用于改善藥物保留的脂質體組合物的制作方法

專利名稱：用于改善藥物保留的脂質體組合物的制作方法
技術領域：
本發明涉及脂質體組合物，它使脂質體中藥物的保留改善。特別是，本發明涉及包括氟喹諾酮抗生素化合物的脂質體。
背景技術：
脂質體，或脂質囊泡，是公認的能改善各種藥劑的治療活性并增加安全性的藥物轉運系統。就用作診斷或治療化合物的體內載體來說，脂質體一般制備成含有包載在脂質體中的化合物的形式。為了用于醫學治療，脂質體制劑應該具有高的裝載效率，即高的藥物-脂質比，以減少病人負荷的非治療性的脂質，并且應該具有實際的貯存期限，使儲存期間包載的化合物幾乎沒有泄漏或活性損失。
有兩種制備脂質體制劑的通用方法被動裝載，此時藥物和脂質在形成脂質囊泡的時候結合；和遠距離裝載，此時藥物在脂質囊泡形成后在裝載到脂質體中。在被動裝載方法中，干燥的脂質膜一般與含有所需藥物的水相介質水合形成多層囊泡，它們在脂質體形成過程中被動包載藥物。化合物可以是包括在干燥脂質膜中的親脂性化合物，或者是包含在水合介質中的水溶性化合物。對于水溶性化合物，這種方法得到的包封效率非常不好，通常在最終的脂質體懸浮液中只有5-20％的總化合物為包封形式。如果對這些囊泡作進一步的加工，即通過擠壓以生產更小、更均勻大小的脂質體，則可能還會另外損失化合物。
用于形成裝載化合物的脂質體的其他被動包載方法是已知的，現已提出了溶劑注入法和反向蒸發相位法(Szoka，F.C.，Jr.，和Papahadjopoulos，D.，《美國國家科學院院報》754194-4198(1978))。這些方法容易出現相當不好的裝載效率和/或難以處理溶劑的問題。
化合物的遠距離裝載提供了克服被動裝載的某些缺點的方式，特別是提供了能達到高藥物-脂質比的方法。在遠距離裝載中，建立起穿過脂質體脂質雙層的離子梯度，諸如氫或銨離子梯度，可電離的化合物被裝載到脂質體中。
但是，遠距離裝載存在公認的離子梯度問題，其中一個就是具有可電離基團的藥物是有限的。另外，并非所有可電離的藥物都響應離子梯度而在脂質體中聚積(Chakrabarti，A.等，美國專利第5,380,532號；Madden，T.D.等，《脂質化學和物理學》5337-46(1990))。另一個問題是有些確實在脂質體中聚積的藥劑在聚積后立即就釋放了。還有一個問題是有些在體外成功地裝載并保留在脂質體中的藥劑在體內具有很高的從脂質體的泄漏率，從而失去了以藥劑包載在脂質體中的形式給藥的優點。
發明概述因此，本發明的目的是提供一種包括以卓越的保留性能包載在脂質體中的可電離化合物、特別是氟喹諾酮的脂質體組合物。
本發明的另一個目的是提供這種脂質體組合物的制備方法。
在一個方面，本發明包括由成囊泡脂質形成的脂質體懸浮液組成的脂質體組合物。包含在脂質體中的是氟喹諾酮化合物和能有效地與氟喹諾酮形成配合物并增強氟喹諾酮在脂質體中的保留的多陰離子聚合物。
在一個實施方案中，氟喹諾酮是6-氟喹諾酮。在優選的實施方案中，6-氟喹諾酮選自以下成員諾氟沙星、環丙氟哌酸、氧氟沙星、西洛沙星、洛美沙星、氟羅沙星、培氟沙星和氨氟沙星。
在另一個實施方案中，多陰離子聚合物是具有選自硫酸根、磺酸根、磷酸根和羧酸根的陰離子基團的聚合物。特別是，該多陰離子聚合物選自葡聚糖硫酸酯、硫酸軟骨素A、聚乙烯硫酸和多磷酸。
在另一個實施方案中，脂質體進一步包括用親水性聚合物衍生的脂質，諸如聚乙二醇。
在優選的實施方案中，脂質體包括多陰離子聚合物葡聚糖硫酸酯和6-氟喹諾酮環丙氟哌酸。
在另一個方面，本發明包括增強6-氟喹諾酮在脂質體中的保留的方法。該方法包括制備由成囊泡脂質組成的和具有包載的多陰離子聚合物的脂質體；和在6-氟喹諾酮的存在下在能有效地使化合物攝取到脂質體中并使化合物與多陰離子聚合物配合的條件下孵育這些脂質體。
在另一個方面，本發明包括具有以和多陰離子聚合物形成配合物的形式包載在脂質體中的6-氟喹諾酮的脂質體懸浮液的制備方法。該方法包括以下步驟形成脂質體的懸浮液，使具有包括多陰離子聚合物的內部水相和包括多陰離子聚合物的外部相；通過加入能有效地增加外部體相的離子強度并能有效地凝縮聚合物的鹽而從外部相除去任何未被包載的多陰離子聚合物；通過在6-氟喹諾酮的存在下在能有效地使6-氟喹諾酮攝取到脂質體的內部水相中的條件下孵育這些脂質體而將6-氟喹諾酮裝載到脂質體中；以及從外部相除去任何未被包載的6-氟喹諾酮。
在一個實施方案中，除去是通過縮合的多陰離子聚合物的膜滲濾。
用于去除步驟的鹽選自下列成員NaCl、KCl、Na2SO4和K2SO4。
在結合附圖閱讀了下面對本發明的詳細說明后，將更全面地領會本發明的這些以及其他目的和特性。
附圖的簡要描述

圖1A顯示了喹諾酮抗生素化合物的一般結構；圖1B顯示了6-氟-喹諾酮化合物的一般結構；圖1C顯示了6-氟-喹諾酮環丙氟哌酸的結構；圖2顯示了在針對水(空心圓)和針對0.15M NaCl(實心方塊)、0.35M NaCl(實心三角)、0.45M NaCl(實心圓)和1.0M NaCl(X標記)的滲濾過程中從滲透物收集的各部分中葡聚糖硫酸酯的量；圖3顯示了關于具有多陰離子聚合物俘獲劑的脂質體(實心圓)和不帶聚合物俘獲劑的脂質體(空心方塊，空心菱形)的在血漿中孵育后保留在脂質體中的環丙氟哌酸的百分數作為時間的函數所繪制的圖；圖4A顯示了含有與葡聚糖硫酸酯結合的環丙氟哌酸的脂質體(實心圓)和含有與聚丙烯酸結合的環丙氟哌酸的脂質體(實心三角)和含有環丙氟哌酸但不含聚合物俘獲劑的脂質體(空心方塊)在體內給藥后，保留在血流中的環丙氟哌酸的注射劑量百分數作為時間的函數所繪制的圖；圖4B顯示了葡聚糖硫酸酯/環丙氟哌酸的脂質體制劑(實心圓)、與聚丙烯酸酯配合的環丙氟哌酸的脂質體制劑(實心三角)和具有包載的環丙氟哌酸但沒有聚合物俘獲劑的對照脂質體的脂質體制劑(空心方塊)在靜脈給藥后，血流中的環丙氟哌酸濃度，以μg/mL表示。
發明詳述1、脂質體組合物本發明與提供包括穩定地包載在脂質體中的喹諾酮抗生素、優選6-氟喹諾酮的脂質體組合物有關。這部分描述脂質體的組分，包括被包載的藥物和多陰離子聚合物以及脂質體的脂質組分。脂質體的制備和特征描繪將在后面的部分中描述。
A、脂質體包載的喹諾酮化合物喹諾酮是總的4-吡啶酮-3-羧酸結構的一類合成抗微生物劑，如圖1A中所示。在圖中顯示的一般結構中，X為N或C，而R1、R2、R5、R6、R7和R8可以是任何基團。喹諾酮類藥物中的有些成員，諸如萘啶酮酸，已可供使用多年了。最近，已采用了氟化喹諾酮，這些衍生物提供了優于此類藥物中早期成員的治療益處，因為氟化的藥劑具有寬的抗微生物活性，并且口服給藥后能有效地治療各種各樣的感染疾病。這些化合物還具有相對較少的副作用，且對它們的作用產生的微生物抗性不會發展得很快。圖1B中顯示了6-氟喹諾酮的一般結構。
對6-氟-喹諾酮已進行了廣泛的研究，許多結構變體是已知的，其中許多都適用于本發明。更有效的一種6-氟-喹諾酮是環丙氟哌酸，(1-環丙基-6-氟-1，4-二氫-4-氧代-7-(1-哌嗪基)-3-喹啉羧酸)，其結構顯示在圖1C中。與其他喹諾酮一樣，環丙氟哌酸通過抑制細菌DNA的復制起作用。藥物與DNA復制必需的一種酶-DNA回旋酶的β-亞單位結合，使得超螺旋松弛和重構，并有效地抑制了其活性。
環丙氟哌酸包括R1位的環丙基環和R7位的哌嗪環，這包括具有約8.7pKa的可電離胺。該藥物可有效地對抗大多數革蘭氏陰性病原菌和一些革蘭氏陽性病原菌。但是，該抗菌劑的治療效力受到了其3-4個小時的短排除半衰期的限制，這使得它難以在血液中保持治療濃度。
如上所述，將藥物包載到脂質體中是提高藥物治療效力的一種途徑，有關環丙氟哌酸的包載已有記載(Ryan，J.等，WO91/09616；Wong，J.P.等，EP A1 0652008；Hope，M.等，WO96/26715)。但是，脂質體包載的環丙氟哌酸沒有在脂質體中留存足夠長的時間，以達到具有親水性聚合物鏈表面包衣的長時間循環脂質體的體內生物分布的程度。這在對比實施例1中得到證明，該對比實施例描述了具有聚乙二醇鏈表面包衣的脂質體的制備和通過遠距離裝載將環丙氟哌酸包載到脂質體中。對含有環丙氟哌酸的脂質體進行體外測試，以測量從脂質體釋放到血漿中的環丙氟哌酸的量(使用如實施例5中所述的方法)。結果發現在血漿中在37℃下孵育4小時后，幾乎所有藥物都從脂質體中泄漏出來，約75％的藥物在1小時內就釋放了。
長時間循環脂質體在血流中保持最多24小時。本文中所用的“長時間循環”脂質體是指具有親水性聚合物鏈表面包衣的脂質體，諸如美國專利第5,013,556號中所述的聚乙二醇包衣的脂質體。注射給藥24小時后，最多有注射劑量30％的長時間循環脂質體保留在血流中，而常規脂質體，例如沒有聚合物鏈包衣的脂質體，它們在數小時內就從血流中清除了。因此，長時間循環脂質體達到了在除了常規脂質體給藥后迅速積聚的單核吞噬細胞系統或網狀內皮系統以外的包括在器官和組織內的體內生物分布(Paphadjopoulos，D.等，《美國國家科學院院報》8811460-11464(1991))。很清楚，因藥物穿過脂質體雙層泄漏而導致的一半以上加載的環丙氟哌酸在數小時的期間內釋放的環丙氟哌酸-脂質體組合物沒有利用長時間循環脂質體的長時間循環壽命和良好的生物分布。
因此，一個方面，本發明提供了具有包載在脂質體中并在脂質體中保持一段足夠長的能達到脂質體生物分布的時間的環丙氟哌酸的脂質體組合物。在一個實施方案中，環丙氟哌酸包載在具有親水性聚合物鏈表面包衣的脂質體中并且環丙氟哌酸在該脂質體中保持一段足以利用脂質體的長時間血液循環壽命的時間，以實現包載化合物的良好生物分布和持續釋放。
更一般而言，本發明包括將許多化合物包載到脂質體中，特別是任何6-氟喹諾酮。再次參照圖1B，6-氟-喹諾酮一般其中的R1為C1-C3烷基，諸如甲基、乙基、丙基或環丙基，它們可以在一個或多個位置被F、Cl或Br取代；R7是直鏈、支鏈或環狀的含氮烷烴，其優選含有可電離氨基；例舉性的R7取代基包括環結構諸如1-氮雜環丁烷基、1-哌嗪基、4-甲基-1-哌嗪基、4-乙基-1-哌嗪基、2-哌嗪基、1-吡咯烷基，它們各自可以被NH2、NHCH3、N(CH3)2、2-氨基乙基、乙氨基甲基、1-吡咯烷基或氨基乙氨基甲基取代，其他例舉性的飽和和不飽和氮雜環包括單環雜環，例如咪唑、咪唑啉、二氫吡咯、1，2，3，6-四氫吡啶、1，4，5，6-四氫嘧啶、吡咯烷、嗎啉、哌啶、哌嗪、1，3，5-三嗪和二環雜環，例如全氫化吲哚、全氫化喹啉、全氫化異喹啉、全氫化-7-氮雜吲哚、全氫化-4-氮雜苯并咪唑、1，5-二氮雜二環[4.3.0]壬烯(DBN)、1，8-二氮雜二環[5.5.0]十一-7-烯(DBU)、1，5-二氮雜二環[4.3.0]壬烷、1，8-二氮雜二環[5.5.0]十一烷、1，4-二氮雜二環[2.2.2]辛烷(三亞乙基二胺)、3-氮雜二環[3.2.2]壬烷、3-氮雜二環[4.3.0]壬烷、3-氮雜二環[3.3.0]辛烷、2，8-二氮雜二環[4.3.0]壬烷、5-二氮雜二環[4.3.0]壬烷、1，5，7-三氮雜二環[4.4.0]癸-5-烯、2，7-二氮雜螺[4.4]壬烷；X為N或C，當X為N是，沒有R8；當X為C時，R8是H、F、Cl或CF3、OCH3或OCH2CH3，或者R1和R8一起構成將喹諾酮環中的1和8位環原子連接分別形成5元或6元環的2個或3個原子的烷基或烷氧基橋。此時有可能是順式或反式立體異構體，這兩種異構體都包括在本發明內。當存在不對稱手性中心時，化合物可包括單一立體異構體或立體異構體的混合物，通常是外消旋混合物。
一些優選的6-氟喹諾酮包括環丙氟哌酸、諾氟沙星、氧氟沙星、西洛沙星、洛美沙星、氟羅沙星、培氟沙星和氨氟沙星。
B、脂質體脂質組分如上所討論的，喹諾酮化合物包載在脂質體中，此時“包載”指的是化合物螯合在脂質體的中心含水區域中，位于脂質體脂質雙層之間的含水空間里，或位于雙層本身內。更具體地說，在本發明中，喹諾酮化合物以和如上所述的多陰離子聚合物形成配合物的形式包載在脂質體中。本文中所用的“配合物”是指當聚合物與喹諾酮發生接觸時形成的物質。配合物可以是在溶液中穩定的物質，也可以是沉淀。在這部分中，將描述用于本發明的脂質體。
本發明的脂質體由成囊泡脂質組成，通常包括具有疏水性尾基和極性首基的兩親脂質。成囊泡脂質的特點是其在水中自發形成到雙層囊泡中的能力，如磷脂所例證的。這種類型的成囊泡脂質優選具有兩個烴尾基或鏈、通常是酰基、和極性首基的那些。這類物質中包括磷脂，諸如磷脂酰膽堿(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酸(PA)、磷脂酰甘油(PG)和磷脂酰肌醇(PI)，此時兩個烴鏈一般長度在約14-22個碳原子之間，并且具有不同的不飽和度。優選的磷脂包括PE和PC。例舉性的PC是氫化大豆磷脂酰膽堿(HSPC)。也可以使用單鏈脂質，諸如鞘磷脂(SM)。
上述其酰基鏈具有各種不同飽和度的脂質和磷脂可以從商業上獲得，或者按照已公開的方法制備。可包括在本發明中的其他脂質是糖脂。本文中所用的術語“糖脂”包括具有兩個烴鏈、其中一個是鞘氨醇的烴鏈、和一個或多個糖殘基的脂質。
用于本發明的脂質可以是相對“流動的”脂質，意思是脂質相具有相對低的脂質熔化溫度，例如為室溫或低于室溫，或者另一方面，是相對“剛性的”脂質，意思是脂質具有相對高的熔點，例如不超過50℃的溫度。根據普遍規則，更剛性的、即飽和的脂質有助于脂質雙層結構中更大的膜剛度，并因此有助于活性藥物裝載后更穩定的藥物保留。優選的這種類型的脂質是具有約37℃以上的相變溫度的那些。
脂質體另外可包括能穩定囊泡的脂質或主要由磷脂組成的脂質體。來自這組的最常用的脂質是25至45摩爾百分數濃度的膽固醇。
在一個實施方案中，本發明的脂質體包括親水性聚合物鏈表面包衣。“表面包衣”指的是脂質體表面上的任何親水性聚合物包衣。親水性聚合物通過在脂質體組合物中包含一種或多種用親水性聚合物鏈衍生的成囊泡脂質而包括到脂質體中。可以使用的成囊泡脂質是上文中對第一成囊泡脂質組分所描述的那些中的任何一種，不過，優選具有二酰基鏈的成囊泡脂質，諸如磷脂。一種優選的磷脂是磷脂酰乙醇胺(PE)，它含有適于與活化聚合物偶聯的活性氨基。一種例舉性的PE是二硬脂酰PE(DSPE)。
用于與成囊泡脂質偶聯的優選的親水性聚合物是聚乙二醇(PEG)，最好是分子量在1,000-10,000道爾頓之間、更優選在1,000-5,000道爾頓之間的PEG鏈。
其他可能合適的親水性聚合物包括聚乳酸、聚乙醇酸、聚乙烯吡咯烷酮、聚甲基噁唑啉、聚乙基噁唑啉、聚羥基丙基甲基丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、聚二甲基丙烯酰胺和衍生衍生物，諸如羥甲基纖維素或羥乙基纖維素。
含有與適宜的脂質諸如PE結合的這些聚合物的脂質-聚合物共軛物的制備已有過記載，例如在美國專利第5,395,619號中，該專利清楚地結合在此作為參考，以及Zalipsky在STEALTH LIPOSOMES(D.Lasic和F.Martin編輯，CRC出版社，第9章(1995))中描述的。通常，在脂質體形成過程中包括在成脂質體組分中的是約1-20摩爾百分數之間的聚合物衍生脂質。
親水性聚合物鏈提供了親水性鏈的表面包衣，足以延長沒有這種包衣的脂質體的血液循環時間。血液循環時間增加的程度是沒有聚合物包衣時的數倍，如在我們共同擁有的美國專利第5,013,556號中所述的，該專利清楚地結合在此作為參考。
另外，脂質體可以制備成含有表面基團，諸如抗體或抗體片段、用于與細胞表面受體相互作用的小效應器分子、抗原和其他象用于實現所需的對特定細胞群的靶結合性能的化合物。此時，包括在脂質體中的脂質組分將包括用靶向分子衍生的脂質，或具有能用按照已知方法預先形成在脂質體中的靶向分子衍生的極性首化學基團的脂質。
C、多陰離子聚合物本發明的脂質體還包括包載在脂質體中的多陰離子聚合物。該聚合物是由優選類似化學結構的重復單元組成并具有可電離基團、也就是說能電離導致形成離子電荷、優選陰離子電荷的化學官能團的任何分子。分子量在從400-2,000,000道爾頓的較寬范圍內的聚合物都可考慮。
適合用于本發明的多陰離子聚合物包括硫酸化的、磺化的、羧化的或磷酸化的親水性聚合物。例如，硫酸化蛋白聚糖，諸如硫酸化肝素，硫酸化多糖，諸如硫酸化纖維素或纖維素衍生物，角叉菜膠，葡聚糖硫酸酯，粘蛋白，硫酸化多肽，諸如帶有硫酸化氨基的聚賴氨酸，具有磺酸衍生糖類或肽亞單位的糖肽，和透明質酸。還可考慮硫酸軟骨素A、B和C，硫酸角蛋白，硫酸皮膚素。
該聚合物也可以是經過修飾后包括陰離子官能團的中性聚合物。例如，直鏈淀粉、果膠、支鏈淀粉、纖維素和葡聚糖可以修飾成包括陰離子亞單位。
帶有磺基的聚合物諸如聚乙烯硫酸酯、聚乙烯磺酸酯、聚苯乙烯磺酸酯和硫酸化松香樹膠也是合適的。
如下文中所述，多陰離子聚合物在脂質囊泡形成過程中包載到脂質體中。藥物一旦裝載到脂質體中，聚合物就可將藥物俘獲或保留在脂質體中。在為支持本發明而進行的研究中，葡聚糖硫酸酯用作例舉性的多陰離子聚合物。葡聚糖硫酸酯是每個葡糖酰基殘基帶有大約2.3個硫酸根的葡糖酐聚合物。它由占葡聚糖分支的大約95％的α-D-(1-6)鍵和剩余的(1-3)鍵組成。分子量在從5,000至500,000道爾頓范圍內的該聚合物可輕易地獲得。
II、脂質體制備用于本發明的脂質體制備成具有從內到外穿過脂質雙層的離子梯度。該離子梯度然后用于將所需化合物裝載到脂質體中。具有這種離子梯度包括氫離子和銨離子梯度的脂質體是本領域技術人員熟知的，并且容易使用已知方法制備。
在為支持本發明所進行的研究中，制備具有穿過脂質膜的銨離子梯度的脂質體。這類脂質體的制備先前已有過描述，例如在美國專利第5,192,549號中。此時，脂質體在含有銨鹽的含水緩沖液中在合適的pH例如5.5至7.5下制備，所述銨鹽一般是0.1至0.4M的銨鹽，諸如硫酸銨或葡聚糖硫酸銨。脂質體形成并定型后，將外部介質轉換為一種沒有銨離子的介質，例如其中的硫酸銨被NaCl或能提供相同脂質體內外克分子滲透壓濃度的糖取代的同一種緩沖液。
脂質體形成后，脂質體內部的銨離子與氨和質子達到平衡。氨能穿透脂質體雙層，從脂質體內部逃逸。氨的逃逸使脂質體內的平衡不斷向右移動，以產生質子。
按照本發明的另一個方面，描述了具有以和多陰離子聚合物形成配合物的形式包載在其中的喹諾酮抗生素的脂質體懸浮液的制備方法。如實施例2中所述，制備由氫化大豆磷脂酰膽堿(HSPC)、膽固醇和mPEG-DSPE(N-(羰基-甲氧基聚乙二醇2000)-1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)組成的脂質體。這些脂質以50∶45.2∶4.8的摩爾比溶于乙醇中。將溶解的脂質加入到如實施例2中所述制備的葡聚糖硫酸酯銨鹽溶液中，并混合1小時以形成大小不均勻且具有包載在脂質體中的葡聚糖硫酸酯銨鹽的多層脂質體。
如實施例中所述，將該水合脂質體在壓力下擠出，使脂質體的大小為約100-150nm直徑。
脂質體形成后，將選定的藥物裝載到囊泡中。不過，該藥物將在多陰離子聚合物的存在下配合或沉淀。因此在藥物裝載之前必須從外部懸浮液介質中除去任何未被包載的聚合物，以防止在脂質體外部介質中形成不期望的配合物。就環丙氟哌酸而言，沉淀在甚至非常少量例如0.1μg/mL的葡聚糖硫酸酯的存在下發生。從外部介質中事實上除去所有未被包載的聚合物是很重要的。
根據本發明這一方面的重要特性，未被包載的多陰離子聚合物在鹽電解質的存在下通過滲濾除去。如實施例3中所述，使用葡聚糖硫酸酯銨鹽在水合介質中形成的脂質體使用中空纖維超濾筒針對350mM NaCl進行滲濾。鹽的存在降低了脂質體懸浮液的粘度并使聚合物凝縮以促進葡聚糖硫酸酯的去除。優選滲濾在導致任何未被包載的聚合物被充分去除的條件下進行，從而在藥物裝載步驟中見不到聚合物/藥物配合物或沉淀。
在為支持本發明進行的研究中，平均分子量為8,000道爾頓的葡聚糖硫酸酯鈉鹽的去除通過將葡聚糖硫酸酯針對水和針對離子強度不同的各種鹽溶液進行滲濾來檢驗。如實施例3所述，濃度為100mg/ml的葡聚糖硫酸酯溶液針對0.15M NaCl、0.35M NaCl、0.45M NaCl和1.0M NaCl進行滲濾。測定來自各個滲濾操作的滲透物中的葡聚糖硫酸酯，結果顯示在圖2中。從圖中可看出，當針對具有增高的離子強度的溶液0.15M NaCl(實心方塊)、0.35M NaCl(實心三角)、0.45MNaCl(實心圓)和1.0M NaCl(X標記)進行滲濾時更有效地除去了葡聚糖硫酸酯。表1中總結了用各種鹽溶液交換10體積后保留在剩余物中的葡聚糖硫酸酯的量。
表1交換10體積后保留在滲濾溶液中的葡聚糖硫酸酯的濃度
總的來說，結果發現通過增高用于滲濾的溶液的離子強度(即從0mM至350mM NaCl)并將溶液的pH調節為中性范圍(pH＝7.4)可除去99％以上的葡聚糖硫酸酯。
應當領會可以使用各種各樣的電解質來提高滲濾過程中介質的離子強度。優選鹽，諸如NaCl、KCl、Na2SO4和K2SO4。當然，用于聚合物最佳去除的電解質的量將根據聚合物和鹽以及各自的相對量發生變化。一般說來，需要約150mM的電解質，更優選450mM，最多1000mM。電解質用量的上限將部分地由脂質體在溶液中的穩定性決定，因為穿過脂質體雙層的離子梯度是確定的并隨著電解質濃度的升高而增加。
滲濾介質的pH也可以調節以從外部介質中最佳地去除聚合物。在為支持本發明進行的研究中，使用NaCl作為電解質在中性pH(例如pH-7-7.5)下較好地去除了葡聚糖硫酸酯。
除去了未被包載的聚合物后，通過用預先形成的脂質體在能有效地將藥物裝載到脂質體中的條件下孵育藥物溶液而將選定的藥物裝載到脂質體中。如實施例2所述，環丙氟哌酸通過用60-65℃間的脂質體孵育藥物水溶液30分鐘而裝載到含有葡聚糖硫酸酯的脂質體中。然后通過滲濾除去任何未被包載的藥物。
表2總結了使用上述脂質體制備和滲濾方法得到的四種脂質體制劑的性能。這些制劑包括作為舉例的喹諾酮環丙氟哌酸，環丙氟哌酸的濃度使用分光光度法測定。總脂質含量通過測量總磷脂含量確定。顆粒大小的測量使用動態光散射確定。
表2包載了葡聚糖硫酸酯/環丙氟哌酸的脂質體
在為支持本發明進行的其他研究中，將多陰離子聚合物聚丙烯酸用作環丙氟哌酸的俘獲劑。如實施例4所述，40∶45.2∶4.8摩爾比的脂質HSPC、膽固醇和mPEG-DSPE與聚丙烯酸銨的水溶液水合。通過在電解質的存在下進行滲濾而從外部介質除去了未被包載的聚合物后，脂質體用環丙氟哌酸裝載。將這些脂質體以及使用葡聚糖硫酸酯俘獲劑形成的脂質體用于下文中所述的體外泄漏試驗和體內藥動學研究。
III、脂質體的特性描繪對如上所述制備的具有以和葡聚糖硫酸酯或與聚丙烯酸酯形成配合物的形式包載的環丙氟哌酸的脂質體進行體外和體內的特性描繪。
更具體地說，進行體外試驗以確定在血漿的存在下環丙氟哌酸從脂質體泄漏的速率。如實施例5所述，制備脂質體并以50μg環丙氟哌酸/mL血漿的濃度在血漿中孵育。脂質體在37℃下在血漿中孵育4小時，在0、1、2和4小時的時候采樣用于分析。
結果總結在實施例5中的表3A-3C中，作為時間的函數的保留在脂質體中的環丙氟哌酸的百分數顯示于圖3中。用葡聚糖硫酸酯俘獲劑制備的脂質體(實心圓)具有實質上較低的環丙氟哌酸泄漏，孵育2小時后50％的藥物保留在脂質體中。與此對照，具有包載的環丙氟哌酸但沒有多陰離子俘獲劑的脂質體制劑(空心方塊，空心菱形)在大鼠血漿中孵育2小時后只有不到約10％的藥物仍保留在脂質體中。
含有葡聚糖硫酸酯包載的環丙氟哌酸和聚丙烯酸酯包載的環丙氟哌酸的脂質體制劑進行體內測試，以確定用按照本發明制備的脂質體制劑給藥的環丙氟哌酸的血液循環動力學。作為對照，還對動物給藥含有硫酸銨/環丙氟哌酸、也就是不含聚合物俘獲劑的脂質體。如實施例6所述，對大鼠靜脈給藥單次濃注劑量(40mg環丙氟哌酸/kg)。在最多24小時內的不同時間點從動物采集血樣并分析環丙氟哌酸含量。結果總結在下文中的表5中并用圖顯示于圖4A-4B中。
圖4A顯示了含有與葡聚糖硫酸酯結合的環丙氟哌酸的脂質體(實心圓)、含有與聚丙烯酸酯配合的環丙氟哌酸的脂質體(實心三角)和對照脂質體例如含有硫酸銨/環丙氟哌酸但不含聚合物俘獲劑的脂質體(空心方塊)的試驗結果。從圖中可看出，包載在沒有多陰離子聚合物的脂質體中的環丙氟哌酸(空心方塊)迅速從脂質體釋放并從血流中清楚，約50％的注射劑量在給藥后約1.5小時就去除了。與此對照，具有聚合物俘獲劑的脂質體顯示出明顯更好的環丙氟哌酸的保留，具有葡聚糖硫酸酯聚合物俘獲劑的脂質體(實心圓)和具有聚丙烯酸俘獲劑的脂質體(實心三角)在2小時后血流中仍存在50％的環丙氟哌酸劑量。
圖4B類似地顯示了測試制劑的以μg/ml表示的環丙氟哌酸的血漿濃度，所述測試制劑是具有與葡聚糖硫酸酯配合的環丙氟哌酸的脂質體(實心圓；參見表5中的原始數據)；具有與聚丙烯酸酯配合的環丙氟哌酸的脂質體(實心三角，參見表5的原始數據)和在內部區域中含有硫酸銨包載的環丙氟哌酸但不含聚合物俘獲劑的對照脂質體(空心方塊，參見表5的原始數據)。因俘獲劑導致的環丙氟哌酸在脂質體中的增強的保留明顯產生了改善的血液循環壽命。當以不含聚合物俘獲劑的脂質體形式給藥時，給藥后24小時血流中只保留了少許環丙氟哌酸。與此對照，當藥物以包括聚合物俘獲劑的脂質體給藥時，在第24小時的時候血流中仍存在藥物。
有關與葡聚糖硫酸酯結合的環丙氟哌酸、與聚丙烯酸酯結合的環丙氟哌酸和不含聚合物俘獲劑的對照制劑的藥動學參數AUC(曲線下面積)和Cmax總結在表6中。
表6脂質體環丙氟哌酸制劑的藥動學參數
IV、實施例以下對比實施例和實施例說明了包括包載的環丙氟哌酸的脂質體的制備。這些實施例決不打算限制本發明的范圍。
對比實施例1含有環丙氟哌酸的脂質體的制備具有聚乙二醇表面包衣的脂質體通過將氫化大豆磷脂酰膽堿(HSPC)、膽固醇和聚乙二醇衍生的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(PEG-DSPE)以50∶45∶5的摩爾比分別在60-65℃下溶于50ml乙醇加以制備。制備350mM硫酸銨溶液(pH5.5)并加熱至60-65℃。將溶解的脂質加入到硫酸銨溶液中并在60-65℃下混合1小時。所得多層脂質體通過0.4μm、0.2μm、0.1μm和0.08μm孔徑的聚碳酸酯膜擠出，各進行8次。擠出過程在60-65℃下進行。擠出的脂質體具有大約100nm的平均直徑。
這些脂質體然后針對350mM硫酸銨滲濾(交換10體積)，之后針對含有10％蔗糖的5mM NaCl滲濾(交換10體積)。
用10％蔗糖溶液以58mg/ml制備環丙氟哌酸儲備溶液。通過將如上所述制備的脂質體與環丙氟哌酸溶液以0.71mg/mg的藥物/脂質比混合并在60-65℃下孵育30分鐘來進行活性藥物的裝載，此時采取等分試樣并使用交聯葡聚糖G-50柱測定藥物裝載百分數。藥物裝載百分數為56％(使用更低的藥物/脂質比最多可達到94％的裝載效率)。
未被包入的藥物通過針對含有10％蔗糖的10mM組氨酸緩沖液pH6.5滲濾而除去。裝載了環丙氟哌酸的脂質體通過0.2μm的膜無菌過濾并儲存在2-8℃下。最終的脂質體具有101nm的平均直徑和0.41mg/mg的藥物/脂質比。
平均直徑為142nm的另一種含有環丙氟哌酸的脂質體制劑使用上述相同的操作生產，只是對擠壓技術稍作修改。
實施例2含有葡聚糖硫酸酯-環丙氟哌酸的脂質體的制備A、葡聚糖硫酸酯銨鹽的制備葡聚糖硫酸酯，鈉鹽，分子量8,000道爾頓(Dextran ProductLimited(Ontario，Canada))如下所述轉化為葡聚糖硫酸酯銨鹽。柱床體積為400mL的離子交換柱用DOWEX 50X8-100離子交換樹脂(Aldrich Chemical Co，Milwaukee，WI)填滿。裝好的柱子用2L 1NHCl以3-4mL/分鐘的流速沖洗，直到洗脫的pH約為1-2。過量的HCl用2-3L去離子水從柱子上洗掉，直到洗脫水的pH大約為5.5。
將300mL葡聚糖硫酸酯鈉鹽(50mg/mL溶于水)加到樹脂上并收集12份50mL的級分。將含有葡聚糖硫酸酯的級分(第3-12級分)合并，用5M氫氧化銨(大約25mL)將pH從1.29調節至5.5。
葡聚糖硫酸酯銨鹽在1L圓底燒瓶中在4份150mL級分中冷凍干燥。將凍干的粉末以100mg/mL的濃度溶于5mM NaCl。溶液pH為5.4。
B、脂質體的制備如上所述制備8.75mM葡聚糖硫酸酯的溶液并加熱到60-65℃之間。
將氫化大豆磷脂酰膽堿(HSPC，Lipoid K.G.Ludwigshafen，Germany)、膽固醇(Croda，Inc.New York，NY)和mPEG-DSPE(Sygena，Ltd，Liestal Switzerland)在60-65℃下以50∶45.2∶4.8的摩爾比溶于無水乙醇(Quantum Chemical，Cincinnati，Ohio)。將溶解的脂質加入到加熱的葡聚糖硫酸酯溶液中，該混合物在60-65℃下混合1小時。總脂質濃度為106.38mg/mL，或150μmol/mL。
水合脂質體在壓力下在60-65℃下通過0.2μm孔徑的聚碳酸酯膜濾器擠出8-10次。
未被包載的聚合物通過針對NaCl溶液進行滲濾而從調整過大小的脂質體懸浮液中除去。使用中空纖維超濾筒(NMCO 300,000；A/G TechCorp.Needham，MA)，這些脂質體針對350mM NaCl，pH7.4進行滲濾，交換10個體積，然后針對150mM NaCl，pH7.4進行滲濾，交換10體積。
將足夠的環丙氟哌酸(Bayer AG，Leverkusen，Germany)溶于150mM NaCl形成30mg/mL溶液。將該溶液加熱至60℃使完全溶解。將藥物溶液與脂質體懸浮液混合并在60-65℃下孵育30分鐘，接著使用冰浴迅速冷卻至室溫。藥物的包入百分數通過在尺寸排阻柱上將游離藥物與脂質體囊泡分離并通過UV分光光度法定量每一級分中的藥物的量來測量。
未包載的藥物通過滲濾除去，針對150mM NaCl溶液交換5體積，然后針對10％蔗糖，10mM組氨酸，pH6.5交換10體積。
實施例3葡聚糖硫酸酯針對鹽溶液的滲濾將葡聚糖硫酸酯鈉鹽(分子量8,000道爾頓，Dextran ProductsLimited，Scarborough，Ontario，Canada)以100mg/ml的濃度溶于蒸餾水。具有300,000分子量截止閥和0.79 ft2表面積的滲濾筒(A/G/Technology Corporation，Needham，MA)用2升蒸餾水洗滌。90mL的葡聚糖硫酸酯針對1000mL(約交換10體積)蒸餾水進行滲濾。體積交換液(各100mL)分開收集，各1mL用于葡聚糖硫酸酯定量。最終的剩余物用水調節到同一初始體積(90mL)，然后測定葡聚糖硫酸酯的含量。
使用0.15M NaCl、0.35M NaCl、0.45M NaCl和1.0M NaCl重復相同的滲濾操作。收集滲透物并使用1，9-二亞甲基藍和590nm下的吸光度分析葡聚糖硫酸酯。結果顯示于圖2和表1中。
實施例4帶有聚丙烯酸的脂質體制劑制備分子量為2,000道爾頓的250mM聚丙烯酸(AldrichChemicals，Milwaukee，WI)和50mM硫酸銨的水溶液并用5M NaOH將溶液的pH調節至5.5。
如實施例2中所述通過將溶解的HSPC、膽固醇和mPEG-DSPE以50∶45.2∶4.8的摩爾比與聚丙烯酸銨/硫酸銨水溶液水合來制備脂質體。按照實施例2除去未包載的聚合物并將環丙氟哌酸裝載到脂質體中。
實施例5體外特性描繪環丙氟哌酸從按照實施例2和3制備的脂質體的泄漏率通過以50μg環丙氟哌酸/mL血漿的濃度孵育脂質體加以測定。脂質體在37℃下在血漿中孵育4小時，在第0、1、2和4小時的時候采樣用于分析。各個樣品中的脂質體利用固相萃取法(下面的實施例5B中陳述的)分離出游離藥物并利用反向HPLC(下面的實施例5C陳述的)分析環丙氟哌酸的含量。結果總結于下面的表3A-3C中并顯示在圖3中。
表3A具有葡聚糖硫酸酯銨/環丙氟哌酸的脂質體
表3B具有硫酸胺/環丙氟哌酸的脂質體
*BQL＝低于定量限度表3C具有硫酸胺/環丙氟哌酸的脂質體
*BQL＝低于定量限度A、固相萃取法1、樣品制備脂質體-環丙氟哌酸制劑用10％蔗糖/10mM組氨酸pH6.5稀釋到環丙氟哌酸濃度約為2mg/mL。對于每種脂質體-環丙氟哌酸制劑，使1.95mL空白大鼠血漿在冰上急冷。在0時，將50μL冷凍脂質體制劑與冷凍血漿混合(環丙氟哌酸終濃度為50μg/mL)并取出兩個100μL等分試樣用于0時間點時的即時固相萃取。然后將該血漿/脂質體混合物置于37℃水浴中。在1、2和4小時的時候，混合混合物并取出一式兩份100μL等分試樣用于萃取。空白血漿以類似的方式制備，用10％蔗糖/10mM組氨酸，pH6.5緩沖液代替脂質體環丙氟哌酸制劑。在4小時的時候，從各個血漿/脂質體混合物取出另外一組一式兩份的100μL等分試樣用于總環丙氟哌酸測定。
2、固相萃取法SPE-24G固相萃取玻璃柱處理器(JT Baker，part # JT 7208-8)和用于固相萃取的Bond Elute LRC，C18筒，100mg，10mL(Varianpart # 1211-3001)用于萃取操作。在筒的下面連接20計量一次性針頭以幫助收集樣品。筒預先用2mL甲醇洗滌，接著用2mL鹽水洗滌。通過使用約4-6Hg真空使以中度速度通過筒滴落，C18填料床永遠也不允許干燥，直到萃取操作結束。筒的針頭使用一次后拋棄。
將2mL容量瓶置于預期洗滌過的C18筒下用于收集樣品。筒然后用200μL空白大鼠血漿預處理，以除去C18吸附劑上的活性部位。然后將血漿/脂質體混合物的100μL等分試樣裝載到C18床上。筒用1mL鹽水洗滌，將洗脫液收集在下面的相同燒瓶中。這種鹽水級分含有脂質體-環丙氟哌酸，其標記為“S級分”。
然后用1.6mL甲醇/0.1M NaH2PO4，pH2.2(9∶1，v/v)(酸化甲醇)從C18筒洗脫游離的環丙氟哌酸。洗液收集在第二個2mL容量瓶中，將C18填料吸干，取下所有樣品。這種級分標記為“F級分”。
使用鹽水將F級分和S級分調整到2.0mL體積。將在4小時的時候收集的用于測定總環丙氟哌酸的血漿/脂質體-環丙氟哌酸混合物的100μL等分試樣也使用鹽水稀釋到2.0mL并標記為“總”。
B、對環丙氟哌酸的HPLC分析1、HPLC條件柱溫30℃流速1mL/分鐘運行時間12分鐘檢測UV在278nm下流動相25mM NaH2PO4，pH2.3/乙腈(87∶13)注入體積20μL
柱Water Symmetry C184.6×150mm，5微米，有前置柱“總”和“S級分”如下所述處理。將250μL級分與1000μL酸化甲醇渦旋混合，然后在10℃下以3000rpm(Sorvall RT6000)離心30分鐘。將上清液轉移到HPLC瓶中用于分析。
環丙氟哌酸系統精確樣品和校準標準物用存在于鹽水中的15％空白大鼠血漿制備，等分試樣用與“總”和“S級分”相同的方式用酸化甲醇處理。環丙氟哌酸和脂質體包載的環丙氟哌酸優質對照樣品用空白大鼠血漿制備，將樣品的100μL等分試樣用鹽水稀釋至2.0mL。稀釋樣品的等分試樣然后用與“總”和“S級分”相同的方式用酸化甲醇處理。HPLC校正曲線范圍是0.02-10μmg/mL，結果使用通過1/(濃度)2加權的最小二乘方線性回歸進行擬合。
實施例6體內特性描繪A、脂質體制劑按照實施例1、2和4中陳述的操作制備具有下列組分的脂質體，此時脂質體的活性裝載在脂質體利用乙醇水合法制備后使用硫酸銨濃度梯度完成。
表4用于體內試驗的脂質體制劑
1硫酸銨內部2氫化大豆磷脂酰膽堿3甲氧基聚乙二醇二硬脂酰磷脂酰膽堿B、動物18只雄性Sprague-Dawley大鼠(220至250gms)從賣主(Simonsen Labs，Gilroy，Ca)購得并關在12小時12小時白天黑夜循環下的可隨意獲得食物(Lab DietTMLaboratory Rodent Diet #5001)和水的常規籠子里。動物在研究開始前至少關3天以確保它們健康狀態良好。
C、研究設計經由外側尾靜脈以40mg/kg對大鼠單次靜脈注射給藥三種脂質體-環丙氟哌酸制劑之一。通過在下列時間經由眼眶后靜脈竇將全血采集到7.5％EDTA抗凝劑中而從麻醉(吸入異氟烷)的動物獲得血樣給藥后20分30秒、40分、1.5小時、3小時、5小時、7小時和24小時。將血樣儲存在冰中，直到在室溫下以750xg離心20分鐘，以得到血漿部分。血漿在-4℃下冷凍，直到用于通過反向HPLC測定總環丙氟哌酸(游離的加上被包載的)。
D、數據評估使用ADAPT II，4.0版藥動學/藥效學系統分析軟件(D’Argenio和Schmutizky，ADAP II用戶指南。Biomedical SimulationsResource，University of Southern California，Los Angles，CA)使用加權非線性回歸用最大似然估計獲得每只大鼠的藥動學情況。用于環丙氟哌酸濃度的經驗差異模型假定觀察的殘余(“誤差”)標準偏差(σ)與真實值線性相關。模型的判定采用Akaikes信息標準(AIC)(Akaike，H.，自回歸模型擬合的最小AIC規程的貝葉斯擴展，Biometika，66237-242(1979))。最大環丙氟哌酸濃度(Cmax)通過直接觀測血漿濃度得到，從0時間點到無限大的平穩狀態下的曲線下面積(AUCss)通過數值積分確定。
血漿環丙氟哌酸濃度總結在表5中并用圖顯示于圖4A-4B中。來自該體內研究的藥動學參數顯示于上文中的表6中。
表5血漿環丙氟哌酸濃度
*BQL＝低于定量限度盡管本發明已根據特定實施方案進行了描述，但對于本領域技術人員來說，顯然可以在不背離本發明的情況下進行各種變化和修飾。
權利要求
1.一種脂質體組合物，它包含由成囊泡脂質組成的脂質體的懸浮液；在脂質體中含有氟喹諾酮化合物和能有效地與氟喹諾酮形成配合物并增強氟喹諾酮在脂質體中的保留的多陰離子聚合物。
2.權利要求1的組合物，其中所述氟喹諾酮是6-氟喹諾酮。
3.權利要求2的組合物，其中所述6-氟喹諾酮選自下列成員諾氟沙星、環丙氟哌酸、氧氟沙星、西洛沙星、洛美沙星、氟羅沙星、培氟沙星和氨氟沙星。
4.權利要求1的組合物，其中多陰離子聚合物是包括選自硫酸根、磺酸根、磷酸根和羧酸根的陰離子基團的聚合物。
5.權利要求1的組合物，其中多陰離子聚合物選自葡聚糖硫酸酯、硫酸軟骨素A、聚乙烯硫酸和多磷酸。
6.權利要求1的組合物，其中脂質體進一步包括用親水性聚合物衍生的脂質。
7.權利要求6的組合物，其中親水性聚合物是聚乙二醇。
8.權利要求7的組合物，其中多陰離子聚合物是葡聚糖硫酸酯，而6-氟喹諾酮是環丙氟哌酸。
9.增強6-氟喹諾酮在脂質體中的保留的方法，該方法包括制備由成囊泡脂質組成的脂質體，脂質體具有包載的多陰離子聚合物；在6-氟喹諾酮化合物的存在下在能有效地使化合物攝取到脂質體中并使化合物與多陰離子聚合物配合的條件下孵育這些脂質體。
10.權利要求9的方法，其中6-氟喹諾酮選自下列成員諾氟沙星、環丙氟哌酸、氧氟沙星、西洛沙星、洛美沙星、氟羅沙星、培氟沙星和氨氟沙星。
11.權利要求9的方法，其中多陰離子聚合物是包括選自硫酸根、磺酸根、磷酸根和羧酸根的陰離子基團的聚合物。
12.權利要求9的方法，其中多陰離子聚合物選自葡聚糖硫酸酯、硫酸軟骨素A、聚乙烯硫酸和多磷酸。
13.權利要求9的方法，其中脂質體進一步包括用親水性聚合物衍生的脂質。
14.權利要求13的方法，其中親水性聚合物是聚乙二醇。
15.權利要求14的方法，其中多陰離子聚合物是葡聚糖硫酸酯，而6-氟喹諾酮是環丙氟哌酸。
16.具有以和多陰離子聚合物共沉淀的形式包載在脂質體中的6-氟喹諾酮的脂質體懸浮液的制備方法，該方法包括形成脂質體的懸浮液，使具有包括多陰離子聚合物的內部水相和包括多陰離子聚合物的外部相；通過加入能有效地增加外部體相的離子強度并能有效地凝縮聚合物的鹽而從外部相除去任何未被包載的多陰離子聚合物；通過在6-氟喹諾酮的存在下在能有效地使6-氟喹諾酮攝取到脂質體的內部水相中的條件下孵育這些脂質體而將6-氟喹諾酮裝載到脂質體中；和從外部相除去任何未被包載的6-氟喹諾酮。
17.權利要求16的方法，其中所述除去包括通過縮合的多陰離子聚合物的膜滲濾除去。
18.權利要求16的方法，其中鹽選自下列成員NaCl、KCl、Na2SO4和K2SO4。
19.權利要求16的方法，其中裝載包括裝載選自下列成員的6-氟喹諾酮諾氟沙星、環丙氟哌酸、氧氟沙星、西洛沙星、洛美沙星、氟羅沙星、培氟沙星和氨氟沙星。
20.權利要求16的方法，其中形成包括形成具有以包括選自硫酸根、磺酸根、磷酸根和羧酸根的陰離子基團的聚合物作為多陰離子聚合物的脂質體。
21.權利要求16的方法，其中多陰離子聚合物選自葡聚糖硫酸酯、硫酸軟骨素A、聚乙烯硫酸和多磷酸。
全文摘要
本發明描述了用于增強喹諾酮化合物、特別是氟喹諾酮化合物的保留的脂質體組合物。脂質體中包載的是能有效地與氟喹諾酮形成配合物的多陰離子聚合物。還描述了這類脂質體的制備方法,該方法包括除去未被包載的多陰離子聚合物的過程。
文檔編號A61K47/32GK1351495SQ00807566
公開日2002年5月29日 申請日期2000年4月28日 優先權日1999年4月29日
發明者L·S·S·郭, R·基萬 申請人:阿爾薩公司