不飽和膽甾烷衍生物及其在制備調節減數分裂的藥物中的應用的制作方法

專利名稱：不飽和膽甾烷衍生物及其在制備調節減數分裂的藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及藥物活性的不飽和膽甾烷衍生物，包含這些衍生物作為活性物質的藥物組合物，以及這些新的化合物在制備藥物中的應用。更具體而言，已發現本發明的不飽和膽甾烷衍生物可用于調節減數分裂。
減數分裂是生殖細胞的獨特而且是最終的過程。減數分裂包括兩個減數分裂過程。第一個分裂過程中，先進行母體基因與父體基因之間的交換，然后染色體對分裂成兩個子細胞。這些細胞僅包含染色體和2c DNA數量(1n)的一半。第二個減數分裂過程不涉及DNA合成。因此，該分裂過程導致僅有1c DNA的單倍生殖細胞形成。
減數分裂過程在雄和雌生殖細胞中是類似的，但是時間程序以及形成卵及精子的分化過程有非常大的差異。在生命的早期，通常在出生之前，所有的雌生殖細胞都進入第一個減數分裂過程的前期，但所有的細胞隨后在該前期中都以卵母細胞的形式停止(dictyate狀態)，直至青春期后開始排卵。這樣，從生命的早期，雌性就已具有卵母細胞儲備，并用至該儲備耗盡。雌性中的減數分裂在受精后才完成，而且每個生殖細胞僅產生一個卵子和兩個流產極體。相反地，雄性生殖細胞中的一些僅在青春期后進入減數分裂，并在整個生命過程中形成干群(stem population)生殖細胞。一旦開始，雄細胞中的減數分裂將沒有顯著延遲地進行，并產生4個精子。
對于控制雄性和雌性中減數分裂啟動的機理僅知道很少。在卵母細胞中，新的研究表明卵泡嘌呤、次黃嘌呤或腺嘌呤有可能是減數分裂停止的原因(Downs，S.M.等人，Dev Biol 82(1985)454-458；Epplg.J.J.等人，Dev Biol 119(1986)313-312；以及Downs，S.M.，Mol Reprod Dev35(1993)82-94)。Byskov等人首次描述了在胚胎鼠性腺的培養體系中存在擴散性減數分裂調節物質(Byskov，A.G.等人，Dev Biol 52(1976)193-200)。減數分裂活化物質(MAS)是由其中正進行減數分裂的胚胎鼠卵巢分泌的，而防止減數分裂的物質(MPS)是由具有休止且非減數分裂的生殖細胞的、已發生形態分化的睪丸釋放的。這表明MAS和MPS的相對濃度調節雄和雌生殖細胞中減數分裂的開始、停止和重新開始(Byskov，A.G.等人，在The Physiology of Reproduction[Knobil，E.和Neil，J.D.編輯]中，Raven Press，New York(1994))。已清楚地知道，如果可以調節減數分裂，則可控制繁殖。最近的一篇文章(Byskov，A.G.等人，Nature 374(1995)，559-562)描述到可從牛睪丸和人卵泡液中分裂出某些活化卵母細胞減數分裂的甾醇。令人遺憾的是，這些甾醇非常不穩定。因而，如果能夠得到更穩定的減數分裂活化化合物，則可非常方便地使用這項令人感興趣的發現。
可刺激減數分裂而且與本專利申請所要求保護的化合物不同的已知化合物描述在WO 96/27658中。
本發明的目的是提供用于通過活化減數分裂來治療雄性和雌性、特別是人的不育癥的化合物。
本發明的再一個目的是提供可通過抑制減數分裂在雌性和雄性、特別是人中作為避孕藥的新型化合物。
根據本發明，所提供的新型、穩定的化合物具有令人感興趣的藥理性質。具體而言，在此所述的化合物可用于調節卵母細胞和雄生殖細胞中的減數分裂。
本發明的又一個目的是提供新型的化合物，該化合物對于引入熒光標記物是合適的底物。經連接的分子可設計并合成，用于生物成像的目的。
本發明涉及通式I的不飽和膽甾烷衍生物或其酯 其中R1代表氫原子、C2-C6烷基、任選經取代的苯基、氰基、CH2-NH-COR1′，其中R1′是C1-C8烷基或者任選經取代的苯基，或者與R2一起形成另一個鍵；R2代表氫原子、C4-C8烷基、C3-C6烯基、C1-C6羥基烷基，與R2′一起形成任選取代的亞芐基，與R2′一起形成羥基亞甲基，或者與R1一起形成另一個鍵；R2′代表氫原子，與R2一起形成任選取代的亞芐基，或者與R2一起形成羥基亞甲基；R3代表氫原子或者與R3′一起形成另一個鍵；R3′代表氫原子或者與R3一起形成另一個鍵；R4代表氫原子或者甲基；R4′代表氫原子或者甲基；R8與R9或者與R14一起形成另一個鍵；R9代表氫原子或者與R8一起形成另一個鍵；R14代表α-氫原子或者與R8一起形成另一個鍵，或者與R15一起形成另一個鍵；R15代表氫原子或者與R14一起形成另一個鍵；R24代表氫原子或者與R25一起形成另一個鍵；R25代表氫原子或者與R24一起形成另一個鍵。
其條件是，不包括在1和2位同時未被修飾的化合物R1＝R2＝R2′＝H。
通式I的化合物在分子中具有多個手性中心，并因而存在幾種異構體形式。所有這些異構體形式以及它們的混合物都在本發明的范圍內(除非另有說明)。
優選的通式I化合物是其中R1代表氫原子、苯基或者與R2一起形成另一個鍵。其他優選的化合物是其中R2代表C4-C8烷基、烯丙基或者與R1形成另一個鍵。其中R2和R2′代表任選取代的亞芐基的化合物也是優選的。
在另一個實施方案中，本發明涉及通式I化合物的酯。此等酯是用酸酯化通式I化合物的一個或多個羥基而形成的，所述酸例如選自于以下組中琥珀酸以及其他脂族二羧酸、煙酸、異煙酸、乙基碳酸、磷酸、磺酸、氨基磺酸、苯甲酸、乙酸、丙酸以及其他脂族單羧酸。
本發明之說明書和權利要求書中所使用的烷基在單獨或者組合使用時都可以是直鏈或支鏈烷基。C2-C6烷基是指具有2-6個碳原子的烷基，優選的例子是乙基、丙基、異丙基、丁基、叔丁基、戊基、己基和環己基，更優選乙基。類似地，C1-C8烷基是指具有1-8個碳原子的烷基，其優選的例子是甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、叔丁基、戊基、己基和辛基，更優選是甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基和叔丁基，最優選是甲基和乙基。
本發明的式I化合物特別優選是以下化合物2α-烯丙基-4，4-二甲基-5α-膽甾烷-8，14-二烯-3β-醇，(E)-2-亞芐基-4，4-二甲基-5α-膽甾烷-8，14-二烯-3β-醇，5α-膽甾烷-1，8，14-三烯-3β-醇，5α-膽甾烷-1，8，14-三烯-3-酮，1α-氰基-4，4-二甲基-5α-膽甾烷-8，14-二烯-3β-醇，1α-氰基-4，4-二甲基-5α-膽甾烷-8，14-二烯-3-酮，4，4-二甲基-5α-膽甾烷-1，8，14-三烯-3β-醇，4，4-二甲基-5α-膽甾烷-1，8，14-三烯-3-酮，(E)-4-[(3β-羥基-4，4-二甲基-5α-膽甾烷-8，14-二烯-2-亞基)-甲基]芐腈；(E)-N-[[4-[(3β-羥基-4，4-二甲基-5α-膽甾烷-8，14-二烯-2-亞基)-甲基]苯基]甲基]辛酰胺；(E)-N-[[4-[(3β-羥基-4，4-二甲基-5α-膽甾烷-8，14-二烯-2-亞基)-甲基]苯基]甲基]-5-(4，4-二氟-5，7-二甲基-4-硼-3a，4a-二氮雜-s-indacen-3-基)戊酰胺；2α-羥甲基-4，4-二甲基-5α-膽甾烷-8，14-二烯-3α-醇，2α-辛基-4，4-二甲基-5α-膽甾烷-8，14-二烯-3β-醇，以及(E)-4-[(3-氧代-4，4-二甲基-5α-膽甾烷-8，14-二烯-2-亞基)-甲基]芐腈。
本發明的通式I化合物可類似于已知化合物的制備方法來制備。因此，式I化合物的合成可遵循眾多甾醇和甾體文獻中已經描述的已知合成路徑。在合成中可使用以下書籍作為關鍵參考L.F.Fieser & M.FieserSteroidsReinhold Publishing Corporation，NY 1959；Rod′s Chemistry ofCarbon Compounds(編輯S.Coffery)Elsevier Publishing Company，1971；特別是Dictionary of Steroids(編輯R.A.Hill；D.N.Kirk；H.L.J.Makin和G.M.MurphyChapman & Hall。最后一本書中的索引目錄包括了上至1990的原始論文。
具體而言，本發明的化合物根據一些總的方法來合成用作起始物的甾醇可根據文獻中的方法來合成4，4-二甲基-5α-膽甾烷-8，14-二烯-3β-醇、4，4-二甲基-5α-膽甾-8-烯-3β-醇、4，4-二甲基-5α-膽甾-8(14)-烯-3β-醇(Biochem.J.132(1973)，439)，4，4-二甲基-5α-膽甾烷-8，24-二烯-3β-醇、4，4-二甲基-5α-膽甾烷-8，14，24-三烯-3β-醇(J.Am.Chem.Soc.111(1989)，278)，5α-膽甾烷-8，14-二烯-3β-醇(J.Am.Chem.Soc.75(1953)，4404)，5α-膽甾-8-烯-3β-醇(J.Org.Chem.46(1981)，3421)，以及5α-膽甾-8(14)-烯-3β-醇(Biochem.J.144(1974)，59)。
以下將詳細描述4，4-二甲基-Δ-8，14-系列的合成。按照相同的方式由相應的起始物可合成帶有或不帶有4，4-二甲基的Δ-8、Δ-8(14)、Δ-8，14，24以及Δ-8，24-系列中的衍生物。
用不同的試劑氧化3β-醇，形成相應的3-酮(例如，TetrahedronLett.1967，3699)。4，4-二甲基-5α-膽甾烷-8，14-二烯-3β-醇(1)在四丙基過釕酸銨存在時用N-甲基-嗎啉-N-氧化物處理，形成4，4-二甲基-5α-膽甾烷-8，14-二烯-3-酮(2)(例如，Synthesis 1994，639)。合成路線1 在下-步中，在氯苯中，用苯基硒酸酐作為氧化劑，在氧化反應中引入Δ-1雙鍵(J.Chem Soc.Chem.Commun.1978，952)，形成4，4-二甲基-5α-膽甾烷-1，8，14-三烯-3-酮(3)。如果使用沒有4，4-二甲基的化合物，該反應也可進行。在這些化合物中，新的雙鍵可以Δ1-雙鍵的形式選擇性地引入。3-酮基然后可在氯化鈰存在時用硼氫化鈉還原(Luche還原反應，例如J.Am.Chem.Soc.100(1978)，2226)，形成4，4-二甲基-5α-膽甾烷-1，8，14-三烯-3β-醇(4)。
通過在不飽和酮中添加銅酸酯，可在1位處引入烷基和芳基(Tetrahedron Lett.35(1994)，8591)。由烷基或芳基鋰與碘化亞銅形成的銅酸酯與甾體烯酮反應，形成1-取代衍生物。如果烯酮(3)用二烷基銅酸酯處理，則可得到式(5)的化合物(R1＝烷基、芳基)。這些酮然后可根據已知的文獻方法還原，形成兩個非對映異構體醇(6)和(7)(R1＝烷基、芳基)，它們通過色譜法可容易分離。合成路線2 按照類似的方法可引入氰基。在烯酮(3)中結合加成氰化物，形成所希望的1α-氰基-4，4-二甲基-5α-膽甾烷-8，14-二烯-3-酮(5)(R1＝CN)。在該反應中可使用不同的試劑，例如二乙基氰化鋁(J.Org.Chem.59(1994)，2766)以及一些堿金屬和堿土金屬(Tetrahedron Lett.28(1987)，4189；Can.J.Chem.59(1981)，1641)。氰基酮(5)(R1＝CN)也可用標準還原劑如硼氫化鈉還原，形成兩個非對映異構體醇(6)和(7)(R1＝CN)，它們通過色譜法可容易分離。
如果氰基醇(6)(R1＝CN，如上進行合成)用氫化鋁鋰處理，則可得到1α-氨甲基-4，4-二甲基-5α-膽甾烷-8，14-二烯-3β-醇(8)。這個胺可用于進一步修飾。式(9)的酰胺(R1′＝烷基、芳基和熒光標記物)可通過所述胺與各種烷基或芳基羧酸的羥基琥珀酰亞胺基酯反應來合成。(在使用包含熒光標記物的羧酸羥基琥珀酰亞胺基酯時可參考Nonradioactive labeling and detection of biomolecules，Kessler C.編輯，Springer Verlag，Berlin，1992)。合成路線3 2位的取代基可例如通過3-羥基丁醛反應和烷基化反應來引入。如果酮(2)在堿存在時用芳香醛處理，則可得到式(10)的2-亞芐基取代的甾體。芳香環可以是取代的。隨后在氯化鈰存在下用硼氫化鈉進行還原，選擇性地形成相應的烯丙基3β-醇(11)。合成路線4 可如上所示合成的氰基亞芐基取代的化合物(11)(R2″＝4-CN)可用于進一步修飾。該氰基可用氫化鋁鋰還原為芐基胺(12)，其可衍生成式(13)的相應酰胺(R2＝烷基、芳基和熒光標記物)。為此目的，胺(12)用不同羧酸的羥基琥珀酰亞胺基酯衍生物處理。對于該反應，可使用包含熒光標記物的市售酯(參考實施例部分中的實施例11)。包含熒光標記物的式(13)的酰胺可用作用于生物成像的分子探針。合成路線5 烷基-和烯基取代基可如下引入在2位上使酮(2)脫質子化，然后使烯醇化物與烷基-和烯基鹵反應。式(14)的3-酮然后可用硼氫化鈉還原，形成兩個非對映異構體醇(15)和(16)，它們通過色譜法可容易分離。合成路線6 2位的羥甲基取代基例如可通過脫質子化的3-酮與烷基甲酸酯的縮合反應來引入，形成烯醇(17)。其用不同的還原劑如硼氫化鈉還原，形成兩個非對映異構體醇(18)和(19)。合成路線7 這些醇在柱色譜上可容易地分離。通過如上所述的烷基化反應(見合成路線6)，可例如引入更長鏈的羥烷基取代基。
本發明的再一個目的是提供包含一種或多種通式I化合物作為活性物質的藥物組合物。這些藥物組合物可進一步包含藥物學上可接受的、本領域技術人員已知的賦形劑，如載體、稀釋劑、吸收促進劑、防腐劑、緩沖劑、滲透壓調節劑、片劑崩解劑以及通常用于本領域中的其他成分。固體載體的例子是碳酸鎂、硬脂酸鎂、葡萄糖、乳糖、蔗糖、滑石、明膠、果膠、黃蓍膠、甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉、低熔點蠟以及可可脂。
液體組合物包括無菌溶液、混懸液和乳液。此等液體組合物可適用于注射或者用于活體外及體外受精。液體組合物可包含本領域通常使用的其他成分，其中一些如上所述。另外，可以藥貼的形式提供用于經皮給藥本發明化合物的組合物，并以液體或粉末鼻腔噴霧劑的形式提供用于鼻腔給藥的組合物。
本發明化合物的使用劑量可由醫師確定，而且取決于多種因素，如所使用的具體化合物、給藥途徑、以及使用目的。通常情況下，本發明的組合物是如下制備的使活性化合物與液體或固體輔助成分充分混合，然后如果需要的話，將產品成型為所希望的劑型。
本發明涉及通式I的化合物在制備調節減數分裂的藥物中的用于。本發明的化合物影響卵母細胞以及雄生殖細胞中的減數分裂。能夠影響減數分裂的前景是多方面的。根據本發明的優選實施方案，通式I的化合物可用于刺激減數分裂。根據本發明的另一個優選實施方案，通式I的化合物可用于刺激人的減數分裂。因此，通式I的化合物可用作新型生育力調節劑，而不會有目前所用避孕藥物對體細胞的常見副作用，目前的避孕藥物是基于雌激素和/或孕激素。
因此，本發明涉及通式I化合物在緩解雌性和雄性、特別是哺乳動物、尤其是人的不育癥中的應用。通過給藥于由于自身產生減數分裂活化物質不足而不能形成成熟卵母細胞的雌性，包括婦女，通式I的減數分裂誘導物質可用于治療他們中的不育癥。
通式I的化合物還可用于人工受精程序，例如體外受精或者胞質內精子注射。當進行體外受精時，如果在培養卵母細胞的培養基中添加本發明的化合物，可達到更好的結果。當自身減數分裂活化物質產生不足而使包括男性的雄性發生不育，并由此缺少成熟的精子細胞時，給藥本發明的化合物可緩解該問題。
在本發明的再一個方面中，通式I的化合物可用作雌性和雄性、特別是哺乳動物、尤其是人的避孕藥物。在雌性中用作避孕藥物時，可給藥減數分裂誘導物質，以便在卵母細胞仍處于生長的卵泡中時，在發生促性腺激素的排卵高峰之前，在卵母細胞中早熟性地誘導減數分裂重新開始。在婦女中，例如在前一次月經停止后一周誘導減數分裂的重新開始。當排卵時，所產生的過度成熟的卵母細胞最沒有可能被受精。正常月經周期不會被影響。在此方面，重要的是注意，減數分裂誘導物質的存在不影響經培養的人粒膜細胞(卵泡的體細胞)中孕酮的生物合成，然而目前用作激素避孕藥的雌激素和孕激素卻會對孕酮的生物合成產生負面影響。
作為上述方法的替代法，給藥可抑制減數分裂的本發明化合物，也可在雌性中實現避孕，使得沒有成熟卵母細胞產生。類似地，給藥可抑制減數分裂的本發明化合物，可在雄性中實現避孕，使得沒有成熟精子細胞形成。
在另一個方面中，本發明涉及通式I化合物作為工具物質或者作為用于合成生物成像用工具物質的起始物的應用，所述工具物質是用于鑒別所述物質的作用模式。例如，包含熒光標記物的減數分裂活化甾醇可用于使活性物質于其中發揮生物功能的生長細胞的腔顯影。該信息可有助于鑒別所述物質的作用模式。
在另一個方面，本發明涉及調節減數分裂的方法，其包括向需要此等調節作用的受體給藥有效量的一種或多種通式I化合物。
在又一個方面，本發明涉及調節哺乳動物生殖細胞中的減數分裂的方法，其包括向需要此等調節作用的生殖細胞活體外或體外給藥有效量的一種或多種通式I化合物。生殖細胞可以是卵母細胞或者是雄性生殖細胞。
包含本發明化合物的組合物的給藥途徑可以是有效地將活性化合物轉運至作用部位處的任何一種途徑。
因此，在將本發明的化合物給藥于哺乳動物時，其通常是以包含至少一種本發明的化合物以及藥物學上可接受的載體的藥物組合物的形式提供。在口服使用時，此等組合物優選為膠囊或片劑。
由以上描述可以理解到，所需要的給藥方案將取決于待治療的病癥。因此，在用于治療不育時，可只給藥一次，或者在有限的時間內給藥，例如直至實現懷孕。
在用作避孕藥時，本發明的化合物可連續或者周期性地給藥。在用作雌性的避孕藥而且不是連續給藥時，相對于排卵的給藥時間是重要的。
將通過以下實施例進一步描述本發明。實施例14，4-二甲基-5α-膽甾烷-1，8，14-三烯-3-酮a)4，4-二甲基-5α-膽甾烷-8，14-二烯-3-酮在6.40g的4，4-二甲基-5α-膽甾烷-8，14-二烯-3β-醇和4.03g的N-甲基-嗎啉-N-氧化物于32ml二氯甲烷中的溶液內添加幾個顆粒的分子篩，然后攪拌混合物5分鐘。在室溫下添加408mg的四丙基過釕酸銨，并攪拌所得的黑色反應混合物1小時。在celite上過濾后，蒸發溶劑，殘留物用己烷和乙酸乙酯的混合物進行色譜分離，得到5.60g白色固體狀的4，4-二甲基-5α-膽甾烷-8，14-二烯-3-酮。
1H-NMR(CDCl3)δ＝0.83(s，3H，H-18)；0.87(2x d，J＝7Hz，6H，H-26/27)；0.94(d，J＝7Hz，3H，H-21)；1.07(s，3H)；1.12(2x s，6H)；2.55(m，2H)；5.41(s，1H，H-15)b)4，4-二甲基-5α-膽甾烷-1，8，14-三烯-3-酮于室溫下將1.75g的苯基硒酸酐添加在2.00g的4，4-二甲基-5α-膽甾烷-8，14-二烯-3-酮于30ml氯苯中的溶液內。將反應混合物溫熱至100℃共2小時。冷卻并蒸發溶劑后，殘留物用己烷和乙酸乙酯的混合物進行色譜分離，得到0.85g油狀的4，4-二甲基-5α-膽甾烷-1，8，14-三烯-3-酮。
1H-NMR(CDCl3)δ＝0.84(s，3H，H-18)，0.87(2x d，J＝7Hz，6H，H-26/27)，0.96(d，J＝7Hz，3H，H-21)，1.11(s，3H)，1.18(s，3H)，1.25(s，3H)，5.45(s，1H，H-15)，5.95(d，J＝10Hz，1H，H-2)，7.33(d，J＝10Hz，1H，H-1)實施例24，4-二甲基-5α-膽甾烷-1，8，14-三烯-3β-醇在室溫下將14mg的硼氫化鈉添加在73mg的4，4-二甲基-5α-膽甾烷-1，8，14-三烯-3-酮和67mg七水氯化鈰在甲醇中的懸浮液內。混合物攪拌4小時，傾倒在水中，然后用乙醚萃取。分離有機層，用鹽水洗滌，在無水硫酸鈉上干燥，然后過濾。蒸發溶劑后，殘留物用己烷和乙醚的混合物進行色譜分離，得到43mg白色固體狀的4，4-二甲基-5α-膽甾烷-1，8，14-三烯-3β-醇。
1H-NMR(CDCl3)δ＝0.82(s，3H)，0.85(s，3H)，0.87(2x d，J＝7Hz，6H，H-26/27)，0.96(d，J＝7Hz，3H，H-21)，1.02(s，3H)，1.10(s，3H)，3.89(m，1H，H-3)，5.37(s，1H，H-15)，5.50(dd，J＝10Hz，1Hz，1H，H-1)，5.90(d，J＝10Hz，2Hz，1H，H-2)實施例35α-膽甾烷-1，8，14-三烯-3β-醇a)5α-膽甾烷-8，14-二烯-3β-醇如實施例1a所述，2.40g的5α-膽甾烷-8，14-二烯-3β-醇用1.11g的N-甲基-嗎啉-N-氧化物和111mg四丙基過釕酸銨在13ml二氯甲烷中處理。色譜分離后，得到白色固體狀的5α-膽甾烷-8，14-二烯-3-酮1.81g。
1H-NMR(CDCl3)δ＝0.82(s，3H，H-18)，0.87(2x d，J＝7Hz，6H，H-26/27)，0.94(d，J＝7Hz，3H，H-21)，1.18(s，3H，H-19)，5.39(s，1H，H-15)b)5α-膽甾烷-1，8，14-三烯-3-酮如實施例1b所述，1.81g的5α-膽甾烷-8，14-二烯-3-酮用1.67g的苯基硒酸酐在29ml氯苯中處理。色譜分離后，得到0.53g油狀的5α-膽甾烷-1，8，14-三烯-3-酮。
1H-NMR(CDCl3)δ＝0.84(s，3H，H-18)，0.86(2x d，J＝7Hz，6H，H-26/27)，0.96(d，J＝7Hz，3H，H-21)，1.20(s，3H，H-19)，5.43(s，1H，H-15)，5.91(d，J＝10Hz，1H，H-2)，7.42(d，J＝10Hz，1H，H-1)c)5α-膽甾烷-1，8，14-三烯-3β-醇如實施例2所述，150mg的5α-膽甾烷-1，8，14-三烯-3-酮用15mg的硼氫化鈉和147mg的七水氯化鈰處理。色譜分離后得到白色固體狀的5α-膽甾烷-1，8，14-三烯-3β-醇47mg。
1H-NMR(CDCl3)δ＝0.82(s，3H，H-18)，0.87(2x d，J＝7Hz，6H，H-26/27)，0.95(d，J＝7Hz，3H，H-21)，1.07(s，3H，H-19)，4.33(m，1H，H-3)，5.37(s，1H，H-15)，5.56(dd，J＝10Hz，1Hz，1H，H-1)，6.09(d，J＝10Hz，1H，H-2)實施例41α-氰基-4，4-二甲基-5α-膽甾烷-8，14-二烯-3-酮在0℃下將1.47ml的二乙基氰化鋁溶液(1M，在甲苯中)添加在4，4-二甲基-5α-膽甾烷-1，8，14-三烯-3-酮于5ml四氫呋喃中的溶液內。反應混合物溫熱至室溫，然后攪拌1小時。在0℃下添加2.45ml的氫氧化鈉溶液(1M)后，用水稀釋所得混合物，然后用乙醚萃取。分離有機層，用鹽水洗滌，在無水硫酸鈉上干燥，然后過濾。蒸發溶劑后，殘留物用己烷和乙酸乙酯的混合物進行色譜分離，得到白色固體狀的1α-氰基-4，4-二甲基-5α-膽甾烷-8，14-二烯-3-酮110mg。
1H-NMR(CDCl3)δ＝0.86(2x d，J＝7Hz，6H，H-26/27)，0.89(s，3H)，0.94(d，J＝7Hz，3H，H-21)，1.12(s，3H)，1.15(s，3H)，1.20(s，3H)，2.86(m，1H，H-2)，3.29(dd，J＝7Hz，5Hz，1H，H-1)，5.49(ps，1H，H-15)實施例51α-氰基-4，4-二甲基-5α-膽甾烷-8，14-二烯-3β-醇和1α-氰基-4，4-二甲基-5α-膽甾烷-8，14-二烯-3α-醇如實施例5所述，95mg的1α-氰基-4，4-二甲基-5α-膽甾烷-8，14-二烯-3-酮用33mg的硼氫化鈉處理，得到30mg的1α-氰基-4，4-二甲基-5α-膽甾烷-8，14-二烯-3α-醇和25mg的1α-氰基-4，4-二甲基-5α-膽甾烷-8，14-二烯-3β-醇。1α-氰基-4，4-二甲基-5α-膽甾烷-8，14-二烯-3β-醇1H-NMR(CDCl3)δ＝0.83(s，3H)，0.87(2x d，J＝7Hz，6H，H-26/27)，0.94(d，J＝7Hz，3H，H-21)，1.09(s，3H)，1.17(s，3H)，3.08(m，1H，H-1)，3.72(bm，1H，H-3)，5.43(ps，1H，H-15)1α-氰基-4，4-二甲基-5α-膽甾烷-8，14-二烯-3α-醇1H-NMR(CDCl3)δ＝0.87(2x d，J＝7Hz，6H，H-26/27)，0.91(s，3H)，0.93(d，J＝7Hz，3H，H-21)，1.08(s，3H)，1.15(s，3H)，1.28(s，3H)，2.92(m，1H，H-1)，3.57(ps，1H，H-3)，5.44(ps，1H，H-15)實施例6(E)-4-[(3-氧代-4，4-二甲基-5α-膽甾烷-8，14-二烯-2-亞基)-甲基]芐腈將64mg的4-氰基苯甲醛和27mg的氫氧化鉀在2ml乙醇中的懸浮液滴加在4，4-二甲基-膽甾烷-8，14-二烯-3-酮于4ml乙醇中的懸浮液內。反應混合物攪拌20小時，用水稀釋，然后用二氯甲烷萃取。分離有機層，用鹽水洗滌，在無水硫酸鈉上干燥，然后過濾。蒸發溶劑后，殘留物用己烷和乙酸乙酯的混合物進行色譜分離，得到168mg白色固體狀的(E)-4-[(3-氧代-4，4-二甲基-5α-膽甾烷-8，14-二烯-2-亞基)-甲基]芐腈。
1H-NMR(CDCl3)δ＝0.83(s，3H)，0.87(2x d，J＝7Hz，6H，H-26/27)，0.93(d，J＝7Hz，3H，H-21)，0.98(s，3H)，1.16(s，3H)，1.23(s，3H)，2.58(d，J＝17Hz，1H，H-1)，3.10(d，J＝17Hz，1H，H-1)，5.47(ps，1H，H-15)，7.42(s，1H，H-2′)，7.53(d，J＝8Hz，2H，芳香)，7.68(d，J＝8Hz，2H，芳香)實施例7(E)-4-[(3β-羥基-4，4-二甲基-5α-膽甾烷-8，14-二烯-2-亞基)-甲基]芐腈如實施例2所述，156mg的(E)-4-[(3-氧代-4，4-二甲基-5α-膽甾烷-8，14-二烯-2-亞基)-甲基]芐腈在111mg七水氯化鈰存在下用12mg的硼氫化鈉處理，形成93mg白色固體狀的(E)-4-[(3β-羥基-4，4-二甲基-5α-膽甾烷-8，14-二烯-2-亞基)-甲基]芐腈。
1H-NMR(CDCl3)δ＝0.75(s，3H)，0.80(s，3H).0.85(s，3H)，0.87(2xd，J＝7Hz，6H，H-26/27)，0.92(d，J＝7Hz，3H，H-21)，1.18(s，3H)，3.02(d，J＝17Hz，1H，H-1)，3.94(m，1H，H-3)，5.40(ps，1H，H-15)，6.78(s，1H，H-2′)，7.37(d，J＝8Hz，2H，芳香)，7.64(d，J＝8Hz，2H，芳香)實施例 8(E)-N-[[4-[(3β-羥基-4，4-二甲基-5α-膽甾烷-8，14-二烯-2-亞基)-甲基]苯基]甲基]辛酰胺a)(E)-2-(4-氨基甲基-苯基)-亞甲基-4，4-二甲基-5α-膽甾烷-8，14-二烯-3β-醇使27mg的氫化鋁鋰和74mg的(E)-4-[(3β-羥基-4，4-二甲基-5α-膽甾烷-8，14-二烯-2-亞基)-甲基]芐腈在6ml的四氫呋喃中回流4小時。冷卻后，如實施例3b所述處理反應混合物。用乙酸乙酯結晶，得到26mg白色固體狀的(E)-2-(4-氨基甲基-苯基)-亞甲基-4，4-二甲基-5α-膽甾烷-8，14-二烯-3β-醇。
1H-NMR(CDCl3)δ＝0.77(s，3H)，0.82(s，3H)，0.86(2x d，J＝7Hz，6H，H-26/27)，0.89(s，3H)，0.92(d，J＝7Hz，3H，H-21)，1.18(s，3H)，3.15(d，J＝17Hz，1H，H-1)，3.86(s，2H，Ar-CH2-N)，3.92(ps，1H，H-3)，5.38(ps，1H，H-15)，6.72(s，1H，H-2′)，7.26(m，4H，芳香)b)(E)-N-[[4-[(3β-羥基-4，4-二甲基-5α-膽甾烷-8，14-二烯-2-亞基)-甲基]苯基]甲基]辛酰胺將8.6mg的N-羥基琥珀酰亞胺基辛酸酯在1ml二甲基甲酰胺中的溶液于室溫下添加至21mg(E)-2-(4-氨基甲基-苯基)-亞甲基-4，4-二甲基-5α-膽甾烷-8，14-二烯-3β-醇在4ml二甲基甲酰胺中的溶液內。反應混合物攪拌20小時，用水稀釋，然后用乙酸乙酯萃取。
分離有機層，用水洗滌，在無水硫酸鈉上干燥，然后過濾。蒸發溶劑后得到21mg白色固體狀的(E)-N-[[4-[(3β-羥基-4，4-二甲基-5α-膽甾烷-8，14-二烯-2-亞基)-甲基]苯基]甲基]辛酰胺。
1H-NMR(CDCl3)δ＝0.77(s，3H)，0.82(s，3H)，0.86(2x d，J＝7Hz，6H，H-26/27)，0.89(s，3H)，0.92(d，J＝7Hz，3H，H-21)，1.18(s，3H)，3.12(d，J＝17Hz，1H，H-1)，3.92(ps，1H，H-3)，4.44(d，J＝5Hz，2H，Ar-CH2-N)，5.37(ps，1H，H-15)，5.76(t，J＝5Hz，1H，NH)，6.72(s，1H，H-2′)，7.24(m，4H，芳香)實施例9(E)-N-[[4-[(3β-羥基-4，4-二甲基-5α-膽甾烷-8，14-二烯-2-亞基)-甲基]苯基]甲基]-5-(4，4-二氟-5，7-二甲基-4-硼-3a，4a-二氮雜-s-indacen-3-基)戊酰胺5.0mg的5-(4，4-二氟-5，7-二甲基-4-硼-3a，4a-二氮雜-s-indacen-3-基)戊酸琥珀酰亞胺基酯在0.5ml二甲基甲酰胺中的溶液于室溫下添加至8.9g的(E)-2-(4-氨基甲基-苯基)-亞甲基-4，4-二甲基-5α-膽甾烷-8，14-二烯-3β-醇在2ml二甲基甲酰胺中的溶液內。反應混合物攪拌44小時，用水稀釋，然后用乙酸乙酯萃取。分離有機層，用水洗滌，在無水硫酸鈉上干燥，然后過濾。蒸發溶劑后，殘留物用己烷和乙酸乙酯的混合物進行色譜分離，得到6.5mg的(E)-N-[[4-[(3β-羥基-4，4-二甲基-5α-膽甾烷-8，14-二烯-2-亞基)-甲基]苯基]甲基]-5-(4，4-二氟-5，7-二甲基-4-硼-3a，4a-二氮雜-s-indacen-3-基)戊酰胺。
1H-NMR(CDCl3)δ＝0.77(s，3H)，0.82(s，3H)，0.86(2x d，J＝7Hz，6H，H-26/27)，0.89(s，3H)，0.92(d，J＝7Hz，3H，H-21)，1.19(s，3H)，2.25(s，3H，Ar-Me)，2.55(s，3H，Ar-Me)，3.12(d，J＝17Hz，1H，H-1)，3.92(ps，1H，H-3)，4.44(d，J＝5Hz，2H，Ar-CH2-N)，5.37(ps，1H，H-15)，5.87(m，1H，NH)，6.09(s，1H，芳香)，6.30(d，J＝5Hz，1H，芳香)，6.70(s，1H，H-2′)，6.90(d，J＝5Hz，1H，芳香)，7.24(m，4H，芳香)實施例102α-烯丙基-4，4-二甲基-5α-膽甾烷-8，14-二烯-3β-醇a)2α-烯丙基-4，4-二甲基-5α-膽甾烷-8，14-二烯-3-酮在-70℃下將200mg的4，4-二甲基-5α-膽甾烷-8，14-二烯-3-酮在3ml的THF中的溶液滴加在新制的二異丙基酰胺鋰溶液(5.8ml，1M)中。溶液攪拌1小時，然后添加0.07ml的3-碘-丙烯。在0℃下再攪拌1小時后，將反應混合物傾倒在飽和氯化銨溶液中，并用乙酸乙酯萃取。分離有機層，用鹽水洗滌，在無水硫酸鈉上干燥，然后過濾。蒸發溶劑后，殘留物用己烷和乙酸乙酯的混合物進行色譜分離，得到160mg白色固體狀的2α-烯丙基-4，4-二甲基-5α-膽甾烷-8，14-二烯-3-酮。
1H-NMR(CDCl3)δ＝0.82(s，3H)，0.87(2x d，J＝7Hz，6H，H-26/27)，0.93(d，J＝7Hz，3H，H-21)，1.10(2x s，6H)，1.30(s，3H)，2.60(m，1H，烯丙基)，2.77(m，1H，烯丙基)，5.05(m，2H，烯丙基)，5.38(ps，1H，H-15)，5.80(m，1H，烯丙基)b)2α-烯丙基-4，4-二甲基-5α-膽甾烷-8，14-二烯-3β-醇如實施例5所述，160mg的2α-烯丙基-4，4-二甲基-5α-膽甾烷-8，14-二烯-3-酮用55mg的硼氫化鈉處理，得到15mg的2α-烯丙基-4，4-二甲基-5α-膽甾烷-8，14-二烯-3α-醇和80mg的2α-烯丙基-4，4-二甲基-5α-膽甾烷-8，14-二烯-3β-醇2α-烯丙基-4，4-二甲基-5α-膽甾烷-8，14-二烯-3β-醇1H-NMR(CDCl3)δ＝0.81(s，3H)，0.85(s，3H)，0.87(2x d，J＝7Hz，6H，H-26/27)，0.94(d，J＝7Hz，3H，H-21)，1.03(s，3H)，1.05(s，3H)，2.50(m，1H)，2.95(d，J＝11Hz，1H，H-3)，5.06(m，2H，烯丙基)，5.37(ps，1H，H-15)，5.89(m，1H，烯丙基)2α-烯丙基-4，4-二甲基-5α-膽甾烷-8，14-二烯-3α-醇1H-NMR(CDCl3)δ＝0.82(s，3H)，0.87(2x d，J＝7Hz，6H，H-26/27)，0.90(s，3H)，0.94(d，J＝7Hz，3H，H-21)，1.00(s，3H)，1.05(s，3H)，3.36(ps，1H，H-3)，5.05(m，2H，烯丙基)，5.35(ps，1H，H-15)，5.85(m，1H，烯丙基)實施例11在卵母細胞實驗中測試減數分裂活化物質動物由未成熟的體重為13-16克的雌性小鼠(C57B1/6J×DBA/2J F1-雜交，Bomholtgaard，Denmark)得到卵母細胞，所述小鼠在受控的光照和溫度下飼養。小鼠接受腹膜內注射0.2ml的促性腺激素(Gonal F，Serono，Solna，Sweden，包含20 IU FSH，或者，Puregon，Organon，Swords，Ireland，包含20 IU FSH)，48小時后通過頸錯位將動物殺死。卵母細胞的收集和培養剝離出卵巢，使用一對27號針手工破壞卵泡，在立體顯微鏡下于Hx-培養基(見下)中分離卵母細胞。球形的裸卵母細胞(NO)顯示出完整的生發泡(GV)，將其放置在α-最小基本培養基(α-MEM，不含核糖核苷，Gibco BRL，目錄號22561)中，該培養基中添加有3mM的次黃嘌呤(Sigma，目錄號H-9377)、8mg/ml的人血清白蛋白(HAS，State Serum Institute，Denmark)、0.23mM的pyrubate(Sigma，目錄號S-8636)、2mM的谷氨酰胺(Flow目錄號16-801)、100IU/ml的青霉素和100μg/ml的鏈霉素(Flow，目錄號16-700)。該培養基稱為Hx-培養基。卵母細胞在Hx-培養基中淋洗3次，然后在4孔培養板(Nuncion，Denmark)中培養，在各孔中包含0.4ml的Hx-培養基和35-45個卵母細胞。對照(在沒有添加測試化合物的Hx-培養基中培養的卵母細胞35-45個)用測試培養基同時進行，該測試培養基具有不同濃度的待測化合物。
在37℃、100％濕度、5％CO2空氣的條件下進行培養。培養時間為22-24小時。卵母細胞的檢查在培養期結束后，使用立體顯微鏡或者具有微分干涉相差設備的倒置顯微鏡計數具有生發泡(GV)或生發泡碎片(GVB)的卵母細胞以及具有極體(PB)的卵母細胞的數量。在測試培養基中計算總卵母細胞數量中具有GVB的卵母細胞百分比以及總卵母細胞數量中具有PB的卵母細胞的百分比，并與對照培養基相比。實施例12在卵母細胞實驗中測試減數分裂抑制物質使用如實施例11中描述的相同方法(見上)，由經過FSH處理的未成熟的雌性小鼠中得到生發泡(GV)卵母細胞。裸露的卵母細胞(NO)在Hx-培養基中淋洗3次。以前已表明4，4-二甲基-5α-膽甾烷-8，14，24-三烯-3β-醇(FF-MAS)可在體外誘導NO中的減數分裂(Byskov，A.G.等人，Nature 374(1995)559-562)。于4孔培養板(Nunclon，Denmark)中NO在Hx-培養基中培養，該培養基中添加有5μM的FF-MAS，并與不同濃度的測試化合物共同培養，各孔包含0.4ml的Hx-培養基和35-45個卵母細胞。一個正對照(在包含FF-MAS的Hx-培養基中培養的35-45個卵母細胞，其中不添加測試化合物)總是用測試培養基同時進行，該測試培養基中添加有不同濃度的待測試化合物。另外，與正對照同時進行一個負對照(僅在Hx-培養基中培養的35-45個卵母細胞)。卵母細胞的檢查在培養期結束后，使用立體顯微鏡或者具有微分干涉相差設備的倒置顯微鏡計數具有生發泡(GV)或生發泡碎片(GVB)的卵母細胞以及具有極體(PB)的卵母細胞的數量。在測試培養基中計算總卵母細胞數量中具有GVB的卵母細胞百分比以及總卵母細胞數量中具有PB的卵母細胞的百分比，并與對照培養基相比。實施例13在“體外受精實驗”中測試減數分裂活化物質由未成熟的(C57BL/6xDBA/2)F1小鼠(21-24天齡)的卵泡中得到裸露的卵母細胞(NkO)和堆積(cumulus)封閉的卵母細胞(CEO)，所述小鼠已在收集卵母細胞前48小時i.p.接受10 IU Pregnant Mare血清促性腺激素(FSH活性)。
匯集卵母細胞(NkO和CEO)，并在改良的α-MEM培養基中培養約20小時，所述培養基包含3mM的次黃嘌呤(Hx-培養基)和1mg肽球蛋白/ml培養基。使用兩組卵母細胞(a)對照卵母細胞，在無Hx-培養基中培養(正對照組)，以及(b)在包含測試化合物的Hx-培養基中培養的卵母細胞。約20小時后，表現出生發泡碎片(GVB)的卵母細胞在無Hx-培養基中簡單洗滌，然后轉移至預先準備好的受精盤中，該受精盤包括由雄性小鼠的附睪尾(cauda epididymis)得到的能動的精子制劑。所述盤在特定的氣體條件(5％CO2)和37℃下于改良的α-MEM IVF-培養基中培養。受精后20-22小時檢查卵母細胞，以檢查受精情況并記錄2-細胞胚胎的數量。用已分離為2-細胞胚胎的卵母細胞相對于總受精數量來測定受精百分比(＝受精率)。用總共50-200個GVB/PB卵母細胞進行各IVF-實驗。計算包含測試化合物的組中以及對照組中受精率的比例，由此計算刺激系數。
表1在裸露的鼠卵母細胞中減數分裂的活化
Hx＝次黃嘌呤GV＝生發泡GVB＝生發泡碎片PB＝極體n＝卵母細胞數量表2在裸露的鼠卵母細胞中減數分裂的相對抑制作用
Hx＝次黃嘌呤，GV＝生發泡GVB＝生發泡碎片，PB＝極體n＝卵母細胞數量表3在裸露的鼠卵母細胞中減數分裂的相對抑制作用
Hx＝次黃嘌呤，GV＝生發泡GVB＝生發泡碎片，PB＝極體n＝卵母細胞數量
權利要求
1.通式I的化合物或其酯 其中R1代表氫原子、C2-C6烷基、任選經取代的苯基、氰基、CH2-NH-COR1′，或者與R2一起形成另一個鍵，其中R1′是C1-C8烷基或者任選經取代的苯基；R2代表氫原子、C4-C8烷基、C3-C6烯基、C1-C6羥基烷基，與R2′一起形成任選取代的亞芐基，與R2′一起形成羥基亞甲基，或者與R1一起形成另一個鍵；R2′代表氫原子，與R2一起形成任選取代的亞芐基，或者與R2一起形成羥基亞甲基；R3代表氫原子或者與R3′一起形成另一個鍵；R3′代表氫原子或者與R3一起形成另一個鍵；R4代表氫原子或者甲基；R4′代表氫原子或者甲基；R8與R9或者與R14一起形成另一個鍵；R9代表氫原子或者與R8一起形成另一個鍵；R14代表α-氫原子或者與R8一起形成另一個鍵，或者與R15一起形成另一個鍵；R15代表氫原子或者與R14一起形成另一個鍵；R24代表氫原子或者與R25一起形成另一個鍵；R25代表氫原子或者與R24一起形成另一個鍵。其條件是，不包括在1和2位同時未被修飾的化合物R1＝R2＝R2′＝H。
2.如權利要求1所述的化合物，其中R1代表氫原子、苯基或者與R2一起形成另一個鍵。
3.如權利要求1或2所述的化合物，其中R2代表C4-C8烷基、烯丙基或者與R1形成另一個鍵。
4.如權利要求1或2所述的化合物，其中R2和R2′代表任選取代的亞芐基。
5.如權利要求1-4之一所述的化合物，其是2α-烯丙基-4，4-二甲基-5α-膽甾烷-8，14-二烯-3β-醇，(E)-2-亞芐基-4，4-二甲基-5α-膽甾烷-8，14-二烯-3β-醇，5α-膽甾烷-1，8，14-三烯-3β-醇，5α-膽甾烷-1，8，14-三烯-3-酮，1α-氰基-4，4-二甲基-5α-膽甾烷-8，14-二烯-3β-醇，1α-氰基-4，4-二甲基-5α-膽甾烷-8，14-二烯-3-酮，4，4-二甲基-5α-膽甾烷-1，8，14-三烯-3β-醇，4，4-二甲基-5α-膽甾烷-1，8，14-三烯-3-酮，(E)-4-[(3β-羥基-4，4-二甲基-5α-膽甾烷-8，14-二烯-2-亞基)-甲基]芐腈；(E)-N-[[4-[(3β-羥基-4，4-二甲基-5α-膽甾烷-8，14-二烯-2-亞基)-甲基]苯基]甲基]辛酰胺；(E)-N-[[4-[(3β-羥基-4，4-二甲基-5α-膽甾烷-8，14-二烯-2-亞基)-甲基]苯基]甲基]-5-(4，4-二氟-5，7-二甲基-4-硼-3a，4a-二氮雜-s-indacen-3-基)戊酰胺；2α-羥甲基-4，4-二甲基-5α-膽甾烷-8，14-二烯-3α-醇，2α-辛基-4，4-二甲基-5α-膽甾烷-8，14-二烯-3β-醇，以及(E)-4-[(3-氧代-4，4-二甲基-5α-膽甾烷-8，14-二烯-2-亞基)-甲基]芐腈。
6.藥物組合物，其包含一種或多種如權利要求1-5之一所述的通式I化合物作為活性成分。
7.如權利要求1-5之一所述的通式I化合物在制備減數分裂調節藥物中的應用。
8.如權利要求7所述的應用，其是用于制備治療雌性或雄性、優選人的不育癥的藥物。
9.如權利要求7所述的應用，其是用于制備治療雌性或雄性、優選人的避孕藥物。
10.如權利要求1-5之一所述的通式I化合物在調節人工受精過程中的受精率方面的應用。
11.如權利要求1-5之一所述的通式I化合物作為工具物質或者作為用于合成生物成像用工具物質的起始物的應用，所述工具物質是用于鑒別所述通式化合物的作用模式。
12.一種調節減數分裂的方法，其包括向需要此等調節作用的受體給藥有效量的一種或多種如權利要求1-5之一所述的通式I化合物。
13.一種調節哺乳動物生殖細胞中的減數分裂的方法，其包括向需要此等調節作用的生殖細胞活體外或體外給藥有效量的一種或多種如權利要求1-5之一所述的通式I化合物。
14.如權利要求13所述的方法，其中生殖細胞是卵母細胞或雄性生殖細胞。
全文摘要
本發明涉及藥物活性的不飽和膽甾烷衍生物,包含這些衍生物作為活性物質的藥物組合物,以及這些新的化合物在制備藥物中的應用。更具體而言,已發現本發明的不飽和膽甾烷衍生物可用于調節減數分裂。
文檔編號A61P15/08GK1368977SQ00803662
公開日2002年9月11日 申請日期2000年2月9日 優先權日1999年2月10日
發明者托爾斯滕·布盧姆, 彼得·埃斯佩林, 約阿希姆·庫恩克, 赫麗斯塔·黑格勒－哈通, 莫尼卡·萊瑟 申請人:舍林股份公司