肺炎鏈球菌抗原的制作方法

專利名稱：肺炎鏈球菌抗原的制作方法
技術領域：
本發明涉及衍生自肺炎鏈球菌的蛋白質、編碼這些蛋白質的核酸分子、核酸和/或蛋白質作為抗原/免疫原及在檢測/診斷中的用途，以及篩選蛋白質/核酸序列作為潛在抗微生物靶的方法。
在世界范圍內呼吸道疾病仍然是引起發病和死亡的主要原因。肺炎鏈球菌是呼吸道的主要致病菌。由此致病菌引起的感染包括中耳炎、下呼吸道感染、菌血癥以及腦膜炎。
肺炎鏈球菌，通常又稱為肺炎球菌，是一種重要的致病生物體。已經有人對在發展中國家和發達國家中與人類疾病有關的肺炎鏈球菌感染的持續重要性進行了權威性的綜述(Fiber，G.R.Science，2651385-1387(1994))。該報告指出，在全球范圍內，這種生物體被認為是急性呼吸道感染最常見的細菌性原因，估計每年可以導致一百萬兒童死亡，主要是在發展中國家(Stansfield，S.K.，Pediatr.Infect.Dis.，6622(1987))。在美國，有人提出(Breiman等人，Arch.Intern.Med.1501401(1990))肺炎球菌仍然是細菌性肺炎最常見的原因，該疾病在幼童、老人、和患有易感染疾病(例如無脾、心臟病、肺病以及腎病、糖尿病、酒精中毒或具有免疫抑制失調性疾病(尤其是AIDS))的患者中發病率特別高。這些人群組具有肺炎球菌敗血病并因此具有腦膜炎的高發危險性，因此更容易死于肺炎球菌感染。這些肺炎球菌還可以導致中耳炎和鼻竇炎，其仍為發展中國家兒童中的流行性感染，并帶來很大的費用。
由于新近出現了抗青霉素的肺炎球菌使得對肺炎球菌感染的有效預防戰略的需要變得突出。據報道，已發現在美國12個洲的13所醫院中得到的肺炎球菌的分離物中有6.6％對青霉素具有抗性，有一些分離物還對其它抗菌素具有抗性，包括第三代的環孢菌素(Schappert，S.M.，Vital and Health Statistics of the Centres for DiseaseControl/National Centre for health Statistics，2141(1992))。在一些醫院中，青霉素抗性比率較高(高達20％)(Breiman等人，J.Am.Med.Assoc.，2711831(1994))。由于肺炎球菌中產生青霉素抗性的情況是新近的而且很突然，其出現于一直用青霉素進行有效治療的數十年之后，所以在這些發現被視為一種警示。
由這些致病菌引起的疾病的負擔是很明顯的，并對國家的健康預算有重大影響。盡管有針對于肺炎鏈球菌的疫苗，但這種疫苗對2歲以下的兒童不是十分有效。目前的治療依賴于感染的抗菌素治療。許多患有因肺炎鏈球菌引起感染的人群生活在發展中國家，那里的一些社區僅有非常有限的獲得適當藥物治療的手段。因此，不可能得到抗菌素治療。在可以獲得抗菌素的發達國家，已經明顯出現了這些細菌對抗菌素具有抗性的情況。
因此，開發抗肺炎鏈球菌的有效疫苗是人們期望的目標。特別地，期望開發出能夠用于幼童的疫苗。
采取了各種方法以便提供用于預防肺炎球菌感染的疫苗。出現了一些困難，例如就基于圍繞在有機體周圍的多糖莢膜結構的各種血清型(至少90種)而言。能抵抗單個血清型的疫苗無法有效地抵抗其它血清型，這意味著疫苗必須包括來自全部血清型的多糖抗原，以便對大多數病癥有效。由于已經發現當被純化和用作疫苗時，莢膜多糖(其中的每一個決定血清型并作為主要的保護性抗原)對2歲以下的幼童不能可靠地誘導保護性抗體反應，而侵入性肺炎球菌感染和腦膜炎在該年齡組中的發病率最高，所以產生了另外一個問題。
對采用莢膜抗原的方法的修飾依賴于多糖與蛋白質的綴合，以便誘導增強的免疫反應，特別是通過給出反應T-細胞依賴特性。例如該方法已經被用于開發抗流感嗜血菌疫苗。然而，這需要有關于復合多糖疫苗及基于綴合物的那些疫苗的費用支出。
第三個方法是尋找具有作為疫苗候選者潛力的其它抗原組分。這是本發明的基礎。我們現已鑒定了一些來自肺炎鏈球菌的抗原性和免疫原性的蛋白質。
因此在本發明的第一個方面中提供了可得自肺炎鏈球菌的蛋白質或多肽，它們選自(i)用SDS/PAGE測定的分子量為55kDa，并且所具有的N-末端序列為VEPKAKPADPSVV的蛋白質或多肽；(ii)用SDS/PAGE測定的分子量為50kDa，并且所具有的N-末端序列為NDRLVATQSADGRNESVLMSIET的蛋白質或多肽；(iii)用SDS/PAGE測定的具有分子量為85kDa，并且所具有的N- 末 端 序 列 為EDTTNSRFGSQFDKYRQPNAEPDHSHDAVSADNSTAHNRFGYGFAIGSKYIRYD的蛋白質或多肽；(iv)用SDS/PAGE測定的分子量為38kDa，并且所具有的N-末端序列為DKYRQPNAEPDDHHYAV的蛋白質或多肽；(v)用SDS/PAGE測定的分子量為30kDa，并且所具有的N-末端序列為DAVSAD或SETNVY的蛋白質或多肽；(vi)用SDS/PAGE測定的分子量為32kDa，并且所具有的N-末端序列為DKVDGLSAKPDILKP的蛋白質或多肽；(vii)用SDS/PAGE測定的分子量為43kDa，并且所具有的N-末端序列為ELKEEG(W)VVK的蛋白質或多肽；(viii)用SDS/PAGE測定的分子量為100kDa，并且所具有的N-末端序列為EVHA的蛋白質或多肽；(ix)用SDS/PAGE測定的分子量＜14kDa，并且所具有的N-末端序列為MKLNEVKEFVKELRAET的蛋白質或多肽；(x)用SDS/PAGE測定的分子量＜14kDa，并且所具有的N-終端為AKYEILYIERPNIEEFAK的蛋白質或多肽；(xi)用SDS/PAGE測定的分子量＜14kDa，并且所具有的N-末端序列為I(R)LTRM(E)GGKKKP(K)FYY的蛋白質或多肽；(xii)用SDS/PAGE測定的分子量為16kDa，并且所具有的N-末端序列為VMTDPIADXLXRI的蛋白質或多肽；(xiii)用SDS/PAGE測定的分子量為27.5kDa，并且所具有的N-末端序列為(VA)(KE)LVFARHGE(LT)E(NK)的蛋白質或多肽；(xiv)用SDS/PAGE測定的分子量為44kDa，并且所具有的N-末端序列為IITDVYAREVLDSRGNPTL的蛋白質或多肽；(xv)在還原條件下，用SDS/PAGE測定的分子量為12-14kDa，并且所具有的氨基末端序列如下的蛋白質或多肽A L N I E N I I A E I K I A SAla Leu Asn Ile Glu Asn Ile Ile Ala Glu Ile Lys Ile Ala Ser(xvi)為上述(xv)中所定義的蛋白質的還原毒性變體或片段；(xvii)在還原條件下，用SDS/PAGE測定的分子量約為16kDa的蛋白質或多肽；或者(xviii)在還原條件下，用SDS/PAGE測定的分子量約為57kDa，并且具有下列氨基末端序列R I I K F V Y A KArg Ile Ile Lys phe Val Tyr Ala Lys.
本發明中的蛋白質或多肽可以基本上純的形式提供。例如，其可以基本上不含其它蛋白質的形式提供。關于上面引用的分子量，技術人員將會意識到用不同的人手或甚至用同樣的人手在不同的場合會得到有細微差別的結果，因此，這里所引用的分子量數字應理解為有±5％或甚至±10％的波動。
正如這里所討論的，本發明蛋白質和/或多肽可用作抗原物質。這類物質可以是“抗原性”和/或“免疫原性”的。通常，“抗原性”是指蛋白質或多肽能夠用來產生抗體或確實能夠誘導實驗對象的抗體反應。“免疫原性”是指蛋白質或多肽能夠引發實驗對象體內的保護性免疫反應。因此在后一種情況下，蛋白質或多肽不僅可能能夠產生抗體反應，另外還能產生非抗體基礎的免疫反應。
技術人員將會意識到本發明中的蛋白質或多肽的同系物或衍生物也將在本發明的上下文中找到用途，即作為抗原性/免疫原性物質。因此，包括一或多個添加、缺乏、取代等處理的蛋白質或多肽均包括在本發明的范圍內。另外，可以用另一個相似“類型“的氨基酸取代一個氨基酸。例如用另一個氨基酸取代一個疏水性的氨基酸。人們可以利用程序(例如CLUSTAL程序)來比較氨基酸序列。該程序可比較氨基酸序列，并且在適當處通過在任一序列中插入間隔來發現最適順序。可以計算最適順序的氨基酸同一性或相似性(氨基酸類型的同一性加保守性)。類似BLASTx的程序將對比相似序列的最長的一段，并給該配合指定一個值。因此，有可能獲得一個比較，在其中發現有幾個區域是相似的，每一個具有不同的分值。這兩種類型的分析本發明均予以關注。
在同系物和衍生物的情況下，與這里所述的蛋白質或多肽的同一性程度比起同系物或衍生物應該保留其對肺炎鏈球菌的抗原性或免疫性性來說重要性要小得多。然而，適宜地是提供與這里所述的蛋白質或多肽具有至少60％相似性的同系物或衍生物(正如這里所討論的)。優選的是，提供具有至少70％的相似性、更優選的是至少80％的相似性的同系物或衍生物，最優選的是，提供具有至少90％或甚至95％的相似性的同系物或衍生物。
在另一個方法中，同系物或衍生物可以是混入使純化更為容易的組成成分的融合蛋白質，例如通過有效地標記需要的蛋白質或多肽。除去“標記”可能是必要的或也可以是這種情況融合蛋白質本身保持足夠可用的抗原性。
在本發明的另一個方面中，其提供了本發明蛋白質或多肽或其同系物或衍生物的抗原性片段。
對于這里所述的蛋白質或多肽或其同系物或衍生物的片段來說，情況稍有不同。已知可以篩選抗原性蛋白質或多肽來鑒定表位區域，即那些對蛋白質或多肽的抗原性或免疫性性負有責任的區域。進行這類篩選的方法在本領域內是已知的。因此，本發明的片段應包括一或多個這樣的表位區域或與這些區域足夠相似以保留它們的抗原性/免疫性性質。因此，對于本發明的片段來說，同一性的程度可能是無關的，因為它們可與這里所述的蛋白質或多肽、同系物或衍生物的特定部分達到100％的同一性。再一次地，關鍵的問題是該片段保留它們的抗原性/免疫原性。
因此，對于同系物、衍生物和片段來說，重要的是它們至少具有一定程度的蛋白質或多肽(它們從中衍生而來)的抗原性/免疫原性。
通過提取可以從肺炎鏈球菌中獲得蛋白質，因此，在本發明的另一方面中，提供了一種制備分離的和純化的蛋白質的方法，該方法包括以下步驟(a)制備肺炎鏈球菌培養物，使培養物在合適的條件下生長并采集，接著用離心洗滌，得到洗滌過的細胞小丸；(b)將洗滌過細胞再懸浮于合適的緩沖液中，接著使細胞破裂；(c)離心除去細胞碎屑并獲得含有可溶性細胞蛋白質的上清液；(d)使得到的溶液以氯化鈉作為梯度洗脫液進行陰離子交換層析，合并相應于每一個峰的組分；(e)將蛋白質組分懸浮于含有0.5M Tris HCl pH 68；10％(v/v)甘油；10％(w/v)SDS；0.05％(w/v)溴苯酚藍；以及0.05％(v/v)β-巰基乙醇的緩沖液中；將混合物煮沸，然后利用SDS-PAGE，采用帶有4％(w/v)丙烯酰胺/BIS層積凝膠的12％(w/v)丙烯酰胺/BIS分離凝膠進行純化，在16mA下在層積凝膠中和24mA下在拆解凝膠中進行試驗；(f)選擇含有分子量為12-14kDa，16kDa，34kDa或57kDa的蛋白質的組分，并從選擇的組分中分離蛋白質。
另外，可以采用基因克隆技術來提供本發明的基本上純化形式的蛋白質。例如在J.Sambrook等人，Molecular Cloning 2ndEdition，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)中公開了這些技術。因此，在這里公開的蛋白質的N-末端序列可以反過來用作探針的基礎，來分離編碼單個蛋白質的基因。因此，本發明的另一個方面是提供了包含或由下列序列組成的核酸分子
(i)編碼這里所述蛋白質或多肽的DNA序列或它們的RNA等價物；(ii)與(i)序列中的任意一個互補的序列；(iii)基本上具有與(i)和(ii)序列中的任意一個同一性的序列；(iv)編碼這里所述的蛋白質的同系物、衍生物或片段的序列。
本發明的核酸分子可以包括眾多的這類序列和/或片段。技術人員會意識到本發明可以包括在此舉例說明的那些特定的新穎核酸分子的新穎變體。本發明包括這類變體。這些變體可以是天然存在的，例如由于菌株變化。例如，包括添加、取代和/或缺失。另外且特別是當利用微生物表達系統時，人們可以寄希望于在用來表達的特定的有機體中，利用已知的優選的密碼子選擇來人工改造核酸序列。因此，本發明也包括合成或非天然存在的變體。
上述使用的術語“RNA等價物”是指給定的RNA分子具有與給定的DNA分子的序列互補的序列(考慮這樣一個事實，即RNA中的“U”取代了遺傳密碼中的“T”。
當為了測定同源性或同一性的程度而進行核酸序列比較時，可以采用BESTFIT和GAP等程序(兩者均來自Wisconsin GeneticsComputer Group(GCG)軟件包)。例如BESTFIT可比較兩個序列并產生最相似區段的最適順序。GAP可使序列沿著它們的整個長度排列，并通過在任一序列的適當位置插入間隔發現最適順序。適宜地，在本發明的上下文中，當討論核酸序列的同一性時，通過使序列沿著它們的整個長度排列進行比較。
優選地，具有實質同一性的序列與所述序列具有至少50％序列同一性、期望的是至少75％序列同一性、更需要的是至少90％或至少95％的序列同一性。在一些情況下，序列同一性可為99％或更高。
期望地，術語“實質同一性”是指，與現有技術的核酸序列相比，所述的序列與這里所述的任何序列具有更大程度的同一性。
然而，應該注意到，本發明的核酸序列為新穎基因產物的至少一部分進行編碼，因此本發明包括所有可能為基因產物或為其新穎部分進行編碼的序列。
核酸分子可以為分離或重組的形式。其可以混入載體中，并且該載體可以混入宿主中。這類載體和合適的宿主構成了本發明進一步的方面。
因此，例如，利用在這里所述的N-終端氨基酸基礎上設計的探針，可以鑒定肺炎鏈球菌中的基因。然后利用限制酶將它們切除，并克隆到載體中。可將載體引入合適的宿主中進行表達。
通過使用合適的與核酸分子序列的一部分互補的探針，可以從肺炎鏈球菌中獲得本發明的核酸分子。可以采用限制酶或聲處理技術來獲得用于探測的合適大小的片段。
另外，可以利用PCR技術來擴增需要的核酸序列。因此，這里提供的序列數據可用來設計兩個用于PCR的引物，以便能夠靶向需要的序列(包括其整個基因或片段)，然后以較高的程度進行擴增。一般情況下，一個引物將對位于DNA分子一條鏈上的第一個序列顯示出高度的特異性，而另一個引物將對位于DNA序列互補鏈上的第二個序列顯示出高度的特異性，并且與第一個序列的互補序列隔開。
典型的引物具有至少15-25個核苷酸長度。
作為另外的方案，可以采用化學合成。這種方法可以是自動化的。可以通過化學方法合成相對短的序列，然后連接起來提供一個較長序列。
正如這里所討論的，本發明人還發現12-14kDa的蛋白質是一種毒素，如果通過修飾降低其毒性，有可能提供高度有效驗的疫苗。確定蛋白質毒性部分的戰略包括連續截短的片段或突變體的制備。
正如這里所討論的，發現本發明的蛋白質以及其片段和同系物可以用作免疫原。因此，在另一個方面中，本發明提供了本發明蛋白質、其同系物和/或其片段在藥物方面的用途，尤其是在肺炎鏈球菌感染的預防和/或治療方面的用途。
在進一步的方面中，本發明提供了一種免疫原性/抗原性組合物，該組合物包含一或多種這里所述的蛋白質或多肽、或它們的同系物或衍生物，和/或任何這些物質的片段。在優選的實施方案中，免疫原性/抗原性組合物為一種疫苗或可用于診斷測定。
疫苗組合物還可以包含佐劑。本領域內熟知的佐劑的實例包括無機凝膠，例如氫氧化鋁或油包水乳劑，例如弗氏不完全佐劑。其它有用的佐劑對于本領域內的專門人員來說是熟知的。
蛋白質可經各種途徑進行給藥，包括腸道給藥，例如口服、鼻腔、頰、局部或肛門等途徑，或非腸道給藥，例如靜脈、皮下、肌內或腹膜內等途徑。
當然，組合物所采用的劑型以及其所含有的賦形劑取決于選擇的給藥途徑。例如，口服制劑可以為糖漿劑、酏劑、片劑或膠囊劑形式，其可以用腸衣包裹以使蛋白質免受在胃中的降解。鼻腔或透皮制劑通常分別為噴霧劑或貼片形式。注射制劑可以是溶于蒸餾水或其它藥物上可接受的溶劑或懸浮劑中的溶液或懸浮液。
給予患者的本發明蛋白質合適的劑量將由醫生來決定。然而，作為一種指導，合適的劑量可為約0.5-20mg/kg體重。在大多數情況下，預計劑量約為1-15mg/kg體重，優選的是1-10mg/kg體重。因此對于一個體重約70kg的男性來說，典型的劑量約為70-700mg。
還可以利用這里所述的核酸序列來制備所謂的DNA疫苗。因此，本發明還提供了包含一或多種這里所定義的核酸序列的疫苗組合物。本領域內有關于這種DNA疫苗用途的描述。例如，可以參見Donnelly等人，Ann.Rev.Immunol.，15617-648(1997)。
正如這里已經討論的，這里所述的蛋白質或多肽、它們的同系物或衍生物，和/或任何這些物質的片段可以用于肺炎鏈球菌的檢測/診斷方法中。這種方法可基于對抵抗可能存在于檢測對象體內的這種蛋白質的抗體的檢測。因此，本發明提供了檢測/診斷肺炎鏈球菌的方法，該方法包括使受試樣品與至少一種這里所定義的蛋白質、或它們的同系物、衍生物或片段進行接觸的步驟。適宜地，樣品為生物樣品，例如得自受試對象的組織樣品或者血液或唾液樣品。
在另一個方法中，可用這里所定義的蛋白質、或它們的同系物、衍生物和/或片段來產生抗體，該抗體反過來可用來檢測抗原，如肺炎鏈球菌。這類抗體構成了本發明的另一個方面。包括在本發明范圍內的抗體可以是單克隆的也可以是多克隆的。
當將這里所定義的蛋白質、或其同系物、衍生物或片段注射到動物體內時，在合適的動物宿主(例如小鼠、大鼠、荷蘭豬、兔子、綿羊、山羊或猴子)中通過刺激它們的生成可以產生多克隆抗體。如有需要，可與蛋白質一起給予佐劑。熟知的佐劑包括弗氏佐劑(完全的和不完全的)以及氫氧化鋁。借助該抗體與這里所述蛋白質的結合可以對其進行純化。
從雜交瘤可以生產單克隆抗體。通過將能產生需要抗體的骨髓瘤細胞和脾細胞融合在一起以便形成無限增殖的細胞系可以形成這些抗體。因此，可以采用熟知的Kohler&Milstein技術(Nature 256(1975))或基于此技術其隨后的變化形式。
用于生產與特定多肽/蛋白質結合的單克隆和多克隆抗體的技術在本領域中已經得到了充分的發展。在標準的免疫學教科書中有所討論，例如Roitt等人，Immunlogy第二版(1989)，ChurchhillLivingstone，London。
除了整個的抗體之外，本發明還包括能夠與這里所述的蛋白質等結合的抗體衍生物。因此，本發明包括抗體片段和合成構建物。Dougall等人在Tibtech 12372-379(1994年9月)中給出了抗體片段和合成構建物的實例。
例如，抗體片段包括Fab，F(ab’)2和Fv片段。Fab片段(在Roitt等人[上文]中討論了這些片段)。可以修飾Fv片段來生成已知為單鏈Fv(scFv)分子的合成的構建物。其包括與Vh和Vl區域共價結合的肽接頭，它們有助于分子的穩定性。其它可用的合成構建物包括CDR肽。這些是包含抗原結合決定簇的合成肽。也可以采用肽模擬物。這些分子通常是構象受限的有機環，其模仿CDR環結構并且包括抗原相互作用的側鏈。
合成構建物包括嵌合分子。因此，例如，人源化(或靈長類化)抗體或其衍生物也在本發明的范圍之內。人源化抗體的實例為具有人類構架區、但嚙齒動物高變區的抗體。例如Morrison等人在PNAS，81，6851-6855(1984)及Takeda等人在Nature.314，452-454(1985)中討論了生產嵌合抗體的方式。
合成構建物還包括含有附加的部分，該部分可以提供除了抗原結合之外具有一些期望性質的分子。例如該部分可以是一種標記(例如熒光或放射標記)。另外，其可為一種藥物活性劑。
發現抗體或其衍生物在肺炎鏈球菌的檢測/診斷上有用。因此，本發明的另一個方面提供了檢測/診斷肺炎鏈球菌的方法，其包括使待測樣品與能夠與一或多種這里所述的蛋白質或多肽、或其同系物、衍生物和/或片段結合的抗體進行接觸的步驟。
另外，可以利用所謂的“親和體”。它們是結合蛋白，選自α-螺旋細菌受體結構域的組合文庫(Nord等人)。因此，可利用組合方法來選擇能夠與不同靶蛋白特異性結合的小蛋白質結構域。
還將清楚地看到，這里所述的核酸序列可用來檢測/診斷肺炎鏈球菌。因此，再一方面本發明提供了檢測/診斷肺炎鏈球菌的方法，其包括使受試樣品與至少一種這里所述的核酸序列進行接觸的步驟。適宜地，樣品為生物樣品，例如得自受試對象的組織樣品或者血液或唾液樣品。這些樣品在用于本發明方法之前可以進行預處理。因此，例如，可以處理樣品提取DNA，然后可用基于這里所述的核酸序列的DNA探針檢測來自肺炎鏈球菌的核酸。
在另外的方面中，本發明提供了(a)給受試對象接種以抵抗肺炎鏈球菌的方法，其包括給予受試對象本發明中的蛋白質或多肽、或其衍生物、同系物或片段，或免疫原性組合物的步驟。
(b)給受試對象接種以抵抗肺炎鏈球菌的方法，其包括給予受試對象這里所定義的核酸分子的步驟。
(c)預防或治療肺炎鏈球菌感染的方法，其包括給予受試對象本發明中的蛋白質或多肽、或其衍生物、同系物或片段，或免疫原性組合物的步驟。
(d)預防或治療肺炎鏈球菌感染的方法，其包括給予受試對象這里所定義的核酸分子的步驟。
(e)用于檢測/診斷肺炎鏈球菌感染的試劑盒，其包括一或多種本發明蛋白質或多肽，或其同系物、衍生物或片段，或本發明抗原性組合物，以及(f)用于檢測/診斷肺炎鏈球菌感染的試劑盒，其包括一或多種這里所定義的核酸分子。
假設我們鑒定了一組重要的蛋白質，這類蛋白質是用于抗微生物治療的潛在的靶。然而，必要的是，測定是否每一種蛋白質對于有機體的存活來說都是必需的。因此，本發明還提供了一種測定這里所述的蛋白質或多肽是否代表潛在的抗微生物靶(其包含失活的所述蛋白質或多肽)以及測定在體外或體內肺炎鏈球菌是否依然存活的方法。
合適的用于使蛋白質失活的方法是進行選擇的基因剔除，即防止蛋白質表達并測定這是否導致致死性變化。Li等人在P.N.A.S.，9413251-13256中描述了進行這類基因剔除的適宜方法。
本發明的最后一個方面提供了能夠拮抗、抑制或干擾本發明蛋白質或多肽的功能或表達的藥劑在制備用于治療或預防肺炎鏈球菌感染的藥物中的用途。
通過下列實施例將進一步描述本發明，這些實施例不應以任何方式限制本發明的范圍。
實施例提到下列附圖，其中

圖1顯示了從細胞壁物質中提取的蛋白質的12％SDS PAGE凝膠的照片，所述的細胞壁物質用1M的1.乙酸銨溶液、2.氯化銨溶液、3.三甲基氯化銨溶液或4.Tris-HCl(pH6.8)溶液進行過處理。
圖2用本發明中所用的蛋白質純化過程的圖解概述來表示的流程圖。
圖3肺炎鏈球菌細胞壁提取物的電洗脫分布圖，用SDS-PAGE進行分析。
泳道1用SDS-PAGE分離的粗品提取物的考馬斯染色；泳道3分子量標準泳道2以及4-11通過電洗脫回收的蛋白質。
圖4陰離子交換層析的分布圖。
圖5顯示了分子量為14、16、34以及57kDa的純化肺炎鏈球菌蛋白質。
圖6是顯示在用16kDa的肺炎鏈球菌蛋白質接種后的肺清除的直方圖。
圖7是顯示在用34kDa的肺炎鏈球菌蛋白質接種后的肺清除的直方圖。
圖8是顯示在用57kDa的肺炎鏈球菌蛋白質接種后的肺清除的直方圖。
實施例1從肺炎鏈球菌菌株中分離抗原性或免疫原性蛋白質從肺炎鏈球菌NCTC 7466(血清型2)的胞外被膜中分離出這里所鑒定的蛋白質。在不振搖的情況下，于37℃下，使該菌株在含有10％馬血以及0.5％葡萄糖的Bacto Tryptic Soy Broth中生長過夜至靜止期。然后，將10ml過夜培養物接種到500ml含有0.5％葡萄糖但不含血的細菌培養用胰胨大豆肉湯(Bacto Tryptic Soy Broth)中，并且在不振搖的情況下，于37℃下培養過夜。通過3000rpm(1100g)下離心25min回收完整的細胞然后再懸浮于40ml 50mM的Tris馬來酸鹽pH6.8中，向其中加入蛋白酶抑制劑。將壓力設置在40Kpsi，在Constant Systems細胞破裂器(型號為22/40/AA/AA)中使細菌破裂。在4℃下用2600rpm(1100g)的轉速將細胞的勻漿離心10min，除去完整的細胞。然后在4℃、15,000rpm(27000g)的轉速下離心上清液使細菌細胞壁成小丸。然后通過離心作用將細胞小丸在10ml含有蛋白酶抑制劑的50mM的Tris馬來酸鹽pH6.8中洗滌兩次。最后使細胞小丸與含有不同化合物的同樣緩沖液進行混合，來測定那一種蛋白質將從細胞壁物質中釋放出來。離心后，從細胞壁物質中提取的蛋白質存在于上清液中。用SDS-PAGE分析從細胞壁物質中提取的蛋白質。圖1的照片顯示了從細胞壁物質中提取的蛋白質的12％SDS PAGE凝膠，所述的細胞壁物質用1M的乙酸銨溶液、氯化銨溶液、三甲基氯化銨溶液或Tris-HCl溶液(pH6.8)進行過處理。
采用centricon 10旋轉濾器濃縮提取的蛋白質，并采用各種不同濃度的丙烯酰胺借助SDS PAGE對其進行分離。然后將分離的蛋白質轉移至用于分離和N-終端測序的硝基纖維素膜上。
根據Applied Biosystems方案進行N-終端的測序。然而，根據Matsudaira在J.Biol.Chem.26210035-10038(1997)中所述的方法，技術人員也可以進行這樣的測序。實施例2動物研究進行了一項比較試驗，以觀察如上制備的蛋白質混合物保護小鼠抵抗肺炎球菌攻擊的能力。研究中還包括不同的佐劑。對鼻內攻擊的抗體水平和存活率進行了評價。
接種方案在第1周對7周大的雌性CBA/Ca小鼠進行接種，對弗氏和Titremax佐劑而言，在第5周進行加強，對于Ribi而言，在第4周進行加強，第8周用肺炎球菌進行鼻內攻擊。在每次接種時，經皮下給予20μg的劑量。從頸背處經皮下給予弗氏完全佐劑+蛋白質混合物和Titremax+蛋白質混合物，并經皮下從腹部給予Ribi+蛋白質混合物。采血在第2，4和6周時采血用于進行抗體滴度的比較。肺炎球菌攻擊按照以下方法制備4型肺炎鏈球菌的標準接種物通過小鼠使肺炎球菌1x的培養物傳代，從被感染的動物血中收集所述的培養物，在凍存前使之生長達到109cfu/ml左右預定的活菌計數。可按下列流程圖來進行制備劃線培養肺炎球菌和證實鑒定↓使來自上述平板上的4-5個菌落的過夜培養物生長↓動物傳代培養肺炎球菌(腹膜內注射心臟采血以收集)↓使來自動物傳代的肺炎球菌的過夜培養物生長↓使來自動物傳代過夜和在-70℃下-這是標準的最低限度凍存的日培養物生長(至預定的光密度)↓融化標準接種物的一份等分試樣至活菌計數↓利用標準接種物確定有效劑量(稱為毒力試驗)↓所有隨后的攻擊-利用稀釋到有效劑量的標準接種物在PBS中將標準接種物的等分試樣稀釋500倍，并對小鼠進行接種。
用鹵代烷使小鼠輕微麻醉，然后將劑量為50μl的1.4×105cfu/ml肺炎球菌施用于每只小鼠的鼻腔。通過小鼠的正常呼吸使攝入更為方便，使小鼠仰臥讓其恢復。
在感染過程中，于設定的間隔記錄小鼠的癥狀。結果存活數據通過24小時對照，未接種的小鼠顯示出感染跡象，它們的平均存活時間為49.2小時。弗氏佐劑+蛋白質的平均存活時間為124.5小時，Ribi+蛋白質以及Titremax+蛋白質平均存活時間為168小時。在弗氏佐劑組的6只中有2只存活，Ribi組的6只中有4只存活，Titremax組的6只全部存活。
弗氏佐劑+蛋白質以及Ribi+蛋白質組中的小鼠沒有生病，與未接種的對照小鼠比較，發病有所拖延。抗體滴度利用ELISA在佐劑組之間進行了免疫反應評價。對于弗氏佐劑組來說，平均滴度為199024，在第二和第三次采血時為722119。對于Ribi組來說，平均滴度為16674，在第二和第三次采血時為1474354。對于Titremax組來說，平均滴度為138455，在第二和第三次采血時為705486。實施例2-抗原的分離和純化細菌用血清組3肺炎鏈球菌(ATCC 49619)來獲得本研究中所調查的抗原，并將其用于動物研究中同源性細菌的攻擊。使細菌菌株在37℃并和5％CO2下在血液瓊脂上生長過夜，或在37℃下于震蕩培養箱中，在胰胨大豆肉湯(Oxoid Ltd，Basingstoke，Hampshire，UK)中培養過夜。蛋白質純化細胞壁蛋白質的提取無菌地，將一滿環的肺炎鏈球菌接種到10ml無菌胰胨大豆肉湯中，并在37℃的震蕩培養箱中培養過夜。使2×5mL的等分試樣在2×500mL體積的無菌胰胨大豆肉湯中進行傳代培養，并在37℃的震蕩培養箱中培養過夜。無菌地，將一環細菌懸浮液從每一個培養物中移出，在血瓊脂上劃線并在37℃下在CO2中培養過夜，作為生長和污染物的檢查。
在4℃下，用Beckman J-2TM離心機使細菌培養物在18000×g的轉速下離心20min。通過離心用磷酸緩沖鹽水(PBS)將小丸洗滌兩次，然后將小丸再懸浮于10mLPBS和200μl 10％(w/v)脫氧膽酸鈉中，室溫下攪拌1小時。4℃下，使懸浮液在27000×g的轉速下離心15min，回收上清夜，攪拌下逐漸加入硫酸銨至最終濃度達到70％(w/v)。4℃下，使懸浮液在27000×g的轉速下離心15min，將小丸再溶于10mL 10mM磷酸鈉(pH7.0)中。4℃下，針對于3×1L 10mM磷酸鈉(pH7.0)的更換透析再懸浮的小丸，更換之間最少留出2小時。4℃下，使透析蛋白質懸浮液在15000rpm下離心20min，保存上清夜，進行蛋白質測定。經冷凍干燥濃縮蛋白質懸浮液，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析。SDS-PAGE根據蛋白質的分子量，采用Protean II ixi槽TM(Bio-Rad)來分離蛋白質。從30％(w/v)丙烯酰胺/BIS(N，N’-亞甲基雙丙烯酰胺)Tris緩沖液的儲備溶液來制備由12％(w/v)丙烯酰胺/BIS分離凝膠和4％(w/v)丙烯酰胺/BIS積層(上部)凝膠組成的非連續凝膠。用過硫酸銨和TEMED使聚丙烯酰胺凝膠進行聚合。將冷凍干燥的蛋白質提取物1∶1(v/v)懸浮于樣品緩沖液(0.5M Tris HCl pH 6.8；10％(v/v)甘油；10％(w/v)SDS；0.05％(w/v)溴酚藍；0.05％(v/v)β-巰基乙醇)中，煮沸5min，然后將大約1mL此溶液裝載到凝膠的頂部。在每凝膠16mA的恒定電流下進行電泳，直至染料前沿通過堆積處(stacker)，然后將電流加大至24mA，通過拆解凝膠進行電泳。平均的泳動時間為4-5小時。在200V和0.2mA的最大電流下，采用BIORADTM平床電洗脫器電洗脫1小時，將分離的蛋白質回收到30根單獨的管子中。用分析SDS-PAGE以及Coomassie或Silver蛋白質染色測定回收級分中的蛋白質組成。在200V的恒定電壓下，采用Mini-protean IITM槽(Bio-Rad)進行約45min分析SDS-PAGE。采用Pierce Micro BCATM蛋白質測定法并與白蛋白標準比較來測定蛋白質的濃度。從純化的蛋白質中除去SDS每1mL含有SDS的樣品用200μl體積的100mM磷酸鉀進行處理，然后將其置于冰上60min。4℃下，使樣品在微量離心機中于10000×g的轉速下離心20min。回收上清液，經對納純水過夜透析脫鹽。液相層析分離陰離子交換液相層析另外用陰離子交換層析純化提取的蛋白質，并根據它們分子電荷的相互作用進行分離。在1mL/min的流速下，用低鹽緩沖液(20mATris-HCl pH8.45)平衡柱子(Q5柱，Bio-Rad)10min。將凍干的細胞壁提取物再懸浮于同樣的緩沖液中，達到濃度為5mg/mL，然后裝載到柱子上。通過逐漸增加通過柱子的20mM Tris-HCl，500mM氯化鈉，pH8.6的比例來利用增加的鹽梯度洗脫蛋白質。回收組分，凍干并用分析SDS-PAGE進行測定。將來自多個實驗的組分進行混合，通過制備SDS-PAGE以及前述的電洗脫進一步純化蛋白質。結果上述方法成功地純化了具有不同分子量的10種蛋白質，在下列實施例4中所述的動物免疫研究中能夠對其進行評價。所純化的最具活性的蛋白質具有的分子量為12-14 kDa，16 kDa，34 kDa和57 kDa。總共，分離出23種不同的蛋白質，其產率范圍為20-500μg/6L培養物，細胞壁提取物的總蛋白質濃度范圍為25-30mg。圖2顯示了細胞壁提取物以及粗品蛋白質提取物經電洗脫后分離出來的不同蛋白質的分布圖。并不是所有蛋白質都是作為單一蛋白質條帶從凝膠中洗脫出來的；一些級分由2-3種不同的蛋白質組成。采用陰離子交換層析進行的細胞壁蛋白質的洗脫分布3中顯示了陰離子交換層析的洗脫分布圖。第一個峰代表未結合蛋白質的洗脫，隨后的兩個主要峰含有用增加的鹽濃度洗脫的大多數蛋白質。用SDS-PAGE對這些峰中的蛋白質進行進一步的純化。實施例3-N-末端序列分析從來自分析SDS-PAGE的切除條帶中測定蛋白質的N-末端序列。用Biomolecular Resource Unit，The John Curtin School of MedicalScience(Australian Capital Territory，Australia)進行分析。
表1-純化蛋白質的氨基酸序列分析結果
為了幫助蛋白質定性，通過GenBank數據庫對從部分氨基酸序列獲得的信息進行檢索以確定其與已知蛋白質序列的同源性。結果發現12-14kDa的蛋白質與來自肺炎鏈球菌的12kDa蛋白質具有100％的序列同源性。34kDa蛋白質與來自枯草芽孢桿菌的蛋白質具有78％的序列同源性。從對兩種蛋白質有限的調查假設它們是核糖體蛋白質，但這有待進一步證實。
根據Koberg等人(Microbiology，143(1)，55-61(Jan 1997))的研究，抵抗肺炎鏈球菌的兩種單克隆抗體與真細菌的L7/L12核糖體蛋白質上高度保守的表位進行反應。在代表27個不同種的66種真細菌中發現了高度的氨基酸序列同源性。我們的大約12-14kDa蛋白質與來自Kolberg等人研究中的12kDa蛋白質具有100％的序列匹配。由于假設這種蛋白質具有毒性，并在物種、甚至是革蘭氏陰性細菌間是保守的，因此人們對于進行進一步的研究以鑒定蛋白質并確定其在與此有機體有關疾病的毒力方面所涉及到的情況具有很大興趣。
34kDa蛋白質似乎為肺炎鏈球菌的新穎蛋白質，因為最接近的匹配為與枯草芽孢桿菌核糖體蛋白質S6 78％匹配。核糖體蛋白質S6具有啟動細胞周期中染色體復制的作用(Moriya等人，Nucleic Acids Res.13，2251-2265(1985))。同源性匹配揭示了此蛋白質在物種間的保守性程度。實施例4-小鼠肺清除模型動物將6-10周齡的Balb/c小鼠圈養并保持在不含致病菌的環境中，隨意攝取無菌的食物和水。
活細菌的制備在37℃和5％CO2下，使細菌在血瓊脂平板上生長過夜。收集細菌，室溫下通過在10000×g的轉速下離心將上述細菌在無菌PBS中洗滌兩次。由在405nm處的光密度確定細菌的濃度，并從回歸曲線計算。通過滴定和過夜培養證實活菌計數濃度的準確度。免疫方案在第0天，通過Peyer’s貼片接種使小鼠開始免疫，14天后經氣管內給藥進行加強。第21天時，用活的肺炎鏈球菌攻擊這些小鼠。Peyer’s貼片免疫通過皮下注射0.25mL氯胺酮/甲苯噻嗪(劑量為5mg/ml鹽酸氯胺酮；2mg/ml鹽酸甲苯噻嗪)使小鼠鎮靜。通過中部(mid-line)腹部切口暴露出小腸，蛋白質經漿膜下層注射到每一個Peyer’s貼片中。按照與不完全弗氏佐劑成1∶1的比例，通過乳化2.5μg/μl蛋白質來制備免疫蛋白質(Sigma Immunochemicals，St Louis，MI，USA)，給予每只動物總濃度為10μg的蛋白質。小鼠的氣管內接種第14天時，小鼠接受氣管內加強。按每Kg體重20mg二羥孕烷二酮-21-醋酸酯-羥-5α-孕烷二酮復合劑經靜脈注射使小鼠鎮靜。使用22.1/2G的導管將總體積為20μL的溶于PBS中的10μg蛋白質經氣管送入肺中。肺攻擊第21天時，使小鼠接受活菌攻擊。用上述的二羥孕烷二酮-21-醋酸酯-羥-5α-孕烷二酮復合劑使小鼠鎮靜，就氣管內加強而言，是將處于20μL活肺炎鏈球菌中的1×107CFU的接種物經氣管引入肺中。攻擊5小時后，經腹膜內注射0.2mL的戊巴比妥鈉使小鼠安樂死。
通過心臟穿刺采血，分析前將分離的血清儲存于-20℃下。暴露氣管，通過加入和除去0.5ml的無菌PBS灌洗肺部。通過將10倍的系列稀釋液平鋪到用于CFU測定的血瓊脂上，測定回收液(BAL)中的細菌回收率。移出等分試樣用于制備Cytospin載玻片，染色并進行細胞分類計數。4℃下，使BAL在1000rpm的轉速下離心10min，將上清液儲存于-20℃下直至需要使用為止。將小丸再懸浮于PBS和亞甲蘭中，對BAL中的白細胞總數進行計數。灌洗后移出肺，置于2mL無菌PBS中并進行勻漿。將10倍的系列稀釋液平鋪到用于CFU測定的血瓊脂上，進行肺勻漿測定。結果的表示僅對于蛋白質，其顯示了顯著程度的肺部的肺清除率。結果在免疫和細菌攻擊中測定的三種蛋白質均顯示了顯著程度的肺部肺清除率。這些是分子量為16，34和57kDa的蛋白質，它們在上述表1中得到鑒定。下列表2中顯示了細菌清除率以及與在同樣時間遭受攻擊的非免疫小鼠的回收率比較的結果，并在圖5-7中以圖示的方式進行了表達。第4種具有顯著性的蛋白質是12-14kDa。在三個單獨的免疫研究中且每項研究均使用新鮮分離的蛋白質的情況下，免疫對小鼠是致死性的，大多數動物未能從麻醉中恢復過來。17只小鼠中的13只在3個實驗過程中死亡，最多只有2只在任何給定的實驗中存活。這種蛋白質作為一種毒素和潛在的肺炎鏈球菌的毒力組分而使人感興趣。對毒性組分的鑒定以及蛋白質的脫毒可以產生高度有效驗的抗原。由于這種蛋白質存在于許多細菌中，以前曾通過單克隆抗體測定進行過鑒定(參見上文)。然而，文獻中沒有證據表明其已作為疫苗抗原得到測試。
表2-在用純化蛋白質免疫后的肺清除率
權利要求
1.可得自肺炎鏈球菌的蛋白質或多肽，選自(i)用SDS/PAGE測定的分子量為55kDa，并且所具有的N-末端序列為VEPKAKPADPSVV的蛋白質或多肽；(ii)用S/PAGE測定的分子量為50kDa，并且所具有的N-末端序列為NDRLVATQSADGRNESVLMSIET的蛋白質或多肽；(iii)用SDS/PAGE測定的具有分子量為85kDa，并且所具有的N- 末 端序 列 為EDTTNSRFGSQFDKYRQPNAEPDHSHDAVSADNSTAHNRFGYGFAIGSKYIRYD的蛋白質或多肽；(iv)用SDS/PAGE測定的分子量為38kDa，并且所具有的N-末端序列為DKYRQPNAEPDDHHYAV的蛋白質或多肽；(v)用SDS/PAGE測定的分子量為30kDa，并且所具有的N-末端序列為DAVSAD或SETNVY的蛋白質或多肽；(vi)用SDS/PAGE測定的分子量為32kDa，并且所具有的N-末端序列為DKVDGLSAKPDILKP的蛋白質或多肽；(vii)用SDS/PAGE測定的分子量為43kDa，并且所具有的N-末端序列為ELKEEG(W)VVK的蛋白質或多肽；(viii)用SDS/PAGE測定的分子量為100kDa，并且所具有的N-末端序列為EVHA的蛋白質或多肽；(ix)用SDS/PAGE測定的分子量＜14kDa，并且所具有的N-末端序列為MKLNEVKEFVKELRAET的蛋白質或多肽；(x)用SDS/PAGE測定的分子量＜14kDa，并且所具有的N-末端序列為AKYEILYIERPNIEEFAK的蛋白質或多肽；(xi)用SDS/PAGE測定的分子量＜14kDa，并且所具有的N-末端序列為I(R)LTRM(E)GGKKKP(K)FYY的蛋白質或多肽；(xii)用SDS/PAGE測定的分子量為16kDa，并且所具有的N-末端序列為VMTDPIADXLXRI的蛋白質或多肽；(xiii)SDS/PAGE測定的分子量為27.5kDa，并且所具有的N-末端序列為(VA)(KE)LVFARHGE(LT)E(NK)的蛋白質或多肽；(xiv)用SDS/PAGE測定的分子量為44kDa，并且所具有的N-末端序列為IITDVYAREVLDSRGNPTL的蛋白質或多肽；(xv)在還原條件下，用SDS/PAGE測定的分子量為12-14kDa，并且所具有的氨基末端序列如下的蛋白質或多肽A L N I E N I I A E I K I A SAla Leu Asn Ile Glu Asn Ile Ile Ala Glu Ile Lys Ile Ala Ser(xvi)為上述(xv)中所定義的蛋白質的還原毒性變體或片段；(xvii)在還原條件下，用SDS/PAGE測定的分子量約為16kDa的蛋白質或多肽；或者(xviii)在還原條件下，用SDS/PAGE測定的分子量約為57kDa，并且具有下列氨基末端序列R I I K F V Y A KArg Ile Ile Lys Phe Val Tyr Ala Lys.
2.權利要求1中所定義的蛋白質或多肽，其以基本上純的形式存在。
3.權利要求1或2中所定義的蛋白質或多肽的同系物或衍生物。
4.權利要求1或2中所定義的蛋白質或多肽的或權利要求3中所定義的同系物或衍生物的一或多個抗原性片段。
5.包含下列序列或由下列序列組成的核酸分子(i)編碼權利要求1或2中所定義的蛋白質或多肽的DNA序列或它們的RNA等價物；(ii)與(i)序列中的任意一個互補的序列；(iii)基本上具有與(i)和(ii)序列中的任意一個同一性的序列；(iv)編碼權利要求1-4任意一項中所定義的蛋白質或多肽的同系物、衍生物或片段的序列。
6.包含權利要求5中所定義的核酸分子的載體。
7.包含權利要求6中所定義的載體的宿主細胞。
8.權利要求1或2中所定義的蛋白質或多肽，或權利要求3中所定義的同系物或衍生物在藥物方面的用途。
9.含有一或多種權利要求1或2中所定義的蛋白質或多肽，或它們的同系物或衍生物，和/或任何這些物質的片段的免疫原性/抗原性組合物。
10.權利要求9中所定義的組合物，該組合物為疫苗或可用于診斷測定。
11.包含一或多種權利要求5中所定義的核酸分子的疫苗。
12.針對權利要求1或2中所定義的蛋白質或多肽、權利要求3中所定義的同系物或衍生物或權利要求4中所述片段而產生的和/或可與之結合的抗體。
13.檢測/診斷肺炎鏈球菌的方法，其包括使待測樣品與至少一種權利要求1或2中所定義的蛋白質或多肽、權利要求3中所定義的同系物或衍生物或權利要求4中所定義的片段進行接觸的步驟。
14.檢測/診斷肺炎鏈球菌的方法，其包括使待測樣品與一或多種能夠與一或多種權利要求1或2中所定義的蛋白質或多肽、 3中所定義的同系物或衍生物或權利要求4中所定義的片段結合的抗體進行接觸的步驟。
15.檢測/診斷肺炎鏈球菌的方法，其包括使待測樣品與至少一種權利要求5中的核酸分子進行接觸的步驟。
16.給實驗對象接種以抵抗肺炎鏈球菌的方法，其包括給予實驗對象權利要求1或2中所定義的蛋白質或多肽、權利要求3中所定義的衍生物或同系物、權利要求4中所定義的片段，或權利要求9或10中所定義的免疫原性組合物的步驟。
17.實驗給對象接種以抵抗肺炎鏈球菌的方法，其包括給予對象權利要求5中所定義的核酸分子的步驟。
18.預防或治療肺炎鏈球菌感染的方法，其包括給予實驗對象權利要求1或2中所定義的蛋白質或多肽、權利要求3中所定義的衍生物或同系物、權利要求4中所定義的片段，或權利要求9或10中所定義的免疫原性組合物的步驟。
19.預防或治療肺炎鏈球菌感染的方法，其包括給予實驗對象權利要求5中所定義的核酸分子的步驟。
20.用于檢測/診斷肺炎鏈球菌感染的試劑盒，其包括一或多種權利要求1或2中所定義的蛋白質或多肽、權利要求3中所定義的同系物或衍生物、權利要求4中所定義的片段，或權利要求9或10中所定義的抗原性組合物。
21.用于檢測/診斷肺炎鏈球菌感染的試劑盒，其包括一或多種權利要求5中所定義的核酸分子。
22.測定權利要求1或2中所定義的蛋白質或多肽是否代表潛在的抗微生物靶的方法，其包括使所述的蛋白質或多肽失活，并在體外或體內測定肺炎鏈球菌是否依然存活。
23.能夠拮抗、抑制或干擾權利要求1或2中所定義的蛋白質或多肽的功能或表達的藥劑在制備用于治療或預防肺炎鏈球菌感染的藥物中的用途。
24.制備分離和純化的蛋白質的方法，該方法包括下列步驟(a)制備肺炎鏈球菌培養物，使培養物在合適的條件下生長并采集，接著在離心下洗滌，得到洗滌過的細胞小丸；(b)將洗滌過細胞再懸浮于合適的緩沖液中，接著使細胞破裂；(c)離心除去細胞碎屑并獲得含有可溶性細胞蛋白質的上清液；(d)使得到的溶液以氯化鈉作為梯度洗脫液進行陰離子交換層析，合并相應于每一個峰的組分；(e)將蛋白質組分懸浮于含有0.5M Tris HCl pH 68；10％(v/v)甘油；10％(w/v)SDS；0.05％(w/v)溴苯酚藍；以及0.05％(v/v)β-巰基乙醇的緩沖液中；將混合物煮沸，然后利用SDS-PAGE，采用帶有4％(w/v)丙烯酰胺/BIS層積凝膠的12％(w/v)丙烯酰胺/BIS分離凝膠進行純化，在16mA下在層積凝膠中和在24mA下在拆解凝膠進行試驗；(f)選擇含有分子量為12-14kDa，16kDa，34kDa或57kDa的蛋白質的組分，并從選擇的組分中分離蛋白質。
全文摘要
本發明提供了來自肺炎鏈球菌的各種新穎的抗原及其同系物、衍生物和片段。描述了這些抗原在醫學、尤其是在治療或預防肺炎鏈球菌感染方面的用途。還描述了抗原在診斷中的用途。
文檔編號A61P31/04GK1345375SQ00805589
公開日2002年4月17日 申請日期2000年3月27日 優先權日1999年3月26日
發明者A·W·克利普斯, J·M·吉德, M·喬瑪, J·M·威爾斯, P·M·翰斯博羅 申請人:普羅瓦利斯英國有限公司