鑒定適于移植的細胞的制作方法

專利名稱：鑒定適于移植的細胞的制作方法
技術領域：
本發明涉及適合移植入脊椎動物腦中的細胞的鑒定。具體地說，本發明涉及在移植入腦之后能修復神經損傷的多能神經細胞的鑒定。
背景技術：
人們越來越了解到，脊椎動物的腦損傷能通過細胞移植技術得到修復。一般，移植入受損腦中的細胞是神經干細胞，例如，能分化成具有神經細胞表型的細胞的多能神經上皮干細胞。
例如，Sinden等人，神經科學(neuroscience)(1997)81599-608,公開，可以將條件性永生化的海馬神經上皮干細胞移植入局部缺血損傷的海馬，以用于提高空間學習。也可參閱WO-A-97/10329。
但是，發現不是所有的神經干細胞都能通過移植，成功地修復神經損傷。
例如，雖然MHP36細胞(Sinden等人，supra)的確有助于修復，但另一個與之明顯類似的細胞系，MHP15，卻不能修復損傷。盡管這兩個MHP細胞系都有相同的組織來源(即海馬)，并且兩者都是多能神經前體細胞系，即，這兩個細胞系都有能力形成全部種類的腦細胞，包括神經元、星形膠質細胞和少突神經膠質細胞，但卻存在上述差異。
因此，能在早期鑒定適合用于移植，或者能修飾細胞系，從而獲得成功的移植和修復的細胞，這是大有益處的。
發明概述本發明以適合移植和修復的細胞能根據它們的基因表達圖譜得到鑒定的認識為基礎。
舉例，本發明運用了稱為差異顯示(DD)的技術，來研究修復和非修復細胞系的差別。差異顯示常被用于顯現兩個或更多的細胞系之間在基因表達上的差別，并且發現修復細胞系之間有著非常相似的基因表達圖譜，而與非修復細胞系之間的圖譜有很大差別。這代表一個重要而出乎意料的發現，因為除了它們之間修復能力的不同外，這些細胞系通常在形態學、生長特點和對生長因子的反應性上是驚人的相似。
根據本發明的一個方面，選擇適合移植入脊椎動物受損腦中的細胞的方法，包括(i)分離是或有能力分化成具有神經細胞表型的細胞的細胞；(ii)獲得這些細胞的基因表達圖譜；(iii)將這些細胞的基因表達圖譜與已知適合移植的對照細胞的基因表達圖譜比較；并且(iv)選擇與對照細胞具有相似基因表達圖譜的細胞。
在本發明的一個實施方案中，對照細胞來自于MHP36細胞系。步驟(ii)采用差異顯式。
本發明不僅對鑒定適合移植的細胞有用，而且可被用于鑒定可能參與或不參與決定神經細胞能否被修復的基因或基因產物。
根據本發明的第二個方面，鑒定參與決定移植入受損腦中時神經細胞能否幫助修復的基因的方法，包括(i)分離是或有能力分化成具有神經細胞表型的細胞的細胞；(ii)獲得這些細胞的基因表達圖譜；(iii)將這些細胞的基因表達圖譜與已知適合移植的對照細胞的基因表達圖譜比較；并且(iv)分離與對照細胞表達相同(或不同)的基因。
運用這個方法，已有可能鑒定許多在修復細胞系中表達，而在非修復細胞系中不表達的基因。
根據第三個方面，選擇適合移植入受損腦中的細胞的方法，包括確定在此鑒定為SEQ ID NOS.1至5的任何基因序列的存在情況。
發明詳述本發明提供了一個方便的方法，來鑒定不能用于在受損的脊椎動物腦中進行移植和修復的細胞。運用差異顯式技術，可參照對照篩選細胞系，并選擇合適細胞系用于進一步發展。
雖然已知有其它技術可獲得基因表達圖譜，但差異顯式技術是優選的。簡單的說，這個技術依賴于從一群細胞中分離mRNA，然后據此確定特定基因的表達水平。這通常是使用反轉錄來獲得拷貝DNA(cDNA)，再通過專一和半定量的引物序列共同擴增來完成。然后將這個結果與對照比較，以評價基因表達的差異。
用于實施差異顯式的試劑盒可以購買得到。
此方法中用到的細胞必須具有分化成有神經細胞表型的細胞的能力，即，分化成的細胞應具有神經元、星形膠質細胞或少突神經膠質細胞表型。優選地，在未分化狀態的細胞是多能的，即它們具有發育成上述神經細胞表型中的至少兩種的能力。多能細胞是已知的，并且本領域技術人員清楚這些細胞的方法。
差異顯式技術可以對已分化或未分化狀態的細胞進行。但是，優選的是在該操作過程中保持細胞處于未分化狀態。保持細胞處于未分化狀態的條件在本領域是已知的，包括利用生長因子的培養方法、用于插入如癌基因或條件性可誘導的癌基因進入細胞的重組DNA技術。
本發明提供了一個方便的方法，可用來鑒定能用于在受損的脊椎動物腦中進行移植和修復的細胞。運用本發明的方法，可以參照對照篩選細胞系，并選擇合適的細胞系用于進一步開發。
在非修復細胞系中差異表達的基因可以得到鑒定。可通過例如定點突變修飾這些基因，使這些基因失活，從而產生新的適合移植的細胞系。例如，可破壞Pax6或者3R2C基因，以制備適于移植的細胞。技術人員明確修飾或失活這些基因的方法。
修飾過的細胞系，或經本發明方法鑒定為適合移植的細胞系，可以用于常規移植方法。例如，Sinden等人，supra，說明了用于移植入小鼠腦中的干細胞的制備。
本發明涉及本發明的細胞在制備適于治療脊椎動物腦損傷的組合物中的使用。依據用于治療目的的細胞的性質，采用適當的遞送細胞進入腦中的制劑，技術人員對此是清楚的。根據常規制劑方法，技術人員知道治療使用的合適的細胞量，以及適合的賦形劑、稀釋劑或載體。
下述的實施例說明用差異顯式實驗來鑒定細胞系MHP36、MHP15、MHP3和SVE10的基因表達圖譜。
實施例將細胞系于175cm3錐形瓶中，在含有bFGE的標準MHP培養基中于33℃培養。使細胞達到90％匯合，之后轉移細胞系到39℃，在缺乏干擾素的條件下進一步培養七天。
用20mlHBSS(GibcoBRL)洗滌細胞5分鐘。加入20ml Trizol(LifeTechnologies)，37℃孵育10分鐘，使細胞裂解。然后將溶胞產物轉移到一個50ml Falcon管(Stardts)中，加入5ml氯仿。用力混合試管中的物質1分鐘，然后通過在4,000轉/分的條件下離心15分鐘分離各相。將上層水相轉移到一個新的50ml試管中，加入7ml異丙醇。將試管在-20℃下放置1小時，使RNA沉淀。在4,000轉/分的條件下離心20分鐘，RNA成片狀沉淀。用70％乙醇(由DEPC處理的水配成)洗滌片狀沉淀，在上述條件下離心，并室溫下風干10分鐘。然后將片狀沉淀重新懸浮在439μl的DEPC處理的水中，轉移到沒有核糖核酸酶(RNase)的Eppendorf管里。
為除去RNA樣品中的任何污染DNA，在重新懸浮的RNA溶液中加入下列物質MgCl2至終濃度為5mM；DDT至終濃度為100mM；核糖核酸酶抑制劑500單位和脫氧核糖核酸酶I(DNaseI)700單位。然后37℃孵育1小時。加入等體積的酸性苯酚/氯仿/異戊醇(125∶24∶1)，渦流式混合1分鐘，然后在14,000轉/分(4℃)的條件下離心6分鐘，純化RNA。將得到的上層水相轉移到一個新的Eppendorf管中，重復酚/氯仿抽提，直到界面清晰。加入8M LiCl至最后的水層，使之達到終濃度為2.5M，然后將試管置于-20℃過夜。
在14,0000轉/分(4℃)的條件下離心15分鐘，使RNA成片狀沉淀。用1ml 70％的乙醇(DEPC)洗滌片狀RNA，在空氣中干燥5分鐘。然后將RNA重新懸浮在100μl DEPC水中。通過測定260nm和280nm吸收值確定RNA的濃度和純度。然后稀釋RNA，獲得濃度為200ng/μl的等分試樣，將其保存在-70℃。
差異顯式分析所有3’端錨定引物、5’端隨機引物均獲自Genomyx HieroglyphmRNA profile試劑盒制備。差異顯式方法可分為三步cDNA合成、PCR擴增和凝膠電泳。
cDNA第一條鏈合成通過Qiagen Omniscript反轉錄酶進行。
取12種Hieroglyph寡聚(dT)錨定的3’引物中的一種和400ng總RNA，組成一個20μl的反應體系，利用它產生足夠量的cDNA。將相同寡聚(dT)引物與所有四種Hieroglyph隨機5’引物配對組合，利用上述cDNA進行雙份差異顯式PCR(differential displayPCR，DD-PCR)。
將2μl濃度為200ng/μl的RNA溶液加到0.2ml薄壁PCR管中，同時加入2μl Hieroglyph T7(dT12)錨定引物(AP)(2μM)。70℃加熱5分鐘，然后置于冰上。向變性RNA/引物溶液中加入10×Omniscript反轉錄酶(RT)緩沖液，2μl；5mM dNTP’s，2μl；0.1M DTT；0.5μl RNASEOUT核糖核酸酶抑制劑(40μ/μl)(Gibco BRL)；1μlOmniscript(1單位/微升)和DEPC水，至總體積為20μl。將該反應混合物42℃孵育1小時。
每個樣品的差異顯式PCR一式兩份進行。使用Hieroglyph系統(Genomyx)，ClontechTaq聚合酶混合物和[α-33P]dATP(3,000Ci/mmol，Amersham)完成DD-PCR。
對于每個cDNA亞群，一個包括適當的反轉錄酶(RT)混合物和相匹配的錨定引物(AP)的PCR核心混合物，按滿足反應數所需的體積準備。這個核心混合物包括全部的DD-PCR成分，但要用的隨機引物除外，它被單獨等分在適當的試管中。
每個單獨的DD-PCR試管所含成分如表1所示。
表1
DD-PCR之后，在變性條件下用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離放射性標記的cDNA片段。此過程包括使用Genomyx LR測序儀和LR優化HR-1000聚丙烯酰胺凝膠制劑。4.5％和6％HR-1000凝膠根據制造商的建議制備；4.5％凝膠用于分辨大小為700bp至2kb的片段，6％凝膠用于分離大小為100bp至600bp的片段。
從每個DD-PCR樣品中取7μl，與4μl上樣染料(Genomyx)混合，95℃加熱3分鐘，置于冰上冷卻。取3μl熱變性的樣品加入凝膠泳道。將一式兩份的反應上樣于相鄰的泳道，并且由相同引物對產生的樣品上樣于連續的泳道中。6％凝膠在2,500V、100W、50℃下，電泳6小時；4.5％凝膠在1,500V、100W、50℃下，電泳16小時。
電泳后，按制造商的方案，將凝膠干燥于Genomyx-LR測序儀的玻璃板上。放置BioMax MR(Kodak)超高分辨率膠片于凝膠上，曝光16小時，得到凝膠的放射自顯影照片。
放射自顯影照片顯示對應于在非修復細胞SVE10和MHP15中表達，但在修復細胞系MHP36和MHP3中不表達的基因的條帶。照片上也顯示了對應于在修復細胞系中表達，但在非修復細胞系中不表達的基因的條帶。
從凝膠中切下條帶之前，將放射自顯影照片用90％乙醇洗滌，且晾干。在自顯影標記(Stratgene)的幫助下，使放射自顯影照片對齊于凝膠的頂部。沿著凝膠長邊，固定放射自顯影照片。鑒定出差異表達的轉錄本(DET)，并且根據Genomyx方案切下條帶。將切下的條帶置于100μl洗脫緩沖液(EB，10mM TrisHCl，pH7.5)中，使DNA在室溫下洗脫6小時。洗脫的DNA保存在-20℃。
利用單鏈構象多態性(SSCP)凝膠分析消除可能由于相同大小、不同序列片段的共遷移造成的假陽性結果。這個方法包括，對分離片段進行有限再擴增(SSCP-PCR)，隨后在SSCP凝膠上分離擴增產物。PCR的條件與DD-PCR的類似，不同之處為低退火溫度(50℃)的循環數減至2，高退火溫度(60℃)的循環數為10。取4μl SSCP-PCR反應物，加入10μl SSCP上樣緩沖液(80％甲酰胺，0.01％溴酚藍，0.01％二甲苯腈藍，1mM EDTA，10mM NaOH)，95℃變性10分鐘，然后上樣于瓊脂糖凝膠。樣品在Genomyx-LR測序儀上在0.6×tris硼酸EDTA緩沖液(TBE)中，8W電泳16小時。放射自顯影后，切下凝膠中對應于差異表達轉錄本的候選區域，且置于100μl洗脫緩沖液(EB)中。測序和鑒定DET回收的差異表達cDNA通過PCR再次擴增，以提供用于直接測序的有效模板原料。PCR反應包含的成分如表2所示。
表2
根據制造商的方案，用PCR純化試劑盒純化PCR產物。純化的產物用60μl洗脫緩沖液洗脫。純化的PCR產物用Thermosequenase放射標記末端循環測序試劑盒(Amersham)測序。根據制造商的方案，利用M13反向引物(-48)(Genomyx)完成該反應。將測序產物上樣于含6％Long Ranger(FMC)、8M尿素、1×GTB(甘油耐受緩沖液)的凝膠，在2,500V、100W、50℃、1×GTB中電泳4小時。放射自顯影后，手工讀取測序梯度，得到的序列數據用于查找Genbank數據庫(已發表的和EST)。
表3顯示了實驗中用到的細胞系的基因表達圖譜。MHP36和MHP3是適合移植入受損腦中的細胞。可以清楚地看到，MHP36和MHP3的表達圖譜相似。同樣的，MHP15和SVE10的圖譜相似。但MHP36/3的圖譜，以及MHP15/SVE10的圖譜明顯不同。這表明這兩類細胞在功能上有差別，MHP15和SVE10不具有修復能力。
表3
對表達產物的分析顯示，非修復的MHP15細胞表達名為Pax6的基因(Gotz等人，神經元(Neuron)(1998)，21；1031-1044)，而來自MHP36的細胞不表達該基因。
因此，預計表達Pax6基因的神經細胞不能修復腦損傷，相反，不表達該基因的神經細胞系能夠幫助修復。
Pax6被認為是一個定位基因，對決定胚胎細胞在腦發育中注定要處的位置有重要作用(Fernandez等人，發育(Development)(1998)1252099-2111)。
進一步分析顯示，非修復、非多能細胞表達3R2C基因(Genbank編號25216)。在允許的條件下培養時，MHP36細胞不表達該基因。
序列表<110>ReNeuron Limited<120>鑒定適于移植的細胞<130>REP06134Wo<140>未知<141>2000-10-24<150>9925210.8<151>1999-10-25<160>7<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>273<212>DNA<213>小鼠<400>1gtggcctcaa ccacattggt actagtcaat agcgcatgtg gcttcccctg gacaacaagt 60gagtttatgc cctggaatgt gtttgatggc aagcttttcc atcagaagta ccgcagtctg 120aaaagggata tgccgtggaa gttcttttgg aacaaaatag atcgtggctc accaagttcc 180acaacctgaa ggcagtggtc tgcaaggcct gctccaagga gaaccggcgc atcgtaggca 240gaacgcattg ggactctcct tacacaggga ggc 273<210>2<211>325<212>DNA<213>小鼠<400>2cataatttag aagaccgttt gaaaagatat gaaaagaatg catgtgcagc aactgtgggg 60acaccttaca aaggtggcaa tttgtaccac actgaggtct cactcttcgg agaacctacc 120gagtttgagt atttgcgaga agtgatgttt gaatatatga tgggtcgcga gactaagacc 180atggccaaag ttataaccac tgtcctgaaa ttccctgatg atcaggctca gaaaattttg 240gaaagagaag atgctcgtct gatgttgctt ttctgttgat tctgtgaaat agactgatac 300atggactaac agccaccaag aatgg 325<210>3<211>272<212>DNA<213>小鼠<400>3ttgtagtggg ctgccttcat ccataggaag tgtgtgtaaa ttagatgaga gcagtgctga 60ggaggccgac aaatcgcgag aaagatctca gtgtgctgtg aaagctgcta ataaagattc 120cagtgtcaca ccaaaaggga atttaagcaa tggaaacagt ggctctaaca gcaaagctgt 180taaggaaaat gacaaagaaa agggcaaaga aaaagaaaaa aaagaaaaga ccccagctgt 240tatccagagg ccgggtactt ggtaaagaca gt 272<210>4<211>438<212>DNA<213>小鼠<400>4taccagttca agcactgccc atggttgtcc cacctcagga gcctgacaaa ccacctgcca 60accttgctgc tactcttccc gttaggagta aagcagtcag tggaagagca tctgcaatgt 120caaacactcc tacccacagt atcgctgctt ctgtttccca acctcagact ccaactccaa 180gtcccatcat ctctccttca gccatgctac ctatctaccc tgccattgat attgatgcac 240agactgagac taatcatgat actgcactaa cacttgcctg tgctggtggc catgaggaac 300tggtacaaac actactagag agaggagcta gtattgaaca tcgagacaag aaaggtttta 360ctggactcat cttggctgct acagctggtc atgttggtgt tgtagagata ttgctggaca 420atggtgcaga cattgaag 438<210>5<211>206<212>DNA<213>小鼠<400>5gccatgtact actgtgccag acacacagtg tgggaagtcc aatgagagcc tgcacaaata 60cttctctgca gggatgctca caaccagcag ggggcgctga ggacccaaag ggacttccca 120ggatctcttc tggaatctag ggagctctga cctgtgtcta tcagcatgtg tttcaatgtt 180agagttctta gttttccttc cagcaa 206<210>6<211>204<212>DNA<213>小鼠<400>6aagtcacaat tactctgata cctaaaccac acaaagaccc aataagtaaa gagaacttca 60gaccagtttc ccttatgaat atcaatgcaa aaaaagctca ataaaatttt cacaaaccga 120agccaagaat aaaataaaag ccaagaataa aaggatcatc catcatgatc aagtaggctt 180catcccaggg atgctgggat ggtt204<210>7<211>267<212>DNA<213>小鼠<400>7cgcgctttta aatgagaatg tctatagcgt tcacttcgaa aaggagcata aagctgagaa 60agtcccagcc gtagctaact acattatgaa aatacacaat tttactagca aatgcctcta 120ctgtaatcgc tatttgccta cagataccct acttcaacca tatgttaatt catggtctgt 180cttgtccgta ttgccgttcc accttcaatg atgtagagaa gatggcagca cacatgcgaa 240tggttcatat tgatgaagag atggggg 26權利要求
1.選擇適合移植入脊椎動物受損腦中的細胞的方法，包括(i)選擇是或有能力分化成具有神經細胞表型的細胞的細胞；(ii)獲得這些細胞的基因表達圖譜；(iii)將這些細胞的基因表達圖譜與已知適合移植的對照細胞的基因表達圖譜比較；并且(iv)選擇與對照細胞具有相似基因表達圖譜的細胞。
2.鑒定其表達能確定神經細胞能否修復受損腦的基因的方法，包括(i)選擇是或有能力分化成具有神經細胞表型的細胞的細胞；(ii)獲得這些細胞的基因表達圖譜；(iii)將這些細胞的基因表達圖譜與已知適合移植的對照細胞的基因表達圖譜比較；并且(iv)分離與對照細胞表達相同(或不同)的基因。
3.根據權利要求1或者2所述的方法，其中對照細胞不表達基因Pax6或者3R2C。
4.根據前面的權利要求中任意一項所述的方法，其中對照細胞是MHP36。
5.根據前面的權利要求中任意一項所述的方法，其中步驟(ii)通過差異顯式實現。
6.選擇適合移植入受損腦中的細胞的方法，包括確定在此鑒定為SEQ ID NOS.1至5的任何基因序列的存在。
全文摘要
本發明涉及通過例如差異顯示，對選擇細胞的基因表達圖譜與獲自對照細胞的圖譜進行比較，鑒定適于在移植治療中修復神經損傷的多能細胞。
文檔編號A61K35/12GK1420936SQ0081482
公開日2003年5月28日 申請日期2000年10月24日 優先權日1999年10月25日
發明者J·普賴斯, D·尤瓦諾格 申請人:蘭諾龍有限公司