，48.3mmol)在無水CH2Cl2(170mL)和TFA(170mL)中的溶液攪拌2小時，并在甲苯存在下真空濃縮，得到化合物28(32.3g)。
TLCRf＝0.73，CH2Cl2/MeOH 8/2，v/v。化合物29室溫下，將化合物28(32.3g)，H-GABA-OtBu.HCl(9.5g，48.4mmol)、TBTU(29.0g，90.5mmol)和二異丙胺(25.2mL，179.8mmol)在無水DMF(622mL)中的溶液攪拌2小時，并真空濃縮。將殘余物溶于乙酸乙酯(840mL)，用碳酸氫鈉水溶液(5％，1400mL)和鹽酸(0.1N，1400mL)洗滌，經MgSO4干燥，過濾并真空濃縮。將殘余物溶于乙醇(75mL)中，并緩慢加到攪拌的二異丙醚(2990mL)中，得到化合物29，為灰白色結晶(32.0g)。
TLCRf＝0.56，CH2Cl2/MeOH 9/1，v/v。化合物30室溫下，將化合物29(3.0g，3.82mmol)在無水CH2Cl2(15mL)和TFA(15mL)中的溶液攪拌2小時，并在甲苯存在下真空濃縮。殘余物在硅膠上用CH2Cl2/MeOH(0％-6％的MeOH)提純，得到純的化合物30(1.98g)。
TLCRf＝0.56，CH2Cl2/MeOH 8/2，v/v。化合物31室溫下，將化合物30(900mg，1.23mmol)、TBTU(396mg，1.23mmol)和二異丙胺(215μL，1.53mmol)在無水DMF(45mL)中的溶液攪拌2小時。加入化合物17(2.0g，1.11mmol)，攪拌4小時后，將混合物真空濃縮，得到化合物31(4.17g)。來源于化合物31的化合物21在連續氫氣流下，將化合物31(4.17g)和10％的Pd/C(2.8g)在叔丁醇(28ml)和水(56ml)中的溶液攪拌過夜。過濾除去Pd/C催化劑，將濾液真空濃縮。殘余物溶于水中并用Q-瓊脂糖凝膠柱提純。收集適宜級分，濃縮并用Sephadex G-25柱色譜法(水)脫鹽。收集適宜級分并凍干，得到偶聯物21，為白色固體(1.74g)。示意圖1 示意圖3 示意圖4 示意圖5 示意圖6
實施例2通過下述測試方法測定本發明化合物的生物活性。I.抗凝血酶分析凝血酶(IIa因子)是血凝級聯中的因子。
通過分光光度法，測定由凝血酶導致的生色底物S-2238水解的速率，評價本發明化合物的抗凝血酶活性。對抗凝血酶活性的分析在緩沖系統中進行，以確定待試化合物的IC50值。
測試介質氨丁三醇(Tromethamine)-NaCl-聚乙二醇6000(TNP)緩沖液參照化合物I 2581(Kahi)載體TNP緩沖液可用二甲亞砜、甲醇、乙醇、乙腈或叔丁醇增溶，這些溶劑在最終反應化合物中高達2.5％的濃度下不會產生副作用。
方法試劑*1.氨丁三醇-NaCl(TN)緩沖液；緩沖液細成氨丁三醇(Tris)6.057g(50mmol)，NaCl 5.844g(100mmol)，水加至1升。37℃下用HCl(10mmol/升)將溶液的pH調至7.4。2.TNP緩沖液將聚乙二醇6000溶于TN緩沖液中，濃度為3g/升。3.S-2238溶液將一瓶S-2238(25mg，Chromogenix；瑞典)溶于20ml TN緩沖液中，使其濃度為1.25mg/ml(2mmol/升)。4.凝血酶溶液人凝血酶(1000NIH單位/瓶，Enzyme Res.Lab.公司，美國)溶于TNP緩沖液中，配成50NIH單位/ml的貯備液。該溶液在使用前立即用TNP緩沖液稀釋至濃度為30.2 NIH單位/ml。
*-使用的所有組分均為分析純-水溶液采用超純水(Milli-Q質量)。
制備待試化合物和參照化合物溶液將待試化合物和參照化合物溶于Milli-Q水中，配成濃度為10-2mol/升的貯備液。用載體對每一濃度進行梯度稀釋，濃度為10-3、10-4和10-5mol/升。該分析使用包括貯備液的稀釋液(在反應混合物中的終濃度分別為3×10-4；10-4；3×10-5；10-5；3×10-6；10-6；3×10-7和10-7mol/升)。
步驟室溫下，用吸量管將0.075ml和0.025ml待試化合物溶液或參照化合物溶液或者載體分別加至微量滴定板的孔中，并分別用0.115ml和0.0165mlTNP緩沖液將這些溶液稀釋。向每孔加入等分的0.030mlS-2238溶液，振蕩下將滴定板置于恒溫箱(Amersham)中在37℃下預熱并預保溫10分鐘。預保溫后，向每孔中加入0.030ml凝血酶溶液，使S-2238開始水解。將滴定板于37℃下保溫(振蕩30秒)。保溫1分鐘后，用動力學微量滴定板讀數儀(Twinreader plus，FlowLaboratories)于405nm處測定每一試樣的吸光度值，在90分鐘內每2分鐘測定一次。
將所有數據收集到具有數據處理程序(Biolise)的個人計算機中。對于每一化合物濃度(以mol/升反應混合物表示)及空白，以反應時間(分鐘)對吸光度作圖。
反應評價由分析曲線計算每一終濃度的最大吸光度。按照Hafner等的方法(Arzneim.-Forsch./Drug Res.1977；27(II)1871-3)，采用對數變換分析法計算IC50值(使空白的最大吸光度抑制50％的終濃度，以μmol/升表示)。
實施例1化合物的抗凝血酶活性IC50值為17nM。II.抗Xa因子分析活化因子X(Xa)是血凝級聯中的因子。通過分光光度法測定由Xa導致的生色底物S-2222水解的速率，來評價本發明化合物的抗Xa活性。抗Xa活性的分析在緩沖系統中進行，以確定待試化合物的IC50值。
參照化合物戊糖Org 31540載體TNP緩沖液可用二甲亞砜、甲醇、乙醇、乙腈或叔丁醇增溶，這些溶劑在最終反應化合物中高達1％(DMSO)和2.5％(其他溶劑)的濃度下，不會產生副作用。
方法試劑*1.氨丁三醇-NaCl(TN)緩沖液；該緩沖液組成氨丁三醇(Tris)6.11g(50.4mmol)，NaCl 10.17g(174mmol)，聚乙二醇6000是3g/升，水加至1升。在37℃下用HCl(10mmol/升)將溶液的pH調至7.4。3.S-2222溶液將一瓶S-2222(25mg，Chromogenix；瑞典)溶于水中，使其濃度為0.375mg/ml(0.5mmol/升)。4.Xa溶液牛Xa因子人(71nKat/瓶；Chromogenix)溶于10ml TNP緩沖液中，再進一步用TNP緩沖液配成0.75nKat(1.5U)/ml。稀釋液需新鮮配制。5.ATIII溶液人ATIII(Chromogenix)溶于水中，濃度為1U/ml，然后用3倍體積的TNP緩沖液稀釋成0.25U/ml。6標準溶液5.7抗XaU/ml Org31540的貯備液用TNP緩沖液稀釋成0.05U/ml。7待試樣品將每一制劑溶于水中，并用TNP緩沖液稀釋成0.05nmol/ml。對于每一制劑，配制9稀釋度的溶液(稀釋因子1.5)。
測定Xa活性室溫下，用移液管將每一待試樣品(0.05ml)加到微量滴定板的孔中。將AT-III溶液(0.05ml)加到每一試樣中，微量滴定板用Vari-振動器振蕩。加入AT-III溶液10分鐘后，取等分的Xa溶液(0.05ml)加入每一孔中，并再次振蕩滴定板。在加入Xa溶液剛好2分鐘后，取0.1ml的S-2222溶液加入每一孔中，并再次振蕩滴定板。采用12-槽吸量管加液。殘余量的Xa催化S-2222的水解，分別于室溫下保溫2和22分鐘后光度法測定水解速率。用Reader Microelisa，310C型(Organon Teknika，Oss，荷蘭)于405nm測定每一樣品的吸光度，并計算吸光度的增加值(ΔOD)。每一試樣測定二次。其中每10份試樣，包括一個空白(0.05mlTNP緩沖液)。
標準曲線用一定稀釋度的標準樣品配制等分標準溶液試樣(Org31540試樣的稀釋因子是1.4)。所得標準試樣(約12份試樣)應包含0.01-0.05抗XaU/ml。每一操作中，均按上述″Xa活性測定″項下，每份標準試樣取0.05ml測量至少3次。用最小二乘法，以
Log平均ΔOD(空白)-平均ΔOD(標準試樣)平均ΔOD(標準試樣)對log抗XaU/ml值作一直線，即可得到標準曲線。
反應評估采用標準曲線，測定每一試樣的平均抗Xa活性(U/ml)。
實施例1化合物的抗Xa因子活性1012U/μmol。
權利要求
1.式(I)化合物或其藥用鹽、前藥或其溶劑化物， 其中R獨立地為SO3-或CH3；間隔基為鏈長為13-25個原子的柔性隔離基；戊糖殘基的電荷由荷正電的抗衡離子抵消；和戊糖殘基中硫酸鹽基團的總數為4、5或6。
2.如權利要求1的化合物，其中戊糖殘基具有以下結構
3.如權利要求1或2的化合物，其中間隔基的鏈長為16-22個原子。
4.如權利要求1-3任一項的化合物，其中間隔基的鏈長為19個原子。
5.如權利要求1-4任一項的化合物，其中間隔基為*-(CH2CH2O)3-(CH2)2-NH-C(O)-(CH2)3-NH-C(O)-CH2-，用*表示的端基與戊糖殘基鏈接。
6.如權利要求1的化合物，具有以下結構
7.式I化合物的制備方法，包括芐脒基部分為1，2，4-氧雜二唑啉-5-酮基團形式的前體的步驟。
8.一種藥物組合物，其中包含如權利要求1-6任一項的化合物和藥用輔料。
9.用于治療的權利要求1-6任一項化合物。
10.如權利要求1-6任一項的化合物在制備用于治療或預防血栓形成或其他與凝血酶有關疾病的藥物中的用途。
全文摘要
本發明涉及式(I)化合物或其藥用鹽、前藥或其溶劑化物，其中R獨立地為SO
文檔編號A61K31/702GK1407989SQ00816775
公開日2003年4月2日 申請日期2000年12月1日 優先權日1999年12月7日
發明者C·A·A·范伯伊克爾, C·M·特羅姆普, T·T·M·吉爾特森 申請人:阿克佐諾貝爾公司