專利名稱：抗凍/融損害的脂質體組合物的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種脂質體組合物，具有改進的在冷凍和隨后的融化之后，防護發生微囊聚集、微囊融合和包容物的損失。
有關申請的交叉引用本文引用于1999年7月16日向美國專利與商標局提交的美國臨時專利申請No.60/144,380的完整公開內容，發明名稱為“脂質體組合物的低溫防護”。這些申請一般是申請人自有的。
背景技術：
脂質體是用于各種目的的密封脂質微囊。確切地說，通過脂質體的全身給藥，脂質體可以用來運送治療劑到達靶部位或細胞。已經證實脂質體特別可用于緩沖藥物毒性和改變某些治療化合物的藥動學參數，例如阿霉素和兩性霉素B。結合有這些化合物的產品是市售的。
藥物脂質體制劑的穩定性和有效貯存是脂質體產品的重要方面。具體來說，重要的是脂質體制劑在適當條件下長期貯存而不發生包封的藥物的不當損失或脂質體大小的改變。不過，有種擔心是當脂質體被脫水時或者冷凍隨后融化時，可能發生微囊融合和/或包容物的滲漏。
保護微囊在脫水和冷凍期間完整的通常方法是在脂質體制劑中包括一種低溫防護劑，例如糖(Harrigan等《脂質的化學與物理學》52139-149(1990))。低溫防護劑保持脂質的完整，防止微囊融合和微囊內容物的損失。
例如，美國專利No.4,927,571涉及從凍干形式再生的、含有阿霉素的脂質體組合物，它包括1％至10％的一種低溫防護劑，例如海藻糖或乳糖。
美國專利No.4,880,635涉及通過在糖的存在下干燥脂質體而制備的脫水脂質體組合物，其中的糖存在于脂質體雙分子層膜的內部和外部表面。類似地，美國專利No.5,077,056涉及脫水脂質體組合物，它優選地在脂質體表面的內部和外部包括防護性糖。
其他脂質體制劑例如DOXIL，這是一種含有阿霉素的脂質體制劑懸液，其中脂質體不被脫水用于后面的再生，而是在貯存期間留在懸液中。不過，懸液介質通常包括糖，用于防護冷凍損害。
發明概述因此，本發明在一方面提供脂質體組合物，防護經過冷凍和隨后的融化之后發生微囊聚集和融合，防護發生包容物的損失。
本發明在另一方面提供脂質體組合物，與由單獨的低溫防護劑所提供的防護作用相比，它提高了對凍/融損害的防護作用，這一點可由微囊融合減少和包容物損失減少加以證明。
本發明進一步提供包埋有高離子強度藥物的脂質體組合物，防護在經過冷凍和隨后的融化之后發生微囊融合和內容物的損失。
本發明在另外一方面提供脂質體組合物，它提高了對凍/融損害的防護作用。在一種實施方案中，組合物由脂質體懸液組成，每粒脂質體包埋有具有一定內部重量克分子滲透濃度的水性介質。脂質體是懸浮在外部介質中的，外部介質是由水溶性鹽和低溫防護劑組成的，其中外部介質的外部重量克分子滲透濃度高于內部脂質體重量克分子滲透濃度，由此建立跨越每粒脂質體的內低/外高滲透梯度。
在另一種實施方案中，外部介質包括一種鹽，選自硝酸鹽、鈉鹽、鉀鹽、銨鹽和硫酸鹽。在優選的實施方案中，鹽是氯化鈉(NaCl)或氯化鉀(KCl)。
低溫防護劑通常是一種糖，單糖或二糖、甘油、或聚乙二醇。在優選的實施方案中，低溫防護劑選自海藻糖、麥芽糖、蔗糖、葡萄糖、乳糖、葡聚糖、甘油、聚乙二醇和氨基苷類。
在另一種實施方案中，組合物進一步包括包埋在脂質體中的治療劑。在優選的實施方案中，治療劑是順鉑或順鉑類似物、或其衍生物。
在另外一種實施方案中，脂質體組合物包括與親水性聚合物鏈衍生的成微囊脂質。
本發明在另一方面提供用于防護脂質體組合物免遭凍/融損害的方法。該方法包括制備脂質體懸液，懸液中的每粒脂質體包埋有具有一定內部重量克分子滲透濃度的水性介質。脂質體是懸浮在由水溶性鹽和低溫防護劑組成的外部介質中的，其中外部介質的外部重量克分子滲透濃度高于內部脂質體重量克分子滲透濃度，由此建立跨越每粒脂質體的內低/外高滲透梯度。
本發明在另外一方面提供用于防護含有金屬配位化合物的脂質體組合物凍/融損害的方法。該方法包括制備脂質體懸液，懸液中的每粒脂質體包埋有具有一定內部重量克分子滲透濃度的水性介質和一種包埋的化合物。脂質體是懸浮在由水溶性鹽和低溫防護劑組成的外部介質中的，其中外部介質的外部重量克分子滲透濃度高于內部脂質體重量克分子滲透濃度，由此建立跨越每粒脂質體的內低/外高滲透梯度。在一種實施方案中，治療劑是順鉑或順鉑類似物、或其衍生物。在另一種實施方案中，外部介質中的鹽是氯化鈉(NaCl)，低溫防護劑是蔗糖。
本發明在另外一方面提供用于提高脂質體懸液低溫防護作用的方法，在懸液介質中包括低溫防護劑。這一改進在懸液介質中包括水溶性鹽，以有效建立跨越每粒脂質體的滲透梯度，其中懸液介質的重量克分子滲透濃度高于脂質體內部。在一種實施方案中，滲透梯度至少為100mOsm，優選為大于約200mOsm，更優選為大于約400mOsm，最優選為大于約500mOsm。
發明的詳細說明I、說明本文所用的下列術語具有下列含義“冷卻損害”或“冷凍損害”指的是脂質體組合物暴露于足以導致一種不良后果的溫度之后發生的若干不良后果的任意一種。足以導致冷凍損害的溫度通常是低于約0℃的溫度，更常見為低于約-5℃的溫度，進而更常見為低于約-10℃的溫度。不良后果包括但不限于因微囊聚集和/或融合而致粒徑生長增加、和包封治療劑的損失。能夠導致這樣一種后果發生的實際溫度將因脂質體制劑而異，例如脂質和其他雙分子層組分的類型、以及包埋的介質和治療劑。有時，冷凍損害在極冷的溫度下是較小的，特別是如果冷凍和隨后的融化速率較快時。
本文所用的“凍/融損害”包括與冷凍損害(如上所述)有關的不良副作用，和另外作為至少一個冷凍與融化周期結果所觀察到的后果，例如不均勻的粒徑分布。所述后果在慢融化過程期間可能更加明顯，也就是在約2-8℃，這是相對快融化過程而言的，也就是在室溫下，或者水浴條件(例如參見表8)。
“低溫防護劑”指的是適合于防護脂質體組合物免遭冷凍損害和/或凍/融損害的試劑或化合物。優選的低溫防護劑包括例如糖類(二糖和單糖)、甘油和聚乙二醇。
本文所報道的“滲透梯度”值是這樣測定的，計算脂質體組合物的內部與外部重量克分子滲透濃度，取自于摩爾濃度乘以分子(M×1)內部與外部脂質體介質中的非電解質或每分子電解質的離子數，從外部重量克分子滲透濃度減去內部重量克分子滲透濃度。
II、示范性脂質體組合物如上所述，本發明涉及抗冷凍損害和/或凍/融損害的脂質體組合物。脂質體組合物具有跨越脂質體脂質雙分子層的滲透梯度，其中脂質體外部的懸液介質的重量克分子滲透濃度高于包埋在脂質體內部的介質的重量克分子滲透濃度。
例如，實施例1(如下)描述兩種脂質體安慰制劑的制備，也就是一種脂質體制劑在內部與外部脂質體介質中都具有低溫防護劑蔗糖，另一種脂質體制劑僅在外部介質中含有蔗糖。兩種脂質體制劑在脂質體內部與外部介質中含有0.9％重量/體積(w/v)NaCl，脂質體由脂質HSPC、膽固醇和mPEG-DSPE組成，摩爾比分別為51/44/5。
將兩種脂質體制劑在-20℃下冷凍2.7天(大約65小時)，隨后在室溫下靜置融化。對兩種脂質體安慰制劑進行動態光散射，以測定冷凍前后的粒徑。結果如表1所示。
表1
*平均粒徑是對單一樣本進行三次測量的標準偏差。
在內部與外部介質中含有蔗糖的脂質體制劑(制劑#2)對冷凍損害更敏感，粒徑增加證明了這一點，例如從大約116nm(從未冷凍的對照組)增至凍/融樣本的204nm。僅在外部介質中含有蔗糖的脂質體制劑(制劑#1)粒徑在冷凍后增加較小，至大約166nm。正如下列實施例將更加充分證明的那樣，這些結果提示，具有高滲梯度的脂質體制劑、也就是外部重量克分子滲透濃度大于內部重量克分子滲透濃度(例如滲透梯度為146mOsm的制劑#1)，對凍/融損害較不敏感。
實施例2描述具有上述脂質組成的脂質體安慰制劑的制備，其外部含有5％(w/v)的蔗糖，內部不含蔗糖。隨后將脂質體制劑用5％(w/v)蔗糖和不同量NaCl稀釋，得到在外部水性介質中具有0.9％、0.6％和0.3％(w/v)NaCl的脂質體制劑。內部水性介質中的NaCl濃度為0.9％(w/v)。將每種脂質體制劑樣本在-20℃下冷凍大約5天(大約118小時)，隨后融化。測定粒徑，結果如下表2所示。
表2
*平均粒徑是對單一樣本進行三次測量的標準偏差。
表2所示數據揭示，由冷凍后的粒徑增加所判定的凍/融損害程度受到跨越脂質體脂質雙分子層的滲透梯度的影響。外部介質含5％蔗糖和0.9％NaCl(滲透梯度＝146mOsm)的脂質體制劑對凍/融損害最不敏感，這一點可由三種脂質體制劑的粒徑增加最小加以證明。具有相反滲透梯度的脂質體制劑、也就是外部介質含5％蔗糖和0.3％NaCl(滲透梯度＝-59mOsm)的制劑經過冷凍和融化之后粒徑增加最大。
實施例3描述對24種脂質體制劑所進行的定性試驗，以進一步評價滲透梯度對脂質體制劑對凍/融損害敏感度的重要性。本例中，制備了具有上述脂質組成(HSPC、膽固醇和mPEG-DSPE)的脂質體安慰制劑。內部脂質體介質是0.9％或1.8％(w/v)NaCl。外部水性介質含有(i)10毫摩爾(mM)組氨酸、(ii)0％、5％或10％(w/v)蔗糖和(iii)NaCl，濃度等于內部NaCl濃度乘以0.5、1、1.5或2.0。每種制劑的內部與外部介質如表3所述。表3
1nc＝與未冷凍的對照組相比外觀沒有顯著改變；粒子＝存在肉眼可見的粒子；渾濁＝樣本不如未冷凍的對照組那樣透明將表3所示樣本在-20℃下冷凍3小時，隨后融化至室溫。用肉眼觀察每份樣本冷凍損害的宏觀證據，例如肉眼可見的粒子的存在，和懸液的澄明度。具有低滲透梯度的樣本(表3中第1和13-14號樣本，其中的外部重量克分子滲透濃度小于內部重量克分子滲透濃度)可以見到在冷凍和融化之后是不均勻的，含有肉眼可見的粒子。相反，具有高滲透梯度的樣本(表3中第3、5-12和17-24號樣本)可以見到類似于未冷凍的對照樣本。接近等滲的樣本(表3中第2、4和15-16號樣本)具有中等外觀，既不象低滲透樣本那樣存在很多粒子，但是也不象對照組那樣澄明。值得注意的是接近等滲的樣本(樣本#16)內部與外部具有1.8％NaCl，其外觀介于中間，說明對冷凍損害的防護作用不僅僅是簡單的外部NaCl濃度增加的結果，而且也是跨越脂質體脂質雙分子層的高滲透梯度的結果。
在所進行的另一項支持本發明的實驗中，如實施例4所述，制備了含有順鉑的脂質體制劑。脂質體由HSPC、膽固醇和mPEG-DSPE組成，摩爾比分別為51/44/5。包埋在脂質體中的是順鉑的0.9％(w/v)NaCl溶液。外部的大批懸液介質由10mM組氨酸、濃度為0.9％、1.8％、2.7％或3.6％(w/v)的NaCl和濃度為5％、10％、15％或20％(w/v)的蔗糖組成。示范性制劑如表4所述。將脂質體樣本在-20℃下冷凍6.8天(大約118小時)，然后在室溫下靜置融化。測定每份樣本的平均脂質體粒徑，作為冷凍損害程度的量度。結果如表4所示。表4
*平均粒徑是對單一樣本進行三次測量的標準偏差。
如表4所示，當外部NaCl濃度增加至等滲濃度、即0.9％(w/v)NaCl以上時，經過單一凍/融周期之后的平均粒徑增加較小。在蔗糖的每種濃度下，即5％、10％、15％和20％(w/v)，NaCl濃度越高，防護脂質體微囊免遭凍/融損害就越好。提供對冷凍損害的最佳防護作用的外部組成是5％(w/v)蔗糖和3.6％(w/v)NaCl，其中粒子的粒徑沒有統計學增加。
表4第四欄所示數據證明，即使在沒有冷凍時，隨著外部重量克分子滲透濃度增加，也可測量到平均粒徑減少。這里的實驗說明，粒徑減少不是脂質體形狀改變的結果。盡管在高滲透梯度的存在下，預期脂質體發生皺縮，不過由于水的逐出，脂質體形狀的改變不應持續至用0.9％(w/v)NaCl稀釋300倍之后，稀釋之后通過動態光散射測量粒徑。實驗顯示，用3.6％(w/v)NaCl或蒸餾水稀釋高滲制劑，導致所測量的平均粒徑與用0.9％(w/v)NaCl稀釋的樣本相同。這提示隨著重量克分子滲透濃度的增加，測量到粒徑減少，這主要是由于微囊聚集狀態的改變。
表4所示的一個驚人結果是，增加外部蔗糖濃度并不顯著減少經過冷凍和融化之后粒徑生長的程度，特別是當外部NaCl濃度大于或等于1.8％(w/v)時。當外部NaCl濃度為2.7％或3.6時，數據提示較低的外部蔗糖濃度可能為這種特定的脂質體組合物提供最好的對冷凍損害的防護作用。為了進一步研究這一點，制備具有與實施例4所述相同組成的脂質體制劑，但是外部蔗糖濃度為1％、2％、3％、4％或5％(w/v)。將樣本在-20℃下冷凍3.9天(大約94小時)，融化至室溫，通過測量冷凍前后的平均粒徑，判定冷凍損害的程度。結果如表5所示。表5
*平均粒徑是對單一樣本進行三次測量的標準偏差。
表5所示結果與表4所示結果是一致的，說明對這種特定的脂質體制劑來說，在高外部NaCl濃度下，對低溫防護作用來說最佳的外部蔗糖濃度是相對低的。
上述實驗主要集中于經過冷凍和隨后的融化之后的粒徑生長，這一點可由凍/融損害的程度加以證明。這里所述的其他實驗涉及所包埋的治療劑的損失，以評價凍/融損害的程度。該實驗中，進一步分析了表5所示有些樣本在冷凍前后的藥物包封百分率。通過火焰原子吸收光譜測量所包埋的順鉑的百分率，如下列方法所述。結果如表6所述。
表6
*平均粒徑是對單一樣本進行三次測量的標準偏差。
順鉑的包封百分率與平均粒徑生長之間的相互關系是明顯的。例如，當存在粒徑生長時，例如通過動態光散射(DLS)測量到增加，發現順鉑經過冷凍和隨后的融化之后釋放。
為了確保在冷凍期間不生成少量較大粒子，在650nm下進行濁度測量(如下列方法所述)。濁度測量一般比動態光散射對樣本中的小批量大粒子更加敏感。如實施例4所述制備脂質體，但是外部蔗糖濃度保持恒定在3％(w/v)。外部NaCl濃度的范圍如表7所述。將樣本在-20℃下冷凍3.9天(大約93小時)，在室溫下靜置融化。然后通過DLS和濁度測定分析樣本，并與對照，也就是從未冷凍的樣本進行比較。結果如下表7所示。表7
*平均粒徑是對單一樣本進行三次測量的標準偏差。
通過濁度(冷凍與融化)與濁度(從未冷凍)之比測定一個凍/融周期所致濁度相對改變。比較表7的最后兩欄，由于對冷凍與融化的防護作用，平均粒徑生長與濁度相對改變之間的相互關系是明顯的。數據提示，在大于約3％(w/v)NaCl的存在下，由跨越脂質體雙分子層的滲透梯度的存在所提供的對凍/融損害的阻抗是良好的，特別是當外部蔗糖濃度為約1％至約10％之間，更優選為約1％至約5％之間，最優選為約2％至約4％之間。
確切地說，在外部介質的存在下，防護了用在上述實驗中的含有順鉑的脂質體組合物凍/融損害，外部介質含有約2.7％至約3.6％(w/v)之間的NaCl和約2％至約5％之間的蔗糖。
在另外一項實驗中，含有不同量低溫防護劑和鹽的脂質體制劑暴露于不同的凍/融條件。如上所述，從HPSC、mPEG-DSPE和膽固醇制得脂質體。將順鉑的0.9％(w/v)NaCl溶液包埋在脂質體中，調節外部介質，使其含有3.3％(w/v)NaCl和3％(w/v)蔗糖。將樣本制備一式三份，通過若干方法冷凍，包括(i)干冰/異丙醇浴約10分鐘，然后在-70℃冰庫內培育；(ii)干冰/異丙醇，然后在-20℃冰庫內培育；(iii)直接貯存在-70℃冰庫內；(iv)直接貯存在-35℃冰庫內，和(v)直接貯存在-20℃冰庫內。3.9天(大約94小時)后，融化所有樣本。每組一式三份樣本中，一份在室溫水中融化，一份在室溫空氣中融化，一份在2-8℃冰箱內融化。通過DLS測量粒徑，評價所有樣本的凍/融損害。唯一表現可測量的粒徑生長的樣本是冷凍在-70℃下的樣本，無論直接冷凍還是在引入干冰/異丙醇浴之后培育在-70℃冰庫內。粒徑生長取決于冷凍與融化條件，冷凍與融化速率越慢，所致凍/融損害越大，如下表8所示。
表8
1所有脂質體都具有919mOsm的滲透梯度(0.9％內部NaCl；3.3％外部NaCl+3％外部蔗糖+10mM外部組氨酸；假定順鉑大多數沉淀。)2縮寫N.A.＝不適用；DI/IPA，-70＝干冰/異丙醇，然后置于-70℃冰庫內；RT＝室溫。
*平均粒徑是對單一樣本進行三次測量的標準偏差。
該實驗提示，具有滲透梯度的脂質體組合物對至少-35℃的溫度具有防護凍/融損害的作用。
上述實驗已經證明，跨越脂質體雙分子層的滲透梯度為脂質體組合物提供抗凍/融損害的防護作用。不過，滲透梯度在非冷凍條件下不影響脂質體組合物的穩定性也是必要的。為了評價具有滲透梯度的脂質體組合物的穩定性，將樣本置于加速穩定性試驗中。具體來說，如實施例4所述制備兩批脂質體組合物。脂質體組合物含有HSPC、mPEG-DSPE和膽固醇，以及包埋的順鉑。外部水性懸液介質由3.3％(w/v)NaCl和3％(w/v)蔗糖組成。表9顯示試驗第1批與第2批和對照制劑的組分和濃度。
表9
將兩個試驗批次和對照制劑在不同溫度(如表10所示)下貯存長達3.5個月。在此3.5月期間，按一定間隔取出樣本進行DLS分析，以測定所包封的順鉑的百分率和平均粒徑。結果總結在表10中。表10
*平均粒徑是對單一樣本進行三次測量的標準偏差。
表10尤其闡述將第1批在-20℃下冷凍一周，導致所包封的藥物量下降6％。該樣本中，冷凍2周，所包封的藥物損失百分率為9％。如上所示，這些時間點的平均粒徑僅有微小增加。所選擇的包埋藥物損失9％證明粒徑幾乎沒有改變，這樣的產品浸劑不應危及功效或患者的安全，因為大多數藥物是包埋在脂質體中的。如上所示，第2批比第1批較少滲漏。
穩定性試驗說明，其中外部脂質體重量克分子滲透濃度高于內部重量克分子滲透濃度的、具有跨越脂質雙分子層的滲透梯度的脂質體組合物在產品運輸期間提供另外的對意外冷凍損害的防護作用，對產品穩定性的影響可以忽略不計。
III、脂質體組分A、脂質上面所討論的研究采用一種滲透梯度，也就是其中外部脂質體重量克分子滲透濃度高于內部重量克分子滲透濃度，可減少脂質體對冷凍損害的敏感性，這一點可以使用由氫化大豆磷脂酰膽堿(HSPC)、膽固醇和mPEG-DSPE組成的脂質體來顯示。不過，本領域技術人員將認識到，由各種脂質組合物組成的脂質體組合物都涵蓋其中。脂質體主要由成微囊脂質組成，也就是在水中能夠自發形成雙分子層微囊的脂質體，例如磷脂。這種類型的成微囊脂質優選地具有兩條烴鏈，通常為酰基鏈，和一個頭基，是極性或非極性的。有各種合成的成微囊脂質和天然存在的成微囊脂質，包括磷脂，例如磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酰絲氨酸、磷脂酸、磷脂酰肌醇和神經鞘磷脂，其中兩條烴鏈通常長約12-22個碳原子，并且具有不同的不飽和度。其酰基鏈具有不同不飽和度的上述脂質和磷脂是市售的，或者可以按照文獻方法加以制備。關于脂質合成的參考文獻包括(i)Mason等“異構體純的飽和混合鏈磷脂酰膽堿的合成方法”《生物化學年報》113(1)96-101(1981)；(ii)Zalipsky，S.“端基官能化的聚乙二醇-脂質綴合物的合成，用于聚合物-接枝脂質體的制備”《生物綴合物化學》4(4)296-299(1993)。
脂質體還可以包括穩定地結合在脂質體脂質雙分子層內的脂質，例如二酰基甘油、溶血磷脂、脂肪酸、糖脂、腦苷脂和固醇，例如膽固醇。
如果需要的話，脂質體還可以包括與親水性聚合物衍生的成微囊脂質，例如美國專利No.5,013,556所述。在脂質體組合物中包括衍生的脂質會在脂質體周圍形成親水性聚合物鏈的表面包衣。與缺少這樣一種包衣的脂質體相比，親水性聚合物鏈的表面包衣有效增加脂質體的體內血液循環壽命。
適合與親水性聚合物衍生的成微囊脂質包括上文列舉的任意那些，確切地是磷脂，例如二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE)。
適合與成微囊脂質衍生的親水性聚合物包括聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯甲醚、聚甲基噁唑啉、聚乙基噁唑啉、聚羥丙基噁唑啉、聚羥丙基異丁烯酰胺、聚異丁烯酰胺、聚二甲基丙烯酰胺、聚羥丙基異丁烯酸酯、聚羥乙基丙烯酸酯、羥甲基纖維素、羥乙基纖維素、聚乙二醇、聚天冬酰胺和親水性肽序列。聚合物可以采用其均聚物、共聚物和嵌段或無規共聚物的形式。
優選的親水性聚合物鏈是聚乙二醇(PEG)，PEG鏈的分子量優選為約500道爾頓至約10,000道爾頓，更優選為約1,000道爾頓至約5,000道爾頓。PEG的甲氧基或乙氧基蓋帽(capped)的類似物也是優選的親水性聚合物，市售的各種大小的聚合物，例如約120道爾頓至約20,000道爾頓。
與親水性聚合物衍生的成微囊脂質的制備例如已經描述在美國專利No.5,395,619中。包括這類衍生的脂質的脂質體的制備也已經描述過，它們通常含有約1-20摩爾百分率的包括在脂質體組合物中的這樣一種衍生的脂質。
B、包埋的試劑脂質體通常還包括包埋的試劑和/或藥物，其中“包埋”打算包括在脂質體的水性內核和水性空間中試劑和/或藥物的包封，另外試劑和/或藥物還包埋在脂質體的脂質雙分子層中。
用在本發明的脂質體組合物中的試劑和/或藥物是各種各樣的，例如包括治療應用和診斷應用。
治療劑和/或藥物包括天然與合成的化合物，具有下列治療活性抗關節炎、抗心律失常、抗細菌、抗膽堿能、抗凝血、抗利尿、解毒、抗癲癇、抗真菌、抗炎、抗代謝、抗偏頭痛、抗腫瘤、抗寄生物、退熱、抗癲癇發作、抗血清、抗痙攣、止痛、麻醉、β-阻滯、生物反應調節、骨代謝調節、心血管、利尿、酶、生育力增強、生長促進、止血、激素、激素抑制、高鈣血癥減輕、低鈣血癥減輕、低血糖減輕、高血糖減輕、免疫抑制、免疫增強、肌肉松弛、神經傳遞、擬副交感、擬交感的血漿增容、血漿膨脹、治療精神病、溶解血栓和血管舒張。
在優選的實施方案中，所包埋的試劑是“細胞毒性藥物”，也就是對靶細胞具有有害或毒性作用的藥物。示范性細胞毒性試劑包括蒽環抗生素，例如阿霉素、柔紅霉素、表柔比星和伊達比星，和它們的類似物，例如epirubidin和米托蒽醌；鉑化合物，例如順鉑、卡鉑、奧馬鉑、奧沙利鉑、折尼鉑、恩洛鉑、洛鉑、螺鉑、((-)-(R)-2-氨基甲基吡咯烷(1，1-環丁烷二羧酸離子)鉑)(DWA2114R)、(SP-4-3(R)-1，1-環丁烷二羧酸離子(2-)-(2-甲基-1，4-丁二胺-N，N’)鉑)(CI-973)、奈達鉑(254-S)和(雙-乙酸離子-胺-二氯-環己胺-鉑(IV))(JM-216)(Weiss等《藥物》46(3)360-377(1993))；和長春花屬生物堿，例如長春新堿、長春花堿、長春羅新、長春羅定、長春瑞濱(諾威本)和長春地辛。
另一類細胞毒性試劑是拓撲異構酶I抑制劑，例如喜樹堿及其類似物，包括SN-38((+)-(4S)-4，11-二乙基-4，9-二羥基-1H-吡喃并[3’，4’6，7]-中氮茚并[1，2-b]喹啉-3，14(4H，12H)-二酮)；9-氨基喜樹堿；9-硝基喜樹堿；托泊替堪(hycamtin；9-二甲基-氨基甲基-10-羥基喜樹堿)；伊立替康(CPT-11；7-乙基-10-[4-(1-哌啶子基)-1-哌啶子基]-羰基氧基-喜樹堿)，它在體內水解為SN-38)；7-乙基喜樹堿及其衍生物(Sawada等《化學與藥學通報》41(2)310-313(1993))；7-氯甲基-10，11-亞甲-二氧基-喜樹堿；和其他(SN-22，Kunimoto等《藥物生物動力學雜志》10(3)148-151(1987)；DX-8951f和GG-211((7-(4-甲基哌嗪基-亞甲基)-10，11-亞乙二氧基-20(S)-喜樹堿))(Rothenberg《腫瘤學年鑒》8(9)837-855(1997))，和7-(2-(N-異丙氨基)乙基)-(20S)-喜樹堿(Chong KunDang公司，Seoul，韓國，CKD602)。
在本發明的優選實施方案中，組合物用于脂質體的防護，該脂質體包埋具有高離子強度的治療劑和/或藥物，例如上述順鉑及其有關類似物。
C、鹽和低溫防護劑脂質體組合物的外部懸液介質通常比內部脂質體介質具有更高的重量克分子滲透濃度。增加重量克分子滲透濃度主要是通過向外部介質中加入一種鹽而提供的。任何水溶性鹽都適合于此目的。例如，所涵蓋的鹽選自硝酸鹽、鈉鹽、鉀鹽、銨鹽和硫酸鹽。在優選的實施方案中，鹽是NaCl或KCl。
外部介質還包括低溫防護劑，一般是如上所定義的，包括糖、甘油和聚乙二醇。糖可以是二糖或單糖，示范性糖包括海藻糖、麥芽糖、蔗糖、葡萄糖、乳糖、葡聚糖和氨基苷類。
所有公開出版物、專利和專利文獻均引用在此作為參考文獻，如同分別引用作為參考文獻。已經根據各種具體和優選的實施方案和技術對發明進行了描述。不過，應當認為可以在本發明的精神和范圍內進行很多修改和改變。
下列實施例打算闡述而非限制發明。
材料DSPE購自Avanti Polar Lipids(伯明翰，AL)，甲氧基聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(mPEG-DSPE，mPEG MW 2000道爾頓)來自Sygena，Inc.(劍橋，MA)。膽固醇來自Slovay制藥(Veenedaal，荷蘭)。HSPC由Lipoid K.G.(Ludwigshafen，德國)制造。順鉑來自W.C.Heraeus GmbH(Hanau，德國)。
方法1、脂質體粒徑利用Coulter N4MD型(Coulter Corp，邁阿密，FL)，通過動態光散射測定脂質體粒徑。除非另有注解，將每種脂質體組合物用0.9％(w/v)NaCl稀釋約300倍，再用不同角度(90°和30°)的光柱進行DSL測量。測量在20℃下重復進行三次。
2、順鉑的包封百分率通過凝膠排阻色譜法分離脂質體和游離藥物，利用Perkin-Elmer3110型，通過火焰原子吸收光譜分析各部分的總Pt含量。
3、濁度將脂質體用0.9％(w/v)NaCl稀釋5倍，再在室溫下測量650nm下的光密度(OD650nm)，使用0.9％NaCl(w/v)作為空白。由冷凍與融化所導致的濁度相對改變被定義為OD650nm(冷凍與融化)與OD650nm(從未冷凍)之比。
實施例1在滲透梯度存在下的低溫防護作用A、脂質體安慰制劑內部蔗糖向60-65℃無水乙醇中加入摩爾比為51/44/5的脂質HSPC、膽固醇和mPEG-DSPE，得到0.002摩爾脂質/每毫升乙醇，混合直至溶解，大約1小時。向0.9％(w/v)NaCl和5％(w/v)蔗糖的無菌水溶液中加入溶解后的脂質，得到總脂質濃度為大約126mg/ml。在滲析后樣本稀釋到總脂質體濃度大約為100nm。
B、脂質體安慰制劑無內部蔗糖向60-65℃無水乙醇中加入摩爾比為51/44/5的脂質HSPC、膽固醇和mPEG-DSPE，得到0.002摩爾脂質/每毫升乙醇，混合直至溶解，大約1小時。向0.9％(w/v)NaCl的無菌水溶液中加入溶解后的脂質，得到總脂質濃度為大約126mg/ml。
關于上述A和B兩種制劑，使脂質體在60-65℃下水合，同時機械攪拌大約1小時，再在60-65℃下利用孔徑為0.1微米的聚碳酸酯膜通過擠出作用形成直徑大約為120nm的單層微囊。除去乙醇，通過透析調節外部水性介質至0.9％(w/v)NaCl和5％(w/v)蔗糖。
C、冷凍和融化條件將上述A和B中形成的脂質體懸液的3ml室溫等份試樣置于10ml透明玻璃血清小瓶中。將小瓶置于常規-20℃冰庫內2.7天。然后從冰庫中取出樣本，置于室溫下融化。
D、樣本的分析通過動態光散射測定融化后每種制劑以及每種制劑的對照(對照表示樣本沒有冷凍)樣本的脂質體粒徑。結果如表1所示。
實施例2具有不同NaCl外部濃度的脂質體制劑脂質體是這樣制備的，將摩爾比為51/44/5的脂質HSPC、膽固醇和mPEG-DSPE溶于60-65℃無水乙醇，得到0.002摩爾脂質/每毫升乙醇。向0.9％(w/v)NaCl中加入溶解后的脂質，得到總脂質濃度為大約126mg/ml。將脂質水溶液混合，形成脂質體。隨后通過擠出作用減少脂質體的大小。透析后，使總脂質達到約100mM(在用5％蔗糖和0.9％、0.45％或0％NaCl稀釋3倍之前，如下所述)。
通過透析作用，將外部大批介質用含有0.9％(w/v)NaCl和5％(w/v)蔗糖的介質置換。將制劑用5％(w/v)蔗糖和0.9％、0.45％或0％(w/v)NaCl水溶液稀釋3倍，得到5％(w/v)蔗糖和0.9％、0.6％或0.3％(w/v)NaCl的外部介質。
將每種制劑的樣本在-20℃下冷凍4.9天。將樣本在室溫下靜置融化，然后通過動態光散射測定粒徑。結果如表2所示。
實施例3表3的脂質體制劑如實施例1和2所述制備表3所述脂質體制劑，并作下列修改(i)關于一半樣本，用于水合的含水相是0.9％NaCl，另一半是1.8％NaCl；和(ii)用組氨酸以及不同量的NaCl和蔗糖進行透析之后的稀釋，使外部[NaCl]和[蔗糖]達到表3所示的值，并且含有0.5mM pyranine。pyranine是一種熒光探針，它不影響凍/融實驗的結果。所有水合介質除了NaCl以外都含有0.5mM pyranine。
實施例4包埋有順鉑的脂質體在內襯特氟隆的壓力容器內將無菌水加熱至63-67℃，加入氯化鈉(0.9％)。加入濃度為8.5mg/ml的順鉑，混合直至溶解，大約15-25分鐘。向60-65℃的900ml無水乙醇中加入257.0g PEG-DSPE、719.4gHSPC和308.4g膽固醇(摩爾比為50.6/44.3/5.1)，混合直至溶解，大約2小時。向7670g藥物溶液中加入溶解后的脂質，得到總脂質濃度為大約150mg/ml。
向溫熱(63-67℃)的藥物溶液中迅速加入溫熱的脂質溶液，同時攪拌，形成大小不均的脂質體懸液。將懸液在63-67℃下混合一小時。水合混合物中的順鉑濃度為7.7mg/ml，在此階段，大約30％的藥物被包封在脂質體中。總溶液體積的10％是乙醇，總脂質濃度為150mg脂質/ml。
通過調節通過安放在內襯特氟隆的不銹鋼容器內的聚碳酸酯濾筒的擠出作用，使脂質體形成所需的平均粒子直徑。在6-8個小時的整個擠出過程中，脂質體懸液保持在63-65℃。
調整大小后，將脂質體懸液冷卻至2-8℃過夜，然后溫熱至室溫(20-25℃)，再通過1.2μm 142-mm Gelman Versapor濾器(尼龍66載體上的丙烯酸共聚物)過濾，以除去所沉淀的藥物。
將NaCl溶于無菌水，制得0.9％(w/v)NaCl水溶液。將溶液的pH用2N HCl或NaOH調至大約5.5。將溶液通過0.22μm Durapore濾器過濾。
將脂質體懸液用NaCl溶液按大約1∶1(v/v)稀釋，通過聚砜中空纖維超濾器滲濾。對NaCl溶液進行八體積置換，以除去乙醇和未包封的藥物。加工流體溫度保持在約20-30℃。總滲濾時間為大約4.5小時。
然后通過超濾作用將脂質體懸液濃縮至大約1.2mg順鉑/ml。通過HPLC分析滲濾過程后流體的順鉑含量。脂質體的內相為7.7mg/ml順鉑的0.9％ NaCl溶液，外相為含水0.9％NaCl。
將脂質體制劑的樣本置于玻璃小瓶中，加入固體NaCl和蔗糖，得到外部NaCl濃度在0.9％-3.6％(w/v)之間，外部蔗糖濃度在約1％至約20％(w/v)之間，假定在加入固體之前，外部介質的體積占總體積的85％。將每份樣本在-20℃下冷凍6.8天，然后在室溫下靜置融化。測定每份樣本中脂質體的平均粒徑，作為冷凍損害程度的量度。結果如表4所示。
盡管已經根據特定的實施方案對發明進行了描述，不過對本領域技術人員來說顯而易見的是可以進行各種改變和修改而不背離發明。
權利要求
1.防護凍/融損害的脂質體組合物，包含脂質體的懸液，其中每粒脂質體含有具有一定內部重量克分子滲透濃度的被包埋的水性介質，該脂質體是懸浮在由水溶性鹽和低溫防護劑組成的外部介質中的，所述外部介質具有高于內部脂質體重量克分子滲透濃度的外部脂質體重量克分子滲透濃度，由此建立跨越每粒脂質體的內低/外高的滲透梯度。
2.權利要求1的組合物，其中該外部介質包括一種鹽，選自由硝酸鹽、鈉鹽、鉀鹽、銨鹽和硫酸鹽組成的組。
3.權利要求1的組合物，其中該低溫防護劑是二糖。
4.權利要求1的組合物，其中該低溫防護劑是單糖。
5.權利要求1的組合物，其中該低溫防護劑選自由海藻糖、麥芽糖、蔗糖、葡萄糖、乳糖、葡聚糖、甘油、聚乙二醇和氨基苷類組成的組。
6.權利要求2的組合物，其中該鹽選自氯化鈉(NaCl)和氯化鉀(KCl)或其組合。
7.權利要求1的組合物，進一步包含包埋在該脂質體中的治療劑。
8.權利要求7的組合物，其中該脂質體包括與親水性聚合物鏈衍生的成微囊脂質。
9.權利要求8的組合物，其中該治療劑是順鉑或順鉑類似物或其衍生物。
10.用于防護脂質體組合物凍/融損害的方法，包括制備脂質體的懸液，其中該懸液中的每粒脂質體包含具有一定內部重量克分子滲透濃度的被包埋的水性介質，該脂質體是懸浮在由水溶性鹽和低溫防護劑組成的外部介質中的，所述外部介質具有高于內部脂質體重量克分子滲透濃度的外部脂質體重量克分子滲透濃度，由此建立跨越每粒脂質體的內低/外高的滲透梯度。
11.權利要求10的方法，其中該外部介質包括一種鹽，選自由硝酸鹽、鈉鹽、鉀鹽、銨鹽和硫酸鹽組成的組。
12.權利要求10的方法，其中該低溫防護劑是二糖。
13.權利要求10的方法，其中該低溫防護劑是單糖。
14.權利要求10的方法，其中該低溫防護劑選自由海藻糖、麥芽糖、蔗糖、葡萄糖、乳糖、葡聚糖、甘油、聚乙二醇和氨基苷類組成的組。
15.權利要求11的方法，其中該鹽選自氯化鈉(NaCl)和氯化鉀(KCl)或其組合。
16.用于防護含有金屬配位化合物的脂質體組合物凍/融損害的方法，包括制備脂質體的懸液，其中該懸液中的每粒脂質體包含具有一定內部重量克分子滲透濃度的被包埋的水性介質和金屬配位化合物，該脂質體是懸浮在由水溶性鹽和低溫防護劑組成的外部介質中的，所述外部介質具有高于內部脂質體重量克分子滲透濃度的外部脂質體重量克分子滲透濃度，由此建立跨越每粒脂質體的內低/外高的滲透梯度。
17.權利要求16的方法，其中該金屬配位化合物是順鉑或順鉑類似物或其衍生物。
18.權利要求17的方法，其中該外部介質中的鹽是NaCl，該低溫防護劑是蔗糖。
19.用于改善冷凍脂質體懸液的方法，包括在該脂質體懸液中結合低溫防護劑和水溶性鹽，以有效建立跨越每粒脂質體的滲透梯度，該懸液介質具有高于脂質體內部的重量克分子滲透濃度。
20.權利要求19的方法，其中該滲透梯度至少是100mOsm。
全文摘要
描述了一種脂質體組合物,它提高了對凍/融損害的防護作用。脂質體組合物含有跨越脂質體脂質雙分子層的滲透梯度,其中外部介質的重量克分子滲透濃度高于脂質體內部介質的重量克分子滲透濃度。通常,外部介質包括一種鹽和一種低溫防護劑,以增加重量克分子滲透濃度。
文檔編號A61K47/24GK1361682SQ00810438
公開日2002年7月31日 申請日期2000年7月14日 優先權日1999年7月16日
發明者R·M·阿布拉, A·R·迪布爾 申請人:阿爾薩公司