多重交聯的透明質酸衍生物的生產方法

專利名稱：多重交聯的透明質酸衍生物的生產方法
技術領域：
本發明涉及透明質酸(HA)衍生物，尤其多重例如雙重交聯透明質酸衍生物的生產方法，和涉及所獲得的新型交聯衍生物，涉及含有它們的產品和它們在化妝品、醫藥和藥物應用中的用途。
HA是已知為葡萄糖胺聚糖的一類聚合物中的一員。HA是長鏈線性多糖和通常作為鈉鹽形式存在，它具有分子式(C14H20NNaO11)n，其中n根據來源、分離工藝和測定方法來變化。然而，已經報道了至多14×106的分子量。
HA和它的鹽類能夠從許多來源中分離出來，其中包括人臍帶，公雞雞冠和幾乎所有脊椎動物組織的結締基質(connective matrices)。HA也可以是細菌如鏈球菌的囊組分，如Kendall等人(1937)在Biochem.Biophys.Acta，279，401405中所述；它因此也可通過發酵工藝操作法獲得。例如，本申請人的US專利No.5,411,874描述了由馬鏈球菌的連續發酵生產透明質酸的方法。
HA是非致免疫的，因此在醫藥領域中有很大的應用潛力。因為它的粘彈性質，具有高分子量(在1百萬以上)的HA已經被發現特別可用于各種臨床領域，其中包括傷口治療，眼外科和矯形外科。HA也有潛力用于各種非醫學領域中，如化妝品應用。
然而，HA在某些領域中的使用受到以下事實的限制在施用給人之后，HA快速被酶例如透明質酸酶和被自由基降解。此外，HA在室溫下可溶于水，也能夠使它適合于某些應用。所以進行各種嘗試，尤其通過交聯HA分子，來制備更穩定形式的HA。
因此，USP4,582,865(Biomatrix Inc.)描述了透明質酸的交聯凝膠的制備方法，它們是通過交聯HA本身來形成或使用二乙烯基砜作為交聯劑與其它親水聚合物混合。在這種情況下似乎是利用HA的羥基進行交聯。
USP5,550,187(Collagen公司)描述了制備交聯的生物材料組合物的方法，它包括將生物相容性聚合物(它優選是膠原但可以選自包括透明質酸在內的其它聚合物)與無菌的干燥交聯劑如合成親水聚合物混合。
USP5,578,661(Nepera Inc.)描述了從三種主要組分形成的用作傷口敷料的凝膠形成用體系，第一種是水溶性聚合物，第二種是含酸的聚合物和第三種是多糖或含胺的聚合物如透明質酸。在這種情況下該交聯似乎利用離子結合來實現的。
USP5,644,049(Italian Ministry for Universities andScientific and Technology Research)描述包括互穿聚合物網絡(IPN)的生物材料，其中聚合物組分中的一種是酸性多糖如透明質酸和第二種聚合物組分可以是合成化學聚合物。這兩種組分可以(但是不一定)交聯。
Tomihata和Ikada報道了使用水溶性碳化二亞胺作為交聯劑來交聯HA。推測交聯是通過酯基來發生的。該交聯反應也可在L-賴氨酸甲酯存在下進行，看起來利用酰胺鍵接于賴氨酸酯上來實現附加的交聯。(J.Biomed.Mater.Res.，37，243-251，1997)。
US專利No.5,800,541描述了使用多步反應制備的膠原-合成聚合物基質。第一步包括讓膠原與合成親水性聚合物反應；所獲得的基質然后在第二步驟中改性，該第二步驟包括基質與合成聚合物的交聯或結合，生物活性分子或葡萄糖胺聚糖偶聯到基質上，使用普通的化學交聯劑使基質交聯或利用化學反應在基質中改性膠原。在這一方法中，最初的膠原-合成聚合物基質似乎利用僅僅一種類型的鍵進行交聯，附加的工藝步驟用于引入其它的化學物質，可形成不同類型的鍵。然而，沒有跡象表明，用于形成產物的那些物質中的任何兩種將通過一種以上的鍵相互連接。
國際專利申請WO97/04012(Agerup)描述了多糖(尤其是透明質酸)凝膠組合物，它是通過形成多糖的水溶液，在多官能化交聯劑存在下引發交聯，在凝膠發生之前(例如通過稀釋該溶液)在空間上妨礙交聯反應使之不被終止和然后在引進空間無妨礙條件(例如通過蒸發溶液)繼續交聯形成粘彈性凝膠來最終制得。在這一申請中沒有任何提示在兩個交聯階段中形成了不同類型的鍵。
上述文獻沒有描述其中HA分子利用兩種不同類型的交聯鍵被相互連接的產物。
我們現在發現透明質酸可通過兩種不同類型的交聯鍵實施交聯，進行“雙重交聯”。不同類型的鍵的形成是利用不同官能團進行交聯來實現的。如此形成的鍵因此能夠表述為官能鍵。因此，例如，利用羥基交聯形成了一種鍵，利用例如羧基交聯形成了不同的官能鍵。這類多重交聯已被發現導致了使HA有改進生物穩定性的高度交聯。
所以在第一方面，本發明提供了制備多重交聯的透明質酸衍生物的方法，該方法包括利用兩種或多種不同的官能團將HA交聯。
每一種類型的官能團的交聯可通過HA與一種或多種交聯劑同時或順序接觸來進行，這將在下文中更詳細地描述。
在本說明書中，“多重交聯的HA”是指其中HA分子利用兩種或多種不同類型的官能鍵交聯到另一個HA分子上的透明質酸衍生物。類似地，“雙重交聯的HA”是指其中HA分子利用兩種不同類型的官能鍵交聯到另一個HA分子上的透明質酸衍生物和“單交聯的HA”是指其中HA分子利用僅一種官能鍵交聯到另一HA分子上的透明質酸衍生物。
主要用于使HA分子交聯的官能團是羥基和羧基。羥基可利用醚鍵交聯和羧基能夠利用酯鍵交聯。如果需要，HA可在交聯之前進行化學改性以形成其它化學活性基團。因此，例如，HA可用酸或堿處理，以使它接受至少部分的脫乙酰作用，導致存在游離氨基。該氨基可利用酰胺(-C(O)-NH-)；亞氨基(-N＝CH-)或仲胺(-NH-CH-)鍵交聯。亞氨基鍵是胺鍵的前身和亞氨基鍵能夠在還原劑存在下轉化成胺鍵。
可用于本發明的方法中的交聯劑包括現有技術中眾所周知的那些，例如甲醛，戊二醛，二乙烯基砜，聚酐，聚醛，多元醇，碳化二亞胺，表氯醇，乙二醇二縮水甘油基醚，丁二醇二縮水甘油基醚，聚甘油多縮水甘油基醚，聚乙二醇，聚丙二醇二縮水甘油基醚，或雙-或多-環氧基交聯劑如1，2，3，4-二環氧基丁烷或1，2，7，8-二環氧基辛烷。
為了形成醚鍵，該交聯劑優選選自甲醛，戊二醛，二乙烯基砜和，在堿性條件，雙和多環氧化物。優選該交聯劑含有疏水性烴鏈段，例如1，2，3，4-二環氧基丁烷，或最優選1，2，7，8-二環氧基辛烷。
為了形成酯鍵，該交聯劑優選選自多元醇，碳化二亞胺，聚酐類，羧酰氯和，在酸性條件，雙和多環氧化物。優選該交聯劑含有疏水性烴鏈段，例如1，2，3，4-二環氧基丁烷，或最優選1，2，7，8-二環氧基辛烷。
酰胺鍵優選是通過使用選自碳化二亞胺(在胺存在下)、羧酸酐和羧酰氯(對于脫乙酰的HA)和二異氰酸酯的交聯劑來形成的。
胺鍵優選是在脫乙酰化HA中的氨基存在下使用選自環氧化物或有還原劑的戊二醛的交聯劑來形成的。
亞氨基鍵(席夫堿鍵)是在脫乙酰化HA中的氨基存在下使用戊二醛來形成的。
砜鍵優選使用磺酰氯形成的。
在本發明的一個實施方案中，不同的官能鍵能夠在多步驟方法中順序形成，這可通過在每一階段中使用不同的交聯劑或在每一階段中使用同樣的交聯劑以及調節反應條件控制所需的特定交聯反應來實現。
因此，為了在根據本發明的逐步方式中實現多重(例如雙重)交聯，第一次交聯反應例如通過使用下述方法中的一種來進行。當這次反應結束時，或根據需要進一步延續時，將另外的交聯劑加入到反應混合物中以進行第二次交聯。另外的交聯劑可與第一次的相同或不同。當使用不同的交聯劑時，通常要求在不改變反應條件的前提下作出選擇，它將形成不同類型的官能鍵。然而，當使用同樣的交聯劑來形成兩種交聯時，應該調節反應條件以形成不同類型的鍵。所屬領域中的那些技術人員能夠容易地選擇合適的交聯劑和合適的反應條件以形成所需要的鍵。
為了免除疑問，應該指出的是，如果在每一步驟中在同樣反應條件下使用同樣的交聯劑，則導致形成僅僅一種鍵，即得到單種交聯的產物，雖然在兩個或多個步驟中生產的。
可以認識到的是，當順序形成根據本發明的兩種或多種官能鍵時，即在多步反應中，在第一反應階段中形成的交聯鍵應該足夠強以便能夠承受為形成第二或后續交聯所需要的反應條件。因此，應該首先形成兩種(或多種)鍵中的較強者。這對于所屬領域的技術人員是顯而易見的和如果必要，能夠通過常規的實驗來確定。
因此，當利用羥基和羧基形成交聯時，可以想到，第一階段的交聯應該利用羥基來進行以形成醚鍵和第二階段的交聯則利用羧基來進行以得到酯鍵。
醚鍵可通過在堿性條件下，優選在10或10以上的PH值下使用環氧化物交聯劑來形成，或如果需要HA不含游離氨基，在酸性條件下例如在PH4或4以下使用戊二醛作為交聯劑來形成。酯鍵可在酸性條件下(例如PH4或4以下)使用環氧化物交聯劑來形成。
因此，例如，形成醚鍵的第一交聯反應可在堿性條件下，優選在10或10以上的PH值下，例如在PH10至PH12范圍內，使用環氧化物如1，2，7，8-二環氧基辛烷來進行。形成酯鍵的第二交聯反應隨后可使用同樣的交聯劑和調節反應介質的PH值到pH4或4以下，例如在PH4至PH2范圍內來進行。另外，在每一步驟可使用不同的交聯劑，在這種情況下沒有必要調節反應條件。因此，例如，通過在酸性條件下使用戊二醛形成醚鍵，隨后也在酸性條件下與環氧化物交聯劑反應形成酯鍵，來進行第一交聯反應。
在該方法的每一階段中交聯劑與HA的比率一般是在1∶10到10∶1(按重量計)范圍內。
根據所屬領域中已知的方法進行各個交聯反應。
因此，用作起始原料的HA可以是膜形式或溶液形式。
當使用HA膜時，可將它與交聯劑一起懸浮于合適的溶劑中。該反應介質優選包括與酸性或堿性水溶液混合的有機溶劑如丙酮，氯仿，或醇，例如乙醇或異丙醇。酸性水溶液優選具有4或4以下的PH值，堿性水溶液優選具有10或10以上的PH值。該交聯反應適宜在15-30℃范圍內的溫度下進行，例如在環境溫度下。
優選，當HA膜用作起始原料時，首先在堿性條件下用環氧化物或如果沒有游離氨基存在的話在酸性條件下用戊二醛形成醚交聯鍵，隨后在酸性條件下使用環氧化物形成酯交聯鍵。如果HA脫乙酰產生游離氨基，能夠在酸性條件下使用戊二醛形成具有亞氨基鍵的席夫堿。亞氨基鍵能夠使用還原劑轉化成胺鍵。
HA也可以用作加入交聯劑的酸性或堿性水溶液。在酸性條件下起始溶液的PH值優選是PH4或4以下和對于堿性溶液而言PH值優選是PH10或10以上。HA的濃度適宜在1-10％w/w范圍內。該反應適宜在15-50℃范圍內的溫度下進行。交聯反應的結束時間一般是約1小時至幾天。
優選地，當使用HA的溶液時，首先在堿性條件下用環氧化物形成醚交聯鍵，隨后在酸性條件下使用環氧化物(優選與第一步中相同的環氧化物)形成酯交聯鍵。
另外，HA溶液可以經歷第一次交聯反應，中間產物經過干燥形成膜和該膜進行如上所述的進一步交聯反應得到膜形式的雙重交聯產物。優選，為了根據這一程序獲得雙重交聯的HA衍生物，首先在堿性條件下用環氧化物形成醚交聯鍵，隨后在酸性條件下使用環氧化物(優選與第一步的環氧化物相同)形成酯交聯鍵。
在本發明的另一實施方案中，HA的多重交聯，尤其雙重交聯，可通過HA同時與適合在同樣條件下交聯兩種不同官能團的兩種不同交聯劑接觸，在單個步驟的反應中進行。因此，例如，為了在單個步驟中同時形成醚和酯基，HA與戊二醛和1，2，7，8-二環氧基辛烷的混合物接觸。
在該方法的每一階段中交聯劑與HA的比率一般是在1∶10到10∶1(按重量計)范圍內。
產物的準確性質可通過適當選擇反應條件以控制交聯度和進而控制產物的性能來變化。影響交聯度和進而影響最終產物的性質的因素包括所使用的HA起始原料的形式，交聯劑與HA的進料比，反應時間，溫度和PH。該產物能夠以凝膠或膜形式獲得并可以是透明或不透明的。該吸水能力和生物穩定性將取決于產物的準確性質來變化。
根據本發明的產物能夠通過使用溶液、膜或片形式的HA起始原料并在無攪拌下進行該方法而能夠以膜或片形式獲得。可以想到的是，當HA以膜或片形式使用時，在放入水溶液如PBS緩沖液中時它吸收水，進而溶脹形成凝膠。如果需要，在第一個交聯步驟之后任選形成中間產物膜，如上所述。該產物可以是透明或不透明的，這取決于產生的交聯度。高度交聯的HA產物一般是不透明的和甚至是白色的。
凝膠形式的本發明產物可通過例如如上所述制備的膜的水合來獲得。如有必要，該膜可分成小片以有利于吸收水。
為了獲得不透明凝膠形式的本發明產物，該HA起始原料能夠以溶液、膜或片形式使用，整個過程在攪拌下和在任何階段沒有形成膜的情況下進行。
無論使用哪一個交聯方法，該反應的完成是通過現有技術中已知的方法由常規方式控制的，例如，通過中和反應混合物終止該反應和溶劑沉淀獲得具有所需交聯度的產物。
最終的產物可由常規方法從反應介質中分離出來。
在一個優選實施方案中本發明提供制備雙重交聯的HA的方法，該方法包括讓HA與一種或多種交聯劑在適合于在HA分子之間形成兩種不同的鍵的條件下進行接觸。優選這些交聯反應是順序進行。因此，本發明的該兩階段方法包括(a)利用第一官能團讓HA交聯，和隨后(b)利用第二種官能團進一步使(a)的產物交聯，其中第一和第二官能團代表不同的化學實體。
可以理解，當要求含超過兩種的不同的交聯的產物時，它可以通過如上所述的順序的或同時的交聯反應的適當的結合來制備。
根據本發明制備的交聯的HA含有至少兩種類型的交聯鍵，例如醚鍵和酯鍵。
可以相信，根據本發明制備的多重(例如雙重)交聯的HA衍生物本身是新型的。因此，在再一方面，本發明提供了可由前面所述的方法獲得的多重交聯的HA(即HA利用兩種或多種不同的官能鍵交聯)。優選本發明提供通過上述方法獲得的雙重交聯的HA。
在再一方面，本發明提供交聯至其本身(即另一HA分子)上的HA，其中HA利用至少兩種不同類型的鍵進行交聯。優選HA是雙重交聯的HA。
根據本發明的雙重交聯的HA可具有在10-50％，例如15-30％，優選20-25％范圍內的交聯度(其中100％表示所有在C6位的OH基和所有在C5位的COOH基團的交聯)。交聯度可通過元素分析或固態NMR分析測量。
不同的官能鍵在產物的比率將根據所存在的官能鍵的類型和用于形成它們的反應條件來變化。對于含有醚和酯鍵的雙重交聯的產物，這些鍵的比率可在50∶50到95∶5，例如60∶40到80∶20的醚∶酯鍵范圍內變化。
一般來說，根據本發明的產物具有更高的交聯度，也就是說，比單種交聯的HA有更致密的交聯網絡。較高的交聯度已經被發現會降低交聯HA的吸水能力，導致在水溶液中更大的穩定性。另外，已經發現雙重交聯的HA在抵抗透明質酸酶的降解作用和防止由于自由基的降解作用方面顯示出更大的穩定性，說明提高了生物穩定性。
本發明的不透明物產物一般比透明產物具有更高的交聯度和因此更低的吸水能力和更高的穩定性。這樣的產物適合于長期植入。
根據本發明的透明產物例如透明膜具有比不透明產物更高的吸水能力，此類產物特別地適合于皮膚植入、傷口愈合(滲出液的吸收)和可再吸收的短期植入物。
當需要具有較低吸水能力的高度交聯的產物時，以上描述的該多步方法是優選的。同時的交聯通常導致獲得水不溶性的產物，但是比在類似條件下使用多階段(例如兩階段)方法制備的產物有更高的吸水能力。
此外已經發現，使用第一次交聯的HA膜用于第二次交聯步驟可提供一種產物(它可以是膜形式或可轉化成凝膠)，該產物比在類似交聯條件下(即沒有中間膜的形成)從HA溶液制備的雙重交聯HA產物有更低的吸水能力。的確已經發現，所獲得的產物的吸收能力分別對于膜和凝膠起始原料能夠在400％到1000％范圍內變化。
根據本發明的交聯HA衍生物可用于各種藥物、醫學(包括外科)和化妝品應用中。
因此，它們例如可用于促進傷口愈合，例如用作皮膚的傷口敷料。
它們也可用于防止粘合，例如在外科手術之后防止在器官之間的組織生長。
根據本發明的交聯HA衍生物還發現可用于眼科領域中，例如用于玻璃體液置換，作為輸送藥物到眼內的角膜貼片或用作晶狀體。
根據本發明的交聯HA衍生物也可用于外科領域中，例如作為硬組織增長的固體植入物(例如軟骨或骨骼的修復或置換)，或用于軟組織增長，作為乳房填充物，或用作希望長期在身體內使用的植入物的涂層，這些植入物例如有乳房填充物、導管、插管、骨骼修補物、軟骨替代物、微型泵和其它藥物輸送裝置、人工臟器和血管、組織增強用的網等。它們也可用作關節潤滑劑用于關節炎的治療。
本發明的衍生物的進一步用途是在于包括在任何前述應用中的治療活性劑的輸送。治療活性劑可以是化學治療劑或生物學上的活性因子(例如細胞素)并包括消炎劑，抗生素，止痛藥，麻醉劑，傷口愈合促進劑，細胞生長抑制劑，免疫刺激劑，免疫抑制劑和抗病毒藥。
該治療活性因子能夠通過現有技術中已知的方法結合于交聯的HA衍生物上。
該交聯的HA衍生物可以許多形式使用，其中包括薄膜、珠粒、海綿、管、片和成形的植入物。
現在通過下列非限制性的例子來說明本發明。
下列方法用于測量產物的穩定性。
方法吸水能力的測量將20mg(Wd)的每種干燥的交聯樣品在PBS(磷酸鹽緩沖鹽水)配方緩沖溶液中浸泡24小時以獲得完全溶脹的凝膠。過濾出濕凝膠和使用紗紙除去表面上的殘余水。將濕凝膠稱量得到Ws。因此，吸水能力(WAC)(％)能夠根據下式來計算WAC(％)＝(Ws-Wd)/Wd×100耐透明質酸酶消化的功能將20mg交聯HA懸浮在含有1000U透明質酸酶的6ml PBS緩沖溶液(PH＝7.2)中并在37℃下培養24小時。在那之后，取出該膜和用PBS緩沖液漂洗，收集全部的漂洗溶液獲得總共10mL溶液。這一溶液被煮沸30分鐘得到透明質酸酶沉淀物。該溶液然后在4000rpm/10min下離心處理。在容量瓶中使用PBS溶液將上層清液補充至25ml。使用咔唑(Carbazole)分析測量HA濃度。
通過使用下式能夠計算由于透明質酸酶消化所引起的HA重量損失HA重量損失(％)＝[HA]×25/[HA]0×100其中[HA]是HA的濃度，[HA]0是初始HA含量(mg)。
抵抗自由基的能力Ferton試劑用于產生自由基，它們是由25微升0.1抗壞血酸和0.25微升0.1M H2O2在5ml PBS溶液中形成的。將20mg的干燥樣品加入到這一用于消化的溶液中。消化時間是在37℃下24小時。在此之后，取出該膜和用PBS緩沖液漂洗，收集全部的漂洗溶液，在容量瓶中使用PBS溶液補充至25mL。使用咔唑分析測量HA濃度。使用與透明質酸酶消化同樣的公式可以計算HA重量損失。
實施例1由HA膜形成雙重交聯的HA膜將5ml HA(1％)在室溫下流延4天得到HA膜。將得到的膜懸浮于CHCl3溶劑/酸性或堿性溶液/1，2，7，8-二環氧基辛烷或戊二醛交聯劑的混合物中。交聯反應在室溫下進行固定時間(24小時)。再加入一定量的交聯劑，和如果需要調節pH，混合物在室溫下再放置24小時，從完成第二次交聯反應。詳細的交聯條件示于表1中。交聯之后，樣品用IPA和丙酮洗滌3次，浸入IPA/去離子水(60/40)中過夜，然后用丙酮洗滌并在37℃爐中干燥至恒重。
表1 從HA膜形成交聯的HA(CHA)
*進料比HA與交聯劑的重量比E＝1，2，7，8-二環氧基辛烷；G＝戊二醛H+代表pH約4，OH-代表pH約10CHA-1，CHA-4和CHA-7都在每一交聯步中采用相同的條件制備，得到僅一個醚鍵(單次交聯)。
實施例2由HA溶液形成雙重交聯的HA凝膠將0.1g HA溶于0.25N NaOH溶液或0.25N HCl溶液中得到濃度10％或2.5％的HA溶液。加入交聯劑并機械攪拌混合物。第一次交聯反應在40℃進行約2小時。第二次交聯反應采用另外量的相同交聯劑進行，并調節反應條件。詳細的反應條件列于表2。交聯后，形成的凝膠用IPA、丙酮沖洗和用IPA/水提取過夜，然后用IPA和丙酮分別洗滌3次。樣品在37℃爐中干燥至恒重。獲得不透明的凝膠產品。
表2 從HA溶液形成交聯的HA(CHA)
E1，2，7，8-二環氧基辛烷H+代表pH約4；OH-代表pH約10實施例3通過HA膜從HA溶液形成雙重交聯的HA(CHA)將0.1g HA溶于0.25N NaOH溶液或0.25N HCl溶液以獲得濃度為10％或2.5％的HA溶液。加入交聯劑，在替陪氏培養皿中在少許或無攪拌的條件下進行反應。第一次交聯反應在室溫下進行約48或72小時。干燥中間產物得到膜或片(取決于厚度)。第二次交聯采用實施例1中所述的方法進行。詳細的反應條件列于表3中。交聯后，產品用IPA和丙酮洗滌(×3次)并用IPA/水提取過夜，然后用丙酮沖洗。樣品在37℃爐中干燥至恒重，獲得膜或片形式的產品。
表3 通過HA膜從HA溶液形成交聯的HA(CHA)
E1，2，7，8-二環氧基辛烷；E-1表氯醇
H+代表pH約4；OH-代表pH約10表4 變聯的HA抵抗透明酸酶和自由基的生物穩定性
實施例4將0.1g HA溶于2ml 1N NaOH溶液中過夜得到5％HA堿性溶液。向該溶液中加入2ml 1，2，7，8-二環氧基辛烷。然后加入0.2ml氯仿同時在40℃攪拌30分鐘。在形成醚交聯鍵后，加入2.2ml 1N HCl將溶液的pH改變為3-4。再加入0.2ml 1，2，7，8-二環氧基辛烷和0.2ml氯仿同時在40℃下攪拌30分鐘。在形成酯交聯鍵后，用20ml丙酮沉淀形成的凝膠并且按實施例2中所述的相同程序純化。
實施例5向5ml HA/NaOH(1N)溶液中加入0.5ml表氯醇和0.2ml氯仿并在室溫下混合10分鐘。該溶液在替陪氏培養皿上流延并干燥成為交聯的HA膜(CHA-18)。在用1N HCl中和后，將CHA-18樣品懸浮于20ml氯仿/0.1N酸性水溶液(3/1 v/v)中，并且加入0.2ml 1，2，7，8-二環氧基辛烷并在室溫下反應24小時。所得的樣品CHA-19按實施例1中所述的相同的程序純化。
實施例6將20ml 2.5％HA/NaOH(1.0N)溶液與不同體積的1，2，7，8-二環氧基辛烷在攪拌下混合5分鐘。然后將混合溶液鋪展于7cm尺寸的聚苯乙烯非膠原涂布的帶蓋替陪氏培養皿上。在室溫下24小時后，移去蓋，交聯的凝膠干燥48小時。具有可控厚度的干膜用丙酮/HCl溶液中和，并用丙酮/H2O、丙酮和IPA純化。然后將第一交聯的片狀材料放入pH5的丙酮/HCl溶液和0.4ml 1，2，7，8-二環氧基辛烷中在室溫下另外交聯24小時。所得的片用丙酮/水、丙酮、和IPA/水、IPA純化幾次。
所得的雙重交聯的HA片不溶于水并且吸取10倍的水形成透明的凝膠。它總是體現十分好的機械強度，這對組織工程是十分重要的。
HA樣品的固態13C NMR分析透明質酸原(hyaluroan)和雙重交聯樣品的固態13C NMR分析是采用Advance 200光譜儀在50MHz下進行的。采用1毫秒的接觸時間按標準的交叉偏振(CP)脈沖序列獲得的譜圖示出

圖1-3中。采用5毫秒的接觸時間也獲得了含有內標物四(三甲基)硅烷(TKS，化學位移3.2ppm)的第3號樣品的譜圖(見圖4)。參照TKS分配峰如下。
化學位移，ppm羧基和乙酰基中C＝O 170-180改性樣品酯基中的C＝O165-170(肩峰)C195-110改性劑中的C2-C5加OCH和OCH265-90C660-65C-N 53-60改性劑中未鍵接至O上的CH220-40乙酰基中的CH320-25樣品1(圖1)是沒改性的純透明質酸。樣品2和3的實際配方示于下表中
樣品2(圖2)是按實施例3的方法制備的，但沒有進行第二次交聯。進料比是HA與1，2，7，8-二環氧基辛烷的量之比。形成的膜沖成用于NMR分析的細篩網。
樣品3(圖3和4)是按實施例2的方法制備的凝膠，它磨成細粉用于NMR分析。
權利要求
1.制備多重交聯的透明質酸衍生物的方法，該方法包括利用兩種或多種不同的官能團將HA交聯。
2.根據權利要求1的方法，其中官能團選自羥基、羧基和氨基。
3.根據權利要求1或2的方法，其中交聯是利用選自醚、酯、砜、胺、亞氨基和酰胺鍵的兩種或多種不同的鍵來進行。
4.根據權利要求1-3中任何一項的方法，其中該交聯劑選自甲醛，戊二醛，二乙烯基砜，聚酐，聚醛，多元醇，碳化二亞胺，表氯醇，乙二醇二縮水甘油基醚，丁二醇二縮水甘油基醚，聚甘油多縮水甘油基醚，聚乙二醇二縮水甘油基醚，聚丙二醇二縮水甘油基醚，或雙-或多環氧基交聯劑。
5.根據權利要求1-4中任何一項的方法，其中醚鍵是使用選自雙和多環氧基化物的交聯劑在堿性條件下形成的。
6.根據權利要求1-4中任何一項的方法，其中酯鍵是使用選自雙和多環氧基化物的交聯劑在酸性條件下形成的。
7.根據權利要求5或權利要求6的方法，其中該交聯劑選自1，2，3，4-二環氧基丁烷和1，2，7，8-二環氧基辛烷。
8.根據權利要求1-4中任何一項的方法，其中醚鍵是使用戊二醛交聯劑在酸性條件下形成的。
9.根據權利要求1-8中任何一項的方法，其中每一種類型的官能團的交聯是順序進行的。
10.根據權利要求9的方法，它包括利用第一種官能團將HA交聯和隨后利用第二種官能團進一步交聯該產物，其中該第一種和第二種官能團代表不同的化學實體。
11.根據權利要求9或10的方法，其中HA首先利用羥基通過形成醚鍵被交聯和隨后利用羧基通過形成酯鍵被交聯。
12.根據權利要求1-8中任何一項的方法，其中每一種類型的官能團的交聯是同時進行的。
13.制備雙重交聯HA的根據權利要求1-12中任何一項的方法。
14.根據權利要求13的方法，它包括(a)利用第一官能團讓HA交聯，和隨后(b)利用第二種官能團進一步使(a)的產物交聯，其中第一和第二官能團代表不同的化學實體。
15.可由根據權利要求1-14中任何一項的方法獲得的多重交聯HA。
16.交聯到其本身上的HA，其中HA利用至少兩種不同類型的鍵進行交聯。
17.根據權利要求15或16的交聯HA，其中交聯鍵選自醚、酯、砜、胺、亞氨基和酰胺鍵中的兩種或多種。
18.膜形式的根據權利要求15-17中任何一項的多重交聯HA。
19.凝膠形式的根據權利要求15-17中任何一項的多重交聯HA。
20.根據權利要求15至19中任何一項的為雙重交聯HA的HA。
21.包括根據權利要求15-20中任何一項的多重交聯HA的產品。
22.根據權利要求15-20中任何一項的HA在制備用于藥物、醫藥和化妝品用途的產品中的用途。
23.根據權利要求15-20中任何一項的HA或根據權利要求21的產品在醫藥或外科手術領域中的用途。
全文摘要
本發明提供制備交聯的透明質酸(HA)衍生物,尤其多重(例如雙重)交聯的透明質酸衍生物的生產方法。本發明還提供新型的交聯的HA衍生物,包含它們的產品和它們用于化妝品、醫藥和藥物應用中的用途。
文檔編號A61P25/00GK1342171SQ0080464
公開日2002年3月27日 申請日期2000年2月3日 優先權日1999年2月3日
發明者趙曉斌 申請人:維特羅萊夫英國有限公司