與ELAGIGILTV肽相結合的腸細菌OmpA蛋白用于治療黑素瘤的用途的制作方法

專利名稱：與ELAGIGILTV肽相結合的腸細菌OmpA蛋白用于治療黑素瘤的用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及腸細菌，特別是肺炎克氏桿菌(Klebsillla pneumoniae)，OmpA膜蛋白，連同一種抗原或半抗原用于制備意欲產生或增強針對傳染性因子或腫瘤細胞的細胞毒性T應答的藥物組合物的用途。本發明包括這些化合物用于預防和治療感染或癌癥，特別是與腫瘤抗原相關的癌癥，諸如黑素瘤的用途，和包含一些這些化合物的藥物組合物。
接種疫苗是預防或治療病毒或細菌感染的有效方法。接種疫苗運動在這些領域的成功使之有可能將至今在傳染病學領域中用途的疫苗概念延伸到癌癥和自身免疫疾病領域。單獨施用于宿主的疫苗抗原的免疫原性常常不足以誘導免疫應答，因此必需與佐劑相伴或與載體蛋白偶聯來誘導(或增強)免疫原性。在這些條件下，只能誘導體液類型的免疫應答。現在，在抗病毒治療的過程中，產生能夠識別并消滅病毒的細胞毒性T淋巴細胞(CTL)是及其重要的(Bachmann等人，1994，歐洲免疫學雜志(Eur.J.Immunol.)242228-2236；P.Borrow，1997，病毒性肝炎雜志(J.Virol.Hepat.)416-24)，正如許多研究證明的，在體內顯示針對病毒表位的應答的保護性作用(A.M.Arvin，1992，傳染病雜志(J.Inf.Dis.)166S35-S41；Koszinowski等人，1987，免疫學通訊(Immunol.Lett.)16185-192)。
CTL應答的重要性在抗腫瘤應答中同樣獲得了證明，特別是針對黑素瘤細胞的應答(回顧見Rivoltini等人，1998，免疫學評論性回顧(Crit.Rev.Immunol.)1855-63)。已經定義了多種抗原的CTL表位(與I型分子相互作用并呈遞給CD8＋T淋巴細胞的肽序列)。
然而，困難在于在體內產生CTL，因為這些肽的免疫原性是微弱的(Melief，1992，癌癥研究進展(Adv.Cancer Res.)58143-175；Nandaz和Sercaz，1995，細胞(Cell)8213-17)。
因此，研究針對鑒定使之有可能誘導CTL的新的佐劑或抗原投遞系統。由于它們在呈遞抗原和刺激免疫系統、樹突細胞中的有效性，例如已經用于產生抗病毒CTL應答(B.Ludewig等人，1998，病毒學雜志(J.Virol.)723812-3818；P.Brossard等人，1997，免疫學雜志(J.Immunol.)1583270-3276)或抗癌CTL應答(F.O.Nestle等人，1998，自然醫學(Nat.Med.)4328-332)。這些方法在于，給來自體內的樹突細胞裝載感興趣的抗原(肽或溶胞產物)，并將這些細胞重新移植到患者體內。其它方法在于，用編碼感興趣抗原的基因轉染來自體內的樹突細胞，并重新注射這些經轉染細胞(E.Gilboa等人，1998，癌癥免疫學免疫療法(Cancer Immunol.Immunother.)4682-87)。這些方法已經成功的用于小鼠和最近用于人(F.J.Hsu等人，1996，自然醫學(Nat.Med.)252-58)，但是由于細胞必需進行體外處理(細胞轉化或抗原內化)并移植到宿主生物體內，因而仍然是復雜的。相似的，用途病毒類顆粒(G.T.Layton等人，1993，免疫學雜志(J.Immunol.)1511097-1107)或不完全弗氏佐劑(IFA)(Valmori等人，1994，歐洲免疫學雜志(Eur.J.Immunol.)241458-1462)使之有可能產生CTL應答。然而，對應于CTL表位的抗病毒藥物當存在這種佐劑時可能導致特異性耐受狀態，這可能在某些情況中產生與期望相反的效果，即免疫應答降低(Toes等人，1996，美國國家科學院展(Proc.Nat.Acad.Sci.USA)93，7855-7860)。
由此，現在非常需要當與分子(特別是抗原或半抗原)相結合時能夠產生針對所述分子的CTL的化合物。這種化合物能夠(特別是)用于制備意欲誘導抗病毒、抗細菌、抗真菌、抗寄生蟲、或抗腫瘤的CTL類型的免疫保護的疫苗組合物。
令人驚訝的是，已經證明革蘭氏陰性細菌外膜蛋白，特別是腸細菌OmpA蛋白，諸如肺炎克氏桿菌P40蛋白(WO 95/27787和WO 96/14415中描述的蛋白質)，具有引發針對與之共價或非共價相結合的分子的CTL應答的特性，優選不需加入另一種佐劑。
由此，本發明涉及腸細菌OmpA蛋白或其片段或者編碼所述OmpA蛋白的核酸序列或其片段，用于制備意欲在體外或體內(優選體內)產生或增強針對傳染性因子或腫瘤細胞的細胞毒性T應答的藥物組合物的用途和用于制備意欲產生或增強所述細胞毒性T應答的藥物組合物的用途。
在本發明中，術語“蛋白質”意欲表示肽或多肽，術語“OmpA”(“外膜蛋白”)意欲表示A型外膜蛋白。
表述“OmpA蛋白片段”意欲表示(特別是)OmpA蛋白氨基酸序列所含的任何氨基酸序列片段，當其與傳染性因子或腫瘤細胞特異的抗原或半抗原相結合時，能夠產生或增強針對所述感染性介質或所述腫瘤細胞的細胞毒性T應答，該OmpA蛋白片段包含至少5個氨基酸，優選至少10個氨基酸，或更優選至少15個氨基酸。
表述“傳染性因子或腫瘤細胞特異的抗原或半抗原”意欲表示(特別是)傳染性因子(諸如病毒、細菌、酵母、真菌、或寄生蟲)或腫瘤細胞表達的任何化合物或其結構類似物，其單獨或與免疫佐劑相結合時能夠誘導對所述傳染性因子或所述腫瘤細胞特異的免疫應答。
在此描述中，表述“抗原或半抗原的類似物”意欲表述(特別是)與所述抗原或半抗原具有結構相似性、能夠在預先用所述相似化合物免疫的生物體內誘導針對所述抗原或半抗原的免疫學應答的化合物。
本發明的一個主題是本發明中要求保護的用途，特征為所述藥物組合物還包含與所述腸細菌OmpA蛋白相結合的、對所述傳染性因子或所述腫瘤細胞特異的抗原或半抗原。
優選的，本發明包括本發明中要求保護的用途，特征為所述傳染性因子是病毒顆粒、細菌、酵母、真菌、或寄生蟲。
在特定實施方案中，本發明包括本發明中要求保護的腸細菌OmpA蛋白或其片段的用途，特征為所述腸細菌OmpA蛋白或其片段用途提取方法由所述腸細菌的培養物獲得。
用于提取細菌膜蛋白的方法對于本領域技術人員是知道的，因而在此描述中將不再詳述。例如，可能會提及Haeuw J.H.等人(1998，歐洲生化雜志(Eur.J.Biochem.)255446-454)描述的提取方法，但是不受其限制。
在另一個優選的實施方案中，本發明還包括本發明中要求保護的腸細菌OmpA蛋白或其片段的用途，特征為所述腸細菌OmpA蛋白或其片段通過重組途徑獲得。
用于制備重組蛋白的方法在當今對于本領域技術人員是眾所周知的，因而在此描述中將不再詳述；然而，可以參照實施例中描述的方法。在可能用于產生這些重組蛋白的細胞中，當然應當提及細菌細胞(P.O.Olins和S.C.Lee，1993，E.coli中異源基因表達的最新進展，生物技術中的現行觀點(Curr.Op.Biotechnology)4520-525)、酵母細胞(R.G.Buckholz，1993，用于表達異源基因產物的酵母系統，生物技術中的現行觀點(Curr.Op.Biotechnology)4538-542)、動物細胞特別是哺乳動物細胞培養物(C.P.Edwards和A.Aruffo，1993，基于COS細胞的瞬時表達系統的現行應用，生物技術中的現行觀點(Curr.Op.Biotechnology)4558-563)、和昆蟲細胞，用于昆蟲細胞的方法可能采用例如桿狀病毒(V.A.Luckow，1993，用于表達人類基因產物的桿狀病毒系統，生物技術中的現行觀點(Curr.Op.Biotechnology)4564-572)。
完全優選的是，本發明中要求保護的用途的特征為所述腸細菌是肺炎克氏桿菌。
本發明特別涉及本發明中要求的用途，特征為所述肺炎克氏桿菌OmpA蛋白的氨基酸序列或其片段包含a)序列SEQ ID NO.2的氨基酸序列；b)最佳對比后，與序列SEQ ID NO.2具有至少80％同源性的序列的氨基酸序列；或c)a)中定義的序列的至少5個氨基酸的片段的氨基酸序列。
表述“最佳對比后，與給定的核酸或氨基酸序列具有至少80％同源性的核酸或氨基酸序列”意欲表示與所述給定序列最佳對比后包括與所述給定序列具有至少80％百分率同一性的序列。
為了本發明的目的，術語兩種核酸或氨基酸序列之間的“百分率同一性”意欲表示最佳對比后獲得的所比較的兩種序列之間相同核苷酸或氨基酸殘基的百分率，該百分率完全是統計學的，兩種序列之間的差異隨機分布于其全長。兩種核酸或氨基酸序列之間的序列比較通常通過將這些序列最佳對比后比較來進行，所述比較通過片段或通過“比較窗”來進行，從而鑒定并比較局部區域的序列相似性。除了手工操作，用于比較的序列最佳對比可以通過Smith和Waterman(1981，應用數學進展(Ad.App.Math.)2482)的局部同源性算法、Neddleman和Wunsch(1970，分子生物學雜志(J.Mol.Biol.)48443)的局部同源性算法、Pearson和Lipman(1988，美國國家科學院進展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)852444)的相似性搜索方法、用途這些算法的計算機軟件(威斯康星遺傳學軟件包(Genet ics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，WI)中的GAP、BESTFIT、FASTA、和TFASTA，或者BLAST N或BLAST P比較軟件)產生。
兩種核酸或氨基酸序列之間的百分率同一性通過比較經比較窗最佳對比的這兩種序列來測定，待比較的核酸或氨基酸序列在比較窗中的區域相對于用于這兩種序列間最佳對比的參考序列可能包含添加或刪除。百分率同一性的計算方法是，測定兩種序列之間核苷酸或氨基酸殘基相同的同一位置的數目，將此同一位置數目除以比較窗中的總位置數目，并將得數乘以100，從而獲得這兩種序列之間的百分率同一性。
例如，可以利用BLAST程序“BLAST 2 sequences”，可以由站點http∥www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/b12.html獲得，所用參數為缺省值(特別是“開放缺口補償”參數5和“延伸缺口補償”參數2；所選矩陣是例如由程序提供的“BLOSUM 62”矩陣)，待比較的兩種序列之間的百分率同一性由程序直接計算。
在所述與參考OmpA序列具有至少80％同源性的序列中，優選能夠誘導特異針對與之相結合的抗原或半抗原的CTL活性的肽序列，或其編碼序列，例如，CTL活性用途下文實施例中所述標準技術來測量。
本發明還包括本發明中要求保護的用途，特征為所述抗原或半抗原選自蛋白質、脂肽、多糖、寡糖、核酸、脂類、或能夠特異誘導針對所述傳染性抗原或所述腫瘤細胞的CTL應答的任何化合物。
本發明的一個主題是本發明中要求的用途，特征為所述抗原或半抗原與所述OmpA蛋白或其片段偶聯或混合。
本發明還包括本發明中要求的用途，特征為所述抗原或半抗原通過共價連接(特別是化學偶聯)與所述OmpA蛋白或其片段偶聯。
在特定實施方案中，本發明中要求的用途的特征為在所述OmpA蛋白或其片段和/或所述抗原或半抗原中導入一種或多種連接元件，從而有助于化學偶聯；所述導入的連接元件優選氨基酸。
如本發明中要求的，有可能導入一種或多種連接元件，特別是氨基酸，從而有助于OmpA蛋白或其片段與所述抗原或半抗原之間的偶聯反應。如本發明中要求的，OmpA蛋白或其片段與所述抗原或半抗原之間的共價偶聯可能在OmpA蛋白或其片段的N或C末端進行。能夠進行這種偶聯的雙功能試劑將由選擇用來進行偶聯的OmpA蛋白或其片段的末端和待偶聯的所述抗原或半抗原的本性來確定。
在另一個特定的實施方案中，本發明中要求的用途的特征為當所述抗原或半抗原的本質是肽時，所述抗原或半抗原與所述OmpA蛋白或其片段之間的偶聯通過基因重組產生。
由與所述OmpA蛋白或其片段偶聯衍生的綴合物可以通過基因重組制備。嵌合或雜合蛋白(綴合物)可以用途重組DNA技術，通過在編碼所述OmpA蛋白或其片段的DNA序列中插入或添加編碼其本質是肽的所述抗原或半抗原的序列而產生。
用于合成雜合分子的方法包括在基因工程中用于構建編碼期望多肽序列的雜合多核苷酸的方法。有利的是，例如可以參考由D.V.Goeddel(1990，基因表達技術，酶學方法(Methods in Enzymology)1853-187)描述的用于獲得編碼融合蛋白的基因的技術。
另一方面，本發明涉及本發明中要求的用途，特征為藥物組合物包含編碼所述雜合蛋白的核酸構建物，或包含含編碼所述雜合蛋白的核酸構建物的載體，或包含所述核酸構建物、能夠表達所述雜合蛋白的經轉化宿主細胞。
本發明還包括本發明中要求的用途，用于制備意欲消除傳染性因子或抑制腫瘤生長的藥物組合物。
優選的是，本發明中要求的用途涉及意欲預防或治療傳染病或癌癥的藥物組合物的制備，優選與腫瘤抗原相關的癌癥。
在腫瘤表達相關腫瘤抗原、可以用本發明中要求的用途預防或治療的癌癥中，可能特別提及(但是不受其限制)·乳腺癌、肺癌、結腸癌、和胃癌(Kawashima等人，1999，癌癥研究(Cancer Res.)59431-435)；·間皮瘤、骨肉瘤、腦癌(Xie等人，1999，國家癌癥學會會刊(J.Natl.Cancer.Inst.)91169-175)；·黑素瘤(Zheuten等人，1998，Bratilsl.Lek.Listy 99426-434)；·胰囊腺瘤(Hammel等人，1998，歐洲胃腸病學和肝病學雜志(Eur.J.Gastroenterol.Hepatol.)10345-348)；·結腸直腸癌(Ogura等人，1998，抗癌研究(Anticancer Res.)183669-3675)；·腎細胞癌(Jantzer等人，1998，癌癥研究(Cancer Res.)583078-3086)；和·卵巢和宮頸癌(Sonoda等人，1996，癌癥(Cancer)771501-1509)。
本發明的一個主題特別是本發明中要求的腸細菌OmpA蛋白或其片段的用途，用于制備意欲預防或治療傳染病，特別是病毒、細菌、真菌、或寄生蟲起源，或癌癥，優選與腫瘤抗原相關的，特別是黑素瘤的藥物免疫組合物。
本發明還包括本發明中要求的用途，特征為所述藥物組合物的裝載(Vehicled)形式使之有可能改進其穩定性和/或其免疫原性，特別是脂質體的形式。
優選的是，本發明包括本發明中要求的用途，特征為所述載體(Vehicle)是包含編碼所述OmpA蛋白或其片段、所述抗原或半抗原、或所述雜合蛋白的核酸構建物的病毒載體(Vector)，或能夠表達所述OmpA蛋白或其片段、所述抗原或半抗原、或所述雜合蛋白的經轉化宿主細胞。
本發明還包括本發明中要求的用途，特征為所述核酸構建物、或包含在所述載體或所述經轉化細胞中的核酸構建物，所含核酸序列選自序列SEQ ID NO.1、具有序列SEQ ID NO.1至少15個連續核苷酸(優選30個連續核苷酸)的片段、或與所述序列之一最佳對比后具有至少80％同源性的序列。
優選的是，本發明的一個主題是本發明中要求的腸細菌OmpA蛋白或其片段，與抗原或半抗原相結合用于制備意欲產生針對腫瘤細胞的細胞毒性T應答的藥物組合物的應用，如本發明所要求保護的，特征為所述抗原或半抗原是序列SEQ ID NO.3ELAGIGILTV的肽，且細胞毒性T應答針對黑素瘤細胞。
同樣優選的是，本發明的一個主題是本發明中要求的腸細菌OmpA蛋白或其片段的用途，與序列ELAGIGILTV的肽相結合用于制備意欲治療或預防惡性黑素瘤的藥物組合物。
另一方面，本發明的一個主題是上文定義的藥物組合物，特別是-藥物組合物，特征為包含腸細菌OmpA蛋白或其片段，其通過混合或共價偶聯與序列ELAGIGILTV的肽相結合；或-藥物組合物，特征為包含含編碼腸細菌OmpA蛋白或其片段的核酸和編碼序列ELAGIGILTV的肽的核酸的核酸構建物。
如上文為本發明中要求的用途而定義的，本發明中要求的所述藥物組合物可以(例如)包含腸細菌OmpA蛋白或其片段，通過共價連接(通過化學合成)將用途重組OmpA或由提取方法獲得的OmpA與序列ELAGIGILTV的肽偶聯，或者通過基因重組而偶聯。
同樣如上文為本發明中要求的用途而定義的，本發明中要求的所述藥物組合物可以(例如)包含所含核酸構建物包含編碼腸細菌OmpA蛋白或其片段的核酸和/或編碼肽序列ELAGIGILTV的核酸的載體，或者能夠表達腸細菌OmpA蛋白或其片段和/或肽序列ELAGIGILTV的經轉化宿主細胞。
本發明的一個主題是藥物組合物，特征為它包含序列SEQ ID NO.2的肺炎克氏桿菌OmpA蛋白、其序列與序列SEQ ID NO.2最佳對比后具有至少80％同源性的蛋白質、所述序列SEQ ID NO.2 OmpA蛋白的至少5個氨基酸的片段，其通過混合或偶聯與肽序列ELAIGILTV相結合。
本發明的一個主題是藥物組合物，特征為它包含含編碼肺炎克氏桿菌OmpA蛋白序列SEQ ID NO.2、其序列與序列SEQ ID NO.2最佳對比后具有至少80％同源性的蛋白質、或所述OmpA蛋白序列SEQ ID NO.2的至少5個氨基酸的片段的核酸和編碼肽序列ELAGIGILTV的核酸的核酸構建物。
根據本發明，所述組合物的裝載形式使之有可能改進其穩定性和/或其免疫原性，諸如脂質體，或病毒載體、或能夠表達所述OmpA蛋白或其片段和所述肽序列ELAGIGILTV的經轉化細胞的形式。
根據本發明，所述組合物將優選優選包含于制藥學可接受介質中。
為了本發明的目的，制藥學可接受的介質是本發明化合物在其中給藥的介質，優選能夠給人注射的介質。它可能由水、鹽的水溶液、或基于右旋糖和/或甘油的水溶液組成。
根據本發明，所述組合物還可以包含去污劑。
本發明中要求的組合物還可以包含去污劑，特別是任何形式的制藥學可接受的表面活性劑，諸如例如陰離子、陽離子、非離子、或兼性表面活性劑。優選使用去污劑Zwittergent 3-12和辛基葡糖吡喃糖苷，甚至更優選Zwittergent 3-14。
本發明還包括本發明中要求的組合物，特征為它們不包含其它用于誘導CTL應答的佐劑。優選的，除了本發明藥物組合物特征性腸細菌OmpA蛋白或其片段或者編碼腸細菌omA蛋白或其片段的核酸，本發明中要求的所述藥物組合物不包含免疫佐劑。
下文的圖例和實施例意欲例證本發明，絕非限制其范圍。
圖例

圖1A、1B、1C、和1D效應細胞抗MELAN-A和抗TRP-2的CTL活性測量。
在用與3μg rP40混合的50μg hELA(圖1A)、與300μg rP40混合的50μg hELA(圖1B)、與rP40偶聯的50μghELA(圖1C)、或與300μgrP40混合的TRP-2肽(圖1D)免疫之后，在評估它們殺傷可能經(長方形)或可能未經(菱形)相關預肽脈沖的靶細胞的能力之前，用經照射和用1μM相關肽預脈沖的EL-4 A2/Kb細胞(圖1A、1B、或1C)或EL-4細胞(圖1D)刺激引流淋巴結細胞。
圖1A-1D的X軸點對應于效應T細胞(活性淋巴細胞)與靶細胞(EL-4A2/Kb或EL-4)混合的比率。
圖2A、2B、2C、和2D與由標準免疫方案獲得的CTL活性比較，當存在rP40蛋白時效應細胞抗MELAN-A的CTL活性測量。
在單獨用hELA(50μg)(ELA，圖2A)、與300μgrP40混合的hELA(ELA＋P40，圖2B)、與300μg rP40偶聯的hELA(ELA/P40，圖2C)、或以IFA為佐劑與50μg P30肽混合的hELA(ELA＋IFA＋TT，圖2D)(IFA指不完全弗氏佐劑，TT指破傷風類毒素)免疫之后，在評估它們殺傷可能經(長方形)或可能未經(菱形)hELA肽預脈沖的EL-4 A2/Kb靶細胞的能力之前，在體外用經照射和用1μM相關肽預脈沖的EL-4 A2/Kb細胞刺激引流淋巴結細胞2周。
實施例實施例1編碼肺炎克氏桿菌P40蛋白的基因的克隆通過PCR擴增用途肺炎克氏桿菌IP I145(Nguyen等人，1998，基因(Gene))基因組DNA獲得編碼P40蛋白的基因。將編碼該基因的基因片段插入各種表達載體，受各種啟動子的控制，特別是Trp操縱子。P40蛋白的核苷酸序列和肽序列分別由下文的序列SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2表示。用pvaLP40表達載體轉化E.coli K12生產菌株。以包涵體的形式生產重組P40蛋白(rP40)，產量相當高(g蛋白質/g干生物量大于10％)。
此實施例僅僅是rP40蛋白表達的例示，此例示有可能延伸至其它細菌菌株和其它表達載體。實施例2用于rP40融合蛋白的發酵的方法在裝有250ml含氨芐青霉素(100μg/ml，Sigma)和四環素(8μg/ml，Sigma)的TSB(胰胨豆胨培養基，Difco)培養基的錐形瓶中，接種上述經轉化E.coli菌株。于37℃溫育過夜后，用200ml此培養液接種發酵罐(Biolaffite，法國)中的2L培養基。在傳統方法中，培養液可能包含已知促進高密度細菌細胞生長的添加維生素和/或酵母提取物的化學試劑。
在發酵過程中控制的參數是pH、攪拌、溫度、充氧水平、和混合源(甘油或葡萄糖)的供應。一般而言，pH調至7.0，溫度固定在37℃。通過恒速(12ml/h)供應甘油(87％)來控制生長，從而將溶氧張力信號維持在30％。當培養液的混濁度(于580nm測量)達到80時(培養大約24小時后)，通過加入吲哚丙烯酸(IAA)至終濃度25mg/L來處理蛋白質生產。誘導大約4小時后，通過離心收獲細胞。獲得的凈生物量為大約200g。實施例3用于提取并純化rP40蛋白的方法提取rP40將培養液離心(4000rpm，10min，4℃)后，將細胞重懸于25mMTris-HCl緩沖液(pH8.5)。用溶菌酶處理(0.5g/L，1h，室溫，溫和攪拌)后獲得不溶性成分即包涵體。將通過離心(15min，10,000rpm，4℃)獲得的包涵體沉淀用含5mM MgCl2的25mM Tris-HCl緩沖液(pH8.5)吸收，然后離心(15min，10,000rpm)。
將包涵體在含7M尿素(變性劑)和10mM二硫蘇糖醇(還原二硫橋)25mM Tris-HCl緩沖液(pH8.5)中于37℃溶解2小時。離心(15min，10,000rpm)使之有可能消除不溶性顆粒。
然后重懸于13倍體積的含NaCl(8.76g/L)和Zwittergent 3-14(0.1％，w/v)的25mM Tris-HCl緩沖液(pH8.5)中。將溶液于室溫接觸空氣溫和攪拌過夜(從而通過稀釋和二硫橋的再氧化促進蛋白質復性)。純化rP40蛋白-陰離子交換層析步驟再次離心后，將溶液用含0.1％Zwittergent 3-14(100倍緩沖液體積)的25mM Tris-HCl緩沖液(pH8.5)于4℃透析過夜。
將透析液上樣至用上述緩沖液以線性流速15cm/h平衡的含強陰離子交換劑類載體(Biorad Macro Prop High Q凝膠)的層析柱。于280nm檢測蛋白質。用含0.2M NaCl和0.1％Zwittergent 3-14的25mM Tris-HCl緩沖液(pH8.5)以線性流速60cm/h洗脫rP40蛋白。-陽離子交換層析步驟合并含rP40蛋白的收集液，并通過超濾濃縮。對于大約100ml體積，借助Amicon細胞系統攪拌，用途YM10型Diaflo膜(截留閾值10kDa)；對于較大體積，借助Millipore Minitan切向流過濾系統，用途截留閾值10kDa的膜板。將由此濃縮收集液用含0.1％Zwittergent 3-14的20mM檸檬酸鹽緩沖液(pH3.0)于4℃透析過夜。
將透析液上樣至用含0.1％Zwittergent 3-14的20mM檸檬酸鹽緩沖液(pH3.0)平衡的含強陽離子交換劑類載體(Biorad Macro Prop HighS凝膠)的層析柱。用0.7M NaCl濃度以線性流速61cm/h洗脫rP40蛋白。電泳特征顯示大約95％的純度。通過SDS-PAGE監測蛋白質狀態。由肺炎克氏桿菌膜提取的P40蛋白根據其是否處于本性或天然形式而具有特征性電泳(泳動)行為。事實上，天然形式(β-折疊結構)的分子量小于由變性劑(諸如尿素或鹽酸胍)作用或存在SDS時于100℃加熱產生的變性形式(α-螺旋結構)。不管進行后者時是否存在0.1％(w/v)Zwittergent 3-14，rP40蛋白在復性結束時不正確復性。另一方面，用含0.1％(w/v)Zwittergent 3-14的25mM Tris-HCl緩沖液(pH8.5)透析后獲得完全復性。然而，應當注意的是，只有在室溫的稀釋步驟和處理在Zwittergent 3-14(不含去污劑陰性結果)中進行時獲得這種復性。實施例4CTL的產生為幾種抗原定義了針對黑素瘤細胞的抗腫瘤CTL應答。這些抗原包括于下列三類之一a)黑素瘤特異性排異抗原，諸如MAGE家族(由van der Bruggen等人綜述，科學(Science)2541643)；b)來自正常蛋白質突變的抗原。這一組包括MUM-1(Coulie等人，1995，美國國家科學院進展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)927976-7980)；CDK4(Wolfel等人，1995，科學(Science)2961281-1284)；和HLA-A2(Brandel等人，1996，實驗醫學雜志(J.Exp.Med.)1832501-2508)；c)黑素瘤和黑素細胞表達的分化抗原。這一組包括酪氨酸酶(Wolfel等人，1994，歐洲免疫學雜志(Eur.J.Immunol.)4759和Brichard等人，1996，歐洲免疫學雜志(Eur.J.Immunol.)26224)；gp100(Kang等人，1995，免疫學雜志(J.Immunol.)1551343；Cox等人，1994，科學(Science)264716；和Kawakami等人，1995，免疫學雜志(J.Immunol.)1553961)；gp75(Wang等人，1996，實驗醫學雜志(J.Exp.Med.)1831131)；和Mart-1/MelanA(參閱美國專利5,620,886)。
在所有這些抗原中，Mart-1/MelanA似乎是用于免疫治療的最佳候選者，這有幾個原因。首先，該抗原是根據CTL應答鑒定的，所述CTL應答在體內是浸潤黑素瘤的淋巴細胞，在體外是外周血細胞，這說明了該抗原在天然應答中的較大相關性，所述天然應答在體內是針對黑素瘤的(Kawakami等人，1994，實驗醫學雜志(J.Exp.Med.)180347)。此外，Mart-1/MelanA在所有檢查的黑素瘤上表達，使之成為免疫治療干預的優選靶。最后，由Mart-1/MelanA衍生的肽能夠在患有黑素瘤(表達HLA-A2組織相容性抗原)的患者體內誘導特異性CTL應答(Rivoltini等人，1995，免疫學雜志(J.Immunol.)1542257；Valmori等人，1998，免疫學雜志(J.Immunol.)1601750)。
HLA-A2是在高加索人中表達的最常見的等位基因。已經為該等位基因定義了Mart-1/MelahA的CTL表位。由大多數人類CTL系識別的抗原肽包括第27-35位氨基酸AAGIGILTV(Kawakami等人，1994，實驗醫學雜志(J.Exp.Med.)180347)。此外，關于與HLA-A*0201的結合親和力和CTL克隆的識別的研究已經證明，用于這兩種功能的最佳肽是第26-35位十肽EAAGIGILTV(Romero等人，1997，免疫學雜志(J.Immunol.)1592366)。然而，這些肽在體外(Valmori等人，1998，免疫學雜志(J.Immunol.)1601750)和在體內(Jaeger等人，1996，國際癌癥雜志(Int.J.Cancer)66162)似乎是微弱的免疫原。
當將Mart-1/MelanA的T表位氨基酸序列與A*0201的肽基序(Rammensee等人，1995，免疫遺傳學(Immunogenetics)41178)進行比較時，第26-35位和第27-35位肽似乎在第2位具有非優勢錨定殘基，由此微弱結合HLA-A*0201分子(Kawakami等人，1995，免疫學雜志(J.Immunol.)154，3961)，這可以解釋其微弱的免疫原性。以編號WO 98/58951公開的國際專利申請描述了第26-35位肽的類似物，其中第2位丙氨酸用亮氨酸替代(序列命名為ELA)。
用于下文實驗的hELA肽是專利申請WO 98/58951的主題，該專利屬于路德維格癌癥研究學會(Institut Ludwig de Recherche sur leCancer)。hELA是在黑素細胞和黑素瘤上表達的蛋白質Melan-A/Mart-1第26-35位十肽(EAAGIGILTV)的類似物。雖然Melan-A/Mart-1第26-35位十肽能夠結合HLA-A0201分子(Romero等人，1997，免疫學雜志(J.Immunol.)1592366-2374)，但是它在體外和體內是微弱的免疫原(Valmori等人，1998，免疫學雜志(J.Immunol.)1601750-1758)。hELA類似物通過用亮氨酸替代Melan-A/Mart-1第26-35位十肽的第二位氨基酸(丙氨酸)來產生。根據關于將肽錨定至HLA-A0201分子所需殘基的分析，所述替代在體外導致黑素瘤患者CTL的更有效識別和更好的免疫原性(Valmori等人，1998，免疫學雜志(J.Immunol.)1601750-1758)。將C57B1/6 x BDA/s品系(Vitiello等人，1991，實驗醫學雜志(J.Exp.Med.)1731007-1015)的HLA-A*0201/Kb(A2/Kb)轉基因小鼠用于該研究以測試ELA。在這些小鼠中表達的I型MHC分子是由人類HLA-A0201分子(發現的最常見的同種異型)的α1和α2結構域和鼠Kb分子的α3結構域構成的嵌合分子。
序列SEQ ID NO.4 TRP-2肽是對應于酪氨酸酶相關蛋白2(TRP-2)第181-188位氨基酸(VYDFFVWL)的八肽。TRP-2在黑素細胞和黑素瘤中表達。已經證明該抗原在C57BL/6(H-2Kb)小鼠中誘導針對黑素瘤提供保護的CTL應答(Bloom等人，1997，實驗醫學雜志(J.Exp.Med.)185453-459)。A用與肽(Melan-A或TRP-2類似物)混合的rP40免疫之后抗Melan-A和抗TRP-2的CTL的產生實驗方案A2/Kb小鼠通過尾基皮下注射接受-與3或300μg rP40混合的50ug ELA；-與300μg rP40共價偶聯的50μg ELA。
C57BL/6小鼠通過尾基皮下注射接受-與300μg rP40混合的50ug TRP-2肽(第181-188位)。細胞毒性效應細胞的產生免疫后10天，處死小鼠并由引流淋巴結回收淋巴細胞，以在體外用相關肽進行刺激。
將這些淋巴細胞(4-5×106)，在24孔板中，在添加10mM HEPES、10％FCS、和50μMβ-2-巰基乙醇的DMEM中，與2-5×105個經照射(10kRad)和經脈沖(用1μM相關肽于37℃1h)的EL-4 A2/Kb細胞或EL4細胞一起培養。每周一次刺激2次后，測定細胞的細胞毒性活性。細胞毒性活性的測量將EL-4 A2/Kb細胞或EL4細胞與51Cr在存在或不存在相關肽的條件下溫育1h，清洗，然后以各種比率與效應細胞一起在96孔板中體積200μl于37℃溫育4-6小時。然后將細胞離心，并在100μl上清液中測量51Cr釋放。如下計算特異性溶胞百分率％特異性溶胞＝(實驗釋放－自發釋放)/(總釋放－自發釋放)×100。結果如圖1A-1D所示，用在與hELA(圖1B)或TRP-2(圖1D)的混合物中的最佳劑量的rP40(300μg)免疫小鼠誘導強烈的特異性CTL應答。在用與hELA偶聯的rP40(圖1C)免疫后也觀察到這種應答。另一方面，單獨用肽或單獨用rP40(結果未顯示)或者用在與亞最佳劑量rP40(3μg)的混合物中的hELA肽免疫不誘導任何CTL活性(圖1A)。這些結果證明與免疫原性肽混合或偶聯的rP40分子使之有可能在不加入佐劑的情況下在體內誘導特異性CTL應答。B用與肽(Melan-A類似物)混合的rP40免疫之后抗Melan-A的CTL的產生，與標準免疫方案比較實驗方案A2/Kb小鼠接受-50μl IFA(不完全弗氏佐劑)，通過尾基皮下注射；3周后，50μghELA，同時存在50μg由破傷風類毒素(TT)衍生的輔助T p30肽(Panina-Bordignon等人，1989，歐洲免疫學雜志(Eur.J.Immunol.)192237)，以IFA為佐劑。此方案被描述用于產生抗肽CTL(Valmori等人，1994，歐洲免疫學雜志(Eur.J.Immunol.)241458)并作為陽性對照用途。-50μg hELA或與50μg hELA混合或偶聯的300μg rP40。細胞毒性效應細胞的產生最終免疫后10天，處死小鼠并由引流淋巴結回收淋巴細胞，以在體外用相關肽刺激。
將這些淋巴細胞(4-5×106)，在24孔板中，在添加10mM HEPES、10％FCS、和50μMβ-2-巰基乙醇的DMEM中，與2-5×105個經照射(10kRad)和經脈沖(用1μM相關肽于37℃ 1h)的EL-4 A2/Kb細胞(經HLA-A*0201/Kb基因轉染的鼠細胞)一起培養。
每周一次刺激1次、2次、或3次后，測定細胞的細胞毒性活性。
根據上述方法測量細胞毒性活性。結果用與hELA偶聯的非佐劑的rP40免疫后，測量到與用hELA＋P30/IFA免疫后觀察到的可比的抗hELA的CTL活性(參照圖2C和2D)。相似的，rP40＋hELA肽混合物(其自身也無佐劑的)產生CTL，其方式與用于產生CTL的傳統方案獲得的相似(參照圖2B和2D)。
單獨用肽(參照圖2A)或單獨用rP40蛋白(未顯示)免疫后，無論在哪天刺激效應細胞，沒有檢測到CTL活性。
權利要求
1.與序列SEQ ID NO.3 ELAGIGILTV的肽相結合的腸細菌OmpA蛋白或其片段用于制備意欲產生針對黑素瘤細胞的細胞毒性T應答的藥物組合物的用途。
2.權利要求1中的與序列SEQ ID NO.3的肽相結合的腸細菌OmpA蛋白或其片段用于制備意欲治療或預防惡性黑素瘤的藥物組合物的用途。
3.權利要求1或2的用途，特征為所述腸細菌OmpA蛋白或其片段用途提取方法由所述腸細菌培養物獲得。
4.權利要求1或2的用途，特征為所述腸細菌OmpA蛋白或其片段由重組途徑獲得。
5.權利要求1-4之一的用途，特征為所述腸細菌是肺炎克氏桿菌。
6.權利要求5的用途，特征為所述opmA蛋白或其片段的氨基酸序列包含a)序列SEQ ID NO.2的氨基酸序列；b)與序列SEQ ID NO.2具有至少80％同源性的序列的氨基酸序列；或c)a)中定義的序列的至少5個氨基酸的片段的氨基酸序列。
7.權利要求1-6之一的用途，特征為所述序列SEQ ID NO.3肽與所述OmpA蛋白或其片段偶聯或混合。
8.權利要求6的用途，特征為所述序列SEQ ID NO.3肽與所述OmpA蛋白或其片段通過共價連接而偶聯。
9.權利要求8的用途，特征為通過共價連接的偶聯是通過化學合成產生的偶聯。
10.權利要求9的用途，特征為在所述OmpA蛋白或其片段和/或所述序列SEQ ID NO.3肽中導入一種或多種連接元件，從而有助于化學偶聯。
11.權利要求10的用途，特征為所述導入的連接元件是氨基酸。
12.權利要求8的用途，特征為由所述序列SEQ ID NO.3肽與所述OmpA蛋白或其片段之間的偶聯產生的雜合蛋白通過基因重組獲得。
13.權利要求12的用途，特征為藥物組合物包含編碼所述雜合蛋白的核酸構建物。
14.權利要求13的用途，特征為所述核酸構建物包含于載體或能夠表達所述雜合蛋白的轉化的宿主細胞中。
15.權利要求1-14之一的用途，用于制備能夠通過皮下或皮內途徑施用的藥物組合物。
16.權利要求1-15之一的用途，特征為所述藥物組合物的運載形式使之有可能改進其穩定性和/或其免疫原性。
17.權利要求1-16任一項定義的藥物組合物。
18.權利要求17的藥物組合物，特征為它包含通過混合或偶聯與序列SEQ ID NO.3肽相結合的序列SEQ ID NO.2肺炎克氏桿菌OmpA蛋白、其序列與序列SEQ ID NO.2具有至少80％同源性的蛋白質、或所述序列SEQ ID NO.2 OmpA蛋白的至少5個氨基酸的片段。
19.藥物組合物，特征為它含有一種核酸構建物，該核酸構建體包含編碼序列SEQ ID NO.2肺炎克氏桿菌OmpA蛋白、其序列與序列SEQ ID NO.2具有至少80％同源性的蛋白質、或所述序列SEQ ID NO.2 0mpA蛋白的至少5個氨基酸的片段的核酸，和編碼序列SEQ ID NO.3肽的核酸。
20.權利要求17-19之一的組合物，特征為所述藥物組合物以一定形式運載使之有可能改進其穩定性和/或其免疫原性。
21.權利要求20的組合物，特征為所述載體是脂質體、或病毒載體或能夠表達所述OmpA蛋白，或其片段，和所述序列SEQ ID NO.3肽的轉化的宿主細胞。
22.權利要求17-21之一的組合物，特征為所述組合物包含于制藥學可接受的介質中。
23.權利要求17-22之一的組合物，特征為所述組合物還包含去污劑。
24.權利要求17-23之一的組合物，不含任何其它用于誘導CTL應答的佐劑。
全文摘要
本發明涉及腸細菌膜蛋白OmpA,特別是肺炎克氏桿菌,與一種抗原或半抗原用于制備設計產生或增強針對腫瘤細胞的細胞毒性T應答的藥物組合物的用途。本發明還涉及該化合物用于預防或治療感染或癌癥的用途,特別是與腫瘤抗原相關的癌癥,諸如黑素瘤,和包含一些該化合物的藥物組合物。
文檔編號A61P31/04GK1341029SQ00803959
公開日2002年3月20日 申請日期2000年2月17日 優先權日1999年2月17日
發明者T·雷諾, P·羅米勒, I·米肯奈特, J－C·卡羅緹尼, J－Y·布耐弗 申請人:皮埃爾法博赫藥品公司