專利名稱：新型3－硝基吡啶衍生物和含有該衍生物的藥物組合物的制作方法
技術領域：
本發明涉及新型3-硝基吡啶衍生物和包含該衍生物的藥物組合物。更具體地，涉及本發明下列式1所表示的3-硝基吡啶衍生物和其可藥用鹽，它們可以有效地抑制乙肝病毒和人免疫缺陷型病毒的繁殖。本發明還涉及制備3-硝基吡啶衍生物的方法以及含有作為抗病毒有效成分的所述衍生物的藥物組合物。
通式1 其中，R1是甲氧基或 R3是H、羥基、C2-C6二烷基氨基、C2-C6直鏈或支鏈羥烷基、C3-C6直鏈或支鏈二羥基烷基，C3-C6烷氧基烷基，或飽和或不飽和的含有1-3個選自N、O和S的雜原子的5元或6元雜環化合物，該化合物可以是未取代的或用C1-C3烷基取代；R3可含有或不含有不對稱碳原子；R4是H，C1-C4直鏈或支鏈烷基，或C3-C6環烷基；R3和R4兩者可組成含有1-3個選自N、O和S的雜原子的5元或6元雜環，該雜環是未取代的或被C1-C5直鏈或支鏈烷基、C2-C5直鏈或支鏈羥烷基或羥基所取代；R2是吲唑-5-基，或吲唑-6-基；n是在0和3之間的整數。
背景技術：
乙肝病毒(HBV，下文簡稱“HBV”)引發急性或慢性肝炎，其可發展成肝硬化和肝癌。據估計全世界有3億人感染HBV(Tiollais和Buendia，Sci.Am.，264，48，1991)。為尋找預防和治療乙肝的方法，對HBV的分子生物學特性及其與肝病的關系已有許多研究。現已開發出了各種疫苗和診斷藥物，并正努力開辟研究治療乙肝的新途徑。
HBV基因組由編碼聚合酶(P)、表面蛋白(pre-S1、pre-S2和S)、核心蛋白(pre-C和C)和X蛋白的基因組成。在這些HBV基因表達的蛋白中，聚合酶、表面蛋白和核心蛋白是結構蛋白，而X蛋白具有調控功能。
HBV聚合酶基因占全部病毒基因組的80％，可生成94kD大小由845個氨基酸組成的蛋白，該基因在病毒基因組復制中有幾種功能。該多肽包括許多序列，這些序列負責蛋白引物、RNA依賴的DNA聚合酶、DNA依賴的DNA聚合酶和核糖核酸酶H(RNase H)的活性。Kaplan和其同事首先發現了聚合酶的反轉錄酶的活性，這導致在HBV復制機理方面更多的研究。
當病毒粒體表面的抗原蛋白被肝細胞特異性受體識別后，HBV就進入肝臟。在肝細胞內，DNA通過HBV聚合酶作用合成并附著到短鏈上從而形成HBV基因組完整的雙螺旋。完整的HBV雙螺旋DNA基因組由于RNA聚合酶的作用產生前基因組mRNA以及核心蛋白、表面蛋白和調控蛋白的mRNA。使用這些mRNA合成病毒蛋白。聚合酶在病毒基因組產生、與核心蛋白和前基因組mRNA形成被稱為復制體的結構方面具有重要功能。該過程稱為包殼作用。聚合酶在3’末端有谷氨酸重復單元，其對核酸有高親和性，有利于包殼作用。當復制體形成時，(-)DNA鏈由HBV聚合酶的反轉錄作用合成，而(+)DNA鏈則通過DNA依賴的DNA聚合酶作用制成，其反過來又產生前基因組mRNA。重復全過程直到基因組的總數達200-300以上(Tiollais和Buendia，Scientific American，26448-54，1991)。
盡管HBV和HIV是不同的病毒，但它們增殖過程中的復制機理具有一些相同步驟，即病毒RNA的反轉錄形成DNA以及從隨后形成的RNA-DNA雜合體去除RNA鏈。
近來，已報道核苷化合物如lamivudine和泛苜洛弗(famvir)對HBV增殖是有用的抑制劑，雖然它們初始已被開發成治療獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS，下文簡稱“AIDS”)和帶狀皰疹感染的治療劑(Gerin，J.L.，Hepatology，14198-199，1991；Lok，A.S.P.，J.Viral Hepatitis，1105-124，1994；Dienstag，J.L.等，New England Journal of Medicine，3331657-1661，1995)。但是由于高耗費和副作用如毒性、抗性病毒的產生以及停止治療后疾病的復發，這些核苷化合物被當作治療乙肝不好的選擇。在非核苷化合物范圍內尋找乙肝治療劑的努力一直持續著，并且對喹諾酮化合物(EPO 563732，EPO 563734)、三價銥(iridos)化合物(KR 94-1886)和對苯二胺衍生物(KR 96-72384，KR 97-36589，KR 99-5100)已有抗HBV的抗病毒效果報道。盡管付出很多努力，然而治療乙肝的有效藥物仍未開發成功，療法還主要依賴于癥狀治療。
AIDS病誘導體細胞中的免疫功能顯著下降并誘發各種正常人罕見的感染癥狀，并擴散到全身。造成AIDS的人免疫缺陷病毒(HIV，下文簡稱“HIV”)已知主要進攻輔助T細胞，該細胞是免疫系統中具有調節功能的T細胞之一。當輔助T細胞感染HIV病毒并遭受壞死后，人免疫系統就不能正常發揮作用。隨后免疫功能的損傷導致致命的感染和惡性腫瘤的發展。從AIDS病人在美國1981年第一次被發現，但1993年的AIDS病人數在187個國家已增長到85萬以上(WHO1993年報道)。WHO預測到2000年將有3千萬到4千萬以上人口感染HIV，并且他們中的1千萬至2千萬將發展成疾病。
目前，藥物控制HIV的增殖已廣泛應用于治療AIDS。在這些藥物中，疊氮胸苷(zidovudine)以前稱為Azidothymidine，是1987年開發的藥物。當疊氮胸苷無效或由于副作用不能使用時，1991年開發出二脫氧肌苷(didanosine)作為AIDS病人的選擇替代藥。此外，1992年許可扎西他賓(zalcitabine)和疊氮胸苷同時使用。這些藥減輕了癥狀，拖延了受感染個體的疾病發展成典型的AIDS，由此某種程度上延長了患者的生命。但是這些藥物不能完全治愈病人，而且經常出現一些諸如抗性和副作用的問題。
鑒于這些問題，本發明人試圖開發治療乙肝時毒性、副作用和誘發抗性毒株的可能性都小的治療劑。我們發現了具有極好的抗HBV抗病毒效果的非核苷化合物，合成了式1表示的新型3-硝基吡啶衍生物，其對HIV和HBV的增殖顯示了明顯的抑制作用，從而完成了本發明。
本發明的公開本發明提供新型3-硝基吡啶衍生物和包含該衍生物的藥物組合物。更具體地，本發明提供了新型3-硝基吡啶衍生物和其可藥用鹽、制備方法和含有所述衍生物作為有效成分的藥物組合物。本發明的3-硝基吡啶衍生物可抑制乙肝病毒和人免疫缺陷病毒的增殖并可有效用于預防和治療乙肝和AIDS病。
為了實現上述目標，本發明提供了以下式1表示的新型3-硝基吡啶衍生物以及它們的可藥用鹽。
通式1 其中，R1是甲氧基或
R3是H、羥基、C2-C6二烷基氨基、C2-C6直鏈或支鏈羥烷基、C3-C6直鏈或支鏈二羥基烷基、C3-C6烷氧基烷基、或飽和或不飽和的含有1-3個選自N、O和S的雜原子的5元或6元雜環化合物，該化合物可以是未取代的或用C1-C3烷基取代；R3可含有或不含有不對稱碳原子；R4是H，C1-C4直鏈或支鏈烷基，或C3-C6環烷基；R3和R4兩者可組成含有1-3個選自N、O和S的雜原子的5元或6元雜環，該雜環是未取代的或被C1-C5直鏈或支鏈烷基、C2-C5直鏈或支鏈羥烷基或羥基所取代；R2是吲唑-5-基，或吲唑-6-基；n是在0和3之間的整數。
當R3和R4都表示為具有1-3個選自N、O和S的雜原子的5或6元雜環化合物時，n等于0。該雜環是未被取代的或被C1-C5直鏈或支鏈烷基、C2-C5直鏈或支鏈羥烷基或羥基取代；當式1的化合物具有不對稱碳原子時，它們可以R或S旋光異構體存在，因此本發明覆蓋了旋光異構體以及外消旋混合物。
對于本發明中的R2來說的吲唑-5-基和吲唑-6-基分別在通式2和3中給出。
通式2 通式3 在本發明中通式1的化合物能夠以鹽形式使用，而且通過添加可藥用游離酸所制得的酸加合鹽也是有用的。根據本技術領域中的一般實踐，通式1的化合物可轉變成相應的酸加合鹽。在這種情況下，無機酸和有機酸均可用作游離酸。在無機酸中，可采用鹽酸、氫溴酸、硫酸和磷酸。在有機酸中，可采用檸檬酸、乙酸、乳酸、酒石酸、蘋果酸、富馬酸、甲酸、丙酸、草酸、三氟乙酸、苯甲酸、葡糖酸、甲磺酸、甘醇酸、琥珀酸、4-甲苯磺酸、半乳糖醛酸、embonic acid、谷氨酸和天門冬氨酸。
本發明還提供由反應方案1表示的制備3-硝基吡啶衍生物的方法。
反應方案1 其中，X是Cl或OCH3；R2，R3，R4和n與通式1中定義相同。
在本發明中的制備方法包括以下步驟(步驟1)由通式4的2-氯-3-硝基吡啶衍生物與通式5的5-氨基吲唑或6-氨基吲唑在適宜溫度下在堿性條件下，在合適溶劑中進行反應，來合成通式6的3-硝基吡啶衍生物；(步驟2)由步驟1中制備的通式6的3-硝基吡啶衍生物與通式7的合適胺化合物在適宜溫度下在堿性條件下，在合適溶劑中進行反應，來合成通式1的3-硝基吡啶衍生物；
當在通式1的化合物中的R1是甲氧基時，步驟1完成了所需化合物的合成(X＝OCH3)。在這種情況下，本發明包括由通式4的2-氯-6-甲氧基-3-硝基吡啶與通式5的5-氨基吲唑或6-氨基吲唑在堿存在下進行反應來制備通式6的6-甲氧基-3-硝基吡啶衍生物的方法；反應方案2 在反應方案1中的第一步驟中的通式4的化合物是2-氯-6-甲氧基-3-硝基吡啶或2，6-二氯-3-硝基吡啶。
在反應方案1的第二步驟中使用的化學試劑，即，通式4的2-氯-3-硝基吡啶衍生物，通式5的5-氨基吲唑或6-氨基吲唑，和通式7的胺化合物，可通過商業途徑獲得并可以購買到。
在以上步驟2中的通式7的化合物用于將取代基(R3-(CH2)n-NR4-)引入到通式1的化合物中，并根據所需的取代基選擇合適的胺化合物，這能夠由本技術領域中的一般知識來容易地做到。
為了給出在合成過程中有關步驟1的更具體細節，可以使用有機堿，并且普通的叔胺如三乙胺，N，N-二異丙基乙胺，N-甲基嗎啉，N-甲基哌啶，4-二甲基氨基吡啶，N，N-二甲苯胺，2，6-二甲基吡啶，吡啶是優選的。
優選的反應時間和溫度是4-15小時和20-60℃。
為該反應所優選的是選自氯仿，二氯甲烷，乙腈和醇類如甲醇和乙醇中的單種溶劑或溶劑混合物。
在步驟1的反應中生產的通式6的3-硝基吡啶衍生物當中，將在6位上具有氯基團的一種衍生物用于下面的步驟2的反應中。
更詳細地描述在步驟2中的反應。優選的溶劑是選自乙腈，氯仿，二氯甲烷，四氫呋喃，N，N-二甲基甲酰胺，N-甲基吡咯烷酮，吡啶，水和醇類溶劑如甲醇、乙醇和異丙醇中的單種溶劑或溶劑混合物。
優選使用過量的胺化合物(通式7)以提高反應的效率。在通式6的3-硝基吡啶衍生物的合成中的前述步驟1中使用的溶劑是優選的。25-80℃的反應溫度是優選的，雖然這取決于所使用的胺化合物的類型。
在本發明的另一方面，還提供的是用于預防和治療乙肝的治療用的藥物組合物，它含有通式1的3-硝基吡啶衍生物和它們的可藥用鹽類作為有效成分。
本發明還提供用于預防和治療艾滋病的治療用的藥物組合物，它含有通式1的3-硝基吡啶衍生物和它們的可藥用鹽類作為有效成分。
本發明的式1的3-硝基吡啶衍生物對HIV和HBV的增殖有抑制效果，這是因為它們干擾了從病毒RNA反轉錄成DNA時所形成的RNA-DNA雜合體中去除RNA鏈的過程，該反轉錄是在這兩種病毒的復制機理中的常見步驟。
式1的化合物可以口服及通過其它臨床使用途徑給藥；例如，可以靜脈內、皮下、腹膜內或局部施用和以一般藥物形式使用。
對于含有本發明藥物組合物的藥物的臨床使用，式1的化合物能與可藥用賦形劑混合并制成各種可藥用形式；例如，口服片劑、膠囊、trochese、溶液、懸浮液；和注射溶液、懸浮液，或與蒸餾水混合制成速溶的注射溶液的干粉。
式1的化合物的有效量一般為成人10-500mg/kg，優選50-300mg/kg，其可分成數個劑量，如果醫師或藥劑師認為適當的話，優選分成每天1-6個劑量。
實施本發明的最佳方式本發明的實際和目前優選的實施方案是舉例性質的，如下面的實施例中所示。
然而，本技術領域中的那些技術人員會認識到，通過考慮本公開物，可以在本發明的精神和范圍內進行修改和改進。
<制備例1>6-氯-2-(1H-5-吲唑基氨基)-3-硝基吡啶的制備。
向2，6-二氯-3-硝基吡啶(4g)和5-氨基吲唑(2.8g)在乙腈(50ml)中的溶液中添加三乙胺(3.2ml)，然后溶液在20-25℃下反應12小時。反應混合物在室溫下被冷卻，緩慢添加30ml水，然后在20℃下反應1小時。反應混合物被過濾，用乙腈∶水＝1∶1(體積比)的混合溶液(15ml)洗滌反應混合物，并在50℃下真空干燥，獲得所需化合物(4.7g，78％)。
熔點233℃(分解)1H-NMR(DMSO-d6)，ppmδ6.94(d，1H)，7.44(d，1H)，7.56(d，1H)，7.91(s，1H)，8.08(s，1H)，8.53(d，1H)，10.20(s，1H)，13.12(br s，1H)<制備例2>6-氯-2-(1H-6-吲唑基氨基)-3-硝基吡啶的制備。
向2，6-二氯-3-硝基吡啶(4g)和6-氨基吲唑(2.8g)在乙腈(50ml)中的溶液中添加三乙胺(3.2ml)，然后溶液在35-40℃下反應12小時。反應混合物在室溫下被冷卻，緩慢添加水(20ml)，然后在20-25℃下反應1小時。反應混合物被過濾，用乙腈(6ml)和水(15ml)洗滌反應混合物，然后在50℃下真空干燥，獲得所需化合物(4.4g，73％)。
熔點234℃(分解)
1H-NMR(DMSO-d6)，ppmδ7.02(d，1H)，7.20(d，1H)，7.73(d，1H)，7.99(d，2H)，8.55(d，1H)，10.26(s，1H)，13.09(s，1H)<實施例1>2-(1H-5-吲唑基氨基)-6-甲氧基-3-硝基吡啶的制備。
向2-氯-6-甲氧基-3-硝基吡啶(5g)和5-氨基吲唑(3.7g)在甲醇(60ml)中的溶液中添加三乙胺(4.1ml)，溶液然后在25-30℃下反應5小時。反應混合物在室溫下被冷卻，緩慢添加水(30ml)，然后攪拌為0.5小時。反應混合物被過濾，用甲醇(10ml)洗滌，獲得固體產物。固體產物在50℃下真空干燥，獲得所需化合物(6.5g，86％)。
熔點206-208℃1H-NMR(DMSO-d6)，ppmδ3.80(s，3H)，6.32(d，1H)，7.55(m，2H)，8.06(s，2H)，8.43(d，1H)，10.52(s，1H)，13.09(br s，1H)<實施例2>2-(1H-6-吲唑基氨基)-6-甲氧基-3-硝基吡啶的制備。
向2-氯-6-甲氧基-3-硝基吡啶(5g)和6-氨基吲唑(3.9g)在甲醇(60ml)中的溶液中添加三乙胺(4.1ml)，溶液然后在55-60℃下反應14小時。反應混合物在室溫下被冷卻，在25℃下緩慢添加30ml水，然后攪拌0.5小時。反應混合物被過濾，用50％甲醇水溶液(15ml)洗滌和獲得固體產物。固體產物在50℃下真空干燥，獲得所需化合物(6.8g，90％)。
熔點261-264℃1H-NMR(DMSO-d6)，ppmδ3.94(s，3H)，6.39(d，1H)，7.24(m，1H)，7.71(d，1H)，8.01(s，1H)，8.19(s，1H)，8.44(d，1H)，10.62(s，1H)，13.04(br s，1H)<實施例3>2-(1H-5-吲唑基氨基)-6-甲基氨基-3-硝基吡啶的制備。
在有40％甲胺的甲醇溶液(20ml)中添加由實施例1獲得的2-(1H-5-吲唑基氨基)-6-甲氧基-3-硝基吡啶(1g)，溶液在25℃下反應1小時。向反應混合物中緩慢添加H2O(20ml)并攪拌1小時。反應混合物被過濾，用30％甲醇水溶液(5ml)洗滌然后獲得固體產物。固體產物在50-60℃下真空干燥，獲得所需化合物(0.82g，82％)。
熔點238-240℃1H-NMR(DMSO-d6)，ppmδ2.86(d，3H)，6.09(d，1H)，7.51(d，1H)，7.57(d，1H)，8.05(t，2H)，8.24(d，2H)，10.97(s，1H)，13.05(br s，1H)<實施例4>2-(1H-6-吲唑基氨基)-6-甲基氨基-3-硝基吡啶的制備。
在有40％甲胺的甲醇溶液(20ml)中添加由實施例2獲得的2-(1H-6-吲唑基氨基)-6-甲氧基-3-硝基吡啶(1g)，溶液在25-30℃下反應2小時。反應混合物被冷卻和在20℃下攪拌0.5小時。反應混合物被過濾，用甲醇(4ml)洗滌，獲得固體產物。固體產物在40℃下真空干燥，獲得所需化合物(0.79g，79％)。
熔點＞270℃1H-NMR(DMSO-d6)，ppmδ2.98(d，3H)，6.15(d，1H)，7.18(d，1H)，7.69(d，1H)，7.99(s，1H)，8.09(d，1H)，8.35(brs，1H)，8.44(s，1H)，11.14(s，1H)，13.03(br s，1H)<實施例5>2-(1H-5-吲唑氨基)-6-異丙氨基-3-硝基吡啶的制備。
向由實施例1獲得的2-(1H-5-吲唑基氨基)-6-甲氧基-3-硝基吡啶(1g)在甲醇(20ml)中的溶液中緩慢添加異丙基胺(20ml)，并在45℃下反應20小時。反應混合物被冷卻，在25℃下添加水(60ml)，然后攪拌1小時。反應混合物被過濾，用20％甲醇水溶液(5ml)洗滌，然后獲得固體產物。固體產物在50-60℃下真空干燥，獲得所需化合物(1.05g，96％)。
熔點233-235℃1H-NMR(DMSO-d6)，ppmδ1.15(d，6H)，4.03(m，1H)，6.06(d，1H)，7.50(d，2H)，8.05(m，2H)，8.15(t，2H)，10.97(s，1H)，13.06(b rs，1H)<實施例6>2-(1H-6-吲唑基氨基)-6-異丙氨基-3-硝基吡啶的制備。
向由實施例2獲得的2-(1H-6-吲唑基氨基)-6-甲氧基-3-硝基吡啶(1g)在甲醇(20ml)中的溶液中緩慢添加異丙基胺(20ml)，并在45℃下反應45小時。反應混合物被冷卻和在25℃下攪拌1小時。反應混合物被過濾，用甲醇(5ml)洗滌，獲得固體產物。固體產物在40-50℃下真空干燥，獲得所需化合物(0.95g，87％)。
熔點＞270℃1H-NMR(DMSO-d6)，ppmδ1.23(d，6H)，4.17(m，1H)，6.12(d，1H)，7.15(d，1H)，7.68(d，1H)，8.00(s，1H)，8.09(d，1H)，8.28(d，1H)，8.35(s，1H)，11.12(s，1H)，13.08(br s，1H)<實施例7>2-(1H-5-吲唑基氨基)-6-異丁基氨基-3-硝基吡啶的制備。
向由實施例1獲得的2-(1H-5-吲唑基氨基)-6-甲氧基-3-硝基吡啶(1g)在甲醇(20ml)中的溶液中緩慢添加異丁基胺(15ml)，并在45-50℃下反應20小時。反應混合物被冷卻，緩慢添加水(40ml)，然后在25℃下攪拌1小時。反應混合物被過濾，用30％甲醇水溶液(5ml)洗滌，獲得固體產物。固體產物在50-60℃下真空干燥，獲得所需化合物(0.95g，83％)。
熔點230-232℃1H-NMR(DMSO-d6)，ppmδ0.83(d，6H)，1.83(m，1H)，3.11(d，2H)，6.11(d，1H)，7.50(s，2H)，7.99(s，1H)，8.06(d，1H)，8.19(d，1H)，8.39(t，1H)，10.91(s，1H)，13.07(br s，1H)<實施例8>6-環丙基氨基-2-(1H-5-吲唑基氨基)-3-硝基吡啶的制備。
向由實施例1獲得的2-(1H-5-吲唑基氨基)-6-甲氧基-3-硝基吡啶(1g)在甲醇(20ml)中的溶液中緩慢添加環丙基胺(10ml)，并在40-45℃下反應25小時。反應混合物被冷卻，緩慢添加水(40ml)，然后在25℃下攪拌1小時。反應混合物被過濾，用30％甲醇水溶液(5ml)洗滌，獲得固體產物。固體產物在50℃下真空干燥，獲得所需化合物(0.82g，75％)。
熔點237-240℃1H-NMR(DMSO-d6)，ppmδ0.56(m，2H)，0.81(m，2H)，2.81(br s，1H)，6.06(d，1H)，7.50(d，1H)，7.62(d，1H)，8.02(s，1H)，8.09(d，1H)，8.46(s，1H)，8.57(s，1H)，11.02(s，1H)，13.04(br s，1H)<實施例9>6-氨基-2-(1H-5-吲唑基氨基)-3-硝基吡啶的制備。
向由制備例1中獲得的6-氯-2-(1H-5-吲唑基氨基)-3-硝基吡啶(1g)在氯仿(20ml)中的溶液中添加7N氨的甲醇溶液(30ml)并在35-40℃下反應15小時。反應混合物被冷卻，在25℃和減壓下濃縮，然后用甲醇(10ml)處理進行沉淀。反應混合物被過濾，用甲醇∶二氯甲烷＝4∶1重結晶，獲得所需化合物(0.63g，67％)熔點263℃(分解)1H-NMR(DMSO-d6)，ppmδ6.05(d，1H)，7.48(m，2H)，7.56(br s，1H)，7.65(brs，1H)，8.01(s，1H)，8.12(d，1H)，8.28(s，1H)，10.81(s，1H)，13.06(br s，1H)<實施例10>6-(2-羥乙基)甲基氨基-2-(1H-5-吲唑基氨基)-3-硝基吡啶的制備。
向由制備例1獲得的6-氯-2-(1H-5-吲唑基氨基)-3-硝基吡啶(1g)在乙腈(20ml)中的溶液中添加2-(甲基氨基)乙醇(1.4ml)和三乙胺(0.6ml)，然后回流12小時。反應混合物被冷卻，在20-25℃下添加過量的水進行沉淀，過濾后獲得固體物。以上所獲得的固體物用水洗滌，在50℃下真空干燥，用氯仿∶乙醚＝1∶3重結晶，獲得所需化合物(0.7g，62％)。
熔點172-174℃1H-NMR(DMSO-d6)，ppmδ3.14(s，3H)，3.64(m，4H)，4.80(d，1H)，6.36(d，1H)，7.50(s，2H)，8.02(s，1H)，8.15(m，2H)，10.71(d，1H)，13.03(brs，1H)按照與實施例10所用相同的方法，在制備的實施例11-30中制備化合物。在表1中顯示了在制備的實施例11-30中的化合物名稱，產率，重結晶溶液，熔點以及作為起始原料的3-硝基吡啶衍生物(6)和胺化合物(7)。在表2中顯示了在制備的實施例11-30中的化合物的1H-NMR。
表1a
表1b
表2a
表2b
<試驗1>對反轉錄中HBV聚合酶體外活性的抑制作用為了測定式1的化合物對反轉錄中HBV聚合酶活性的影響進行了下列體外試驗。
本發明人提交了有關在E.coli中重組表達并從中分離出的HBV聚合酶、其制備方法以及測定酶活性的方法的專利申請(KR 94-3918，KR96-33998)。在本試驗中采用了如上所述的已在E.coli中表達的HBV聚合酶。
本發明所使用的體外測定HBV聚合酶反轉錄活性的方法如下。基本原理與ELISA相同。將附著生物素或洋地黃毒苷基團的核苷酸包括在底物中，并以附著在過氧化物酶上的抗-DIG的抗體識別該聚合底物。
在被鏈霉抗生物素包被的孔中加入20μlHBV聚合酶、20μl反應混合物(DIG-UTP和生物素-UTP各10μM、46mM Tris-HCl、266mMKCl、27.5mM MgCl2和9.2mM DTT底物/引物雜合體)和20μl測試化合物(添加到1、0.1和0.01μg/ml)，使其在22℃反應15小時。在反應過程中，HBV聚合酶催化DNA合成，附著到核苷酸上的洋地黃毒苷和生物素與涂在孔底部的鏈霉生物素形成鍵。當反應完成后，每個孔用250μl的清洗緩沖液(pH 7.0)洗滌30秒鐘，重復5次以去除殘留雜質。將200μl抗-DIG-POD抗體加入到每個孔中，37℃反應1小時，然后用清洗緩沖液洗滌這些孔以去除雜質。然后每孔加入200μl過氧化物酶底物，即ABTSTM，室溫反應30分鐘。使用ELISA讀數儀于405nm測定吸光度。
使用沒有測試化合物的組作為對照，計算反轉錄中HBV聚合酶活性降低的百分比，結果顯示在表3中。
表3a對反轉錄中HBV聚合酶活性的影響
表3b對反轉錄中HBV聚合酶活性的影響
如表3所示，本發明的化合物在濃度1μg/ml時對HBV聚合酶活性的抑制作用超過90％，具有極好的抑制作用。進一步，預期本發明的化合物不存在如使用核苷酸所觀察的問題如毒性和抗性病毒的產生，因此由于其具有與核苷酸化合物不同的作用機理而可與核苷酸化合物一起施用。
總之，本發明的化合物有效降低了HBV聚合酶的活性，抑制了HBV的復制和增殖，并可用作預防和治療乙肝治療劑。
<試驗2>對生產HBV的細胞系中HBV增殖的抑制作用為了測定式1的化合物對生產HBV細胞系的增殖的抑制效果進行了下列試驗。
為測試抗病毒效果，HBV的復制和增殖在一種人肝癌細胞系HepG2.2.15中測定。
將細胞濃度調整到1×105細胞/ml，并在24-孔細胞培養板的每個孔中加入1ml，然后放于培養箱中于37℃ 5％CO2下培養3-4天直到細胞充分生長，每天更換培養基。當細胞足夠成熟時，加入測試化合物至最終濃度0.01、0.1和1μg/ml。測試化合物加入一周后，培養液在5000rpm離心10分鐘。將25μl上清液轉移到一個新試管中，并往每個試管中加入5μl裂解液
。試管放置37℃ 1小時后，加入30μl的中和溶液
作為反應溶液用于競爭性的聚合酶鏈式反應(PCR)。
采用HBV核心蛋白的基因序列作為基質進行PCR。將1單位Taq聚合酶加入到25pmol每個引物、250μM dNTP、5μl PCR反應液
，進行PCR反應。
由PCR聚合的DNA進行瓊脂糖凝膠電泳分析，為了評價本發明化合物對HBV增殖降低的影響采用成像分析儀(Gel Doc 1000，Bio-Rad)定量分析。
3TC(lamivudine)用作陽性對照，其濃度和測試化合物相同。使用沒有測試化合物的組作為對照，計算HBV增殖降低的百分比，結果顯示在表4中。
表4對HBV增殖的抑制作用
如表4所示，本發明的非核苷酸化合物在濃度1μg/ml時對反轉錄中HBV聚合酶活性具有極好的抑制作用，HBV增殖減少幅度超過80％。進一步，本發明的化合物由于是非核苷酸，不存在如使用核苷酸物質所觀察的問題如毒性和早期產生抗性病毒株。既然本發明化合物作用在變構結合口袋(allosteric binding pockets)，而核苷酸化合物作用在聚合酶活性區域，因此也可預期前者與后者能平行使用。
如上所述，本發明化合物對HBV聚合酶活性具有很好的抑制效果，而聚合酶活性在HBV復制的反轉錄步驟中至關重要。基于該機理，這些化合物能有效控制HBV增殖并可用作預防和治療乙肝的治療劑。
<試驗3>對反轉錄中體外HIV酶活性的抑制作用為了測定式1化合物對反轉錄中HIV酶活性降低的作用，進行了下列離體試驗。
將非放射性反轉錄酶分析試劑盒(Boehringer Mannheim)用于體外測定轉錄酶的活性。將20μl(40ng)HIV轉錄酶和20μl含有基質-引物雜合體、poly(A)oligo(dT)15、DIG(洋地黃毒苷)-dUTP、生物素-dUTP和TTP的反應混合物加入到用鏈霉生物素包被的孔中。也將測試化合物加至最終濃度為0.1和1μg/ml，于37℃反應1小時 此時，憑借HIV逆轉錄酶的作用，從RNA生成DNA，由于洋地黃毒苷和生物素部分附著到核苷酸上，DNA與包被在孔底部的鏈霉生物素形成鍵。
當反應完成后，每個孔用250μl的清洗緩沖液(pH 7.0)洗滌30秒鐘，重復5次以去除殘留雜質。將200μl抗-DIG-POD抗體加入到每個孔中，37℃反應1小時，并如上洗滌去除雜質。每孔加入200μl過氧化物酶底物，即ABTSTM，室溫反應30分鐘。然后使用ELISA讀數儀于405nm處讀取每個溶液的吸光度，并用于定量測定對HIV轉錄酶活性的抑制效果。使用沒有測試化合物的組作為對照，計算HIV反轉錄酶活性降低的百分比，結果顯示在表5中。
表5對HIV反轉錄酶活性的抑制作用
如表5所示，本發明化合物在濃度1μg/ml時對HIV反轉錄酶活性具有很好的抑制作用，降低幅度超過70％。進一步，本發明的化合物由于是非核苷酸，不存在如使用核苷酸物質所觀察的問題如毒性和早期產生抗性病毒株。此外，既然本發明化合物作用在變構結合口袋，而核苷酸化合物作用在聚合酶活性區域，因此本發明化合物可與核苷酸化合物一起使用。
如上所述，本發明化合物對反轉錄中HIV酶活性具有很好的抑制效果，而反轉錄是HIV復制中的一步。基于該機理，這些化合物能有效控制HIV增殖并可用作預防和治療AIDS的治療劑。
<試驗4>細胞毒性試驗為了測定式1化合物是否表現出細胞毒性，采用HepG2細胞和公知的MTT方法進行體外測試，結果顯示在以下表6中。
表6對HepG2細胞的細胞毒性試驗
如上表6所顯示，試驗中所使用化合物的IC50超過100μg/ml，因此可認為沒有細胞毒性。
<試驗5>通過口服給藥測試大鼠中的急性毒性為了檢驗式1的化合物對大鼠是否具有急性毒性，進行下列試驗。
將6周齡的SPF SD系大鼠用在測試急性毒性中。將實施例1-22的化合物懸浮在0.5％的甲基纖維素溶液中，并以2g/kg/15ml的劑量給每組6只大鼠口服一次。觀察大鼠的死亡、臨床癥狀和體重變化，進行血液的血液學測試和生物化學測試，在尸檢過程中用肉眼檢查胸腔和腹部胃腸器官的任何異常癥狀。結果顯示測試化合物不會導致大鼠中任何特異的臨床癥狀、體重變化或死亡。在血液學檢驗、血液的生化檢驗和尸檢中都未發現任何變化。由于本試驗中所用的化合物高達2g/kg水平未導致大鼠任何毒性變化，因此可確定大鼠的LD50值大大超過2g/kg，因此這些化合物經評價確定為安全物質。
工業實用性如上所述，本發明式1的新型3-硝基吡啶衍生物對HBV和HIV的增殖具有顯著的抑制效果而無副作用，可用作預防和治療乙肝和AIDS的治療劑。
進一步，本發明的化合物由于是非核苷酸，不存在如使用核苷酸物質所觀察的問題如毒性和早期發產抗性病毒株。進一步，由于本發明化合物似乎作用在變構結合口袋，而核苷酸化合物作用在聚合酶活性區域，因此本發明化合物可與核苷酸化合物一起使用。
權利要求
1.由通式1表示的3-硝基吡啶衍生物和它們的可藥用鹽類，通式1 其中，R1是甲氧基或 R3是H、羥基、C2-C6二烷基氨基、C2-C6直鏈或支鏈羥烷基、C3-C6直鏈或支鏈二羥基烷基，C3-C6烷氧基烷基，或飽和或不飽和的含有1-3個選自N、O和S的雜原子的雜環化合物，該化合物可以是未取代的或用C1-C3烷基取代；R3可含有或不含有不對稱碳原子；R4是H，C1-C4直鏈或支鏈烷基，或C3-C6環烷基；R3和R4兩者可組成含有1-3個選自N、O和S的雜原子的5元或6元雜環，該雜環是未取代的或被C1-C5直鏈或支鏈烷基、C2-C5直鏈或支鏈羥烷基或羥基所取代；R2是吲唑-5-基或吲唑-6-基；n是在0和3之間的整數。
2.制備通式1的3-硝基吡啶衍生物的方法，包括由反應方案1表示的下列兩個步驟步驟1.由通式4的2-氯-3-硝基吡啶衍生物與通式5的5-氨基吲唑或6-氨基吲唑在堿存在下進行反應，來合成通式6的3-硝基吡啶衍生物；步驟2.由步驟1中合成的由通式6表示的3-硝基吡啶衍生物與通式7的胺化合物反應，制備通式1的3-硝基吡啶衍生物反應方案1 其中，X是氯或甲氧基；R2，R3，R4和n與通式1中定義相同。
3.制備通式6的6-甲氧基-3-硝基吡啶衍生物的方法，按照反應方案2由通式4的2-氯-6-甲氧基-3-硝基吡啶衍生物與通式5的5-氨基吲唑或6-氨基吲唑在堿存在下進行反應，反應方案2 其中，R2與通式1中定義相同。
4.含有權利要求1中的3-硝基吡啶衍生物和它們的可藥用鹽類作為有效成分的乙肝治療劑和預防劑。
5.含有權利要求1中的3-硝基吡啶衍生物和它們的可藥用鹽類作為有效成分的獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)的治療劑和預防劑。
全文摘要
本發明涉及新型3－硝基吡啶衍生物和含有該衍生物的藥物組合物，更具體地說，涉及3－硝基吡啶衍生物和它們的可藥用鹽、制備它們的方法和含有所述化合物作為活性成分的藥物組合物。尤其，本發明的3－硝基吡啶衍生物，由于它們具有抗人類免疫缺陷性病毒(HIV)的增殖以及乙型肝炎病毒(HBV)的抑制活性，能夠用作乙肝和獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)的治療劑和預防劑。
文檔編號A61K31/4439GK1610667SQ00816056
公開日2005年4月27日 申請日期2000年11月27日 優先權日1999年11月27日
發明者尹晟俊, 李常旭, 金南斗, 樸容均, 李根炯, 金種宇, 樸相振, 樸希庭, 申東赫 申請人:同和藥品工業株式會社