治療慢性乙型肝炎病毒感染的方法

專利名稱：治療慢性乙型肝炎病毒感染的方法
技術領域：
本發明涉及治療慢性乙型肝炎病毒(“HBV”)感染和疾病的免疫治療劑。
背景技術：
85％以上兒童HBV感染變成慢性。成人中1-5％急性HBV感染不能治愈，也變為慢性感染。慢性感染可導致慢性活動性肝炎(20-50％的病例)、肝硬化或甚至肝功能衰竭(10-20％的病例)，在某些情況下導致肝癌(1-3％的病例)。肝臟損傷主要是對感染的肝細胞的細胞免疫應答引起的。
僅在美國就有約一百萬HBV的慢性攜帶者。全世界有300,000,000以上的慢性攜帶者。許多慢性攜帶者在泛太平洋地區(即臺灣、日本、南亞)和非洲。
引起慢性HBV感染的機制尚不清楚。乙型肝炎e-抗原(“HBeAg”或“HBe”，前核心多肽)的存在與活動性病毒復制有關，是感染性增加和嚴重性的指標。雖然如果患者是抗-HBe陽性預后較好，但是急性和慢性感染的恢復都與產生針對乙肝表面抗原(“HBsAg”或“HBs”)的抗體有關。隨著中和性抗-HBs抗體的出現，HBsAg消失是感染清除的指標。然而，對抗HBs的自發性血清轉化現象極其罕見。雖然每年有10％的患者經歷了HBeAg到抗-HBe的自發血清轉化，但是由HBs血清轉化成抗HBs每年僅發生在約1％的患者中。
雖然已有治療慢性HBV的療法，但是大多數范圍和效力都有限。干擾素治療僅在3-5％患者中導致抗HBs血清轉化。另外，干擾素治療非常昂貴，可能具有嚴重的副作用，而且必須每日皮下注射。
更新的抗病毒藥物，如拉米夫定可減少病毒負荷，但僅在少數病人中導致抗HBs血清轉化。另外，它們必須長期使用-中斷會導致病毒重新出現，使得可能需要終生治療-而且可能出現耐藥性突變株。
也已有免疫療法。一些免疫療法基于抗體的施用。當單獨使用抗HBs抗體(“HBIG”)時，可具有治療作用，如肝臟移植對HBV感染所證明的那樣。蛋白質設計實驗室(Protein Design Labs)正致力于使用人源化抗HBs抗體作Ig灌注治療。
其他免疫療法基于抗原施用。一種基于抗原的免疫療法利用了酵母表達的HBsAg和油/水乳液加RIBI和QS-21(SmithKline Beecham)。目前正在進行慢性感染的二期試驗。另一種利用PreS1+PreS2+S/明礬(Medeva)。還有另一種(現在正進行150個病人的免疫療法試驗)使用PreS2+S/明礬(Institut Pateur)。另一種基于抗原的免疫療法利用核心蛋白衍生的肽，用于誘導細胞毒性T淋巴細胞應答(Cytel)。
仍然需要能改善慢性HBV感染的強效免疫療法。
發明簡述在一方面，本發明涉及治療慢性HBV感染的方法，包括施用一種組合物，該組合物含有HBsAg的重組PreS2+S蛋白質和一種可代謝的油佐劑，和可任選的抗病毒藥物或化合物。
另一個方面，本發明涉及一種免疫治療藥盒，它包括HBsAg的PreS2+S蛋白質、一種可代謝的油佐劑和可任選的抗病毒藥物或化合物。
附圖簡述

圖1描述了具有感興趣的限制性位點的HBV基因組和用于制備表達質粒的接頭。
圖2示意性描述了該克隆策略。
圖3a-b、4a-b和5a-b描述了三個病人的HBe/抗HBe(a)和血清ALT/HBV DNA(b)結果，第二個病人顯示短時突發加劇。
發明詳述本發明的實施可采用(除非另外說明)病毒學、免疫學、微生物學、分子生物學的常規方法和本領域的重組DNA技術。這些技術在文獻中已有全面論述，見例如Sambrook等，Molecular CloningA Laboratory Manual(第二版，1989)；DNAcloningA Practical Approach，卷I&II(D.Glover編)；Methods In Enzymology(S.Colowick和N.Kaplan編，Academic Press，Inc.)；Handbook of ExperimentalImmunology，卷I-IV(D.M.Weir和C.C.Blackwell編，Blackwell ScientificPublications)和Fundamental Virology，第二版，卷I&II(B.N.Fields和D.M.Knipe編)。
本發明涉及基于抗原的免疫療法，用于治療慢性HBV感染。如本文所用的“治療”包括改善和/或消除HBV感染，并刺激對其的免疫應答，優選抗-HBsAg或抗-HBe應答。人HBV是感染鳥類和哺乳類物種的嗜肝性DNA病毒的嗜肝DNA病毒科的成員。外膜相關抗原HBsAg可誘導中和性保護抗體應答。HBsAg由三種相關蛋白質組成，它們具有共同的氨基酸序列-S、preS2+S和preS1+PreS2+S。
本發明中所用的含抗原的組合物含有HBV的PreS2+S抗原和一種可代謝性油佐劑。在一個實施例中，PreS2+S抗原是在中國倉鼠卵巢細胞中重組產生的。在另一個優選例中，該可代謝性油佐劑是下文所述的佐劑MF59。
在本發明的方法中，將上述組合物施給個體。可任選的，在施用該含抗原的組合物之前、同時或之后施用一種抗病毒藥物。在含抗原的組合物之前施用抗病毒藥物的時間可從1個月到24個月之間。慢性HBV患者中有大群感染的肝細胞。由于肝臟損傷主要是由于對受感染肝細胞的細胞免疫應答引起的，已建議在其他治療前延長抗病毒治療，以減少受感染肝細胞的數量(Genome，J.Clin.Invest.102(5)867-868，1988年9月)。另外，用抗病毒藥物降低循環性HBsAg的水平可通過減少游離抗原量，來減少免疫治療開始后抗原-抗體復合物沉積的可能性。
可對存在慢性HBV感染的個體施用有效量的前述組合物。本文所用的術語“有效量”指實現治療所要的目的，而沒有不良副作用(如中毒、刺激或過敏反應)所需的量。雖然個體的需要可能不同，確定制劑有效量的最佳范圍是在本領域技術人員能力范圍內的。人用劑量也不難從動物研究中推導出(Katocs等，第27章于Remington’s Pharmaceutical Sciences，18版，Gennaro編，Mack PublishingCo.Easton，PA，1990)。通常，提供有效量的制劑所需的劑量(可由本領域技術人員調節)隨幾種因素而變化，包括年齡、健康、生理狀況、體重、接受者所患疾病或異常的種類或程度、治療頻率、同時治療(如果需要)的性質、所需效果的性質和范圍(Nies等，第三章于Goodman&Gilman’s The Pharmaceutical Basis ofTherapeutics，第9版，Hardman等編，McGraw-Hill，New York，NY，1996)。考慮的劑量范圍為大約5-100微克。
還應考慮可能需要多次施用該組合物。給藥之間的時間由給藥數量而定。例如，如果給藥兩次，第一次可在第0月，第二次分別在第1、2或6月。另外，可間隔一月給藥。多次給藥之間的時間不難由本領域技術人員決定。在一個實施例中給藥8次。
本文所用的術語“給藥”包括但不限于透皮、胃腸道外、皮下、肌肉內、口腔和局部遞送。任何途徑給藥的共同要求是有效且傳遞方便。在一個優選例中，肌肉內施用該組合物。
公開本發明方法的目的是改善慢性HBV感染。這種改善可通過例如用核酸試驗測定血液中HBV DNA的減少；用常規試驗測定血清丙氨酸氨基轉移酶(ALT)的減少；或用常規試驗測定轉胺酶的短期突發增高。優選本發明的治療將導致抗-HBe的出現和HBsAg的同時下降/消失，更優選的是出現抗HBs同時伴有HBs的下降/消失。所有這些都可用常規免疫試驗測定。對于本發明而言，正常ALT水平定為女性約6-34IU/L，男性約6-43IU/L。
本文所用的術語“可代謝性油佐劑”指含有對所施用的個體無毒，且可被個體代謝的油性佐劑，該油優選約6-30個碳原子，包括但不限于烷烴、烯烴、炔烴及其對應的酸和醇、醚或酯，及其混合物。該油可以是任何可被宿主動物機體代謝的植物油、魚油、動物油或合成制備的油，它們可被施用的宿主動物的身體代謝，對個體無毒。宿主動物通常是哺乳動物，優選是人。礦物油和類似的有毒石油餾出油明確的排除在本發明之外。
植物油的示范性來源包括堅果、種子和谷物。花生油、豆油、椰子油、橄欖油這些最常見的油是堅果油的例子。種子油包括紅花油、棉籽油、葵花子油、芝麻油等。在谷物類中，玉米油是最容易得到的，但也可用其他谷物油如小麥、燕麥、黑麥、稻、畫眉草、黑小麥等。
獲得植物油的技術已得到了良好開發并且是熟知的。這些和其他類似的油的組分可在例如Merck Index和關于食物、營養和食品技術的原材料中找到。
雖然6-10個碳的甘油和1，2-丙二醇的脂肪酸酯在種子油中天然不存在，但它們可通過水解、分離和酯化合適的來自堅果和種子油的起始材料制備。這些產品可以NEOBEE(PVO International INc.，Chemical Specialties Division，416Division Street，Boongon，NJ)的商品名和其他廠商購得。
還可在本發明的佐劑和免疫原性組合物中使用來自任何動物來源的油。動物油和脂肪通常在生理溫度下是固態的，因為它們以甘油三酯形式存在，而且比魚或植物油的飽和度高。然而，可從動物脂肪通過部分或完全皂化甘油三酯(其提供了游離脂肪酸)獲得脂肪酸。哺乳動物奶的脂肪和油是可代謝的，因此可用于本發明的實施。從動物來源獲得純油所需的分離、純化、皂化和其他方法是本領域熟知的。
許多魚含有不難回收的可代謝油。例如，鱈魚肝油、鯊魚肝油和鯨油如鯨蠟是幾種可在本文中使用的魚油的例子。可以5碳異戊二烯單元生物化學方法合成許多支鏈油，通常稱作萜。鯊魚肝油含有分枝的不飽和萜，稱作鯊烯，2，6，10，15，19，23-六甲基-2，6，10，14，18，22-二十四碳己烷，在本文中是特別優選的。角鯊烯(鯊烯的飽和類似物)也是特別優選的油。魚油(包括鯊烯和角鯊烯)不難從商品來源獲得，或可用本領域已知的方法獲得。
這些佐劑和免疫原性組合物的油組分將以約0.5％-20％體積，優選不大于約15％，特別是約1％-12％的量存在。最優選的是采用約1％-4％油。
EP 0 399 843 B1描述了本文所考慮的可代謝性油佐劑，在此引入以供參考。優選佐劑是比專利中和Ott等“MF59，人用疫苗的明智和強大的佐劑的設計和評價”第10章，pp.277-296，Vaccine DesignThe Subunit and Adjuvant Approach，Michael F.Powell和Mark J.Newman編，Plenum Press，New York，1995(在此引入以供參考)描述的MF59。特別是，MF59如下配制4.3％w/v的鯊烯、0.5％w/v的Tween 80、0.5％Span 85和400微克/毫升的MTP-PE(N-乙酰基胞壁酰基-L-丙氨酰基-D-異谷氨酰基-L-丙氨酸-2-[1，2-二棕櫚基-錫-甘油酯-3-3(羥基磷酰氧基)]乙酰胺)。MF59的作用機制似乎是產生強CD4+T細胞應答。
該佐劑還可以含有乳化和/或免疫刺激劑。在藥物科學中通常使用許多數量的乳化和懸浮劑。這些包括天然衍生的物質如樹膠、植物蛋白質、基于糖的聚合物如海藻酸鹽和纖維素等。某些在碳骨架上具有羥基或其他親水取代基的氧聚合物或聚合物具有表面活性，如聚乙烯吡啶酮、聚乙烯醇和甘油醚基的單或多功能化合物。長鏈脂肪酸衍生的化合物形成可用于本發明的第三組乳化和懸浮劑。只要無毒，可用前述任何一種表面活性劑。
示范性免疫刺激劑包括能提高宿主免疫力的合成性佐劑，如左旋咪唑和異丙肌苷。左旋咪唑是四咪唑的左旋異構體，其通過T-細胞依賴性機制加強體液和細胞免疫力。異丙肌苷，一種含有肌苷、腺嘌呤核苷和鳥嘌呤核苷的嘌呤前體的復合物，能促進T細胞有絲分裂。促吞噬肽(Tuftsin)，一種4個氨基酸的肽(Thr-Lys-Pro-Arg)與免疫球蛋白(Ig)重鏈中的一序列同源，主要刺激巨噬細胞。
本文所用的術語“個體”指動物，通常是哺乳動物，優選人。
本文所用的術語“約”指±10％。
本文所用的術語“一個”和“該”指單個或多個。
本文所用的“慢性HBV感染”通常指已持續超過急性階段的HBV感染。慢性感染可能是兒童或成年期內獲得的慢性疾病引起的。疾病引起的慢性感染通常可通過HBSAg的存在和ALT水平的異常，以及伴有或不伴有可檢測水平的HBeAg來鑒定。正常的ALT水平通常范圍是10-32U/L(女性9-24U/L，嬰兒的正常范圍是成人的兩倍)(網頁On Hepatitis C International，“實驗室血液檢測”7/10/98修改)。然而慢性感染還包括具有正常ALT的無癥狀的攜帶者；開始用抗病毒藥物，如干擾素治療，使病毒降低到可檢測水平以下的病人；和肝臟移植后的病人，他們正在繼續抗病毒治療或接受Ig灌注。急性感染后持續超過6個月的HBsAg是慢性感染的特點。已在慢性感染的病人中記錄到有抗病毒T細胞應答缺陷(Boni等，J.Clin.Invest.，102(5)968-975，1998年9月)。
本文所用的術語“抗病毒劑”或“抗病毒化合物”包括但不限于干擾素和核苷類似物，包括拉米夫定。拉米夫定已被用于減少慢性HBV導致的肝臟損傷，可以每個病人可每天口服25-300毫克劑量，直到1年。然而合適的抗病毒藥物的劑量將具體取決于如藥劑和病人。
已顯示含有重組HBV PreS2+S抗原(10微克)和可代謝性水包油佐劑MF59的疫苗能增強其在成年人中的免疫原性(Poland等，37屆ICAAC，p.216，1997年9月28日-10月1日)。施用一劑疫苗后，89％測試個體產生了血清保護性抗HBs滴度。100％的測試個體在兩次注射后受到保護。另外，PreS2+S/MF59疫苗的幾何平均抗體滴度比含有鋁作為佐劑的對照疫苗高100倍(Poland等，見上)。本發明人預測可用相似的組合物作為免疫治療劑治療慢性HBV感染。
實施例1制備了含有重組PreS2+S和水包油佐劑MF59的組合物。如下制備了重組PreS2+S。Hyclone提供了全部培養液和補充劑。
通過用兩個接頭插入S+PreS2基因，構建了重組質粒pKSVAdPreS-BglII(圖1-2)。構建該重組表達系統中使用的克隆載體是Pharmacia的pKSV-10。pKSV-10載體長7.2kb，克隆位點是BglII。如Valenzuela等，Nature，280815-819，1979年8月30日(在此引入以供參考)所述，分離得到病毒DNA。用HhaI部分消化病毒基因組DNA的約1880個bp的EcoRI/BglII片段，分離得到1230bp的EcoRI/HhaI片段。設計了接頭與EcoRI/HhaI片段連接，形成BglII/BglII片段，用于克隆入pKSV-10。然后將pKSV-10/BglII與Pre S BglII/BglII片段連接，得到DNA質粒載體pKSVAdPreS-BglII。然后轉化感受態細胞HB101。篩選得到轉化株，進行大量制備。
將dhfr序列插入pSV7d構建了克隆載體pSV7d/AML-dhfr(Stibbe等，Virology，123436-442，1989，在此引入以供參考)。用pKSVAPres-BglII和pAML/dhfr共轉染DG44(dhgr-)CHO細胞(Urlaub等，PNAS USA，774216-4220，1980，從Chiron的Dr.Leslie Rall于1985年9月以傳代數約100獲得)。然后，在24孔微量滴定板中培養48個克隆。用Abbott ELISA法篩選克隆，用氨甲蝶呤選擇擴增命名為PKSVAdPres 16的高產克隆，最終得到克隆PKSVAdPreS 16-12-80-30(縮寫為HEP 30細胞)。擴增HEP 30細胞，制備主/工作(Master/Working)細胞庫，命名為HBV B30細胞。
克隆HBV B30主細胞庫的細胞，在補充了6％透析的FBS和50μM氨甲蝶呤(MTX)的DME/F12培養液中擴增。擴增后通過幾步(在3升旋轉燒瓶中FBS濃度從6％到2％逐步下降)使細胞適應MTX-DMEM/F12培養液。適應后，將細胞接種在3L的攪拌灌流容器中，用DMEM/F12，2％FBS灌流。
然后將一些灌流細胞在50μM MTX的存在下亞克隆培養于DMEM/F12 10％FBS培養液中，在2％FBS和2μM MTX存在下通過多次振搖燒瓶傳代，使其適應于HBV生產培養液。在第14代，測試亞克隆的生產性，以親本培養物小試管凍存(保藏在Chiron細胞培養物保藏中心，編號為CMCC11336)。將這些細胞中的一些在DM122培養液中融化，然后在補充了200mM L-谷氨酰胺、1mM(1∶500)MTX的DM122培養液中擴增。當細胞密度達到4.0-8.0×105活細胞/毫升時，將細胞在DM122、含10％人血清蛋白(w/v)+7.5％(v/v)DMSO中濃縮到1.0×109，等分到1毫升/試管，產生新的HBV Master細胞庫(MBVMK001)。以1℃/分鐘將這些細胞冷凍到-96℃，然后儲藏在≤-176℃。
如Ott等(見上，在此引入以供參考)所述，制備了作為無菌水包油乳液的MF59。將0.25毫升體積抗原中的10微克PreS2+S與0.25毫升MF59混合，最終劑量是0.5毫升。下文表1和2列出了該疫苗的成分。
表1HBV抗原組合物成分每最終劑量中的量PreS2+S抗原 0.02毫克氯化鈉，USP 3.80毫克檸檬酸鈉，二水合物，USP 2.15毫克檸檬酸，一水合物，USP 0.04毫克聚山梨醇酯80(Tween 80TM) 0.01毫克注射用水足量pH范圍6.0-7.0表2MF59佐劑組合物成分每最終劑量中的量鯊烯9.75毫克聚山梨醇酯80(Tween 80TM) 1.18毫克三油酸山梨醇酯(Span 85TM) 1.18毫克二水檸檬酸鈉，USP 2.15毫克一水檸檬酸，USP 0.04毫克注射用水足量pH6.4實施例2將500微升實施例1所述組合物肌肉內注射到13個病人的三角肌中，這些病人通過持續存在HBsAg6個月以上而確定患有慢性HBV。8個病人HBe陽性。全部13個病人血清ALT升高(高于1.2×ULN，即正常上限)，沒有代償失調的肝臟疾病證據。在第0、1、2和6個月給藥。通過測定HBV DNA、血清ALT水平降低，HBeAg水平降低，以及第二次給藥一個月后出現抗-HBe抗體而確定有效。用bDNA法測定了HBV DNA(Chiron和Chen等，J.Virol.Methods，53(1)131-7，1995年5月，在此完整引入以供參考)。用如下的化學發光免疫試驗測量了HBeAg、抗-HBe、HBsAg和抗HBs水平。另見美國專利號5,395,752，在此引入以供參考。以光密度單位(s/co)報道了結果。
為了測定HBeAg，將100微升血清人抗-HBe的乳液100微升偶聯有乳磁性顆粒(600微克/毫升)的混合，37℃培育18分鐘。加入100微升與DMAE(二甲基吖啶酯，300 30,000,000相對光單位，“RLU”每毫升)偶聯的人抗-HBe，37℃培育18分鐘。用緩沖液洗滌該顆粒3次，然后測定化學發光。所用的緩沖液具有下列成分50mM TRIS，pH8.0；500mM氯化鉀；0.09％疊氮化鈉；1mM EDTA；0.05％Tween20；和1.75％BSA，巰基修飾，用MILLIPAK-60 0.22微米濾器單位過濾。
為了測定HBsAg，用上述緩沖液1/100稀釋100微升血清，將其與100微升偶聯于順磁顆粒(對于抗體濃度分別為280微克/毫升和150微克/毫升)的小鼠抗-HBs(特異性結合HBsAg的抗“a”中和表位)以及與小鼠抗-HBs(抗“a”，75.0納克/毫升)偶聯的(用上述緩沖液稀釋)50微升DMAE混合，37℃培育18分鐘。用緩沖液洗滌顆粒3次，然后測定化學發光。
為了測定抗-HBe，將50微升血清和100微升重組HBeAG SOD融合蛋白(50納克/毫升)(見例如Choo等，Science，1989，244，359-362，在此引入以供參考)以及100微升偶聯于乳膠磁性顆粒(600微克/毫升)的人抗HBe混合，37℃培育36分鐘。加入與DMAE(300×10E 6 RLU/毫升)偶聯的100微升人抗-HBe，37℃培育18分鐘。用緩沖液洗滌顆粒3次，然后測定化學發光。所用的緩沖液具有下列組分100mM硼酸緩沖液，pH8.9；0.09％疊氮化鈉；5mM EDTA；0.05％TWEEN 20；和0.2％明膠(魚)，用MILLIPAK-60、0.22微米濾器單元過濾。
用標準酶免疫試驗法測定抗-HBs(Abbott)。
在8個最初HBe陽性的病人中，4個在3-4次注射后誘導了HBeAg水平的顯著下降和抗-HBe抗體的產生，伴有HBV DNA和血清ALT的下降。圖3a-b、圖4a-b和圖5a-b描述了3個病人的數據。還在幾個病人中誘導了抗-HBs抗體的顯著水平，包括最初不存在HBe的病人(見例如表3-5，抗-HBs欄)。8個病人中的兩個顯示血清ALT在研究過程中顯著增加。兩者都被治愈。
進一步隨訪后，13個病人中過半產生了抗-HBsAg。4個病人的血清轉化成抗HBe，4個血清轉化病人中3個變成HBV DNA陰性。
實施例3將500微升實施例1所述的組合物和100毫克拉米夫定在0時施給病人。實施例所述的另500微升組合物和另100毫克拉米夫定在1個月時施用。測定抗HBs滴度，以及檢測第二次給藥1個月后HBs的存在，來確定效果。如果可檢測的HBs仍然存在，進行第三次給藥。重復該過程，直到不再檢測到HBs。
實施例4將100毫克拉米夫定在0時開始施給病人，并每日一劑連續給藥。將500微升實施例1所述的組合物在第1、2、3和7月肌肉內注射給病人。測定HBeAg和抗HBe滴度，并在施用實施例1的組合物后1月檢測HBV DNA來確定效果。如果仍然存在可檢測的HBe，進一步施用實施例1的組合物。如果在再一次給藥后1月仍可檢測到HBe的存在，進行另一次給藥。重復該過程，直到檢測不到HBe。
實施例5將500微升實施例1所述的組合物在0時施給病人。1月時施給該病人100毫克拉米夫定。測定抗HBs滴度，并在施用實施例1的組合物后1月檢測HBs和HBe的存在，以確定效果。如果仍然存在可檢測的HBs，第二次施用實施例1的組合物。如果仍可檢測到HBs或HBe的存在，進行第三次給藥。重復該過程，直到檢測不到HBs。
實施例6每日施用100毫克拉米夫定6個月。將500微升實施例1所述的組合物在第7、8、9和13月施給病人。如果存在可檢測的HBs或HBe，進一步給藥。
實施例7材料ChironHBV/MF59抗原CHO細胞產生和純化的重組HBV PreS2+S(20微克/劑量)。佐劑MF59，顯微液化的水包油乳液。以分開的小管提供抗原和MF59，在注射時混合。肌肉內注射每劑總體積0.5毫升。時間表包括在0-、1-、2-和6-月施用4次(表6)。
拉米夫定(Epivir，Glaxo Wellcome)病人必須在開始ChironHBV/MF59治療前已治療了至少1個月。拉米夫定此后(即第四次注射后1個月)以ChironHBV/MF59治療前的劑量水平(每日100毫克-300毫克)持續7個月。
效力測定在本研究結束時，測定具有下列參數的病人比例HBsAg消失或減少，HBeAg消失和抗HBs或抗HBe血清轉化。用ChironHBV/MF59預先治療后HBV DNA水平和血清ALT/AST的變化將在ChironHBV/MF59治療期間和之后進行總結。對于本公開內容，所得到的效力數據限于所選的時間點，未進行全面分析。
方法將含有重組PreS2+S抗原和MF59的組合物(一種水包油佐劑)，即ChironHBV/MF59)(表2)施給患有慢性HBV感染，接受拉米夫定的病人。病人在0、1、2、6月肌肉內接受4次ChironHBV/MF59注射。病人在ChironHBV/MF59注射的6個月內持續用拉米夫定治療，并在第四劑后再接受拉米夫定1個月，然后停用拉米夫定。
合格病人包括慢性HBV感染病人(通過至少6個月血清HBsAg陽性和篩選檢測HBsAg陽性的歷史確定)，其具有代償性肝臟疾病，正接受拉米夫定或是篩選時開始拉米夫定治療的候選人。在篩選時用拉米夫定治療的病人在施用第一劑ChironHBV/MF59前至少接受了拉米夫定治療一個月。這些病人以其研究前的劑量繼續接受拉米夫定(100-300毫克/日)。篩選時未接受拉米夫定治療的病人開始ChironHBV/MF59之前，至少治療至少一個月。這些病人以100毫克/日的批準劑量接受拉米夫定。參與病人中排除了根據病史、體檢、臨床實驗室評估或先前肝臟活體檢查有證據顯示患有代償性差或晚期肝臟疾病的所有病人。
可能的病人在正式加入研究前1-8周內經歷了最初篩選，期間采取了他們的病歷、體格檢查和血和尿樣。在篩檢時獲得了下列HBV感染的血清學和病毒學參數(定性和定量測定)數據HBsAg、HBeAg、抗HBs和抗HBe。其他試驗包括肝功能檢測(LFT)ALT、AST、堿性磷酸酶、膽紅素(總的和直接)、凝血酶原時間、總蛋白質和白蛋白；全血計數(CBC)；和尿的蛋白質、血液分析和糞便。用聚合酶鏈式反應(PCR)定量測定HBV DNA水平。如果有證據證明在篩選前或在篩選時(根據提高的HBV DNA水平)有拉米夫定耐藥性突變株，排除這類病人。篩選調查時其他臨床實驗室測試包括抗HCV抗體、抗HIV抗體和肝炎δ抗體。將這些抗體任一陽性的病人從參加者中排除出去。
除了包括和排除的標準外，在本研究篩選調查時未接受拉米夫定治療的可能合格病人必須符合下列額外的標準才能合格血清ALT比正常上限高1.2倍，用bDNA試驗測定HBV DNA高于0.7MEq/毫升。篩選調查時收集的血樣獲得了這些實驗值。
符合所有包括標準并且無任何排除標準(包括臨床實驗測試的結果)的病人回來接受其首次肌肉內注射。每次注射后觀察30分鐘，觀察其是否有局部和全身反應癥狀。他們填寫日記卡片，描述注射后7日的局部(如注射部位疼痛、發熱、紅斑、硬化等)和全身(如疲勞、不舒服、發熱、發冷、肌肉疼痛、關節痛、惡心、頭痛、皮疹)反應。病人保持記日記卡片，記錄醫療問題和7日期間服的藥物。如果在實驗中任何時間，病人經歷任何可能與治療相關的不尋常、嚴重或重度不良事件，讓他們立即來診所就診。在第二、三和四次注射(如分別為1個月、2個月和6個月)前14日讓病人看醫生，以在接受下一次注射前進行臨床實驗測試(LFT、尿分析、肌酸)檢查。
第一次注射ChironHBV/MF59七個月后停止施用拉米夫定。在7.5、8、9、10.5個月時病人回醫院作臨床和實驗室隨訪。
在實驗過程中從ChironHBV/MF59開始到最終訪問監測所有不良事件(AE)。記錄了整個實驗中所用的全部處方藥物。
病人數量計劃和實際招募為24人。所有病人接受4次ChironHBV/MF59注射。
表6注射發生日免疫#1#免疫的 24(100％)免疫#2 第一次免疫接種后天數平均 31.7中位數28.0標準誤差 11.3最小 21最大 66數目 24免疫#3 第一次免疫接種后天數平均 60.7中位數56.0標準誤差 12.4最小51最大94數目24免疫#3第二次免疫接種后天數平均29.0中位數 28.0標準誤差3.2最小23最大39數目24免疫#4第一次免疫接種后天數平均180.0中位數 180.5標準誤差9.1最小168最大198數目24免疫#4第二次免疫接種后天數平均148.3中位數 148.0標準誤差11.4最小119最大168數目24免疫#4第三次免疫接種后天數平均119.3中位數 120.0標準誤差11.5最小表7篩選時病人統計和病人特征特征病人數目(總共24個病人)HBsAg陽性24(100％)抗HBs陰性 20(83％)陽性 4(17％)HBeAg陰性 9(38％)陽性 14(58％)其他 1(4％)抗HBe陰性 15(65％)陽性 8(33％)其他 1(4％)丙肝陰性 24(100％)肝炎δ感染陰性 24(100％)HIV感染無反應性 24(100％)ALT(U/L)平均 69.5中位數 49.0標準誤差 64.7最小 17最大 276數目 24結果總結病人特征和統計病人平均年齡42歲(27-63歲)。24個病人中20人(83％)男性。13個病人(54％)是亞裔，9(38％)個是高加索人，1人是美國黑人，一人是混血兒。在招募時，14(58％)人HBeAg陽性，而8(33％)人抗HBe陽性(用EIA和Abbott檢測)；一個病人的數據未得到，另一個病人兩者都是陰性。招募時平均血清ALT水平70IU/L(范圍17-276IU/L)(表7)。使用拉米夫定的平均持續時間在接受第一次注射ChironHBV/MF59之前是7.7個月(范圍1-33個月)(表7)。24個病人中16人在參加該試驗前接受了拉米夫定外的其他治療。這些治療包括干擾素(包括干擾素-a和CIFN形式)、法昔洛韋(famciclovir)和乙肝疫苗(CV-1899)(表9)。
在2000年1月1日，所有24名病人接受了全部4次ChironHBV/MF59注射。已跟蹤了22名病人中斷拉米夫定至少2個月。在這22個病人中，5個病人的數據收集至10.5個月，而兩個病人完成了整個研究(第12月)。
表8拉米夫定施用招募前拉米夫定持續時間月平均7.67中位數 5.35標準誤差7.78最小0.9最大33.3數目24使用拉米夫定的總持續時間 月平均14.46中位數 12.25標準誤差7.72最小7.6最大40.3數目24表9試驗前除了拉米夫定外的肝炎治療治療病人干擾素 101，601，602干擾素α201，203，204，208，401，402，403，404，501干擾素(CIFN(共同序列干擾素))202法昔洛韋102，602乙肝疫苗(CV-1899) 101，207臨床實驗室評價盡可能廣泛的收集了研究前血清ALT水平的歷史信息。每個病人所得數據的時間和數量不同。許多病人隨著時間變化ALT水平廣泛波動，包括在接受拉米夫定前的研究中ALT水平顯著提高。在24個病人中，9個記錄有研究前肝炎突發加劇的癥狀，血清ALT水平峰值為700IU/L以上。這9個病人中的ALT水平峰值中位數是1035IU/L，范圍是782IU/L-3116IU/L。
血清ALT水平在大部分病人中，在篩選時或在參加研究的最初7個月中正常或稍過高(小于正常上限的2倍)。這可預期到，因為在此期間所有病人都接受拉米夫定。在兩個病人(205和601)中，血清ALT水平持續不正常，研究中接受拉米夫定時記錄的最高ALT水平分別是112IU/L和119IU/L。兩個病人都在接受拉米夫定時用bDNA試驗檢測到HBV DNA，病人601顯示接受拉米夫定時HBV DNA水平顯著升高，提示可能產生了拉米夫定耐藥性突變株。
表10和11總結了血清ALT水平的數據。表10顯示拉米夫定中斷后24個病人中22的最高ALT水平，其數據直到最近調查才得到。在10個病人中，最高ALT值低于50IU/L。6個病人的最高ALT值在50-100IU/L之間，5個病人的最高值在101-200IU/L之間，一個病人(502)具有峰ALT值＞200IU/L，峰水平為1870IU/L。在12個最高ALT水平大于50IU/L的病人中，中斷拉米夫定后最高的ALT值與招募入該研究之前記錄的最高歷史值相當(表11)。除了一個病人(502)，所有病人在中斷拉米夫定后具有最高ALT水平，其比記錄的研究前最高值低(22個病人中的10個)或相當(22個病人中的1個)。
病人502顯示拉米夫定中斷后早期病毒感染復發，在10.5個月時緩解。中斷拉米夫定治療后一個月(第8個月)，HBV DNA水平升高至511mEq/毫升，ALT水平升高至63IU/L，表明發生了早期病毒感染復發。中斷拉米夫定治療后兩個月(第9個月)，病人502的ALT水平峰值為1870IU/L，然而，HBV DNA的水平下降到118mEq/毫升。第9個月后，病人502的ALT水平在10.5個月時穩定下降到46IU/L。
表10中斷拉米夫定后最高Alt水平最高ALT水平(拉米夫定治 病人數 病人編號療中斷后期間) (N＝22)≤50IU/L10101，102，201，202，203，207，403，404，505,60251IU/L-100IU/L 6204，206，401，501，503，601101IU/L-200IU/L5205，402，504，603，604＞200IU/L 1502表11拉米夫定治療中斷后最高ALT水平大于50IU/L的病人的研究前最高ALT水平和拉米夫定中斷后最高ALT水平病人編號研究前最高血清ALT水平拉米夫定治療中斷后隨訪期(N＝12) (IU/L) 間血清最高ALT水平(IU/L)204 342 54205 141 144206 271 52401 328 77402 400 125501 112 57502 810 1870503 62 53504 924 167601 339 69603 299 130604 285 155定量HBV DNA評價獲得有限數量時間點的定量HBV DNA水平數據。三個病人(402、504和601)在接受拉米夫定時HBV DNA顯著增加(＞100倍)。這種增加的可能原因是出現了對拉米夫定有耐藥性的HBV逃逸突變株。將進行這些樣品的HBV基因定型。得到了16個于第8和第9月測定了HBV DNA水平的病人關于在拉米夫定中斷治療后病毒復發的早期信息。這16個病人中，七人(401、403、404、501、503、504、505)在第8或9個月(拉米夫定中斷后一或兩個月)的HBV DNA水平在bDNA試驗檢測水平以下。其中一個病人(504)在拉米夫定治療同時可能產生了逃逸突變株(第7月時HBV DNA水平是577MEq/ml)，但是他在隨訪期間后來變成HBV DNA陰性。其余9個測定了HBV DNA的病人在中斷拉米夫定治療后具有可檢測的HBV DNA。
表12研究前和末次注射后的最高HBeAg水平和抗HBe水平研究前最高水平 研究后最高水平病人HBeAg(IU/ml) 抗HBe(IU/ml) HBeAg(IU/ml) 抗HBe(IU/ml)10116.4 1.630.2 1.81020.2 9.9＜0.1 46.4201＜0.1 41.5 ＜0.1 47.0202＜0.1 36.9 ＜0.1 24.2203＜0.1 5.2＜0.1 5.72041.0 4.51.9 3.2205＜0.1 122.6 ＜0.1 137.32061.9 5.718.4 2.72079.7 2.918.9 2.42083.3 4.617.8 2.5401＜0.1 44.1 ＜0.1 68.84020.2 4.10.4 4.2403＜0.1 419.7 ＜0.1 355.54041.2 5.0＜0.1 4.5501＜0.1 261.9 ＜0.1 338.25021.4 4.313.0 2.85030.2 62.1 1.1 17.15041.9 3.83.8 2372.05053.1 4.4＜0.1 30.760114.7 1.817.6 1.86022.9 4.3＜0.1 5.2603＜0.1 274.2 ＜0.1 162.0604＜0.1 165.1 ＜0.1 205.5定量HBeAg和抗HBe評價評價了關于HBeAg和抗HBe水平量的改變的有限數據。用內部EIA測定了HBeAg和抗HBe滴度。內部HBeAg試驗的檢測下限與商品EIA(Abbott)相等。在14個篩選時HBeAg陽性的病人(即＞0.1)中，4個病人(102、404、505和602)在末次注射后HBeAg低于檢測極限。這4個病人中的兩個(102和505)抗HBe滴度也顯著增加(大于4倍)。
上述實施例是為了說明本發明，而不是以任何方式限制本發明。本領域技術人員將認識到各修改都在如附加權利要求中舉例說明的本發明精神和范圍內。
全部參考文獻在此引入以供參考。
權利要求
1.一種治療慢性乙型肝炎病毒感染的方法，其特征在于，所述方法包括施給個體有效量的組合物，所述組合物含有PreS2+S抗原和可代謝性油佐劑。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，以每劑約5-100微克施用PreS2+S抗原。
3.如權利要求2所述的方法，其特征在于，以每劑約20微克施用PreS2+S抗原。
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，施用PreS2+S抗原1次以上。
5.如權利要求4所述的方法，其特征在于，施用PreS2+S抗原8次。
6.如權利要求4所述的方法，其特征在于，施用PreS2+S抗原4次。
7.如權利要求4所述的方法，其特征在于，施用PreS2+S抗原直到HBV感染改善。
8.如權利要求4所述的方法，其特征在于，施用PreS2+S抗原直到HBV感染被消除。
9.如權利要求7所述的方法，其特征在于，通過測定血清組分濃度的降低來確定HBV感染的改善，所述組分選自HBV DNA、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、HBsAg和HBeAg。
10.如權利要求7所述的方法，其特征在于，通過測定血清組分濃度的增加來確定HBV感染的改善，所述組分選自抗HBs和抗HBe。
11.如權利要求9所述的方法，其特征在于，通過測定血清ALT濃度降到正常水平來確定HBV感染的改善。
12.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述PreS2+S抗原是在中國倉鼠卵巢細胞中重組產生的。
13.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述可代謝性油佐劑是MF59。
14.如權利要求1所述的方法，其特征在于，該方法還包括施用抗病毒藥物或化合物。
15.如權利要求14所述的方法，其特征在于，所述抗病毒藥物是拉米夫定。
16.如權利要求15所述的方法，其特征在于，每日施用拉米夫定約100-300毫克。
17.如權利要求16所述的方法，其特征在于，每日施用拉米夫定約100毫克。
18.如權利要求14所述的方法，其特征在于，所述抗病毒藥物在施用PreS2+S抗原前至少施用一個月。
19.一種治療慢性乙型肝炎感染的藥盒，其特征在于，該藥盒包括一種含有重組PreS2+S抗原的組合物，所述藥盒還含有抗病毒藥物或化合物，和含有可代謝性油佐劑的組合物。
20.如權利要求20所述的藥盒，其特征在于，所述可代謝性油佐劑是MF59。
21.如權利要求19或20任一項所述的藥盒，其特征在于，重組PreS2+S抗原在中國倉鼠卵巢細胞中產生。
全文摘要
描述了治療慢性HBV感染的方法和藥盒。使用了含有HBV的PreS2+S抗原,以及可代謝性油佐劑的組合物。
文檔編號A61K39/29GK1365286SQ00810900
公開日2002年8月21日 申請日期2000年6月22日 優先權日1999年6月22日
發明者H·赫蘇 申請人:希龍公司