專利名稱：梭狀芽孢桿菌屬微生物毒素的解毒劑的制作方法
技術領域：
本發明涉及梭狀芽孢桿菌屬微生物毒素的解毒劑。更詳細地說，本申請發明涉及含有梭狀芽孢桿菌屬微生物毒素的中和劑和含有此中和劑的藥物或者飲食品。
茶，有綠茶、烏龍茶、紅茶等許多種，但總的來說，所有的茶葉都是由一種叫Camellia sinensis(L)O.Kuntze的山茶科山茶屬多年生常綠樹而來的，只是由于加工方法的不同而叫法不同而已。
茶葉中含有許多成分，如蛋白質、游離氨基酸、咖啡因、生物堿類、多酚類、碳水化合物、有機酸類、脂肪、葉綠素和類胡蘿卜素等色素、維生素類等各種有機物，以及水溶性、不溶性的無機成分等。這些成分因為茶葉的加工方法的不同會發生很大的變化，而且經熱水提取出來的成分以及散發的香氣中含有的成分還有很多種。
茶中含有一種多酚類成分——兒茶酸類以及使其氧化的多酚氧化酶等酶類，在茶葉的加工過程中，如果首先加熱，就會使酶的活性消失，得到的就是綠茶。反之，由于酶的作用，兒茶酸類充分氧化，得到的就是紅茶。
綠茶被稱為非發酵茶，就是先將茶葉用水蒸汽或鍋中翻炒的方法進行加熱，使多酚氧化酶等酶類失去活性，然后干燥而得。綠茶中所含主要成分為茶氨酸、谷氨酸、天冬氨酸等氨基酸類、棓酸表棓兒茶酯、棓酸表兒茶酯、表棓兒茶酚、表兒茶酸等兒茶酸類、咖啡因、蔗糖、葡萄糖、果糖等糖類、還有使茶葉呈現綠色的葉綠素等，這些成分的含量不同，茶的色、香、味的濃淡也就相應變化。還有，構成綠茶香氣的成分包括二甲基硫醚、苯乙醇、芐醇、β-紫羅蘭酮、橙花叔醇、4-乙烯基苯酚、吡嗪類、吡咯類等多種化合物。
而紅茶被稱為發酵茶，將茶葉鋪開、在低溫下使水分蒸發，提高酶的活性，使葉片柔軟，將兒茶酸等成分擠壓出，然后晾曬在空氣中，促進其氧化，得到的就是紅茶。表兒茶酸、表棓兒茶酚等兒茶酸類化合物被多酚氧化酶氧化而形成的茶黃素，或者再進一步氧化聚合而形成的茶玉紅精，還有氧化聚合進一步進行生成的高分子量的氧化聚合物等，這些色素成分就形成紅茶特有的紅褐色。
另外，雖然生茶葉中僅含有極少量的醇類，但經過加工，由里那醇、香茅醇、水楊酸甲酯、紫羅蘭酮系列化合物、內酯、糖和氨基酸而生成的香氣成分、反式-2-乙烯醛等明顯增多。
其他還有綠茶經二次加工而得的煎茶和黑茶、以半發酵茶聞名的烏龍茶、各種植物混合而得的等等多種多樣的茶，各種茶所含成分、熱水沖泡而出的成分、香氣成分都不盡相同，其功效受到了廣泛關注，研究很熱門。
其中，兒茶酸、單寧和單寧酸等多酚類物質最近被科學證明具有抗氧化作用、抗菌作用、抑制膽固醇和血脂升高、抑制血壓上升、抑制血糖升高、以及抗腫瘤作用等各種功效，人們正在研究開發含有兒茶酸和單寧的健康食品、飲料、醫藥品、除臭劑、抗菌劑等各種商品。
但是，人們對兒茶酸和單寧以外的許許多多成分還知之甚少，特別是在抗菌性方面，是茶中何種成分對哪種微生物或毒素起作用還不了解。因此，現在實際上人們還僅限于知道綠茶的抗菌性能最高，還不明確對特定的細菌顯示出中和效果的成分。
現已知道在人體中的各種有害微生物中，肉毒梭狀芽孢桿菌(Clostridium botulinum)和破傷風菌(Clostridium tetani)均為廣泛分布于土壤中的厭氧菌，為梭狀芽孢桿菌屬微生物，其產生的毒素分子量與其大致相等，非常類似。這些梭狀芽孢桿菌屬微生物的毒素作用于運動神經骨骼肌系統，可使其麻痹，致死率極高，因此要注意避免感染。
肉毒梭狀芽孢桿菌可以形成特別耐熱和耐消毒藥的孢子，在食品等中，在3～～40℃、pH4.5以上的環境中，在無氧、有水分和營養的條件下生長，產生毒素。雖然細菌的潛伏期為12～～36個小時，但是其產生的毒素具有強烈的神經毒性，人體一旦吸收，就有無力和眩暈感，表現出惡心嘔吐的胃腸道疾病癥狀，然后出現頭痛、視力模糊、喝東西困難和走路困難等神經障礙，嚴重的情況下還會引起呼吸困難導致死亡。
在日本，尤以咸魚飯團引起的事件多，而最近由進口瓶裝食品、罐頭、火腿和香腸等引起的事件也時有發生，對出現癥狀的治療采用給予肉毒梭狀芽孢桿菌抗毒素的方法。
而破傷風菌為革蘭氏陽性厭氧菌，不僅土壤中和水中，在人體腸道內也常有存在，但如果通過交通事故引起的受傷、竹子、木片和銹釘等引起的扎傷等受污染的外傷進入人體，就會產生毒素，釋放到血液中。破傷風菌的潛伏期一般為1～2周，一旦產生毒素，就會開始出現牙關緊閉和痙笑等神經麻痹癥狀，接著引起全身肌肉痙攣和僵硬，造成呼吸困難而死亡。一旦發病，70～80％肯定死亡。所以是一種致死率非常高的毒素。
預防破傷風，預防接種是最有效的方法，已被推廣實行。目前也接種混合疫苗，但成年人一般接種破傷風類毒素。但是，不僅需要再次接種，而且再次接種的5年以后被感染的情況下，一定要接受破傷風類毒素皮下注射接種。所以總的來說接受接種的人不多。
因此，即使被這種梭狀芽孢桿菌屬微生物感染，現實生活中是在出現了毒素引起的癥狀后才會被發現，于是醫生就要進行緊急處理，而患者就會處于非常危險的狀態。
還有，尤其是在食品加工行業，食物中毒是最令人擔心的，目前也在進行各種殺菌、消毒方法的研究和實施。但正如前文所述，肉毒梭狀芽孢桿菌只在經過長時間高溫處理后毒性才會消失，而實際上，某些食品不可能進行這樣的處理，尤其是作為儲藏食品生產的瓶裝食品和罐頭食品等，它們的厭氧性環境是最受肉毒梭狀芽孢桿菌歡迎的，所以預防起來非常困難。
雖然各種各樣的解毒劑或消毒劑正在研究開發中，但問題是，對這類毒素作用強而有效性又高的解毒劑或消毒劑，其中大部分對人體也十分有害。尤其是近年來因為過敏等方面的問題，社會上越來越多的人厭惡食品添加劑，喜歡少放添加劑或不含添加劑的食品。
如何安全、簡單、有效地中和或除去梭狀芽孢桿菌屬微生物和由此微生物產生的具有強烈毒性的神經毒素，人們目前還一無所知。
于是，本申請發明的課題是鑒于以上情況，力求提供一種解決以往技術上的問題、以茶葉提取成分為有效成分、使用安全簡便、梭狀芽孢桿菌屬微生物所產生毒素的解毒劑。
即，第1，本申請發明提供梭狀芽孢桿菌屬微生物毒素解毒劑，其特征在于至少含有茶玉紅精作為有效成分。
第2，本申請發明提供如上述第1發明所述的梭狀芽孢桿菌屬微生物毒素解毒劑，其特征在于茶玉紅精是茶葉褐色色素成分中的至少一種。
第3，本申請發明提供如上述第1、2發明所述的梭狀芽孢桿菌屬微生物毒素解毒劑，其中茶玉紅精是茶葉的水或熱水提取物。第4，其中茶玉紅精是茶葉經水或開水提取后的醇提取物。
為此，第5項發明提供梭狀芽孢桿菌屬微生物毒素解毒劑，其中上述第1～第4項發明中的茶玉紅精是如下式[1]所示茶黃素的氧化聚合物中的至少一種物質
(式中R表示氫原子或3，4，5-三羥苯甲酰基)另外，第6項發明是上述任一項的梭狀芽孢桿菌屬微生物毒素解毒劑，是在上述第5項發明中，茶玉紅精是在具有用化學結構式[2] (式中R’表示3，4，5-三羥苯甲酰基)表示的茶黃素的氧化聚合物中，具有以下結構式[3] (式中R’表示3，4，5-三羥苯甲酰基)表示的結構的化合物中的至少一種物質。
第7，本發明提供含有上述任一項的梭狀芽孢桿菌屬微生物毒素解毒劑的醫藥品。第8，本發明也提供以上述任一項梭狀芽孢桿菌屬微生物毒素解毒劑作為添加劑的飲料食品。
圖1表示遭肉毒梭狀芽孢桿菌侵襲的運動神經骨骼肌系統受到電刺激后的反應。其中，IT表示神經干受到電刺激后產生的肌肉收縮，DT表示直接給予骨骼肌電刺激時產生的肌肉收縮，a表示加入了肉毒梭狀芽孢桿菌神經毒素(1.5nM、BoNT/A1mg/ml溶液15ml加入20ml試管中濃度成1.5nM)，b表示加入了肉毒梭狀芽孢桿菌神經毒素和茶玉紅精的混合物(BoNT/A1mg/ml溶液15ml)，c表示只加入了茶玉紅精(提取液10ml)。
圖2表示試管內加有破傷風毒素的運動神經骨骼肌系統神經干受到電刺激后的反應。其中，a表示加入了破傷風毒素(4mg/ml、TeT×1mg/ml溶液330ml加入20ml試管，濃度成4mg/ml)，b表示加入了破傷風毒素和茶玉紅精的混合物(TeT×1mg/ml溶液330ml)以及茶玉紅精(提取液10ml)，c表示只加入了茶玉紅精(提取液10ml)。
發明的最佳實施方案發明人著眼于紅茶可以有效降低肉毒梭狀芽孢桿菌的神經毒性這一事實，潛心研究，終于發現茶葉中含有的褐色色素成分茶玉紅精具有解除梭狀芽孢桿菌屬菌類所產生毒素的作用，在此發現上進一步研究終于完成了本發明。
茶葉中如前所述具有非常多種類的成分，本發明中的梭狀芽孢桿菌屬微生物毒素解毒劑，其有效成分包括茶玉紅精。此處的有效成分茶玉紅精，是紅茶等的褐色色素成分之一。而且，是前面提到的化合物[1]茶黃素的氧化聚合產物之一。
茶黃素和茶玉紅精都是茶葉中兒茶酸類在多酚氧化酶的作用下被氧化而成的產物，而茶玉紅精應該是由氧化形成的聚合物。茶玉紅精的結構雖然還未能完全明確，但Katiyar等人提出(Katiyar，S.K.和Mukhtar，H.，Carcinogenesis 18，1911-16(1997))，它具有以下結構式[3]表示的結構。 (式中R表示3，4，5-三羥苯甲酰基。)其中，3，4，5-三羥苯甲酰基就是用以下結構式[4]表示的取代基。 本發明涉及含有如上所述的茶玉紅精作為有效成分的梭狀芽孢桿菌屬微生物毒素解毒劑，具體舉例來說就是茶葉、即含有褐色色素成分的紅茶等茶葉的水或熱開水提取物。其中，優選茶葉加工時經提高酶的活性、使兒茶酸類氧化而得到的發酵茶中的提取物。而作為發酵茶，特別優選紅茶。另外，本發明涉及的梭狀芽孢桿菌屬微生物毒素解毒劑也可以由煎茶等非發酵茶二次加工而得的茶葉中提取。
用水或熱水提取，例如可以在常溫(10-30℃左右)或熱水(30℃以上直到沸騰開水)下進行。用60℃以上的熱水提取效率更高。
提取出的水相必要的話也可以先用酯類等有機溶劑洗，然后再用醇提取。
更具體地來說，本發明中，如后述實施例所示，用水或熱水提取以后用醇提取，更優選丁醇、異丙醇、異丁醇、己醇等醇類，其中例如丁醇提取物是適于本發明的解毒劑。
本發明涉及的梭狀芽孢桿菌屬微生物毒素的解毒劑對所有的梭狀芽孢桿菌屬微生物都有效，其中尤其是對肉毒梭狀芽孢桿菌和破傷風菌產生的神經毒素的解毒效果好。另外，本發明中所說的“中和(解毒)”，意思是抑制、減少并進而消除梭狀芽孢桿菌屬微生物毒素所產生的不良作用。
本發明涉及的梭狀芽孢桿菌屬微生物毒素的解毒劑，可以使受梭狀芽孢桿菌污染產生毒素的食品中的梭狀芽孢桿菌屬微生物毒素變得無毒，可以對受梭狀芽孢桿菌感染產生微生物毒素的創傷部位實施涂抹、噴霧、或擦拭等方法，接觸到創傷部位，作為以清洗劑或消毒劑為代表的藥品而使用。
還有，本發明涉及的梭狀芽孢桿菌屬微生物毒素的解毒劑，可以在食品生產過程中添加，由此來預防梭狀芽孢桿菌屬微生物毒素引起的食物中毒。作為這類食品可以是罐頭食品、瓶裝食品、火腿、香腸、魚糕、咸魚飯團、蜂蜜等，當然也不限于此。而且可以在食品整個加工過程、加工、包裝等所有工序中進行添加。
本發明涉及的梭狀芽孢桿菌屬微生物毒素的解毒劑中所含茶玉紅精是由茶葉中提取出來的天然色素成分，所以本發明的解毒劑對人體和環境無害，安全性高，很適合用于醫藥品和食品添加劑。
以下按根據附圖舉出實施例，對本發明的實施方案進一步詳細說明。當然，本發明的應用并不限于以下實施例，在各個細節可以有多種多樣的可能性。
圖1表示運動神經骨骼肌系統受到電刺激的反應。(IT對神經干進行電刺激時的肌肉收縮；DT對骨骼肌直接給予電刺激時的肌肉收縮)結果顯示對骨骼肌直接給予電刺激時，骨骼肌的收縮反應沒有被BoNT阻斷，但對神經干給予電刺激時，骨骼肌的收縮反應被阻止了。(圖1a)而對BoNT和TRB的混合物來說，即使給予神經干電刺激，骨骼肌的收縮反應也未被阻斷(圖1b)而在只有TRB的情況下，可見骨骼肌的收縮未受影響。
由此可見，茶玉紅精會中和肉毒梭狀芽孢桿菌神經毒素的毒性，而且，在只有茶玉紅精的情況下，運動神經骨骼肌系統的肌肉收縮未受影響。<實施例2>茶玉紅精對破傷風毒素的解毒效果和實施例1同樣，在運動神經骨骼肌系統的依然存活標本中分別加入破傷風毒素(TeTx)、TeTx和TRB、僅有TRB，比較運動神經骨骼肌系統對電刺激的反應。
圖2表示運動神經骨骼肌系統對電刺激的反應。
對神經干實施電刺激時，肌肉收縮由于加了TeTx被阻斷了(圖2a)，而在加了TeTx和TRB的情況下肌肉收縮和正常情況一樣進行(圖2b)。而在只加了TRB的情況下，肌肉收縮也未被阻斷(圖2c)。
由此可見，茶玉紅精對破傷風毒素也有解毒效果。<實施例3、4>和<對照例1-4>茶葉提取成分對肉毒梭狀芽孢桿菌神經毒素的解毒效果和實例1、2一樣，在BoNT中分別加入紅茶(實施例3)和煎茶(實施例4)的沸水提取物的情況下，和只有BoNT的情況下，比較運動神經骨骼肌系統受到電刺激時的肌肉收縮反應。
另外，用同樣的方法，在BoNT中分別加入綠茶(對照例1)、單寧酸(對照例2)、兒茶酸(對照例3)以及茶黃素(比較例4)，觀察運動神經骨骼肌系統受到電刺激時的肌肉收縮反應。
表1表示各成分對肉毒梭狀芽孢桿菌神經毒素的解毒效果表1茶葉提取成分對BoNT的解毒效果
+有解毒效果-無解毒效果在加入紅茶、煎茶、茶玉紅精的情況下，可以看到對BoNT有解毒效果，而在加入綠茶、單寧酸、兒茶酸、茶黃素的情況下，未見對BoNT有解毒效果。其中，加入紅茶的情況下對BoNT的解毒效果特別高。由此可見，紅茶提取物對肉毒梭狀芽孢桿菌神經毒素有很好的解毒效果，而且有解毒效果的紅茶和煎茶的提取物中含有茶玉紅精，它是褐色色素成分中的至少一種物質，由此可知就是茶玉紅精對肉毒梭狀芽孢桿菌神經毒素有解毒效果。<實施例5>茶玉紅精對肉毒梭狀芽孢桿菌神經毒素的解毒效果(2)將溶于0.05M乙酸鹽-0.2M氯化鈉緩沖液(pH6.0)、濃度為1mg/ml的肉毒梭狀芽孢桿菌神經毒素各種樣品100μl(＝100μg)按每只小鼠1個單位容量經口給藥。同時，與此相對，將混合好的TRB(上述的提取液)按與毒素溶液等量(1倍量)、2倍量、4倍量，單獨經口給藥，以及與BoNT混合(混合比1倍量、2倍量、4倍量)經口給藥。結果如表2所示。
表2經口給藥BoNT以及TRB的小鼠存活率
BoNT100μg/100μl/個體TRB(n)茶玉紅精n倍量BoNT肉毒梭狀芽孢桿菌神經毒素/A，/B，/EA、B、E型經口給藥BoNT(A型、B型、E型)的小鼠全部死亡。而將BoNT(A型、B型、E型)和TRB(4倍量)混合后對小鼠經口給藥，小鼠100％存活。
給予了1倍量BoNT(A型)和TRB的小鼠全部死亡，給以了2倍量TRB和BoNT混合物的小鼠3/8存活，由此可知，實驗提取出的TRB的4倍量的確可以發揮出對BoNT的解毒效果。
另外，單獨給以TRB的個體全部存活，由此可見在此范圍內的服用量TRB是沒有毒性的。工業實用性正如上述具體說明的，本發明提供了可以使以肉毒梭狀芽孢桿菌和破傷風菌為代表的梭狀芽孢桿菌屬微生物毒素失去毒性、對生物體和環境的安全性高、使用簡單方便的梭狀芽孢桿菌屬微生物毒素解毒劑。
權利要求
1.梭狀芽孢桿菌屬微生物毒素解毒劑，其特征在于至少含有茶玉紅精作為有效成分。
2.如權利要求1記載的梭狀芽孢桿菌屬微生物毒素解毒劑，其特征在于茶玉紅精是茶葉褐色色素成分中的至少一種。
3.如權利要求1或2記載的梭狀芽孢桿菌屬微生物毒素解毒劑，茶玉紅精是茶葉的水或熱水提取物。
4.如權利要求1或2記載的梭狀芽孢桿菌屬微生物毒素解毒劑，茶玉紅精為茶葉的水或熱水提取后的醇提取物。
5.如權利要求1～4中任一項記載的梭狀芽孢桿菌屬微生物毒素解毒劑，茶玉紅精是如下式[1]表示的茶黃素的氧化聚合物中的至少一種 式中R表示氫原子或3，4，5-三羥苯甲酰基。
6.如權利要求1～5任一項記載的梭狀芽孢桿菌屬微生物毒素解毒劑，茶玉紅精是如下式[2]表示的茶黃素的氧化聚合物 (式中R’表示氫原子或3，4，5-三羥苯甲酰基)中具有如下式[3]表示的結構的化合物中的至少一種 式中R’表示氫原子或3，4，5-三羥苯甲酰基。
7.含有如權利要求1～6任一項記載的梭狀芽孢桿菌屬微生物毒素解毒劑的醫藥品。
8.含有如權利要求1～6任一項記載的梭狀芽孢桿菌屬微生物毒素解毒劑作為添加劑的飲料食品。
全文摘要
本發明提供了使用安全又方便的梭狀芽孢桿菌屬微生物產生毒素的解毒劑，是至少含有有效成分茶玉紅精的解毒劑。
文檔編號A61K36/82GK1402718SQ00816443
公開日2003年3月12日 申請日期2000年11月29日 優先權日1999年11月29日
發明者西村昌數, 清水祥夫 申請人:科學技術振興事業團