作為佐劑的聚氧乙烯脫水山梨醇酯和辛苯昔醇組合及其在疫苗中的應用的制作方法

專利名稱：作為佐劑的聚氧乙烯脫水山梨醇酯和辛苯昔醇組合及其在疫苗中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種新型佐劑系統，所述佐劑系統包含與辛苯昔醇結合的聚氧乙烯脫水山梨醇酯表面活性劑。本發明提供所述新型佐劑、包含所述佐劑的疫苗以及其生產方法和將其配制到疫苗中的方法。也提供了本發明佐劑或疫苗在疾病預防或治療方面的應用。所述佐劑尤其可用作粘膜佐劑，但也是系統有效的。所述佐劑尤其可用于流感疫苗。
除避開對痛苦的注射的需要和相關的因“針頭恐懼”所致的對患者順從的不利影響外，由于已經表明在動物中經粘膜給予抗原在于粘膜表面誘導保護性應答方面的效率更大，而粘膜是許多病原體進入的途徑，因此粘膜接種是吸引人的。另外，已經提出，粘膜接種，例如鼻內接種，可以不僅在鼻粘膜中誘導粘膜免疫，而且在遠端粘膜部位例如生殖器粘膜中也誘導粘膜免疫(Mestecky，1987，Joumal of ClinicalImmunology，7，265-276；McGhee和Kiyono，Infectious Agents andDisease，1993，2，55-73)。盡管在本領域中有許多研究，但適用于人類的安全而有效的佐劑仍有待鑒定。本發明提供對該問題的一種解決方法。
某些非離子表面活性劑的醫藥應用已有描述。例如，已經描述了鼻內給予聚氧乙烯脫水山梨醇酯、聚氧乙烯醚、膽汁鹽和其它滲透增強劑以增強鼻腔中胰島素的吸收(Hirai等1981，International Journal ofPharmaceutics，9，165-172；Hirai等1981，International Journal ofPharmaceutics，9，173-184)。
已經利用了其它非離子表面活性劑制劑。例如，包含或者聚氧乙烯蓖麻油或辛酸/癸酸甘油酯與聚氧乙烯脫水山梨醇一酯和抗原的混合物的疫苗制劑，能夠在局部給予粘膜后誘導系統免疫應答(WO94/17827)。本專利申請公開了，非離子表面活性劑TWEEN20TM(聚氧乙烯脫水山梨醇一酯)和Imwitor742TM(辛酸/癸酸甘油酯)的組合或TWEEN20TM和聚氧乙烯蓖麻油的組合能夠在鼻內免疫后，增強系統免疫應答。在文獻中也已經描述了這種制劑對于增強針對鼻內所給予抗原的免疫應答之影響的細節(Gizurarson等1996.Vaccine Research，5，69-75；Aggerbeck等1997，Vaccine，15，307-316；Tebbey等，ViralImmunol 1999；12(1)41-5)。在WO94/17827所示的實施例(尤其是實施例4)中，增強所述免疫應答所需的TWEEN20TM濃度非常高(36％)，而甚至在有辛酸/癸酸甘油酯的情況下，在28％的濃度下也沒有發生免疫應答的增強作用。
也已經以這樣一種方式配制了非離子表面活性劑，以致形成非離子表面活性劑泡(通常稱為NISV；US5,679,355)。這種非離子表面活性劑的制劑通常在膽固醇存在時的形成脂質雙層囊泡，所述囊泡將抗原捕獲在內部水相中或雙層本身中。
WO96/36352和US5,653,987描述了一種液體藥劑，所述藥劑包含至少兩種吸收增強劑和水，主要用于胰島素的口服傳遞，其中每種吸收增強劑的存在量為所述總制劑的1-10％w/w的濃度。
通常將表面活性劑用于供系統給藥的油乳化佐劑的配制中，起穩定油微滴的作用。例如，聚氧乙烯脫水山梨醇酯(TWEENTM)和脫水山梨醇脂肪酸酯(SPANTM)用來穩定水包油乳液(EP0399843，WO95/17210)。
過去，已經利用Triton X-100或Tween和乙醚的混合物來將流感病毒斷裂，制備了流感病毒疫苗。對這兩種斷裂物(split)系統免疫原性的臨床比較表明它們是相當的(Gross等1981.J.Clin Microbiol 14，534-8)。也研究了其它表面活性劑對所得片段疫苗免疫原性的影響。在胃腸外給藥的比較研究中，Mukhlis等(1984 Vaccine 2，199-203)指出，全病毒比去垢劑斷裂的病毒更具免疫原性，但在不同的去垢劑Triton X-100和溴化十六烷基三甲基銨(CTAB)之間產生了勉強比去垢劑empigen強的免疫原性斷裂物。
本申請人在此介紹一個令人驚訝的發現，即聚氧乙烯脫水山梨醇酯與辛苯昔醇聯合作為一種有效的疫苗佐劑。有利的是，這種組合物可以系統給予，但經粘膜給予時足以誘導系統免疫應答。通過粘膜給予本發明疫苗誘導的免疫應答可以與在系統注射傳統疫苗后觀察到的免疫應答至少一樣強或至少與其相當。
本發明提供了安全而有效的佐劑，它們易于生產，可以或者通過粘膜途徑或者通過系統途徑給予。
在第一個方面，本發明提供包含聚氧乙烯脫水山梨醇酯和辛苯昔醇的佐劑。
另一方面，本發明提供包含按照本發明的佐劑與抗原的疫苗。
特別優選包含按照本發明的佐劑與流感病毒抗原、用于給予粘膜表面、特別是給予鼻粘膜的疫苗組合物。然而，有多種可供選擇的給藥途徑和供按照本發明的疫苗用的其它可能的抗原，在下文中將描述這些抗原。
辛苯昔醇和聚氧乙烯脫水山梨醇酯在“Surfactant systems”編著Attwood和Florence(1983，Chapman and Hall)中有描述。在Merck IndexEntry 6858(第1162頁，第12版，Merck & Co.Inc.，Whitehouse Station，N.J.，USA；ISBN 0911910-12-3)中也描述了辛苯昔醇系列，包括叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100TM)。在Merck Index Entry 7742(第1308頁，第12版，Merck & Co.Inc.，Whitehouse Station，N.J.，USA；ISBN0911910-12-3)中描述了聚氧乙烯脫水山梨醇酯，包括聚氧乙烯脫水山梨醇一油酸酯(TWEEN80TM)。這兩者都可以用其中描述的方法生產，或者從商業來源例如Sigma Inc購買。
供按照本發明的佐劑用的優選辛苯昔醇包括來自Triton系列的其它非離子表面活性劑，例如Triton X-45、、Triton X-102、Triton X-114、Triton X-165、Triton X-205、Triton X-305、Triton N-57、Triton N-101和Triton N-128，但特別優選叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(Triton X-100)。
本發明的佐劑包含一種聚氧乙烯脫水山梨醇酯和一種辛苯昔醇。所述辛苯昔醇最好是叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON-X-100TM)。所述聚氧乙烯脫水山梨醇酯最好是聚氧乙烯脫水山梨醇一油酸酯(TWEEN80TM)。
按照本發明的佐劑還可以有利地包含一種膽汁鹽或膽酸衍生物。
因此，所述佐劑可以包含一種聚氧乙烯脫水山梨醇酯例如聚氧乙烯脫水山梨醇一油酸酯(Tween 80)、一種辛苯昔醇例如叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(Triton X-100)和一種膽汁鹽或膽酸衍生物例如脫氧膽酸鈉或牛磺脫氧膽酸鈉。在一個優選實施方案中，本發明提供一種包含聚氧乙烯脫水山梨醇一油酸酯(Tween 80)、叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(Triton X-100)和脫氧膽酸鈉的佐劑制劑。
最好是，所述佐劑制劑中存在的非離子表面活性劑總濃度低于40％，更優選至多約20％。優選的范圍是在約0.001-20％之間，更優選0.01-10％，最優選至多約2％(w/v)。
所述各種非離子表面活性劑在最終疫苗組合物中的優選濃度如下辛基或壬基苯氧基聚乙氧基乙醇例如Triton X-100或Triton系列中的其它去垢劑0.001％-20％，優選0.001-10％，更優選0.001-1％，最優選0.005-0.1％(w/v)；聚氧乙烯脫水山梨醇酯例如Tween 800.01-1％，最優選約0.0％(w/v)。
所述非離子表面活性劑濃度的特別優選的范圍是Tween 80TM0.01-1％，最優選約0.1％(v/v)；Triton X-100TM0.001-0.1％，最優選0.005-0.02％(w/v)。
本發明的一個方面是包含與辛苯昔醇結合的聚氧乙烯脫水山梨醇酯表面活性劑的疫苗制劑，其中疫苗中存在的抗原未被捕獲在非離子表面活性劑的泡中。
供按照本發明的疫苗用的流感病毒抗原可以是適合于引起免疫應答的任何形式的流感病毒抗原，包括活的或失活的全病毒、斷裂病毒或者由全病毒制備的或通過重組方法制備的亞單位抗原。用于生產抗原的流感病毒可以以常規方法在含胚卵中培養，或所述病毒可以在組織培養物中培養。用于流感病毒組織培養的合適的細胞基質包括例如犬腎細胞，例如MDCK細胞、來自MDCK一個克隆的細胞或MDCK樣細胞；猴腎細胞，例如AGMK細胞，包括Vero細胞；或適合于生產疫苗用流感病毒的任何其它細胞類型。合適的細胞基質也包括人細胞，例如MRC-5細胞。合適的細胞基質不限于細胞系，例如也包括原代細胞，例如雞胚成纖維細胞。
優選包含已經歷一系列純化步驟的斷裂病毒(split virus)的流感病毒抗原制劑。因此，所述抗原制劑可以采用多種不同的商業上適用的方法生產，例如在DD 300 833號和DD 211 444號專利中描述的斷裂流感病毒法，所述專利通過引用結合到本文中。市售的斷裂流感疫苗包括由SmithKline Beecham出售的FluarixTM。
因此，優選的按照本發明的疫苗制劑包含卵或組織培養物來源的流感抗原(優選斷裂流感病毒抗原)與聚氧乙烯脫水山梨醇酯和辛苯昔醇，任選地還包含一種膽汁鹽或膽酸衍生物。最優選這種制劑包含斷裂流感病毒抗原、聚氧乙烯脫水山梨醇一油酸酯(Tween 80)、叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(Triton X-100)和脫氧膽酸鈉。
按照本發明的流感疫苗最好是包含兩種或更多種流感病毒株的多價流感疫苗。最優選的是包含三種病毒株的三價疫苗。傳統的流感疫苗包含三種流感病毒株-兩種A型病毒株和一種B型病毒株。然而，本發明不排除可以用于例如大流行情況下的單價疫苗。大流行流感的單價疫苗最多半含有來自單一A型病毒株的流感抗原。
本發明的疫苗制劑最好用來借助于經粘膜途徑給予所述疫苗來保護或治療易感疾病或患病的哺乳動物，所述粘膜途徑例如口服/口腔含化/腸/陰道/直腸或鼻途徑。這種給予可以微滴、噴霧或干粉形式給予。噴霧或氣霧型疫苗制劑也構成本發明的一部分。腸溶制劑例如用于口服的抗胃液膠囊和顆粒劑、用于直腸或陰道給藥的栓劑也構成本發明的一部分。本發明也可以用來增強用于皮膚(透皮傳遞或經皮傳遞)的抗原的免疫原性。另外，本發明的佐劑可以胃腸外傳遞，例如肌內注射或皮下注射。當供鼻內疫苗用時，就性質而言，本發明的疫苗最好是溶血性的。
根據給藥途徑，可以使用各種各樣的給藥裝置。例如，對于優選的鼻內給藥途徑，可以使用噴霧裝置，例如市售的AccusprayTM(BectonDickinson)。
鼻內應用的優選噴霧裝置是所述裝置的性能不依賴于使用者施加的壓力的裝置。這些裝置被稱為壓力閾裝置(pressure thresholddevice)。僅在達到閾值壓力時才從噴嘴釋放出液體。這些裝置使得更易于達到微滴大小均勻的一致的噴霧。適用于本發明的壓力閾裝置是本領域已知的，例如描述于WO91/13281、EP311863B和EP516636B中，所述文獻通過引用結合到本文中。這類裝置在商業上可得自Pfeiffer GmbH。
優選的鼻內裝置產生范圍為1-200μm、優選10-120μm的微滴(用水作為液體測量)。低于10μm，則有吸入的危險，因此，最好是低于10μm的微滴不超過約5％。大于120μm的微滴的傳播不如較小微滴，因此最好是超過120μm的微滴不超過約5％。
雙劑量傳遞是供按照本發明疫苗使用的鼻內傳遞裝置的再一優選特征。雙劑量裝置含有一個疫苗劑量的兩個分劑量，向每個鼻孔給予一個分劑量。一般所述兩個分劑量在一個小室內，所述裝置的構造允許每次有效地傳遞一個分劑量。
在再一方面，本發明提供一種試劑盒，所述試劑盒包含本文所述的一種鼻內給藥裝置，所述裝置含有一種按照本發明的疫苗制劑。在本發明該方面的一個優選實施方案中，所述鼻內給藥裝置裝有流感疫苗。
對于某些疫苗制劑，可以在所述制劑中包括其它疫苗組分。因此，本發明的佐劑制劑也可以包含膽汁酸或其衍生物，尤其是鹽形式。這些包括膽酸衍生物及其鹽，特別是膽酸的鈉鹽或膽酸衍生物。膽汁酸及其衍生物的實例包括膽酸、脫氧膽酸、鵝脫氧膽酸、石膽酸、熊去氧膽酸、豬脫氧膽酸和衍生物，例如上述膽汁酸的甘氨-、牛磺、氨基丙基(amidopropyl)-1-丙磺酸、氨基丙基-2-羥基-1-丙磺酸衍生物或N，N-雙(3D葡糖酰胺丙基)脫氧膽酰胺(deoxycholamide)。一個特別優選的實例是脫氧膽酸鈉(NaDOC)，它可以存在于最終的疫苗制劑中。
最好是，當制劑為水溶液形式或非囊泡形式的懸浮液時，本發明的佐劑制劑是有利的。這種制劑易于可重復地生產，也易于滅菌(通過450或220nm孔膜終末過濾)以及易于以噴霧形式給予鼻粘膜，而所述佐劑的復雜物理結構不會被降解。
在本發明的又一方面，提供一種制備疫苗的方法，所述方法包括將按照本發明的佐劑與抗原混合。
在再一方面，提供一種誘導或增強受治療者體內免疫應答的方法，所述方法包括將所述抗原和按照本發明的佐劑混合，并且將所述混合物給予所述受治療者。
給予所述受治療者的途徑優選是通過粘膜表面，更優選通過鼻粘膜。當所述疫苗通過鼻粘膜給予時，所述疫苗最好作為噴霧劑給予。在誘導或增強免疫應答的一個優選方法中，通過經鼻給予所述疫苗，誘導系統應答。因此，按照本發明的粘膜疫苗最好是當通過粘膜途徑給予時，能夠誘導系統免疫應答。
本發明還提供聚氧乙烯脫水山梨醇酯和辛苯昔醇在佐劑制劑、特別是在用于患者粘膜的佐劑制劑生產方面的應用。本發明也涉及聚氧乙烯脫水山梨醇酯、辛苯昔醇和抗原在疫苗制劑、尤其是用于粘膜的疫苗制劑生產中的應用。所述抗原最好是流感病毒抗原。
特別優選給予鼻粘膜的佐劑和疫苗。
最好是，按照本發明的疫苗的給予包括給予所述疫苗的一劑誘發疫苗或一劑加強疫苗，例如包含一種流感抗原制劑的流感疫苗的一劑誘發疫苗或一劑加強疫苗。
可以預見，本發明的組合物將可用來配制含有來源于各種各樣來源的抗原的疫苗。例如，抗原可以包括人、細菌或病毒的核酸、來源于病原體的抗原或抗原性制劑、腫瘤來源的抗原或抗原性制劑、宿主來源的抗原包括GnRH和IgE肽、重組產生的蛋白質或肽以及嵌合融合蛋白。
本發明的疫苗制劑最好含有能夠引發針對人類病原體的免疫應答的抗原或抗原性組合物，所述抗原或抗原性組合物來源于HIV-1(例如tat、nef、gp120或gp160)；人皰疹病毒，例如gD或其衍生物、或立即早期蛋白質例如得自HSV1或HSV2的ICP27；巨細胞病毒((尤其是人病毒)(例如gB或其衍生物)；輪狀病毒屬(Rotavirus)(包括減毒活病毒)；EB病毒(例如gp350或其衍生物)；水痘-帶狀皰疹病毒(例如gpI、II和IE63)；或肝炎病毒，例如乙型肝炎病毒(例如乙型肝炎表面抗原或其衍生物)、甲型肝炎病毒、丙型肝炎病毒和戊型肝炎病毒；或者所述抗原或抗原性組合物來源于其它病毒病原體，例如副粘病毒呼吸道合胞病毒(例如F蛋白和G蛋白或其衍生物)、副流感病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、人乳頭瘤病毒(例如HPV6、11、16、18、...)、黃病毒(例如黃熱病毒、登革病毒、蜱傳腦膜炎病毒、日本腦膜炎病毒)或流感病毒(全活病毒或滅活病毒、斷裂流感病毒，在卵或MDCK細胞、或Vero細胞或全流感病毒體中培養的(如R.G1uck，Vaccine，1992，10，915-920中所述)；或其純化的蛋白質或重組蛋白質，例如HA、NP、NA或M蛋白、或其組合)；或者所述抗原性組合物來源于細菌病原體，例如奈瑟氏球菌(Neisseria spp.)，包括淋病奈瑟氏球菌(N.gonorrhea)和腦膜炎奈瑟氏球菌(N.meningitidis)(例如夾膜多糖及其綴合物、運鐵蛋白結合蛋白、乳鐵蛋白結合蛋白、PilC、粘附素)；化膿鏈球菌(S.pyogenes)(例如M蛋白或其片段、C5A蛋白酶、脂磷壁酸質)、無乳鏈球菌(S.agalactiae)、變異鏈球菌(S.mutans)；杜氏嗜血菌(H.ducreyi)；莫拉氏菌(Moraxella spp.)，包括粘膜炎莫拉氏菌(M.cararrhalis)，也稱為粘膜炎布蘭漢氏菌(Branhamella catarrhalis)(例如高分子量和低分子量粘附素和侵染素)；博德特氏菌(Bordetella spp.)，包括百日咳博德特氏菌(B.pertussis)(例如pertactin、百日咳毒素或其衍生物、絲狀血凝素、腺苷酸環化酶、傘毛)、副百日咳博德特氏菌(B.parapertussis)和支氣管敗血性博德特氏菌(B.bronchiseptica)；分枝桿菌(Mycobacerium spp.)，包括結核分枝桿菌(M.tuberculosis)(例如ESAT6、抗原85A、85B或85C)、牛分枝桿菌(M.bovis)、麻風分枝桿菌(M.leprae)、烏分枝桿菌(N.avium)、副結核分枝桿菌(M.paratuberculosis)、恥垢分枝桿菌(M.smegmatis)；軍團菌(Legionellaspp.)，包括嗜肺軍團菌(L.pneumophila)；埃希氏菌(Escherichia spp.)，包括腸毒性大腸桿菌(例如定居因子、熱不穩定毒素或其衍生物、熱穩定毒性或其衍生物)、腸出血性大腸桿菌、腸致病性大腸桿菌(例如志賀菌毒素樣毒素或其衍生物)；弧菌(Vibrio spp.)，包括霍亂弧菌(V.cholera)(例如霍亂毒素或其衍生物)；志賀氏菌(Shigella spp.)，包括索氏志賀氏菌(S.sonnei)、痢疾志賀氏菌(S.dysenteriae)、弗氏志賀氏菌(S.flexnerii)；耶爾森氏菌(Yersinia spp.)，包括小腸結腸炎耶爾森氏菌(Y.enterocolitica)(例如Ypo蛋白)、鼠疫耶爾森氏菌(Y.pestis)、假結核耶爾森氏菌(Y.pseudotuberculosis)；彎曲桿菌(Campylobacter spp)，包括空腸彎曲桿菌(C.jejuni)(例如毒素、粘附素和侵染素)和大腸彎曲桿菌(C.coli)；沙門氏菌(Salmonella spp.)，包括傷寒沙門氏菌(S.typhi)、副傷寒沙門氏菌(S.paratyphi)、豬霍亂沙門氏菌(S.choleaesuis)、腸炎沙門氏菌(S.entertidis)；李斯特氏菌(Listeria spp.)，包括單核細胞增生李斯特氏菌(L.monocytogenes)；螺桿菌(Helicobacter spp)，包括幽門螺桿菌(H.pylori)(例如脲酶、過氧化氫酶、空泡毒素(vacuolating toxin))；假單胞菌(Pseudomonas spp.)，包括銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)；鏈球菌(Staphylococcus spp.)，金黃色鏈球菌(S.aureus)、表皮鏈球菌(S.epidermidis)；腸球菌(Enterococcus spp.)，包括糞腸球菌(E.faecalis)、屎腸球菌(E.faecium)；梭菌(Clostridium spp.)，包括破傷風梭菌(C.tetani)(例如破傷風毒素及其衍生物)、肉毒梭菌(C.botulinum)(例如肉毒桿菌毒素及其衍生物)、艱難梭菌(C.difficile)(例如梭菌毒素A或B及其衍生物)；芽孢桿菌(Baccillus spp.)，包括炭疽芽孢桿菌(B.anthracis)(例如肉毒桿菌毒素及其衍生物)；棒桿菌(Corynebacterium spp.)，包括白喉棒桿菌(C.diphtheriae)(例如白喉毒素及其衍生物)；疏螺旋體(Borrelia spp.)，包括布氏疏螺旋體(B.burgdorferri)(例如OspA、OspC、DbpA、DbpB)、格氏疏螺旋體(B.garinii)(例如OspA、OspC、DbpA、DbpB)、阿氏疏螺旋體(B.afzelii)(例如OspA、OspC、DbpA、DbpB)、B.andersonii(例如OspA、OspC、DbpA、DbpB)、赫氏疏螺旋體(B.hermsii)；埃里希氏體(Ehrlichia spp.)，包括馬埃里希氏體(R.equi)和人粒細胞性埃利希病的病原體；立克次氏體(Rickettsia spp.)，包括立氏立克次氏體(R.rickettsii)；衣原體(Chlamydia spp.)，包括砂眼衣原體(C.trachomatis)(例如MOMP、肝素結合蛋白)、肺炎衣原體(C.pneumoniae)(例如MOMP、肝素結合蛋白)、鸚鵡熱衣原體(C.psittaci)；鉤端螺旋體(Leptospira spp.)，包括問號鉤端螺旋體(L.interrogans)；密螺旋體(Treponema spp.)，包括蒼白密螺旋體(T.pallidum)(例如稀有外膜蛋白)、齒垢密螺旋體(T.hyodusenteriae)、豬痢疾密螺旋體(T.hyodysenteriae)；或者所述抗原或抗原性組合物來源于寄生蟲，例如瘧原蟲(Plasmodium spp.)，包括惡性瘧原蟲(P.falciparum)；弓形蟲(Toxoplasma spp.)，包括鼠弓形蟲(T.gondii)(例如SAG2、SAG3、Tg34)；內阿米巴(Entamoeba spp.)，包括溶組織內阿米巴(E.histolytica)；巴貝蟲(Babesia spp.)，包括田鼠巴貝蟲(B.microti)；錐蟲(Trypanosomaspp.)，包括克魯斯氏錐蟲(T.cruzi)；賈第鞭毛蟲(Giardia spp.)，包括蘭氏賈第鞭毛蟲(G.lamblia)；Leshmania spp.，包括L.major；肺囊蟲(Pneumocystis spp.)，包括卡氏肺囊蟲(P.carinii)；毛滴蟲(Trichomonasspp.)，包括陰道毛滴蟲(T.vaginalis)；血吸蟲(Schisostoma spp.)，包括曼氏血吸蟲(S.mensoni)；或者所述抗原或抗原組合物來源于酵母，例如念珠菌(Candida spp.)，包括白色念珠菌(C.albicans)；隱球菌(Cryptococcus spp.)，包括新型隱球菌(C.neoformans)。
優選的細菌疫苗包含來源于鏈球菌(Streptococcus spp.)包括肺炎鏈球菌(S.pneumoniae)(例如夾膜多糖及其綴合物、PsaA、PspA、鏈球菌溶血素、膽堿結合蛋白)的抗原以及蛋白抗原肺炎鏈球菌溶血素(Biochem Biophys Acta，1989，67，1007；Rubins等，MicrobialPathogenesis，25，337-342)及其突變型去毒衍生物(WO90/06951；WO99/03884)。其它優選的細菌疫苗包含來源于嗜血菌(Haemophilus spp.)包括B型流感嗜血菌(H.influenzae type B)(例如PRP及其綴合物)、不可定型的流感嗜血菌(non typeable H.influenzae)的抗原例如OMP26、高分子量粘附素、P5、P6、蛋白D和脂蛋白D以及絲束蛋白和絲束蛋白衍生肽(US5,843,464)或其多拷貝變異體(varient)或融合蛋白。其它優選的細菌疫苗包含來源于粘膜炎莫拉氏菌的抗原(包括其外膜小泡(outmembrane vesicle)和OMP106(WO97/41731))和來源于腦膜炎奈瑟氏球菌B的抗原(包括其外膜小泡)和NspA(WO96/29412)。
乙型肝炎表面抗原的衍生物是本領域眾所周知的，尤其包括在歐洲專利申請EP-A-414374、EP-A-0304578和EP198-474中描述闡明的那些PreS1、PreS2 S抗原。在一個優選方面，本發明的疫苗制劑包含HIV-1抗原、gp120，尤其是當在CHO細胞中表達時。在再一實施方案中，本發明的疫苗制劑包含以上限定的gD2t。
在本發明的一個具體實施方案中，含有要求保護的佐劑的疫苗包含來源于被認為引起生殖器疣的人乳頭瘤病毒(HPV)的抗原(HPV6或HPV11和其它抗原)和引起宮頸癌的HPV病毒(HPV16、HPV18和其它抗原)。
特別優選形式的生殖器疣預防性或治療性疫苗包含L1粒子或殼粒、以及包含選自HPV6和HPV11的蛋白E6、E7、L1和L2中的一種或多種抗原的融合蛋白。
最優選形式的融合蛋白是WO96/26277中公開的L2E7和GB9717953.5(PCT/EP98/05285)中公開的蛋白D(1/3)-E7。
HPV宮頸感染或宮頸癌的一種優選的預防性或治療性疫苗組合物，可以包含HPV16或18的抗原。例如，L1或L2抗原單體、或作為病毒樣粒子(VLP)一起呈現的L1或L2抗原、或單獨在VLP或殼粒結構中呈現的單獨的L1。這類抗原、病毒樣粒子和殼粒是本來已知的。參見例如WO94/00152、WO94/20137、WO94/05792和WO93/02184。
另外的早期蛋白可以單獨包括或以融合蛋白來包括例如最好是E7、E2或E5；尤其優選的實施方案包括含L1E7融合蛋白(WO96/11272)的VLP。
特別優選的HPV16抗原包含與蛋白D載體融合形成蛋白D-E6或E7融合體的HPV16的早起蛋白E6或E7、或其組合；或者E6或E7與L2的組合(WO96/26277)。
或者，HPV16或18早期蛋白E6和E7可以存在于一個分子中，最好是蛋白D-E6/E7融合體。這種疫苗可以任選地含有來自HPV18的E6和E7中的任一種或兩種，最好是蛋白D-E6或蛋白D-E7融合蛋白或蛋白D E6/E7融合蛋白的形式。
本發明的疫苗可以另外包含來源于其它HPV毒株、優選來自毒株HPV6、11、31、33或45的抗原。
本發明的疫苗可以包含來源于引起瘧疾的寄生蟲的抗原。例如，來源于惡性瘧原蟲的優選抗原包括RTS，S和TRAP。RTS是一種雜種蛋白，包含通過乙型肝炎表面抗原preS2部分的四個氨基酸與乙型肝炎病毒的表面(S)抗原連接的惡性瘧原蟲環子孢子(CS)蛋白的基本上全部的C末端部分。其完整的結構公開于國際專利申請PCT/EP92/02591號中，該專利申請的公布號為WO93/10152，要求英國專利申請9124390.7號的優先權。當在酵母中表達時，RTS作為脂蛋白粒子產生，而當它與HBV的S抗原共表達時，它產生一種稱為RTS，S的混合粒子。TRAP抗原描述于國際專利申請PCT/GB89/00895號中，后者的公布號為WO90/01496。本發明的一個優選實施方案是瘧疾疫苗，其中所述抗原性制劑包含RTS，S和TRAP抗原的組合。可能成為多級(multistage)瘧疾疫苗組分候選者的其它瘧原蟲抗原是惡性瘧原蟲的MSP1、AMA1、MSP3、EBA、GLURP、RAP1、RAP2、鉗合蛋白、PfEMP1、Pf332、LSA1、LSA3、STARP、SALSA、PfEXP1、Pfs25、Pfs28、PFS27/25、Pfs16、Pfs48/45、Pfs230和瘧原蟲屬物種中的其類似物。
或者，所述制劑可以含有一種抗腫瘤抗原，并且可用于癌癥的免疫治療性治療。例如，所述佐劑制劑可和腫瘤排斥抗原一起應用，所述腫瘤排斥抗原例如前列腺癌、乳腺癌、結腸直腸癌、肺癌、胰腺癌、腎癌或黑素瘤的腫瘤排斥抗原。示范性抗原包括用于治療黑素瘤的MAGE 1和MAGE 3抗原或其它的MAGE抗原、PRAME、BAGE或GAGE(Robbins和Kawakami，1996，Current Opinions in Immunology 8，第628-636頁；Van den Eynde等，International Journal of Clinical &Laboratory Research(1997提交)；Correale等(1997)Journal of theNational Cancer Institute 89，第293頁)。實際上，這些抗原在各種各樣的腫瘤類型中表達，例如在黑素瘤、肺癌、肉瘤和膀胱癌中表達。其它腫瘤特異性抗原適于與本發明的佐劑一起使用，所述抗原包括但不限于前列腺特異性抗原(PSA)或Her-2/neu、KSA(GA733)、MUC-1和癌胚抗原(CEA)。因此，在本發明的一個方面，提供一種包含按照本發明的佐劑組合物和一種腫瘤排斥抗原的疫苗。
另外，在許多癌癥的治療中或在immunocastration中，所述抗原可以是自身肽類激素，例如一種短的10個氨基酸長的肽-全長促性腺素釋放激素(GnRH，WO95/20600)。
可以預見，本發明的組合物可用于配制含疏螺旋體來源之抗原的疫苗。例如，抗原可以包括核酸、病原體來源的抗原或抗原性制劑、重組產生的蛋白或肽、以及嵌合融合蛋白。特別是，所述抗原是OspA。OspA可以是借助于宿主細胞(大腸桿菌)而呈脂質化(lipidated)狀態的稱為(Lipo-OspA)的完整的成熟蛋白或非脂質化衍生物。這類非脂質化衍生物包括非脂質化NS1-OspA融合蛋白，它具有流感病毒非結構蛋白(NS1)的N末端的前81個氨基酸和完整的OspA蛋白，而另一種-MDP-OspA是攜帶3個額外N末端氨基酸的非脂質化形式的OspA。
本發明的疫苗可以用于預防或治療變態反應。這類疫苗將包含變應原特異性抗原(例如Der p1)和變應原非特異性抗原(例如來源于人IgE的肽，包括但不限于stanworth十肽(EP0477231B1))。
將每劑疫苗中蛋白質的量選定為在典型疫苗中誘導免疫保護性應答而無顯著不利副作用的量。根據使用哪種具體的免疫原和將其如何呈遞，則這種量將有所不同。一般而言，預期每劑將包含1-1000μg蛋白質、優選1-500μg、優選1-100μg、最優選1-50μg。通過涉及觀測受治療者體內的適當免疫應答的標準研究，可以確定具體疫苗的最適量。在初次接種后，受治療者可以接受一次或數次適當間隔的加強免疫。
本發明的疫苗也可以通過口服途徑給予。在這種情況下，所述藥學上可接受的賦形劑也可以包括抗酸緩沖劑或腸溶膠囊或微粒劑。本發明的疫苗也可以通過陰道途徑給予。在這種情況下，所述藥學上可接受的賦形劑也可以包括乳化劑、聚合物例如CARBOPOL以及其它已知的陰道乳膏和栓劑的穩定劑。本發明的疫苗也可以通過直腸途徑給予。在這種情況下，所述賦形劑也可以包括蠟和本領域已知的用于形成直腸栓劑的聚合物。
本發明的制劑既可以用于預防目的，又可以用于治療目的。因此，本發明提供一種治療易患或患有傳染病或癌癥或變態反應或自身免疫病的哺乳動物的方法。在本發明的再一方面，提供本文所述的用于醫藥的一種佐劑組合和一種疫苗。New Trends and Developments inVaccines，Voller等編著，University Park Press，Baltimore，Maryland，U.S.A.1978全面地描述了疫苗制劑。
在本發明的一個替代的相關實施方案中，本發明的佐劑還可以與其它佐劑聯合，所述其它佐劑包括霍亂毒素及其B亞基、單磷酰基脂質A及其無毒衍生物3-脫氧-酰化單磷酰基脂質A(描述于英國專利GB2,220,211號)、免疫學活性皂苷部分例如來源于南美皂樹QuillajaSaponaria Molina之樹皮的Quil A及其衍生物(例如QS21，美國專利號5,057,540)和寡核苷酸佐劑系統CpG(描述于WO 96/02555)、尤其是5’TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT3’(SEQ ID NO.1)。
通過下面的實施例說明本發明，但本發明不限于以下的實施例。在以下實施例中，我們使用全蛋培養的、用甲醛滅活的流感病毒或TWEEN-醚破碎的病毒或NaDOC破碎的蛋培養并補充以Triton X-100的病毒。Tween-80和Triton X-100的濃度示于實施例中。實施例1，用來測量血清中抗體(Ab)應答的方法用于測量流感特異性血清Ig Ab的ELISAMaxisorp Nunc免疫平板用50μl/孔在PBS中稀釋的1μg/mlβ-丙酸內酯(BPL)滅活的流感病毒的HA(由SSD GmBH廠商供應，Dresden，Germany)于4℃包被過夜。所述平板上的游離位點用飽和緩沖液即含有1％BSA、0.1％聚氧乙烯脫水山梨醇一月桂酸酯(TWEEN 20)的PBS封閉(1小時，37℃)。然后，將按標準曲線加入的參比血清(具有以ELISA單位/ml表示的中點效價的血清，置于A行中)和血清樣品(始于1/100的稀釋度，置于B-H行中)的2倍連續稀釋液于37℃溫育1小時30分鐘。然后用洗滌緩沖液(PBS，0.1％聚氧乙烯脫水山梨醇一月桂酸酯(TWEEN 20))洗滌(×3)平板。然后，將用飽和緩沖液以1/3000稀釋的生物素化的山羊抗人Ig(Amersham)(50μl/孔)于37℃溫育1小時30分鐘。經3次洗滌和隨后加入鏈霉抗生物素蛋白-辣根過氧化物酶綴合物(Amersham)后，將平板洗滌5次，并于室溫下將平板與50μl/孔的顯色緩沖液(OPDA 0.4mg/ml(Sigma)和H2O20.03％，在50mM pH 4.5的檸檬酸緩沖液中)一起保溫20分鐘。加入50μl/孔2N硫酸而終止顯色。用Biorad 3550免疫讀出儀于492nm和630nm讀出光密度。用SoftMaxPro軟件，根據4參數數學方法計算抗體的效價。小鼠中流感特異性血清Ab的血凝抑制(HAI)活性首先用100μl0.5M硼酸鹽緩沖液(pH9)和125μl Dade Behring購買的高嶺土于室溫(RT)下處理血清(25μl)20分鐘。離心(30分鐘，3000RPM或860g)后，取100μl上清液(相當于血清的1/10稀釋液)，并將其與0.5％雞紅細胞一起于4℃孵育1小時。以3200RPM(970g)離心10分鐘后，收集上清液。進行這兩個操作以消除血清中含有的天然血凝因子。然后，在96孔Greiner板中25μl經處理的血清用25μl PBS稀釋(2倍連續稀釋，始于1/20)。以4個血凝單位(即引發紅細胞凝集的最大稀釋度的四分之一的稀釋度)BPL滅活的全病毒(25μl/孔)，于室溫在攪拌下達30分鐘。最后將平板于4℃下保持過夜，然后進行讀出。HAI效價相當于抑制病毒誘導的血凝的最低血清稀釋度的倒數。實施例2，TWEEN80和Triton在小鼠體內對滅活的完整流感病毒的鼻內免疫原性的影響過去，主要在未經攻擊的動物體內進行其它流感疫苗(例如加入佐劑的胃腸外疫苗、基于DNA的疫苗或粘膜傳遞的疫苗)的臨床前評價。一般而言，從這些研究中獲得的有前景的結果未在人體中得到證實。這可能是由于這樣一個事實與未經攻擊的動物不一樣，大多數成人在接種之前已經通過天然感染而在免疫學上“接觸過抗原”。因此，在動物模型中評價鼻內流感疫苗的最佳方式可能是測試其在經鼻接觸過抗原的動物體內加強預先建立的免疫應答的能力。我們在本實施例中評價了TWEEN-80和Triton X-100對這樣的應答的影響。
在第0天，通過用移液器(在麻醉下)在每個鼻孔中給予10μl PBS中含有的2.5μg BPL滅活的A/Beijing/262/95流感病毒之HA，在雌性Balb/c小鼠(8周齡)中進行抗原接觸。28天后，用20μl溶液(每個鼻孔10μl，用移液器以小滴形式傳遞)給小鼠(6只動物/組)進行鼻內加強(在麻醉下)，所述溶液是在或者APBS；或者BTWEEN80(0.11％)加Triton X-100(0.074％)中含有5μg BPL滅活A/Beijing/262/95流感病毒之HA的溶液；或者通過C肌內注射1.5μg HA的流感疫苗，進行加強。抗原由SSD GmBH廠商(Dresden，Germany)供應。如實施例1中所述，測量血清中的HAI Ab應答。如

圖1所示，當用TWEEN80和Triton配制時，鼻內傳遞的滅活流感病毒能夠與傳統胃腸外流感疫苗同樣有效地加強預先建立的系統HAI Ab應答。然而，在缺乏TWEEN80和Triton的情況下，鼻內給予的相同的抗原，其免疫原性顯著較低。實施例3具有TWEEN80和TRITON X-100的斷裂流感病毒鼻內疫苗與經批準的傳統胃腸外疫苗(FluarixTM)在健康成年受治療者體內的免疫原性的比較。用于該項研究的制劑已經評價了蛋來源的斷裂流感抗原的兩種制劑(A、B)。A是一種鼻內制劑，而B是肌內給予的FluarixTM/α-Rix。所述制劑含有三種由WHO建議的1998/1999季節的病毒株制備的滅活斷裂病毒體抗原。
用于鼻內傳遞的裝置是Becton Dickinson的AccusprayTM鼻內注射器。在每個鼻孔內噴100μl A制劑。所述制劑的組成鼻內制劑(A)含有以下滅活斷裂病毒體1. 30μg HA A/Beijing/262/95(H1N1)2. 30μg HA A/Sydney/5/97(H3N2)3. 30μg B/Harbin/7/94的HA和磷酸緩沖鹽溶液pH 7.4±0.1、Tween 80 0.1％、Triton X-100 0.015％、脫氧膽酸鈉0.0045％和低于35μg/ml的硫柳汞。
一劑的體積是200μl(每個鼻孔100μl的分劑量)。
對比物FluarixTM/α-Rix是SmithKline Beecham Biologicals的市售的滅活三價斷裂流感疫苗。肌內給予500μl的劑量。
該劑量含有15μg上述三種病毒株的HA、500-1000μg/ml(0.05％-0.1％)的Tween 80、50-170μg/ml(0.005％-0.017％)的Triton X-100、最高100μg/ml的脫氧膽酸鈉、100μg/ml硫柳汞和pH 6.8-7.5的磷酸緩沖鹽溶液。免疫原性研究一個開放式、有對照和隨機的研究，評價用Tween 80和TritonX-100配制的斷裂流感鼻內疫苗與傳統胃腸外疫苗(即FluarixTM)相比的免疫原性。20位健康的成年受治療者(年齡為18-40歲)接受一劑FluarixTM，10位受治療者接受一劑鼻內流感疫苗。所述鼻內制劑(200μl)含有以下的滅活病毒體30μg血凝素A/Beijing/262/95(H1N1)、30μg血凝素A/Sydney/5/97(H3N2)、30μg血凝素B/Harbin/7/94與磷酸緩沖鹽溶液(pH 7.4±0.1)、Tween 80(0.1％)、Triton X-100(0.015％)、脫氧膽酸鈉(0.0045％)和硫柳汞(＜35μg/ml)。
對于誘發的局部和全身性癥狀有8天的隨訪期，這兩種疫苗在安全性和反應原性方面都能被很好地耐受。沒有報道與接種相關的嚴重不利事件。
通過評價血清血凝抑制(HI)效價以確定血清陽轉率(定義為與第0天相比，第21天時就每種疫苗株而言血清HI效價至少提高3倍的疫苗的百分比)、轉化系數定義為與第0天相比，第21天時就每種疫苗株而言血清HI幾何平均效價(GMT)的增加倍數)和血清保護率(定義為接種后血清HI效價≥40(對于每種疫苗株)的疫苗的百分比，血清HI效價≥40被認可為指示保護作用)，檢驗所述疫苗的免疫原性。一般而言，流感疫苗對于每種病毒株而言，必須血清陽轉率大于或等于40％，血清保護率大于或等于70％，而轉化系數大于或等于2.5，以便滿足國際規章的要求。這適用于18-60歲的成人；老年人適用不同的標準。
另外，通過酶聯免疫吸附測定(ELISA)評價粘膜IgA抗體的應答。
在表1中可以看到在給予一劑FluarixTM或所述鼻內制劑后21天的HI血清陽性率、血清陽轉率和血清保護率。表1在給予1劑后21天時的HI血清陽性率、血清陽轉率和血清保護率
血清陽性(n，％)效價≥10的受治療者的數目和百分率血清保護(n，％)效價≥40的受治療者的數目和百分率血清陽轉(n，％)從第0天至第21天效價增加至少4倍的受治療者的數目和百分率在所有情況下，轉化系數(接種后血清HI GMT增加的倍數)大于2.5，這是成功的流感疫苗所要求的水平。
在表2中可以看到在第21天和第0天之間特異性粘膜IgA抗體/總粘膜IgA抗體之比增加1倍或3倍的受治療者的百分率(一劑)。表2在第21天和第0天之間特異性IgA抗體/總IgA抗體之比增加1倍或3倍的受治療者的百分率(一劑)。
總結以上列表顯示的免疫原性結果表明，在一劑后21天時，所述鼻內制劑導致的血清陽性、血清陽轉和血清保護的水平與由傳統胃腸外疫苗(FluarixTM)所導致的類似。在一劑后，所述鼻內制劑引起的粘膜IgA應答比傳統胃腸外疫苗(FluarixTM)所引起的要好。
權利要求
1.一種聚氧乙烯脫水山梨醇酯與辛苯昔醇的組合的用途，用于生產應用于患者粘膜表面的佐劑。
2.權利要求1的用途，其中所述聚氧乙烯脫水山梨醇酯是聚氧乙烯脫水山梨醇一油酸酯(TWEEN80TM)。
3.權利要求1或權利要求2的用途，其中所述辛苯昔醇是叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100TM)。
4.權利要求1-3中任一項的用途，還包括一種膽汁鹽或膽酸衍生物。
5.權利要求1-4中任一項的佐劑的用途，所述佐劑與抗原一起用于生產供粘膜給藥的疫苗。
6.權利要求5的用途，其中所述抗原選自人免疫缺陷病毒、水痘帶狀皰疹病毒、1型單純皰疹病毒、2型單純皰疹病毒、人巨細胞病毒、登革病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒或戊型肝炎病毒、呼吸道合胞病毒、人乳頭瘤病毒、流感病毒、Hib、腦膜炎病毒、沙門氏菌屬(Salmonella)、奈瑟氏球菌屬(Neisseria)、疏螺旋體屬(Borrelia)、衣原體屬(Chlamydia)、博德特氏菌屬(Bordetella)、鏈球菌屬(Streptococcus)、支原體屬(Mycoplasma)、分枝桿菌屬(Mycobacteria)、嗜血菌屬(Haemophilus)、瘧原蟲屬(Plasmodium)或弓形蟲屬(Toxoplasma)、stanworth十肽；或腫瘤相關抗原(TMA)、MAGE、BAGE、GAGE、MUC-1、Her-2 neu、LnRH、CEA、PSA、KSA或PRAME。
7.權利要求6的用途，其中所述抗原是來源于流感病毒的抗原或抗原性制劑。
8.權利要求7的用途，其中所述抗原性制劑是斷裂流感病毒制劑。
9.權利要求7或權利要求8的用途，用于生產預防流感的疫苗。
10.權利要求5-9中任一項的用途，用于生產供醫藥用的疫苗。
11.一種生產疫苗的方法，所述方法包括將(a)一種聚氧乙烯脫水山梨醇酯、(b)一種辛苯昔醇和(c)一種抗原混合，并且提供供粘膜給藥的一個疫苗劑量的疫苗。
12.權利要求11的方法，其中所述疫苗在鼻內氣霧劑或噴霧劑裝置中提供。
13.一種噴霧劑或氣霧劑裝置，更尤其是雙劑量裝置，所述裝置裝有包含一種聚氧乙烯脫水山梨醇酯、一種辛苯昔醇和一種抗原的疫苗。
14.權利要求13的噴霧劑或氣霧劑裝置，其中所述抗原是流感抗原或抗原性制劑。
15.權利要求14的噴霧劑或氣霧劑裝置，其中所述抗原性制劑是斷裂流感病毒制劑。
16.一種治療患有或易患病原體感染或癌癥或變態反應的哺乳動物的方法，所述方法包括給予所述哺乳動物的粘膜安全而有效量的疫苗組合物，所述疫苗組合物包含一種聚氧乙烯脫水山梨醇酯、一種辛苯昔醇和一種抗原。
17.權利要求16的方法，其中所述疫苗經鼻內給予。
18.權利要求16或權利要求17的方法，其中所述疫苗是流感病毒疫苗，所述流感病毒疫苗包含一種流感抗原或抗原性制劑，例如一種斷裂流感病毒制劑。
全文摘要
本發明涉及一種新型佐劑系統，所述佐劑系統包含與辛苯昔醇組合的聚氧乙烯脫水山梨醇酯表面活性劑，本發明也涉及包含所述佐劑系統連同抗原的疫苗。還提供生產所述佐劑和疫苗的方法以及所述佐劑和疫苗在疾病預防或治療方面的應用。
文檔編號A61K39/12GK1391483SQ00816014
公開日2003年1月15日 申請日期2000年9月22日 優先權日1999年9月24日
發明者M·弗里德, P·赫爾曼德, V·亨德里克斯 申請人:史密絲克萊恩比徹姆生物有限公司