用作TNF－α信號傳導途徑抑制物的TRAF2變體的制作方法

專利名稱：用作TNF－α信號傳導途徑抑制物的TRAF2變體的制作方法
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腫瘤壞死因子α(TNFα)是多種細胞產生的免疫應答中的細胞間遞質，包括活化的巨噬細胞和單核細胞。由TNFα激發的應答通過它與兩個獨特的TNFα細胞表面受體TNFαR1和TNFαR2之間的相互作用啟動。TNFα與這些細胞表面受體結合并激發轉錄因子的活化，例如，核因子κB(NFκB)，它們調節多種免疫和炎性應答基因的表達。
憑借TNFα的結合，TNFα受體通過它們的胞質結構域與多種細胞內信號翻譯蛋白質相互作用。已知與TNFα受體相關的一組細胞內信號翻譯蛋白質是腫瘤壞死因子受體相關因子，即已知為受體蛋白的“TRAF”家族。TRAF家族由許多具有共同結構特征的同源蛋白質組成，它們與TNFα受體蛋白相聯系并從中傳導信號。TRAF蛋白缺少酶促活性基元，而似乎顯示接頭蛋白質的功能，它可將載體偶聯至下游信號傳導級聯中。該家族的一個成員，TRAF2，與許多TNFα受體家族蛋白質相聯系，包括TNFαR1、TNFαR2、CD40和CD30。對于TRAF2，已鑒定至少有8個細胞內分子與其直接結合。TRAF2已顯示出對于TNFα介導的各種轉錄因子的活化是關鍵的，尤其是對NFκB和C-jun N-末端激酶(JNK/SAPK)，這些轉錄因子依次負責免疫/炎性應答的表達。
有多種疾病與受TNFα結合控制的所調節途徑有關系。在某些情況下，TNFα結合激發了最終導致疾病的炎性應答。因此，需要開發預防與TNFα受體結合相關的疾病的方法。尤其期望找到預防炎性應答激活的方法，所述應答原本會被TNFα的激活所引發。為了治療和預防與TNFα結合相關的疾病，本發明提供了以TRAF2為基礎并能抑制TNFα信號傳導途徑的多肽。
已報道的進展TRAF蛋白的一般結構已被描述并在

圖1(a)中進行了大致說明，該圖顯示了圖表形式的全長TRAF2(TRAF-FL)。這些蛋白質具有帶鋅環指基元的N-末端區，隨后是一列類鋅指結構。鋅指區之后是由兩個亞結構域組成的保守(TRAF)結構域N-末端結構域和C-末端結構域。C-末端結構域涉及受體的結合和TRAF的同源及異源寡聚化作用，它是各種其它信號傳導蛋白質的停泊位點。
TRAF2遵循上述TRAF蛋白質的一般結構。已有許多研究試圖將TRAF2蛋白質結構的亞結構域與該蛋白的功能相聯系起來。
Takeuchi等對TRAF2進行了廣泛的突變分析(Takeuchi等，生物化學雜志J.Biol.Chem.，271(33)19935-42(1996))。這些研究顯示TRAF2由介導獨特活性的模塊化結構域組成。作者確定TRAF2的N-末端環指及兩個相鄰的鋅指是NFκB激活所需要的，而TRAF結構域中的獨特的TRAF-N和TRAF-C亞結構域看來是獨立介導自身結合及其與TRAF1的相互作用。
Song等(美國國家科學院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，94，9792-9796(1997))隨后的研究顯示TNFα誘導的NFκB及c-jun N-末端激酶(JNK/SAPK)活化需要TRAF2。作者顯示，TRAF2是兩激酶級聯反應導致NFκB和JNK激活的分支點。此報告支持了TRAF2及TRAF家族其它成員作為接頭蛋白質的功能性模型，其中具有起始平行下游應答之附加信號蛋白質的停泊位點。
Min等(免疫學雜志(J.Immunology)，159，3508-3518(1997))用轉染/過表達的策略來分析TRAF蛋白質的作用。先前已顯示含TRAF結構域但缺少氨基末端殘基1-80的TRAF2可抑制TNFα誘導NFκB的活化。作者證實此TRAF2變體還阻斷TNFα對JNK的激活作用。
Brink等(生物化學雜志(J.Biol.Chem.)，273，7，4129-4134(1998))描述了一種TRAF2的剪接變體，他們稱之為“TRAF2A”。TRAF2A的cDNA除了具有附加的21bp序列外，其余部分與TRAF2相同，此21bp序列編碼的7個氨基酸插入TRAF2A環指結構域中。作者發現TRAF2AmRNA的表達以組織特異的方式被調節，且TRAF2A蛋白能與TNFαR2的胞質結構域結合。他們還發現，與TRAF2相反，當TRAF2A在293細胞中過表達時，它不能刺激NFκB活性，而是充當TNFαR2依賴型NFκB活化的主要抑制物。
許多研究已將炎性過程和TNFα與主要的心血管疾病聯系起來(Bryant等，循環(Circulation)，97(14)1375-81(1998)；Kubota等，循環研究(Circ.Res.)，81(4)627-35(1997)；Muller Werdan等，歐洲細胞因子網(Eur.Cytokine Netw.)，9(4)689-91(1998)；Aukrust等，美國心血管雜志(Am.J.Cardiol.)，83(3)376-82(1999))。在過去的五年中，積累的證據已表明，局部TNFα水平的提高與以下疾病相關(a)心肌梗死、冠狀動脈旁路手術、心臟移植后的心臟局部缺血-再灌注損傷或中風后CNS中的局部缺血-再灌注損傷；(b)嚴重冠狀動脈粥樣硬化斑的加重和斷裂；(c)充血性心力衰竭的發展和加重；以及(d)球囊血管成形術之后的內皮細胞損傷。此外，最近的發現顯示細胞程序死亡可能是心力衰竭或梗塞期間心肌細胞死亡的病理生理學中的一個重要因素。
除上述心血管疾病外，還有許多其它疾病的發病機理與TNFα相關。這些疾病包括克隆病(Crohn’s disease)、牛皮癬、類風濕性關節炎、移植中的排斥反應(graft versus host disease)、炎性腸疾病、非胰島素依賴型的糖尿病和神經變性疾病(如帕金森癥)。
由于TNFα與多種諸如上文所述疾病之間的相互關系，所以希望為抑制和治療這些疾病提供組合物和方法。
發明概述按照本發明，已發現TRAF2變體，尤其是含天然剪接變異的變體(TRAF2TR)和含天然剪接變異且在TRAF2 N-末端區缺失的變體(TRAF2TD)，可抑制TNFα的信號傳導及相關的免疫炎性應答。
按照本發明的實施方案，提供了編碼TRAF2TR的DNA序列，包括如圖2a所示的序列。
按照本發明的另一實施方案，提供了編碼TRAF2TD的DNA序列，包括如圖3a所示的序列。
在優選的實施方案中，TRAF2TR和TRAF2TD DNA是cDNA。
在其它的實施方案中，本發明提供了含如圖2b所示氨基酸序列并能抑制腫瘤壞死因子α(TNFα)所調節途徑的TRAF2TR多肽，以及含如圖3b所示氨基酸序列并能抑制腫瘤壞死因子α(TNFα)所調節途徑的TRAF2TD多肽。
本發明的另一方面提供了抑制患者中TNFα調節的途徑的方法，包括將能抑制TNFα所調節途徑的組合物引入患者體內，該組合物包含能表達TRAF2TR多肽的表達載體、能表達TRAF2TD多肽的表達載體、TRAF2TR多肽及藥學可接受載體或TRAF2TD多肽及藥學可接受載體。
本發明的另一方面是提供了抑制TNFα過度產生所涉及疾病的方法，包括將能抑制TNFα所調節途徑的組合物施用于患者，該組合物包括能表達TRAF2TR多肽的表達載體、能表達TRAF2TD多肽的表達載體、TRAF2TR多肽及藥學可接受載體或TRAF2TD多肽及藥學可接受載體。
本發明還有另一方面提供了抑制TNFα病理的方法，所說病理涉及核因子κB(NFκB)依賴型基因超活化，該方法包括將能抑制TNFα所調節途徑的組合物施用于患者，該組合物包括能表達TRAF2TR多肽的表達載體、能表達TRAF2TD多肽的表達載體、TRAF2TR多肽及藥學可接受載體或TRAF2TD多肽及藥學可接受載體。
本發明還提供了抑制涉及腫瘤壞死因子α的發炎過程的方法，包括將能抑制TNFα所調節途徑的組合物施用于患者，該組合物包括能表達TRAF2TR多肽的表達載體、能表達TRAF2TD多肽的表達載體、TRAF2TR多肽及藥學可接受載體或TRAF2TD多肽及藥學可接受載體。
在某些實施方案中，所述發炎過程選自以下疾病克隆病、牛皮癬、類風濕性關節炎、移植中的排斥反應、炎性腸疾病、非胰島素依賴型的糖尿病和神經變性疾病。
在另一些實施方案中，發炎過程是選自以下的心血管疾病(a)心肌梗死、冠狀動脈旁路手術、心臟移植或中風后CNS中的局部缺血-再灌注損傷引起的心臟局部缺血-再灌注損傷；(b)嚴重冠狀動脈粥樣硬化斑的加重和斷裂；(c)充血性心力衰竭的發展和加重；(d)球囊血管成形術之后的內皮細胞損傷；以及(e)心肌細胞的程序性細胞死亡。
本發明的另一方面，提供了編碼TRAF2TR/2TD變體的DNA序列。
本發明的另一方面，提供了能抑制TNFα所調節途徑的TRAF2TR/2TD變體多肽。
本發明所提供產物具有能治療多種疾病的優勢，它利用天然存在的蛋白質的變體干擾這些疾病共同的早期過程，即TNFα信號傳導。
附圖概述圖1是全長TRAF2(TRAF2-FL)及其剪接變體TRAF2TR的示意結構。圖2a和2b是TRAF2TR cDNA的核酸序列(2a)和TRAF2TR的氨基酸序列(2b)。圖3a和3b是TRAF2TD cDNA的核酸序列(3a)和TRAF2TD的氨基酸序列(3b)。圖4a和4b是剪接過的TRAF2(TRAF2TR)和全長TRAF2的核酸(4a)及氨基酸(4b)排列。圖5說明了TRAF2TR變體mRNA的組織分布。泳道1-對照TRAF2FL cDNA；2-對照TRAF2剪接變體(TRAF2TR)cDNA；3-Jurkat；4-HeLa細胞系；5-胸腺；6-胎盤；7-胸腺；8-脾；9-卵巢；10-對照TRAF2FL。圖6描述了在被轉染HeLa細胞中Nyc-融合的TRAF2FL和TRAF2TR的免疫檢測。泳道1-pcDNA3載體；2-myc-TRAF2FL；3-myc-TRAF2TR。圖7圖示了用NFKB UAS探針進行的電泳遷移率變動測定(EMSA)。來自FL TRAF2過表達細胞的核提取物(泳道3和4)顯示TNF-α誘導的遷移變動明顯強于對照(泳道1和2)。TRAF2-TR過表達阻斷了NF-κB的形成，并因此在TNF-α刺激的細胞中未檢測到遷移變動條帶(泳道5和6)。
發明詳述以下是本文所用術語的定義及本發明優選實施方案的描述。定義
“克隆載體”是一復制子，例如，質粒、噬菌體或粘粒，另一DNA片段可連于其上從而使所連接片段得以復制。“復制子”是用作體內DNA自主復制單位的任何遺傳元件(如質粒、染色體、病毒)，即能在其自身控制下復制。克隆載體可以在一種細胞類型中復制而于另一種細胞中表達(“穿梭載體”)。在本發明的優選實施例中，克隆載體能于宿主細胞中表達，且“表達載體”能表達足以干擾細胞中TNF-α所調節途徑的量的TRAF2TR和TRAF2TD。
“盒”指能在一個或多個特異限制位點插入載體的DNA片段。DNA片段編碼目的多肽，而盒及限制位點的設計要保證盒在轉錄和翻譯的正確閱讀框架處插入。
當外源或異源DNA已被引入細胞中時，細胞就被所說的DNA“轉染”了。當所轉染DNA引起表型改變時，此細胞就已被外源或異源DNA“轉化”了。轉化的DNA可整合入(共價連接)組成細胞基因組的染色體DNA中。
“核酸分子”指核糖核苷(腺苷、鳥苷、尿苷或胞苷；“RNA分子”)或脫氧核糖核苷(脫氧腺苷、脫氧鳥苷、脫氧胸苷或脫氧胞苷；“DNA分子”)的磷酸酯聚合形式或它們的任何磷酸酯類似物，如硫代磷酸酯和硫酯，可以是單鏈形式或雙鏈螺旋。雙鏈DNA-DNA、DNA-RNA和RNA-RNA螺旋是可能的。術語“核酸分子”，特別是DNA或RNA分子，只指該分子的一級和二級結構，并未將其限制于任何三級結構的形式。因此，此術語包括許多分子中，尤其是線性或環狀DNA分子(如限制片段)、質粒及染色體中的雙鏈DNA。在對特殊的雙鏈DNA分子結構的討論中，序列在此可按正常慣例進行描述，即給出的只是沿DNA非轉譯鏈的5’至3’方向的序列(即，所具序列與mRNA同源的鏈)。“重組DNA分子”是經過分子生物學操作的DNA分子。
當核酸分子的單鏈形式能在適當的溫度和離子強度條件下與其它核酸分子如cDNA、基因組DNA或RNA退火時，則對于該另一核酸分子來說，此核酸分子就是“可雜交的”(見Sambrook等，見下文)。溫度和離子強度條件決定了雜交的“嚴格謹性”。雜交要求兩核酸間含互補序列，盡管依賴于雜交的嚴謹性，堿基之間的錯配還是有可能的。對于核酸雜交來說，恰當的嚴謹性取決于核酸長度和互補的程度，這些變量是本領域眾所周知的。
用于此處時，術語“寡核苷酸”指可與編碼TRAF2的基因組DNA分子、cDNA分子或mRNA分子雜交且通常至少18個核苷酸長的核酸。寡核苷酸可被標記，例如，用32P-核苷酸或標記物(諸如生物素之類)已共價連接其上的核苷酸進行標記。在一實施方案中，標記后的寡核苷酸可用作探針檢測編碼TRAF2之核酸的存在。在另一實施方案中，寡核苷酸(其中之一或兩個均可被標記)能用作PCR引物，用于克隆全長或部分長度的TRAF2，或用于檢測編碼TRAF2的核酸的存在。在進一步的實施方案中，寡核苷酸可與TRAF2 DNA分子形成三鏈螺旋。一般說來，寡核苷酸可合成制備，優選用核酸合成儀。因此，可用非天然存在的磷酯類似鍵制備寡核苷酸，諸如硫酯鍵等。
DNA“編碼序列”是指當置于適當調節序列控制下時，在體外或體內細胞中被轉譯和翻譯成多肽的雙鏈DNA序列。DNA編碼序列及合適的調節序列優選提供于表達載體中。編碼序列的邊界決定于5’(氨基)末端的起始密碼子和3’(羧基)末端的翻譯終止密碼子。編碼序列可以包括，但不局限于，原核序列、來自真核mRNA的cDNA、來自真核(如哺乳動物)DNA的基因組DNA序列，甚至是合成的DNA序列。若編碼序列預期用于真核細胞中表達，則多腺苷酸化信號和轉錄終止序列通常將位于編碼序列的3’端。
轉錄和翻譯控制序列是DNA調節序列，如提供編碼序列在宿主細胞中的表達的啟動子、增強子和終止子。在真核細胞中，多腺苷酸化信號是控制序列。
“啟動子序列”是能結合細胞中的RNA聚合酶并起始下游(3’方向)編碼序列轉錄的DNA調節區。為了對本發明進行說明，啟動子序列在3’末端被轉錄起始位點限定并向上游(5’方向)延伸，包括起始背景以上可檢測水平的轉錄所必需的最小數目堿基或元件。在啟動子序列中可找到轉錄起始位點(可方便地確定，例如，用核酸酶S1作圖)，以及負責RNA聚合酶結合的蛋白質結合結構域(共有序列)。
當RNA聚合酶將編碼序列轉譯成mRNA，然后被剪接(如編碼序列含內含子)并翻譯成編碼序列編碼的蛋白質時，則編碼序列處于細胞中轉錄和翻譯控制序列的“控制下”。
用于此處時，術語“同源”指蛋白質間具有“共同進化起源”的相互關系。這樣的蛋白質(及它們的編碼序列)具有序列同源性，反映在它們的序列具有高度的相似性。術語“序列相似性”指具有或不具有共同進化起源的蛋白質核酸或氨基酸序列間的相同或一致程度。不過，在通常使用及本文中，當用諸如“高度”之類副詞修飾時，術語“同源的”可能指序列相似性而非共同的進化來源。
術語“TNFα所調節途徑”及相關術語指涉及TNFα與腫瘤壞死因子受體家族(TNFR)成員結合的信號所調節途徑。
術語“相當于”用于此處是指相似或同源序列在確定位置是否與相似性或同源性已測定的分子相同或不同。核酸或氨基酸序列排列可包括間隔。因此，術語“相當于”指序列相似性而非氨基酸殘基或核苷酸堿基的編號。
術語“剪接變體”指由這樣的mRNA編碼的多肽，此mRNA由一個或多個基因編碼的全長mRNA經過另外的加工后產生，導致mRNA相對于原基因的全長mRNA來說含一個或多個缺失。
本發明的實施方案本發明涉及抑制TNFα信號傳導途徑的TRAF2的兩個變體。一實施方案是在下文被稱為“截短的TRAF2”或“TRAF2TR”的TRAF2 RNA加工剪接變體。另一實施方案是基于缺失相當于TRAF2TR第1-87位氨基酸殘基的TRAF2TR，它被稱為“截短并缺失的TRAF2”或“TRAF2TD”。TRAF2TR和TRAF2TD都具有抑制TNFα信號傳導途徑的能力。由于TRAF2TD顯著降低對TNFα結合之應答的能力，所以它是尤其優選的實施方案。
下文是這兩個實施方案結構的描述，隨后是關于如何制備這些實施方案的討論。
TRAF2TR實施方案的結構和制備此剪接變體的cDNA序列見圖2a，氨基酸序列見圖2b。至于概略性的顯示TRAF2TR的圖1，可見缺失去除了TRAF2FL的第123-201位氨基酸殘基，包括鋅指結構域1的C-末端部分和所有的鋅指2和3，以及鋅指4的N-末端殘基。
可用任何合適的方法制備本領域的TRAF2TR，包括本領域技術熟練人員已知的各種方法。可通過各種渠道找到分離、克隆和DNA測序的教材。本領域技術中普通分子生物學、微生物學和重組DNA技術在文獻中有充分的解釋。參閱，如，Sambrook，Fritsch & Maniatis，分子克隆實驗室手冊(Molecular CloningA Laboratory Manual)，第二版(1989)冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約(此處為“Sambrook等，1989”)；DNA克隆實用方法(DNA CloningA Practical Approach)，第I和第II卷(D.N.Glover編輯，1985)；寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis)(M.J.Gait編輯，1984)；核酸雜交(Nucleic Acid Hybridization)[B.D.Hams & S.J.Higgins編輯(1985)]；轉錄和翻譯(Transcription And Translation)[B.D.Hames& S.J.Higgins，編輯(1984)]；動物細胞培養(Animal Cell Culture)[R.I.Freshney編輯(1986)]；固定化細胞和酶(Immobilized CellsAnd Enzymes)[IRL出版社，(1986)]；B.Perbal，分子克隆實用指導(A Practical Guide To Molecular Cloning)(1984)；F.M.Ausubel等(編輯)，分子生物學通用手冊(Current Protocols in MolecularBiology)，John Wiley & Sons，有限公司(1994)。
基于本文所述關于TRAF2TR DNA序列的信息和本領域所知獲得cDNA的方法，編碼TRAF2TR和TRAF2TD的核苷酸序列可方便地克隆或制備自野生型TRAF2并插入恰當的載體，在體外或體內表達這些蛋白質。關于涉及克隆cDNA和表達載體的方法描述參見文獻，Sambrook等，同上文。
編碼TRAF2的基因，無論是基因組DNA或cDNA，均可分離自人基因組文庫或cDNA文庫。獲得具本文所給出DNA序列信息之基因的方法是本領域眾所周知的。可用本領域已知的標準步驟從克隆DNA(即DNA“文庫”)中獲得TRAF2 DNA。優選由從高水平表達此蛋白質之組織中制備的cDNA文庫(如，淋巴來源的細胞，尤其是，B細胞或骨肉瘤細胞系，例如，呈現TRAF2或TRAF2TR高水平表達的人骨肉瘤SAOS-2(ATCCNo.HTB-85))獲得。DNA還可通過純化自預期細胞的基因組DNA或其片段克隆獲得(參閱，例如，Sambrook等，1989，同上；Glover，D.M.(編輯)1985，DNA克隆實用方法，MRL出版社，Ltd.，牛津，英國，第I、II卷)或用化學合成的方法獲得。來源于基因組DNA的克隆除編碼區外還可包含調節和內含子DNA區；來自cDNA的克隆將不含內含子序列。由于本發明部分以全長TRAF2剪接變體(TRAF2TR)的分離為基礎，所以希望獲得編碼TRAF2TR序列的cDNA。
獲得cDNA的方法是本領域眾所周知的。簡略地說，這些方法包括從真核細胞中分離信使RNA(mRNAs)的混合物，并應用一系列酶促反應合成與分離mRNA互補的雙鏈DNA拷貝(cDNAs)。
如下文實施例1中所提出的，已發現逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)克隆是分離含TRAF2TR剪接變體之cDNA的有效方法。RT-PCR包括用逆轉錄酶逆轉錄細胞mRNA，隨后用PCR擴增產生的DNA產物。
不管是以何方式獲得目的cDNA，用許多已知技術中的任一種都可將雙鏈cDNA混合物插入克隆載體，這至少部分取決于所用的特殊載體。在以下文獻中對多種插入方法進行了相當詳細的討論酶學方法(Methods in Enzymology)，68，16-18(1980)，以及Sambrook等，1989，同上。
一旦DNA片段插入克隆載體，克隆載體就被用于轉化合適的宿主。這些克隆載體通常賦予宿主抗生物素抗性的性狀。這樣的宿主通常是原核細胞且只有一些宿主細胞含目的cDNA。被轉染的宿主細胞組成了基因“文庫”，成為分離出mRNA的細胞中所存在的mRNA的代表性樣品。
根據本文所提供的TRAF2的序列信息，可制備合適的寡核苷酸序列，優選如上所述合成，并用于鑒別含TRAF2序列的克隆。為了鑒定含TRAF2序列的克隆，將單個轉化或轉染的細胞在硝酸纖維素濾膜上長成菌落。溶解菌落并通過加熱將DNA緊密固定在濾紙上。然后將濾紙和與TRAF2互補的被標記寡核苷酸探針一起保溫。與TRAF2基本同源的DNA片段將雜交于探針上。同源程度越大，可使用的雜交條件越嚴謹。
探針與它互補的cDNA雜交。用放射自顯影或可鑒定探針存在的化學反應可進行鑒定。為了鑒定含目的蛋白質所有結構信息的一個或多個克隆，對克隆進行定性。分離編碼目的蛋白的核酸序列并重插入表達載體中。表達載體將克隆基因置于特異原核或真核控制元件調控下，使得ds-DNA有效表達(轉錄和翻譯)。
進一步的篩選可以基因特性為基礎進行。例如，基因是否編碼具有與TRAF2等電的、電泳上相同之氨基酸組成的蛋白質或具有如上所述之TRAF2蛋白質部分氨基酸序列的蛋白質。因此，通過以其表達產物物理、化學或免疫特性為基礎進行的分析可檢測基因的存在。例如，通過其所產生蛋白質在電泳遷移、等電聚焦、非均衡pH凝膠電泳、蛋白水解或抗原性上是否具有與TRAF2TR類似或相同的特性來挑選cDNA克隆或DNA克隆。
TRAF2TD的結構和制備相對于TRAF2TR，TRAF2TD缺失第1-87位氨基酸和編碼這些氨基酸的相應核苷酸。TRAF2TD的DNA序列見圖3a，而氨基酸序列見圖3b。
任何合適的方法都可用于制備TRAF2TD，例如，包括基于上述信息的各種方法。有許多方法可用于產生缺失第1-87位氨基酸的截短形式的TRAF2TR。在優選的制備方法中，TRAF2TR cDNA用作PCR模板，所用的5’引物含TRAf2全長編碼序列的第262-280位核苷酸(ATGAGTTCGGCCTTCCCAGAT)，其中包括ATG以建立翻譯的起始位點；3’引物是TTA TAG CCC TGT CAG GTC CAC。產生的構建體開始于全長TRAF2的第88位氨基酸，缺失TRAF2TR的第123-201位氨基酸。
用上述制備TRAF2TD的方法之類的方式可制備TRAF2TR的其它變體。
TRAF2TR/2TD變體本發明范圍內包括TRAF2TR或TRAF2TD的等位基因變體、取代、添加和缺失突變體、類似物和衍生物(下文稱之為“TRAF2TR/2TD變體”)，以及來自其它物種、具有與TRAF2TR相同或相似功能活性的同系物。在優選的實施方案中，本發明實踐上應用了具缺失或取代的基因，所述突變提高了原基因產物抑制TNFα信號傳導途徑的能力。TRAF2TR/2TD變體的制備或分離也在本發明的范圍內。因此，本發明的范圍包括具功能活性的TRAF2TR/TRAF2TD變體，即呈現與TRAF2TR相關的一個或多個功能活性。
通過取代、添加或缺失改變編碼核酸序列以提供功能相當的分子，可以制備TRAF2TR/2TD變體。優選制備相對于TRAF2TR或TRAF2TD來說具有增強或提高的功能活性的TRAF2TR/2TD蛋白。
由于核苷酸編碼序列的簡并性，編碼與TRAF2TR基本上相同的氨基酸序列(包括含單個氨基酸變異的氨基酸序列)的其它DNA序列也可應用于本發明的實踐中。這些包括，但不局限于，等位基因、來自其它物種的同源基因以及含全部或部分TRAF2TR的核苷酸序列，所說的核苷酸序列通過用編碼原序列中相同氨基酸殘基的不同密碼子取代而改變，因此產生沉默的變異。同樣的，本發明的TRAF2TR/2TD變體包括，但不局限于，從一級氨基酸序列上說，含TRAF2TR全部或部分氨基酸序列的變體，包括用序列中導致保守氨基酸取代的殘基來替代功能相當的氨基酸殘基而被改變的序列。例如，可用極性相似的另一氨基酸取代序列中的一個或多個氨基酸殘基，它可用作功能同等物，產生沉默的改變。序列中氨基酸的取代可選自該氨基酸所屬類型的其它成員。例如，非極性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。帶芳香環結構的氨基酸是苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。極性中性氨基酸包括甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。帶正電的(堿性)氨基酸包括精氨酸、賴氨酸和組氨酸。帶負電的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。預期這樣的改變不會影響聚丙烯酰胺凝膠電泳測定的表觀分子量或等電點。
尤其優選的取代是-用賴氨酸取代精氨酸，反之亦然，從而保持正電荷；-用谷氨酸取代天冬氨酸，反之亦然，從而保持負電荷；-用絲氨酸取代蘇氨酸，從而保持游離羥基；及-用谷氨酰胺取代天冬酰胺，從而保持游離CONH2。
還可導入氨基酸取代，以便用具特別優選特性之氨基酸取代。例如，半胱氨酸可引入一個可能與其它半胱氨酸形成二硫鍵的位點。組氨酸可引入作為特別有催化活性的位點(即，組氨酸可作為酸或堿，是生化催化中最常用的氨基酸)。脯氨酸的引入是由于其特殊的平面結構，該結構在蛋白質結構中可誘導β-轉角。
編碼本發明TRAF2TR/2TD變體的基因可用本領域已知的多種方法產生。導致它們產生的操作可發生在基因或蛋白質水平。例如，可用本領域已知的許多策略中的任一種修飾被克隆的TRAF2基因序列(Sambrook等，1989，同上)。可用限制性內切酶在適當的位點切割此序列，若需要還可進行進一步的酶促修飾、分離和體外連接。生產編碼TRAF2TR/2TD的基因時，應小心保證修飾后的基因保留在與TRAF2TR相同的翻譯閱讀框架內而在編碼預期活性的基因區內不被翻譯終止信號打斷。
此外，編碼TRAF2TR/2TD的核酸序列可體外或體內突變以建立和/或破壞翻譯、起始和/或終止序列，或建立編碼區中的變異和/或形成新的限制性內切酶位點或破壞原先存在的位點，從而方便進一步的體外修飾。優選的，這樣的突變增強了突變TRAF2TR基因產物的功能活性。任何本領域已知的誘變技術都可使用，包括，但不局限于，體外定點誘變(Hutchinson，C.，等，1978，生物化學雜志(J.Biol.Chem.)2536551；Zoller和Smith，1984，DNA3479-488；Oliphant等，1986，基因44177；Hutchinson等，1986，美國國家科學院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)83710)、“TAB”接頭(Pharmacia)的使用，等等。PCR技術優選用于定位誘變中(見Higuchi，1989，“用PCR加工DNA”，在《PCR技術DNA擴增的原理和應用》中，H.Erlich，編輯，Stockton Press，第六掌，第61-70頁)。
以下有關編碼預期多肽之DNA的操作和表達的討論對于TRAF2TR和TRAF2TD以及TRAF2TR/2TD變體都是通用的。將TRAF2TR、TRAF2TD以及TRAF2TR/2TD變體克隆入克隆/表達載體可將鑒定和分離后的DNA序列插入合適的克隆/表達載體(此后稱“載體”)，從而方便序列修飾或蛋白質的表達。這些載體一般包括多克隆位點、啟動子、方便在宿主細胞中復制的序列和選擇標記。
任何合適的載體都可使用。本領域已知的就有許多。可使用的載體包括，但不局限于，例如，質粒或修飾后的病毒。載體通常與供其引入的宿主細胞以方便載體的復制和編碼蛋白質的表達相容。例如，可通過將DNA片段插入有互補粘端的克隆載體從而完成DNA序列插入所給定載體的工作。不過，若使DNA片段化所用的互補限制性位點不存在于克隆載體中，則DNA分子的末端可酶促修飾。或者，通過將核苷酸序列(接頭)連接至DNA末端可產生任何預期的位點；這些連接的接頭可以包含編碼限制性內切酶識別序列的特殊化學合成寡核苷酸。有用的載體可由染色體、非染色體和合成的DNA序列區段組成。可用于本發明實踐中的特殊載體例子包括，但不局限于，大腸桿菌噬菌體，例如，λ衍生物，或質粒，例如，pBR322衍生物或pUC質粒衍生物，如pmal-c、pFLAG，SV40衍生物和已知的細菌質粒，如大腸桿菌質粒colE1、pCR1、pMa1-C2、pET、pGEX(Smith等，1988，基因6731-40)，pMB9和它們的衍生物，諸如RP4之類的質粒；噬菌體DNA，如噬菌體1的許多衍生物，如NM989，以及其它的噬菌體DNA，如M13和絲狀單鏈噬菌體DNA；諸如2μm質粒之類的酵母載體或其衍生物；可用于真核細胞的載體，例如，可用于昆蟲細胞的載體，例如桿狀病毒載體，可用于哺乳動物細胞的載體；質粒和噬菌體DNA聯合形成的載體，已經修飾以便應用噬菌體DNA或其它表達控制序列的質粒；等等。
可按本發明使用的酵母載體包括，但不局限于，非融合型pYES2載體(XbaI、SphI、ShoI、NotI、BstXI、EcoRI、BamHI、SacI、KpnI和HindIII克隆位點；Invitrogen)或融合型pYESHisA、B、C(XbaI、SphI、ShoI、NotI、BstXI、EcoRI、BamHI、SacI、KpnI和HindIII克隆位點，用ProBond樹脂純化并用腸激酶切割的N-末端肽；Invitrogen)。
本發明實踐中可用的桿狀病毒載體包括各種載體，非融合型轉移載體和融合型轉移載體都可使用，其中非融合型轉移載體有例如，pVL941(BamHI克隆位點；Summers)、pVL1393(BamHI、SmaI、XbaI、EcoRI、NotI、XmaIII、BglII和PstI克隆位點；Invitrogen)、pVL1392(BglII、PstI、NotI、XmaIII、EcoRI、XbaI、SmaI和BamHI克隆位點；Summers和Invitrogen)以及pBlueBacIII(BamHI、BglII、PstI、NcoI和HindIII克隆位點，可用藍/白重組子篩選；Invitrogen)；融合型轉移載體有例如，pAc700(BamHI和KpnI克隆位點，其中BamHI識別位點開始于起始密碼子；Summers)、pAc701和pAc702(與pAc700相同，具有不同的閱讀框架)、pAc360(多角體蛋白起始密碼子下游36堿基對處有BamHI克隆位點；Invitrogen(195))和pBlueBacHisA、B、C(三種不同的閱讀框架，具有BamHI、BglII、PstI、NcoI和HindIII克隆位點，用于ProBond純化的N-末端肽和藍/白斑重組子篩選；Invitrogen)。
本發明考慮使用的哺乳動物載體包括，例如，具可誘導啟動子例如二氫葉酸還原酶(DHFR)啟動子的載體，如具DHFR表達載體的任何表達載體，或DHFR/氨甲喋呤共擴增載體，例如，pED(PstI、SalI、SbaI、SmaI和EcoRI克隆位點，該載體既表達克隆基因又表達DHFR；參閱Kaufman，分子生物學通用手冊，16.12(1991))。或者用谷氨酰胺合成酶/甲硫氨酸磺基肟共擴增載體，例如，pEE14(HindIII、XbaI、SmaI、SbaI、EcoRI和BclI克隆位點，其中的載體表達谷氨酰胺合成酶和被克隆的基因；Celltech)。在另一實施方案中，可使用在EpsteinBarr病毒(EBV)控制下指導游離體基因表達的載體，例如，pREP4(BamHI、SfiI、XhoI、NotI、NheI、HindIII、NheI、PvuII和KpnI克隆位點，組成型勞氏肉瘤病毒長末端重復片段(RSV-LTR)啟動子、潮霉素選擇標記；Invitrogen)、pCEP4(BamHI、SfiI、XhoI、NotI、NheI、HindIII、NheI、PvuII和KpnI克隆位點，組成型人巨細胞病毒(hCMV)立即早期基因、潮霉素選擇標記；Invitrogen)、pMEP4(KpnI、PvuI、NheI、HindIII、NotI、XhoI、SfiI、BamHI克隆位點，可誘導的金屬硫蛋白IIa基因啟動子、潮霉素選擇標記；Invitrogen)、pREP8(BamHI、XhoI、NotI、HindIII、NheI和KpnI克隆位點，RSV-LTR啟動子、組氨醇選擇標記；Invitrogen)、pREP9(KpnI、NheI、HindIII、NotI、XhoI、SfiI和BamHI克隆位點，RSV-LTR啟動子、G418選擇標記；Invitrogen)和pEBVHis(RSV-LTR啟動子、潮霉素選擇標記、可通過ProBond樹脂純化并用腸激酶切割的N-末端肽；Invitrogen)。用于本發明的可選擇哺乳動物表達載體包括pRc/CMV(HindIII、BstXI、NotI、SbaI和ApaI克隆位點，G418選擇；Invitrogen)、pRc/RSV(HindIII、SpeI、BstXI、NotI、XbaI克隆位點，G418選擇；Invitrogen)、pcDNA3(HindIII、KpnI、BamHI、BstXI、EcoRI、EcoRV、BstXI[重復]、NotI、XhoI、XbaI、ApaI克隆位點，G418、氨芐青霉素篩選，Invitrogen)及其它。本發明使用的牛痘病毒哺乳動物表達載體(見，Kaufman，1991，同上)包括，但不局限于pSC11(SmaI克隆位點，TK-和β-gal篩選)、pMJ601(SalI、SmaI、AflI、NarI、BspMII、BamHI、ApaI、NheI、SacII、KpnI和HindIII克隆位點；TK-和β-gal篩選)和pTKgptF1S(EcoRI、PstI、SalI、AccI、HindIII、SbaI、BamHI和Hpa克隆位點，TK或XPRT篩選)。
可使用各種方法證實編碼TRAF2TR、TRAF2TD或TRAF2TR/2TD變體的目的DNA序列已克隆入載體中。通常可使用以下一種或多種方法(a)目的質粒DNA或特異mRNA的PCR擴增，(b)核酸雜交，(c)選擇標記基因功能的存在或缺失，(d)用合適的限制性內切酶進行分析，及(e)插入序列的表達。在第一種方法中，可用PCR擴增核酸以檢測擴增產物。在第二種方法中，可用探針通過核酸雜交檢測插入表達載體的外源基因的存在，所用探針含與插入標記基因同源的序列。在第三種方法中，可以外源基因插入載體而引起的某些“選擇標記”基因功能(如，β-半乳糖苷酶活性、胸苷激酶活性、對抗生素的抗性、轉化表型、桿狀病毒中包涵體的形成，等等)的存在或丟失為基礎鑒定和篩選重組載體/宿主系統。在另一實施例中，若編碼TRAF2TR的核酸插入載體的“選擇標記”基因序列中，通過選擇標記基因功能的缺失可鑒定含TRAF2TR插入片段的重組子。在第四種方法中，通過用合適的限制性酶消化鑒定重組表達載體。在第五種方法中，假如表達蛋白質呈現功能活性構象，可通過檢驗重組子所表達基因產物的活性、生化或免疫學特性來鑒定重組表達載體。啟動子編碼TRAF2TR或TRAF2TD或其TRAF2TR/2TD變體的核苷酸序列可插入含被插入蛋白質編碼序列轉錄和翻譯所必需元件的表達載體中。這樣的元件在此被稱為“啟動子”。因此，編碼本發明多肽的核酸在本發明的表達載體中與啟動子可操作性的連接。cDNA和基因組序列都可在這樣的調節序列控制下克隆和表達。表達載體還優選包括復制起點。必需的轉錄和翻譯信號可提供于重組表達載體上，或由編碼TRAF2的天然基因和/或其側翼區提供。前述將DNA片段插入克隆載體的任何方法均可用于構建含具合適轉錄/翻譯控制信號及蛋白質編碼序列之基因的表達載體。這些方法可包括體外重組DNA和合成技術，以及體內重組(遺傳重組)。
表達可用本領域已知的任何啟動子/增強子元件控制，但這些調節元件必須在選定用于表達的宿主中是有功能的。可用于控制TRAF2TR基因表達的啟動子包括，但不局限于，SV40早期啟動子區(Benoist和Chambon，1981，自然(Nature)290304-310)、勞氏肉瘤病毒3’長末端重復片段中所含的啟動子(Yamamoto等，1980，細胞22787-797)、皰疹病毒胸苷激酶啟動子(Wagner等，1981，美國國家科學院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)781441-1445)、金屬硫蛋白基因的調節序列(Brinster等，1982，自然29639-42)；原核表達載體，例如，β-內酰胺酶啟動子(Villa-Kamaroff等，1978，美國國家科學院院報，753727-3731)或tac啟動子(DeBoer等，1983，美國國家科學院院報，8021-25)；也可參閱科技美國人(ScientificAmerican)中“來自重組細菌的有用蛋白質”一文，1980，24274-94；來自酵母或其它真菌的啟動子元件，例如，Gal4啟動子、ADC(醇脫氫酶)啟動子、PGK(磷酸甘油激酶)啟動子、堿性磷酸酶啟動子；和呈現組織特異性并已用于轉基因動物中的動物轉錄控制區在胰腺泡細胞中有活性的彈性蛋白酶I基因控制區(Swift等，1984，細胞38639-646；Ornitz等，1986，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.，50399-409；MacDonald，1987，肝臟病學(Hepatology)7425-515)；在胰腺β-細胞內有活性的胰島素基因控制區(Hanahan，1985，自然315115-122)、在淋巴細胞內有活性的免疫球蛋白基因控制區(Grosschedl等，1984，細胞38647-658)；Adames等，1985，自然318533-538；Alexander等，1987，細胞分子生物學Mol。Cell。Biol。，71436-1444)、在睪丸、乳房、淋巴和肥大細胞中有活性的小鼠乳腺腫瘤病毒控制區(Leder等，1986，細胞45485-495)、在肝中有活性的清蛋白基因控制區(Pinkert等，1987，基因和發育(Geneand Devel.)1268-276)、在肝細胞中有活性的甲胎蛋白基因控制區(Krumlauf等，1985，細胞分子生物學51639-1648；Hammer等，1987，科學(Science)23553-58)、在肝細胞中有活性的α1抗胰蛋白酶基因控制區(Kelsey等，1987，基因和發育，1161-171)、在骨髓細胞中有活性的β珠蛋白基因控制區(Mogram等，1985，自然315338-340；Kollias等，1986，細胞4689-94)、在腦的少突膠質細胞中有活性的髓鞘堿性蛋白基因控制區(Readhead等，1987，細胞48703-712)、在骨骼肌中有活性的肌球蛋白輕鏈2基因控制區(Sani，1985，自然314283-286)和在下丘腦中有活性的促性腺釋放激素基因控制區(Mason等，1986，科學2341372-1378)。將載體引入宿主細胞載體可用任何合適的方法引入宿主細胞，包括，如轉染、電穿孔、顯微注射、轉導、細胞融合、DEAE葡聚糖、磷酸鈣沉淀、脂染(溶酶體融合)、基因槍或DNA載體轉運器(參閱，如Wu等，1992，生化雜志(J.Biol.Chem.)267963-967；Wu和Wu，1988，生化雜志26314621-14624；Hartmut等，加拿大專利申請2,012,311，1990年3月15日提交)，由此產生許多基因拷貝。優選克隆基因在穿梭載體質粒上，以供在克隆細胞如大腸桿菌中擴展，并且方便純化用于隨后插入合適表達細胞系。例如，穿梭載體是能在一種以上類型的生物體中復制的載體，可通過將來自大腸桿菌質粒的序列與來自酵母2μm質粒的序列連接制備既能在大腸桿菌中復制，又能在釀酒酵母中復制的穿梭載體。宿主細胞系統可能的宿主細胞系統包括，但不局限于感染了病毒(如牛痘病毒、腺病毒等)的哺乳動物宿主細胞系統；感染了病毒(如桿狀病毒)的昆蟲宿主細胞系統；微生物，諸如包含酵母載體的酵母；或以噬菌體、DNA、質粒DNA或粘粒DNA轉化的細菌。載體表達元件在強度和特異性上都有所變化。取決于所用的宿主細胞系統，可使用多種合適的轉錄和翻譯元件中的任一種。
此外，可選擇適當的宿主細胞株，它能調節插入序列的表達，或以預期的特異方式修飾和加工基因產物。不同的宿主細胞具有其特性及獨特的蛋白質翻譯和翻譯后加工及修飾機制。可選擇合適的細胞系或宿主系統以保證所表達外源蛋白質的預期修飾和加工。于酵母中表達可產生生物活性產物。于真核細胞中表達可提高“自然”折疊的可能性。此外，于哺乳動物細胞中表達可為重組或構成TRAF2TR抑制活性提供工具。而且，不同的載體/宿主表達系統可不同程度影響加工反應，諸如蛋白水解切割。如上文所指出的，本發明的表達載體都可用于轉染細胞以供TRAF2TR活性調節子的篩選或生物檢測。
在經重組整合編碼序列后，本發明的重組TRAF2TR、TRAF2TD或TRAF2TR/2TD變體可于染色體上表達。在這一點上，有一些擴增系統可用于獲得穩定基因的高水平表達(見Sambtook等，1989，同上)。
已引入含TRAF2TR編碼核酸之重組載體的細胞在供細胞表達TRAF2TR的條件下培養于適當的細胞培養基中。
一旦建立了合適的宿主系統和生長條件，就可繁殖和制備一定量的重組表達載體。如上所述，通過收集培養液或溶解包涵體可獲得可溶形式的蛋白質，如，用去污劑處理，若需要還可以用超聲波法或其他機械加工。用多種技術可分離溶解的或可溶解的蛋白質，包括聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)、等電聚焦、雙向凝膠電泳、層析法(如離子交換、親和、免疫親和及分子排阻柱層析)、離心、差異溶解度、免疫沉淀或用于蛋白質純化的任何其他標準技術。
如上所述，“載體”是用于將本發明核酸轉移至宿主細胞的任何工具。優選的載體是病毒載體，例如，逆轉錄病毒、皰疹病毒、腺病毒和腺伴隨病毒。由此，用病毒載體或通過DNA的直接導入將編碼本發明蛋白質或多肽結構域片段的基因體內、離體或體外引入。通過將轉基因載體定向于特異細胞可達到于靶組織中表達的目的，如用病毒載體或受體配基，或用組織特異的啟動子，或二者結合使用。離體和體內處理方法中病毒載體系統的使用通常用于體內或離體定向和治療步驟的病毒載體是以DNA為基礎的載體和逆轉錄病毒載體。構建和使用病毒載體的方法是本領域所已知的[見，如Miller和Rosman，BioTechniques7980-990(1992)]。優選的病毒載體是復制缺陷型的，即，它們在靶細胞中不能自主復制。一般說來，本發明范圍內使用的復制缺陷型病毒載體基因組缺少至少一個病毒在感染細胞中復制所必需的區域。這些區域可用本領域技術熟練人員已知的任何技術或被刪除(全部或部分)或使其無功能。這些技術包括完全去除、取代(用其他序列，尤其是被插入的核酸)、部分刪除或將一個或多個堿基添加至必需(對于復制來說)區。用遺傳操作方法或用誘變劑處理可在體外(在分離的DNA上)或原位完成這樣的技術。優選復制缺陷型病毒保留包裝病毒顆粒所必需的基因組序列。
DNA病毒載體包括減毒的或缺陷型DNA病毒，諸如以下病毒，但不局限于此單純皰疹病毒(HSV)、人乳頭瘤病毒、Epstein Barr病毒(EBV)、腺病毒、腺伴隨病毒(AAV)、牛痘病毒，等等。優選完全或幾乎完全缺失病毒基因的缺陷型病毒。缺陷型病毒在引入細胞后無復制能力，因而不會導致可能產生的病毒感染。使用缺陷型病毒載體可在特異的局部區域進入細胞，而不用擔心該載體會感染其他細胞。因此可特異定向于特殊組織。具體載體的例子包括，但不局限于，缺陷型皰疹病毒1(HSV1)載體[Kaplitt等，分子細胞神經科學(Molec.Cell.Neurosci.)2320-330(1991)]、缺失糖蛋白L基因的缺陷型皰疹病毒載體[專利公開RD371005A]或其他缺陷型皰疹病毒載體[國際專利申請公開WO94/21807，發表于1994年9月29日；國際專利申請公開WO92/05263，發表于1994年4月2日]；減毒的腺病毒載體，諸如Stratford-Perricaudet等所述的載體[臨床研究雜志(J.Clin.Invest.)90626-630(1992)；也可見La Salle等，科學(Science)259988-990(1993)]；以及缺陷型腺伴隨病毒載體[Samulski等，病毒學雜志(J.Virol.)613096-3101(1987)；Samulski等，病毒學雜志(J.Virol.)633822-3828(1989)；Lebkowski等，分子細胞生物學(Mol.Cell.Biol.)83988-3996(1988)]。
體內施用時，優選將適當的免疫抑制治療與病毒載體(如腺病毒載體)結合使用以避免病毒載體和感染細胞的免疫失活。例如，可用諸如白介素-12(IL-12)、干擾素-g(IFN-g)或抗CD4抗體之類的免疫抑制細胞因子來阻斷對病毒載體的體液或細胞免疫應答[參見，如Wilson，自然醫學(Nature Medicine)(1995)]。此外，應用改造成表達最小數量抗原的病毒載體是有利的。
自然的，本發明涉及載體的送遞，其將表達治療有效量的TRAF2TR用于基因治療。用于此處的短語“治療有效量”指足以減少或最優選預防導致TNFα結合相關疾病之明顯臨床表現的免疫應答的量。或者，治療有效量是足以改善宿主明顯的臨床癥狀的量。離體及體內治療方法中使用的優選病毒載體系統某些病毒載體系統已在本領域中很好的建立起來并適用于本發明的治療方法。a. 腺病毒載體系統在優選的實施方案中，載體是腺病毒載體。腺病毒是真核DNA病毒，它可被修飾后以有效傳送本發明核酸至多種類型細胞中。存在多種血清型的腺病毒。在本發明范圍內，優選這些血清型中的2型或5型人腺病毒(Ad2或Ad5)或動物來源的腺病毒(見WO94/26914)。可用于本發明范圍內的那些動物來源的腺病毒包括犬、牛、鼠(例如May1，Beard等，病毒學75(1990)81)、羊、豬、禽和猿(例如SAV)來源的腺病毒。優選的動物來源腺病毒是犬腺病毒，更優選CAV2腺病毒(如Manhattan或A26/61株(ATCC VR-800))。
優選的本發明復制缺陷型腺病毒載體包含ITR、衣殼化序列及目的核酸。更優選的是至少腺病毒的E1區是非功能性的。E1區中的缺失優選為Ad5腺病毒序列的第455-3329位核苷酸(PvuII-BglII片段)或第382-3446位核苷酸(HinfII-Sau3A片段)。其它區域也可被修飾，尤其是E3區(WO95/02697)、E2區(WO94/28938)、E4區(WO94/28152、WO94/12649和WO95/02697)或晚期基因L1-L5中的任一個。
在優選的實施方案中，腺病毒載體在E1區有缺失(Ad1.0)。E1-缺失的腺病毒例子公布于EP185,573，其內容在此收編作為參考。在另一優選實施方案中，腺病毒載體在E1和E4區有缺失(Ad3.0)。E1/E4-缺失的腺病毒例子公布于WO95/02697和WO96/22378，其內容在此收編作為參考。在另一優選的實施方案中，腺病毒載體在E1區有缺失，并在其中插入了E4區和核酸序列(見FR94 13355，其內容在此收編作為參考)。
用本領域技術熟練人員已知的任何技術都可制備本發明復制缺陷型重組腺病毒(Levero等，基因101(1991)195，EP185 573；Graham，EMBO J.3(1984)2917)。尤其是，它們可通過腺病毒和其中攜帶目的DNA序列的質粒之間的同源重組來制備。在腺病毒和質粒共轉染入合適細胞系后可完成同源重組。采用的細胞系應優選(i)是所述元件可轉化的，且(ii)含能與復制缺陷型腺病毒基因組部分互補的序列，它優選以整合形式存在于細胞系中，從而避免了產生重組的風險。如專利申請WO94/26914和WO95/02697所述，可用的細胞系例子是人胚胎腎細胞系293(Graham等，J.Gen.Virol.36(1997)59)，它含有整合入其基因組中的Ad5腺病毒左手部分基因組(12％)，以及能彌補E1和E4功能的細胞系。用本領域常規技術人員眾所周知的標準分子生物學技術回收和純化重組腺病毒。
b.腺伴隨病毒載體系統腺伴隨病毒(AAV)是相對小的DNA病毒，它們能以穩定的定位方式整合入感染細胞的基因組中。它們能感染廣譜的細胞并不影響細胞生長、形態或分化，且它們看上去不涉及人的病理學問題。AAV基因組已克隆、測序和定性。它包括約4700個堿基，且兩末端含有約145個堿基的反向末端重復(ITR)區，它可作為病毒的復制起點。基因組的剩余部分被分成兩個具衣殼化功能的基本區基因組的左手部分，含涉及病毒復制和病毒基因表達的rep基因；基因組的右手部分，含編碼病毒衣殼蛋白的cap基因。
有關利用來自AAV的載體在體外和體內轉移基因的例子文獻中已有報道(參見WO91/18088；WO93/09239；US4,797,368，US5,139,941，EP488 528)。這些發表的文獻描述了許多AAV-來源的構建體，其中rep和/或cap基因缺失并被目的基因替代，利用這些構建體在體外(進入培養細胞)或體內(直接進入生物體)轉移所述目的基因。通過將含目的核酸序列且該序列側翼有兩AAV反向末端重復(ITR)區的質粒與攜帶AAV衣殼化基因(rep和cap基因)的質粒共轉染入被人輔助病毒(例如腺病毒)感染的細胞系，可制備本發明復制缺陷型重組AAV。隨后用標準技術純化產生的AAV重組子。
因此，本發明還涉及AAV-來源的重組病毒，其基因組包含編碼TRAF2TR或TRAF2TD且側翼為AAV ITR的核酸序列。本發明還涉及含編碼TRAF2TR或TRAF2TD且側翼為兩AAV ITR之核酸序列的質粒。這樣的質粒可用于轉移核酸序列，在適當的情況下，核酸序列與質粒一起摻入脂質體載體(假病毒)。
C.逆轉錄病毒載體系統在另一實施方案中，基因可引入逆轉錄病毒載體中，例如參閱以下文獻Anderson等，美國專利5399346；Mann等，1983，細胞33153；Temin等，美國專利4650764；Temin等，美國專利4980289；Markowitz等，1988，病毒學雜志621120；Temin等，美國專利5124263；EP453242，EP178220；Bernstein等，遺傳工程學(Genet.Eng.)7(1985)235；McCormick，生物技術(BioTechnlogy)3(1985)689；國際專利公開WO95/07358，發表于1995年3月16日，申請人Dougherty等；以及Kuo等，1993，血液學(Blood)82845。逆轉錄病毒是感染分裂細胞的整合病毒。逆轉錄病毒基因組包括兩個LTR、一個衣殼化序列和三個編碼區(gag、pol和env)。在重組逆轉錄病毒載體中，gag、pol和env基因通常全部或部分缺失，并以異源的目的核酸序列替代。這些載體可自不同類型的逆轉錄病毒構建，如HIV、MoMuLV(“鼠莫羅尼白血病病毒”)、MSV(“鼠莫羅尼肉瘤病毒”)、HaSV(“Harvey肉瘤病毒”)；SNV(“脾臟壞死病毒”)；RSV(“勞氏肉瘤病毒”)和弗蘭德病毒。缺陷型逆轉錄病毒載體公布于文獻WO95/02697中。
一般說來，為了構建含核酸序列的重組逆轉錄病毒，先構建了含LTR、衣殼化序列和編碼序列的質粒。此構建體用于轉染包裝細胞系，該細胞系能反式提供質粒中缺陷的逆轉錄病毒功能。通常，這樣的包裝細胞系能表達gag、pol和env基因。這樣的包裝細胞系在現有技術中已有描述，尤其是細胞系PA317(US4861719)；PsiCRIP細胞系(WO90/02806)和GP+envAm-12細胞系(WO89/07150)。此外，重組逆轉錄病毒載體可在LTR中有修飾以抑制轉錄活性，還可含其中可包括部分gag基因的衣殼化序列(Bender等，病毒學雜志61(1987)1639)。用本領域常規技術人員已知的標準方法可純化重組逆轉錄病毒載體。
可構建逆轉錄病毒載體用作感染顆粒或進行單輪轉染。在過去的個案中，病毒被修飾以保留其中除負責致癌轉化特性之基因之外的所有其他基因，并表達異源基因。制備非感染性病毒載體以破壞病毒包裝信號，但保留包裝共轉染病毒所需的結構基因，所述病毒經改造后含異源基因和包裝信號。因此，產生的病毒顆粒不能生產另外的病毒。定向基因送遞參見國際專利公開WO95/28494，公布于1995年10月。離體和體外治療方法中所用的非病毒系統某些非病毒系統已用于本領域中且能促進編碼本發明多肽的DNA進入預期靶細胞中。
A.脂轉染送遞系統通過脂轉染可在體內引入載體。在過去十年中，越來越多將脂質體用于核酸的體外包裝和轉染。為解決脂質體介導轉染中所遇困難和危險而設計的合成陽離子脂類，可用于制備脂質體，以供在體內轉染編碼標記的基因[Felgner等，美國國家科學院院報847413-7417(1987)；參見Mackey等，美國國家科學院院報858027-8031(1988)；Ulmet等，科學2591745-1748(1993)]。使用陽離子脂類可促進帶負電荷核酸的包裝，還促進它與帶負電荷的細胞膜之間的融合[Felgner和Ringold，科學337387-388(1989)]。用于轉移核酸的尤其有效的脂類化合物和組合物參見國際專利文件WO95/18863和WO96/17823，以及美國專利5459127。在體內應用脂轉染將外源基因引入特異器官具有某些實際的好處。脂質體的分子定向于特異細胞是優勢之一。已清楚在具細胞異質性的組織中定向轉染至特殊細胞類型是尤其有利的，例如，在胰、肝、腎和腦中。為了定向的目的，脂類可化學偶聯至其他分子上[見Mackey等，同上]。有定向性的肽(如激素或神經遞質)和蛋白質(如抗體)或非肽分子均可化學偶聯至脂質體上。
其他的分子也可用于促進核酸的體內轉染，例如陽離子寡聚肽(如，國際專利文件WO95/21931)、來自DNA結合蛋白質的肽(如國際專利文件WO96/25508)或陽離子聚合物(如國際專利文件WO95/21931)。b.裸DNA送遞系統還可以以裸DNA質粒的形式將載體導入體內(見美國專利5693622、5589466和5580859)。供基因治療的裸DNA載體可通過本領域已知方法引入預期宿主細胞中，如轉染、電穿孔、顯微注射、轉導、細胞融合、DEAE葡聚糖、磷酸鈣沉淀、基因槍或DNA載體轉移器[見，Wu等，生物化學雜志267963-967(1992)；Wu和Wu，生物化學雜志26314621-14624(1988)；Hartmut等，加拿大專利申請2012311，1990年3月15日提出申請；Williams等，美國國家科學院院報882726-2730(1991)]。也可使用受體介導的DNA送遞方法[Curiel等，人類基因治療(Hum.Gene Ther.)3147-154(1992)；Wu和Wu，生物化學雜志2624429-4432(1987)]。鑒定治療上有用的TRAF2TR變體的方法有許多方法可用于確定TNFα所調節途徑是否涉及某疾病，并確定本發明多肽對這些途徑的效果。例如，為了研究在NFκB調節中TRAF2TR的作用，以NFκB UAS為探針進行電泳遷移率變動檢驗(EMSA)分析(圖7)。來自過表達FL TRAF之細胞的核提取物(泳道3和4)顯示TNFα誘導的變動明顯強于對照(泳道1和2)。TRAF2TR過表達阻斷了NFκB的形成，并因此在TNFα所刺激細胞中檢測不到變動(泳道5和6)。由于在TNFα所刺激細胞中未顯示遷移率變動條帶，所以這些結果表明了對NFκB形成的強抑制作用。在用TNFα刺激后過表達全長TRAF2的細胞中NFκB活性有所提高(泳道4)。
上述類型實驗可用于測定某疾病狀態中牽涉的途徑是否可用本發明組合物治療。大體上，用分離或制備的TRAF2變體取代TRAF2TR或TRAF2TD，確定該變體是否具有抑制TNFα所調節途徑的能力，由此可進行上述實驗。涉及TNFα所調節途徑的疾病如上所述，本發明涉及用TRAF2TR和TRAF2TD及其變體抑制TNFα所調節途徑的用途。尤其是，本發明涉及用上述方法有效阻斷TNFα誘導的數個轉錄因子的活化，包括NFκB和AP-1。TRAF2TR和TRAF2TD及其變體可用于抑制涉及TNFα的過量產生和NFκB依賴型基因的超活化的病理學中的TNFα信號轉導途徑。多種疾病似乎涉及TNFα所調節途徑，而這些疾病的病理學基礎可能包括TNFα的過生產或NFκB依賴型基因的超活化。用TRAF2TR和TRAF2TD蛋白質及它們的變體可治療這些疾病。
有證據顯示發炎過程與所有主要的心血管疾病都有重要關系，且TNFα水平的提高與這些發炎過程相關，因此認為用本發明的組合物和方法能治療各種主要的心血管疾病。這些疾病包括，但不局限于心血管疾病，如心肌梗死后的心臟局部缺血-再灌注損傷、冠狀動脈旁路手術、心臟移植或中風造成的CNS中的局部缺血-再灌注損傷；嚴重冠狀動脈粥樣硬化斑的加重和破裂；充血性心力衰竭的發展和加重；球囊血管成形術之后的內皮細胞損傷。此外，本發明可用于預防心力衰竭或梗塞中心肌細胞的程序性細胞死亡，以及避免肌細胞的凋亡。
通過阻斷TNFα受體的信號傳導，應用TRAF2TR或TRAF2TD或其變體進行基因治療的途徑可治療這些疾病。優選使用TRAF2TD，因為它高效抑制TNFα所調節途徑。
同樣的，通過阻斷TNFα受體的信號傳導，應用TRAF2TR或TRAF2TD或其變體進行基因治療的途徑可治療病理學上涉及TNFα的其他疾病。這些疾病包括，但不局限于克隆病、牛皮癬、類風濕性關節炎、移植中的排斥反應、炎性腸疾病、非胰島素依賴型的糖尿病和神經變性疾病(如帕金森癥)。
此外，TRAF2TD可用于多種實驗中研究TRAF2-依賴型信號傳導途徑的機制。治療組合物和劑量在使用中，本發明的任何載體，不管是病毒或非病毒型的，都優選在藥學可接受載體或工具中導入體內。短語“藥學可接受的”指分子實體和組合物在施用于人體時是生理狀態下可忍受的，且一般不引起明顯的過敏或類似的不適反應，諸如胃部不適、頭暈等等。用于此處時，術語“藥學可接受的”優選表示聯邦或州政府主管機構所批準的，或列于美國藥典或其他通常認可使用于動物，尤其是人身上的藥典中的。術語“載體”指稀釋劑、佐劑、賦形劑或與化合物一起施用的工具。這樣的藥用載體可以是無菌液體，例如，水或油，包括石油、動物、植物或合成來源的油，例如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等等。優選水或鹽水溶液以及葡萄糖水溶液和甘油溶液作為載體，尤其是對于可注射的溶液。合適的藥用載體可見于“Remington的藥物科學”“Remington’s Pharmacertical Sciences”一書，作者E.W.Martin。
本發明提供了包括施用有效量的本發明組合物至人或其他動物在內的治療方法。
有效量可以變化，取決于被治療者的年紀、疾病類型和病情嚴重程度、體重、預期療程、用藥方式及其他參數。主治醫生或其他有資格的醫學專業人士都可確定有效量。
目前認為本發明多肽最廣泛使用的劑量是約0.01mg/kg體重/天-100mg/kg體重/天。優選的劑量是約0.1mg/kg體重/天-50mg/kg體重/天，更優選的劑量是約1mg/kg體重/天-10mg/kg體重/天。
本發明的重組病毒通常以約104-1014pfu之間的劑量形式配制和施用。以AAV和腺病毒為例，優選使用的劑量是約106-1011pfu。術語“pfu”(“噬斑形成單位”)相應于病毒顆粒懸浮液的感染能力，通過感染合適的細胞培養物并檢測形成的噬斑數目來測定pfu。測定病毒溶液pfu滴度的技術在現有技術中有很好的記錄。
以下實施例對本發明進行了例證性的說明。
實施例實施例1-編碼TRAF2TR的cDNA的分離在全長TRAF2的RT PCR克隆(分子生物學通用手冊，1996)中，用來自人骨肉瘤細胞系(OSA1)的mRNA分離TRAF2的剪接變體TRAF2TR。當利用引物產生全長TRAF2的cDNA時，觀察到了較小的PCR產物。獨立切出此片段并克隆。用于RT PCR的5’引物是ATG GCT GCA GCT AGC GTGACC，而3’引物是TTA TAG CCC TGT CAG GTC CAC。
通過對此較小克隆(TRAF2TR)進行測序，鑒定出框架內編碼第123-201位氨基酸殘基的密碼子缺失。圖4a和4b比較了全長TRAF2和TRAF2TR的核酸序列和氨基酸序列。
身體中多種組織已被鑒定為TRAF2TR mRNA的來源，并可通過上述流程分離其中的TRAF2TR mRNA。為了測定TRAF2TR的組織分布，用剪接區之外的一對引物進行RT-PCR。缺失區5’側的引物是GGT GGA GAG CCTGCC GGC CG，而缺失區3’側的引物是GGC AGC CGA TGG CGT GGA ATCTG，并用寡聚dT引物產生不同組織總RNA的cDNA。用瓊脂糖電泳分離cDNA并轉移至硝酸纖維素膜上。用來自鄰近剪接區5’端之TRAF2序列的特異探針(5’-GAT GCA CCT GGA AGG GGA CCC TGA AAT-3’)進行雜交。此探針識別TRAF2的非剪接和剪接變體。對于非剪接變體(TRAF2FL)來說，預期大小是373bp；對于剪接變體(TRAF2TR)來說，預期大小是136bp。現在參照圖5，泳道1-對照TRAF2-FL cDNA；2-對照TRAF2剪接變體cDNA；3-Jurkat；4-HeLa細胞系；5-胸腺；6-胎盤；7-胸腺；8-脾臟；9-卵巢。
對多種細胞來源裂解物的蛋白質印跡分析未能明確的檢測到在表達蛋白質水平有被截短的TRAF2變體存在。似乎該蛋白質的高水平表達和生產以細胞類型依賴的方式在發育上或時間上受到限制，或受一種尚未明確的機制所控制(如，在生發中心的B細胞成熟階段)。
剪接變體TRAF2TR中的缺失保留了開放的閱讀框架，并且5’剪接邊界符合規范的剪接供體序列。缺失去除了野生型TRAF2的第123-201位氨基酸殘基，其中包括鋅指結構域1的C-末端部分和所有的鋅指2和3，以及鋅指4的N-末端殘基(圖1)。此缺失更可能破壞鋅指區的功能，類似于Takeuchi等人在生物化學雜志271(33)，19935-19942中所建立的缺失，據報道它們對TNFα誘導的NFκB活化呈現顯性失活效果。實施例2-TRAF2TD的制備已知TRAF2 N-氨基末端87個氨基酸(代表環指結構域，見圖1)的缺失產生了可用作TNFα依賴型NFκB活化之顯性抑制劑(顯性失活)的蛋白質(Takeuchi等，生物化學雜志271(33)，19935-19942(1996))。為了確定N-末端的缺失是否會影響TRAF2TR的活性，制備了代表TRAF2TR具蛋白質N-末端87個氨基酸缺失(殘基1-87)的構建體。為了制備此TRAF2TR變體，以TRAF2TR cDNA為PCR模板，5’引物含TRAF2全長編碼序列的第262-280位核苷酸(ATGAGTTCGGCCTTCCCAGAT)，其中含ATG密碼子作為翻譯起始位點；3’引物是TTA TAG CCC TGT CAG GTC CAC。產生的構建體開始于全長TRAF2的第88位氨基酸，包含TRAF2TR的第123-201位氨基酸缺失，是“雙缺失”的構建體。此構建體經DNA測序確認并克隆入哺乳動物表達載體(pcDNA3，Invitrogen)中。實施例3-用TRAF2TR轉染HeLa細胞為了確定TRAF2TR對NFκB活化的作用，在哺乳動物表達載體(pcDNA3，INVITROGEN)中構建了帶N-Myc親和標簽的截短及全長(FL)TRAF2。為了制備N-Myc融合構建體，合成5’PCR引物，該引物含Myc標簽序列及起始甲硫氨酸(MetGluGlnLysLeuIleSerGluGluAspLeuAsn)，之后是TRAF2 cDNA最初的20個核苷酸5’-ATG GAG CAG AAA TTGATT TCC GAG GAA GAT CTG AAC ATG GCT GCA GCT AGC GTG AC-3’。3’PCR引物序列是5’-TTAGAGCCCTGTCAGGTCCACAA-3’。用標準技術純化PCR產物并克隆入pcDNA3載體中。
用LipoFectamine(BRL，Gibco)試劑按試劑供應商的說明書將pcDNA3-myc TRAF2構建體轉染HeLa細胞。簡略地說，就是將4m1LipoFectamine與在1ml無血清DMEM(BRL)培養基中的1mg DNA混合，將此混合物與3×105個細胞置于60mm的有蓋培養皿中在5％的二氧化碳培養箱內37℃過夜。轉染24小時后，用磷酸鹽緩沖液清洗細胞并溶于200ml SDS電泳加樣緩沖液(SIGMA)中。電泳分離10ml裂解物并通過蛋白質印跡法轉移到硝酸纖維素膜上。按抗體供應商推薦的方法進行免疫染色和ECL(AMERSHAM)檢測。
抗Myc抗體(BABCO，Berkeley)檢測以pcDNA-TRAF2FL和pcDNA-TRAF2TR轉染的HeLa細胞中預期大小的蛋白質(圖6)。
圖6中的結果顯示了在被感染HeLa細胞中Myc-融合的TRAF2FL和TRAF2TR的免疫測定結果。用lipofectamine(Gibco BFL)將HeLa細胞轉染上TRAF-FL和TRAF-TR的表達構建體，24小時后將細胞溶于SDS上樣緩沖液中。用抗myc抗體和ECL檢測系統檢測Myc-融合蛋白質。泳道1-pcDNA3載體；2-myc-TRAF2FL；3-myc-TRAF2TR。實施例4-NFκB報告系統為了測定TRAF2TR、TRAF2TD或這些多肽的變體對NFκB所調節基因表達的作用，可使用NFκB報告系統，如文獻Takeuchi等，生物化學雜志271(33)，19935-42(1996)中所利用并描述的系統。NFκB報告激活系統可與適當的細胞結合使用，如293細胞、COS7細胞或HeLa細胞。用實施例3中所述的lipofectamine方法使細胞被不同的TRAF2構建體所轉染，即全長TRAF2、TRAF2TR和TRAF2TD。然后比較不同TRAF2片段對共轉染的NFκB報告分子激活的影響，從而鑒定出最有效的抑制劑種類。舉例說來，可將含全長TRAF2、TRAF2TR和TRAF2TD以及TRAF2TR和TRAF2TD變體的TRAF2構建體轉染入293細胞，并監測TNFα存在或缺乏的條件下NFκB報告分子活性的水平。預計全長TRAF2會激活共轉染的NFκB報告分子，而其它TRAF2構建體會不同程度的阻斷TNFα介導的NFκB報告分子激活作用。實施例5-離體治療方法離體基因治療方法是本領域所已知的，它通常包括4個階段。在第一階段，從待治療的患者中收集所需類型的細胞。第二階段，將目的基因轉染到分離的細胞中。第三階段，收集并培養已獲取目的基因的細胞。第四階段，將細胞或灌注或移植回患者體內，從而表達預期基因并治療疾病。
在使用本發明的離體治療方法的第一階段，從患者中獲取細胞。細胞的選擇基于許多因素，主要是被治療的特殊疾病。對這些靶細胞激活作用的阻斷會抑制心血管疾病狀態相關炎性過程中所涉及之前炎性細胞因子及其它蛋白質的表達。
第二階段，將TRAF2TR或TRAF2TD或變體cDNA克隆入適當的哺乳動物表達載體中。表達載體，例如pcDNA3，可用于包括脂轉染在內的轉染方法中。在優選的實施方案中，TRAF2TD由于其對TNFα結合作用的抑制能力有所增強，被克隆入pcDNA3或其它合適的哺乳動物表達載體中。基于被轉染的細胞類型和用于調節表達水平的預期方法來選擇表達載體中所用的啟動子。適當的啟動子可選自上文所述的啟動子中。對于心臟疾病的基因治療來說，啟動子，例如，2MHC(見Palermo等，循環學研究(Circ.Res.)，78(3)，504-9(1996))、MLC2(見Sani，自然314283-286(1985))、CARP(見Jeyaseelan等，生物化學雜志，272(36)，22800-8(1997))被插入TRAF2TD cDNA的上游。然后按提供的方法使用lipofectamine(BRL，Gibco)試劑將含TRAF2TDcDNA的表達載體用于脂質體介導的轉染中。對于使用病毒轉導的轉染方法來說，離體治療方法的第二階段采用了重組腺病毒載體系統。在此方法中，TRAF2TD cDNA被克隆入腺病毒表達載體中，例如，腺需求pQBI-AdBN/NB(QUANTUM生物技術公司)。然后將含有TRAF2TD cDNA的腺病毒轉移載體與腺病毒的病毒DNA共轉染入293細胞中。在噬斑純化及陽性克隆挑選后，擴增含TRAF2TD cDNA的重組腺病毒并用傳統的氯化銫梯度純化方法進行純化，隨后用適當的緩沖液進行透析，例如，磷酸鹽緩沖液。之后重組腺病毒被用于離體轉染靶細胞。
以約104-1014pfu之間的劑量形式配制并施用本發明的重組病毒。以AAV和腺病毒為例，優選使用劑量為約106-1011pfu。術語“pfu”“噬斑形成單位”)相應于病毒粒子懸浮液的感染能力，通過感染合適的培養細胞并檢測所形成噬斑的數量來測定。測定病毒溶液pfu滴度的技術在現有技術中有詳盡的描述。
在第三階段中，在培養基中培養用脂轉染或重組腺病毒感染方式獲得的轉染細胞，選擇已被轉染的細胞。可用多種方式進行選擇，包括使用只有獲取了表達載體的那些細胞才能存活或生長的藥物標記。
在第四階段，將轉染后的細胞灌注或直接移植入患者體內，輸入位點可以在待治療的組織附近或在允許TRAF2TD cDNA產物釋放入循環的部位，以便與受TNFα結合激活的細胞相互作用。送遞方法包括，但不局限于，直接注射或通過導管、灌注泵或支架(stent)。實施例6-體內治療方法體內治療方法可用多種不同的病毒載體中，包括腺病毒載體、腺伴隨病毒載體和逆轉錄病毒載體。在本發明優選的體內治療方法中，用腺病毒系統將TRAF2TR或TRAF2TD cDNA引入宿主細胞中。由于TRAF2TD cDNA相對較高的抑制TNFα結合激活作用的能力，優選在腺病毒表達載體中使用TRAF2TD cDNA。在此方法中，TRAF2TD cDNA被克隆入腺病毒轉移載體中，例如，腺需求pQBI-AdBN/NB(QUANTUM生物技術公司)或上述的其它腺病毒載體。基于被轉染的細胞類型和用于調節表達水平的預期方法選擇表達載體中所用的啟動子。適當的啟動子可選自上文所述的啟動子中。
然后可將含有預期啟動子和TRAF2TD cDNA的腺病毒轉移載體與腺病毒的病毒DNA共轉染入293細胞中。在噬斑純化及陽性克隆挑選后，擴增含TRAF2TD cDNA的重組腺病毒并用傳統的氯化銫梯度純化方法進行純化，隨后用適當的緩沖液進行透析，例如，磷酸鹽緩沖液。
在體內轉染細胞之前，測定病毒顆粒滴度，并進行體外實驗確定蛋白質表達水平以及組織培養物的感染劑量(TCID50)。以約104-1014pfu之間的劑量形式配制并施用本發明的重組病毒。以AAV和腺病毒為例，優選使用劑量為約106-1011pfu。術語“pfu”(“噬斑形成單位”)相應于病毒粒子懸浮液的感染能力，通過感染合適的培養細胞并檢測所形成噬斑的數量來測定。測定病毒溶液pfu滴度的技術在現有技術中有詳盡的描述。
然后將重組腺病毒以約106-1011pfu的劑量感染患者。重組腺病毒可通過以下方式引入吸入、灌注、外科植入、直接注射或通過導管、灌注泵或支架送遞。
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Cys Thr Trp Lys Gly Thr Leu20 25 30Lys Glu Tyr Glu Phe Gln Asp His Val Lys Thr Cys Gly Lys Cys Arg35 40 45Val Pro Cys Arg Phe His Ala Ile Gly Cys Leu Glu Thr Val Glu Gly50 55 60Glu Lys Gln Gln Glu His Glu Val Gln Trp Leu Arg Glu His Leu Ala65 70 75 80Met Leu Leu Ser Ser Val Leu Glu Ala Lys Pro Leu Leu Gly Asp Gln85 90 95Ser His Ala Gly Ser Glu Leu Leu Gln Arg Cys Glu Ser Leu Glu Lys100 105 110Lys Thr Ala Thr Phe Glu Asn Ile Val Cys Val Leu Asn Arg Glu Val
115 120 125Glu Arg Val Ala Met Thr Ala Glu Ala Cys Ser Arg Gln His Arg Leu130 135 140Asp Gln Asp Lys Ile Glu Ala Leu Ser Ser Lys Val Gln Gln Leu Glu145 150 155 160Arg Ser Ile Gly Leu Lys Asp Leu Ala Met Ala Asp Leu Glu Gln Lys165 170 175Val Leu Glu Met Glu Ala Ser Thr Tyr Asp Gly Val Phe Ile Trp Lys180 185 190Ile Ser Asp Phe Ala Arg Lys Leu Gln Glu Ala Val Ala Gly Arg Ile195 200 205Pro Ala Ile Phe Ser Pro Ala Phe Tyr Thr Ser Arg Tyr Gly Tyr Lys210 215 220Met Cys Leu Arg Ile Tyr Leu Asn Gly Asp Gly Thr Gly Arg Gly Thr225 230 235 240His Leu Ser Leu Phe Phe Val Val Met Lys Gly Pro Asn Asp Ala Leu245 250 255Leu Arg Trp Pro Phe Asn Gln Lys Val Thr Leu Met Leu Leu Asp Gln260 265 270Asn Asn Arg Glu His Val Ile Asp Ala Phe Arg Pro Asp Val Thr Ser275 280 285Ser Ser Phe Gln Arg Pro Val Asn Asp Met Asn Ile Ala Ser Gly Cys290 295 300Pro Leu Phe Cys Pro Val Ser Lys Met Glu Ala Lys Asn Ser Tyr Val305 310 315 320Arg Asp Asp Ala Ile Phe Ile Lys Ala Ile Val Asp Leu Thr Gly Leu325 330 335<210>5<211>2262<212>DNA<213>人<220><221>misc_feature<222>()..)<223>TRAF2截短序列含有第421-657位堿基對的缺失<400>5gaattccggc gcgctgcgac cgttggggct ttgttcgcgg gggtcacagc tctcatggct 60gcagctagcg tgaccccccc tggctccctg gagttgctac agcccggctt ctccaagacc 120ctcctgggga ccaagctgga agccaagtac ctgtgctccg cctgcagaaa cgtcctccgc 180aggcccttcc aggcgcagtg tggccaccgg tactgctcct tctgcctggc cagcatcctc 240agctctgggc ctcagaactg tgctgcctgt gttcacgagg gcatatatga agaaggcatt 300tctattttag aaagcagttc ggccttccca gataatgctg cccgcaggga ggtggagagc 360ctgccggccg tctgtcccag tgatggatgc acctggaagg ggaccctgaa agaatacgag 420agctgccacg aaggccgctg cccgctcatg ctgaccgaat gtcccgcgtg taaaggcctg 480gtccgccttg gtgaaaagga gcgccacctg gagcacgagt gcccggagag aagcctgagc 540tgccggcatt gccgggcacc ctgctgcgga gcagacgtga aggcgcacca cgaggtctgc 600cccaagttcc ccttaacttg tgacggctgc ggcaagaaga agatcccccg ggagaagttt 660caggaccacg tcaagacttg tggcaagtgt cgagtccctt gcagattcca cgccatcggc 720tgcctcgaga cggtagaggg tgagaaacag caggagcacg aggtgcagtg gctgcgggag 780cacctggcca tgctactgag ctcggtgctg gaggcaaagc ccctcttggg agaccagagc 840cacgcggggt cagagctcct gcagaggtgc gagagcctgg agaagaagac ggccactttt 900gagaacattg tctgcgtcct gaaccgggag gtggagaggg tggccatgac tgccgaggcc 960tgcagccggc agcaccggct ggaccaagac aagattgaag ccctgagtag caaggtgcag 1020cagctggaga ggagcattgg cctcaaggac ctggcgatgg ctgacttgga gcagaaggtc 1080aggcccttcc aggcgcagtg tggccaccgg tactgctcct tctgcctggc cagcatcctc 1140aggaagctcc aggaagctgt ggctggccgc atacccgcca tcttctcccc agccttctac 1200accagcaggt acggctacaa gatgtgtctg cgtatctacc tgaacggcga cggcaccggg 1260cgaggaacac acctgtccct cttctttgtg gtgatgaagg gcccgaatga cgccctgctg 1320cggtggccct tcaaccagaa ggtgacctta atgctgctcg accagaataa ccgggagcac 1380gtgattgacg ccttcaggcc cgacgtgact tcatcctctt ttcagaggcc agtcaacgac 1440atgaacatcg caagcggctg ccccctcttc tgccccgtct ccaagatgga ggcaaagaat 1500tcctacgtgc gggacgatgc catcttcatc aaggccattg tggacctgac agggctctaa 1560ctgcccccta ctggtgtctg ggggttgggg gcagccaggc acagccggct cacggagggg 1620ccaccacgct gggccagggt ctcactgtac aagtgggcag gggccccgct tgggcgcttg 1680ggagggtgtc ggcctgcagc caagttcact gtcacggggg aaggagccac cagccagtcc 1740tcagatttca gagactgcgg aggggcttgg cagacggtct tagccaaggg ctgtggtggc 1800attggccgag ggtcttcggg tgcttcccag cacaagctgc ccttgctgtc ctgtgcagtg 1860aagggagagg ccctgggtgg gggacactca gagtgggagc acatcccagc agtgcccatg 1920tagcaggagc acagtggatg gccttgtgtc cctcgggcat gacaggcaga aacgagggct 1980gctccaggag aagggcctcc tgctggccag agcaaggaag gctgagcagc ttggttctcc 2040cctctggccc ctggagagaa gggagcattc ctagacccct gggtgcttgt ctgcacagag 2100ctctggtctg tgccaccttg gccaggctgg ctgtgggagg gtctggtccc acgccgcctc 2160tgctcagaca ctgtgtggga gggcacagca cagctgcggg taaagtgtga gagcttgcca 2220tccagctcac gaagacagag ttattaaacc attacaaatc tc226權利要求
1.編碼TRAF2TR、含圖2a所示序列的DNA序列。
2.編碼TRAF2TD、含圖3a所示序列的DNA序列。
3.權利要求1的DNA，其中所說的DNA是cDNA。
4.權利要求2的DNA，其中所說的DNA是cDNA。
5.分離并純化的TRAF2TR多肽，它能抑制TNFα所調節途徑并包含如圖2b所示的氨基酸序列。
6.TRAF2TD多肽，它能抑制TNFα所調節途徑并包含如圖3b所示的氨基酸序列。
7.抑制患者體內TNFα所調節途徑的方法，包括將能抑制TNFα所調節途徑的組合物引入所說患者的體內。
8.權利要求7的方法，其中所說的組合物是能表達TRAF2TR多肽的表達載體。
9.權利要求7的方法，其中所說的組合物是能表達TRAF2TD多肽的表達載體。
10.權利要求7的方法，其中所說的組合物含TRAF2TR多肽和藥學可接受載體。
11.權利要求7的方法，其中所說的組合物含TRAF2TD多肽和藥學可接受載體。
12.抑制TNFα過度產生所涉及疾病的方法，包括將能抑制TNFα所調節途徑的組合物引入患者的體內。
13.權利要求12的方法，其中所說的組合物含能表達TRAF2TR的表達載體。
14.權利要求12的方法，其中所說的組合物含能表達TRAF2TD的表達載體。
15.權利要求12的方法，其中所說的組合物含TRAF2TR多肽和藥學可接受載體。
16.權利要求12的方法，其中所說的組合物含TRAF2TD多肽和藥學可接受載體。
17.抑制涉及核因子κβ(NFκB)依賴型基因超活化的TNFα疾病的方法，包括將能抑制TNFα所調節途徑的組合物引入患者的體內。
18.權利要求17的方法，其中所說的組合物是能表達TRAF2TR的表達載體。
19.權利要求17的方法，其中所說的組合物是能表達TRAF2TD的表達載體。
20.權利要求17的方法，其中所說的組合物含TRAF2TR多肽和藥學可接受載體。
21.權利要求17的方法，其中所說的組合物含TRAF2TD多肽和藥學可接受載體。
22.抑制涉及TNFα之發炎過程的方法，包括將能抑制TNFα所調節途徑的組合物引入患者體內。
23.權利要求22的方法，其中所說的組合物是能表達TRAF2TR的表達載體。
24.權利要求22的方法，其中所說的組合物是能表達TRAF2TD的表達載體。
25.權利要求22的方法，其中所說的組合物含TRAF2TR多肽和藥學可接受載體。
26.權利要求22的方法，其中所說的組合物含TRAF2TD多肽和藥學可接受載體。
27.權利要求22的方法，其中所說的涉及TNFα的發炎過程選自克隆病、牛皮癬、類風濕性關節炎、移植中的排斥反應、炎性腸疾病、非胰島素依賴型的糖尿病和神經變性疾病。
28.權利要求22的方法，其中所說的涉及TNFα的發炎過程是心血管疾病。
29.權利要求28的方法，其中所說的心血管疾病選自(a)心肌梗死后的心臟缺血-再灌注損傷、冠狀動脈旁路手術、心臟移植或中風后CNS中的局部缺血-再灌注損傷；(b)高度冠狀動脈粥樣硬化斑的加重和斷裂；(c)充血性心力衰竭的發展和加重；(d)球囊血管成形術之后的內皮細胞損傷；以及(e)心肌細胞的程序性細胞死亡。
30.編碼TRAF2TR/2TD變體的DNA序列。
31.權利要求30的DNA序列，其中所說的DNA序列包括保守的氨基酸取代。
32.能抑制TNFα所調節途徑的TRAF2TR/2TD變體多肽。
全文摘要
本發明涉及TRFA2的變體,它被證實具有抑制TNF－α信號傳導途徑的能力。具體地說,申請者已分離出TRAF2的剪接變體,在下文中被稱為“截短了的TRAF2”或“TRAF2TR”,以及具有增強的顯性失活特征的TRAF2表達構建體,下文中被稱為“截短－缺失的TRAF2”或“TRAF2TD”。TRAF2TR和TRAF2TD均具有抑制TNF－α信號傳導途徑的能力,在TRAF2TD中,此能力得到了很大的提高,大大降低了它對TNF－α結合的應答。
文檔編號A61P19/02GK1353754SQ00808279
公開日2002年6月12日 申請日期2000年4月6日 優先權日1999年4月30日
發明者G·H·希爾福斯三世, M·F·帕格諾尼, Y·D·伊瓦申科, K·郭, K·L·克拉克 申請人:阿溫蒂斯藥物制品公司