吲哚衍生物及其作為mcp－1拮抗劑的用途的制作方法

專利名稱：吲哚衍生物及其作為mcp－1拮抗劑的用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及消炎化合物，它通過CCR2受體，(也即MCP-1受體)，的拮抗作用發生效用，導致對尤其是單核細胞化學吸引劑蛋白-1(MCP-1)的抑制。這些化合物都含有吲哚部分。本發明涉及含有它們的藥物組合物，其制備方法，制備中有用的中間體和將其作為治療制劑的用途。
MCP-1是傳遞白血球趨化性和活性的促炎癥蛋白的趨化因子家族中的一員。MCP-1為C-C的趨化因子，它是一種最強和選擇性的T細胞之一，還是已知的單核細胞化學吸引劑和活化劑。大量炎癥疾病的病理生理學都涉及到MCP-1，這些疾病包括類風濕性關節炎、腎小球腎炎、肺纖維變性、再狹窄(國際專利申請W094/09128)、牙槽炎(Jones等人，1992，J.Immunol.，149，2147)和哮喘。病理學上認為MCP-1能起作用的疾病包括動脈粥樣硬化(例如Koch等人，1992，J.Clin.Invest.，90，772-779)、牛皮癬(Deleuran等人，1996，J.Dermatological Science，13，228-236)、皮膚延遲過敏反應、炎性腸疾病(Berman等人，1996，J.Leukocyte Biol.，59，804-812)、多發性硬化和腦外傷(Berman等，1996，J.Immunol.，156，3017-3023)。MCP-1抑制劑對中風、再灌注損傷、局部缺血、心肌梗塞和移植排斥也有作用。
MCP-1通過CCR2受體起作用。通過該受體MCP-2和MCP-3也起作用，至少是部分作用。因此在本說明書中，提到“MCP-1的抑制或拮抗作用”或“MCP-1介導的作用”時，這包括MCP-2和/或MCP-3的抑制或拮抗作用、MCP-2和/或MCP-3通過CCR2受體起作用時介導的作用。
本申請人發現了一系列含吲哚部分化合物，都對MCP-1具有抑制活性。共同未決申請UK9716657.3公開了一系列有MCP-1抑制活性的吲哚。本申請是基于我們驚訝地發現特殊取代的5-羥基吲哚是MCP-1的抑制劑，它在效力和/或血濃度和/或生物有效性和/或溶解性上有驚人的優異性質。
因此，本發明提供式(I)化合物或其藥用允許的鹽或前藥 其中R1是氫原子、鹵素或甲氧基；R2是氫原子、鹵素、甲基、乙基或甲氧基；R3是羧基、四唑基或-CONHSO2R4，其中R4是甲基、乙基、苯基、2，5-二甲基異噁唑基或三氟甲基；T是-CH2-或-SO2-；和環A是3-氯苯基、4-氯苯基、3-三氟甲基苯基、3，4-二氯苯基、3，4-二氟苯基、3-氟-4-氯苯基、3-氯-4-氟苯基或2，3-二氯吡啶-5-基。
本說明書中，術語“烷基”包括直鏈和支鏈烷基，但提及如“丙基”這樣的具體烷基時僅特指直鏈類。術語“鹵素”指氟、氯、溴和碘。
本發明的特別新型化合物包括，例如，式(I)化合物、或其藥用允許的鹽或前藥，其中，除非特別說明a)R1含有隨后i)-iii)定義的任意一種內容或其中兩種的組合；b)R2含有隨后iv)-viii)定義的任意一種內容或其中兩種的組合；c)R3含有隨后ix)-xi)定義的任意一種內容或其中兩種的組合；e)T含有隨后xii)-xiii)定義的任意一種內容；f)環A含有隨后xiv)-xxi)定義的任意一種內容或其中兩種或多種的組合；i)R1是氫原子；ii)R1是鹵素；iii)R1是甲氧基；iv)R2是氫原子；v)R2是鹵素；vi)R2是甲基；vii)R2是乙基；viii)R2是甲氧基；ix)R3是羧基；x)R3是四唑基；xi)R3是-CONHSO2R4，其中R4是甲基、乙基、苯基、2，5-二甲基異噁唑基或三氟甲基；xii)T是-CH2-；xiii)T是-SO2-；xiv)環A是3-氯苯基；xv)環A是4-氯苯基；xvi)環A是3-三氟甲基苯基；xvii)環A是3，4-二氯苯基；xviii)環A是3，4-二氟苯基；xix)環A是3-氟-4-氯苯基；xx)環A是3-氯-4-氟苯基；xxi)環A是2，3-二氯吡啶-5-基。
優選R1是氫原子。
優選R2是氫原子。
優選R3是羧基。
優選T是-CH2-。
優選環A是3-氯苯基、4-氯苯基、3-三氟甲基苯基、3，4-二氯苯基、3，4-二氟苯基、3-氟-4-氯苯基或3-氯-4-氟苯基。
更優選環A是3，4-二氯苯基、3-氟-4-氯苯基或3-氯-4-氟苯基。
例如，環A是3，4-二氯苯基或3-氯-4-氟苯基。
另一方面，本發明優選環A是3，4-二氯苯基、2，3-二氯吡啶-5-基或3-氯-4-氟苯基。
因而，在本發明的優選方面，提供上述式(I)化合物或其藥用允許的鹽或前藥，其中R1是氫原子；
R2是氫原子；R3是羧基；T是-CH2-；環A是3，4-二氯苯基、3-氟-4-氯苯基或3-氯-4-氟苯基，特別是3，4-二氯苯基或3-氯-4-氟苯基。
本發明優選的化合物包括各實施例中的任意一種。本發明更優選實施例1、3和4，例如實施例1和3的化合物。
本發明進一步涉及式(I)化合物的各種互變異構形式。
應理解式(I)的某些化合物可以溶劑化也可以非溶劑化形式存在，例如含水形式。還應理解本發明包含所有這些溶劑化形式。
式(I)化合物是單核細胞化學吸引劑蛋白-1的抑制劑。另外，它表現出抑制RANTES誘導的趨化性。RANTES(活化后調節的，由正常T細胞表達和分泌的因子)是與MCP-1同一家族的另一種趨化因子，有與之相似的生物物理特性，但通過CCR1受體起作用。因此，這些化合物可用于治療由這些制劑傳遞的疾病，特別是炎癥。
式(I)化合物的適宜的藥用允許的鹽包括堿加成鹽如堿金屬鹽例如鈉；堿土金屬鹽例如鈣或鎂；有機胺鹽例如三乙胺、嗎啉、N-甲基哌啶、N-乙基哌啶、普魯卡因、二芐胺、N，N-二芐基乙胺或氨基酸例如賴氨酸。另一方面，當化合物堿性充分時，適用的鹽包括酸加成鹽如甲磺酸鹽、富馬酸鹽、氫氯酸鹽、氫溴酸鹽、檸檬酸鹽、馬來酸鹽和與磷酸和硫酸形成的鹽。根據電荷作用和陽離子或陰離子的價態，可有不止一種陽離子或陰離子。優選的藥用允許的鹽為鈉鹽。
各種形式的前藥在本技術領域中是公知的。所述前藥衍生物的例子，見a)《前藥設計》，H.Bundgaard編，(Elsevier，1985)和《酶方法》，卷42，309-396頁，K.Widder等編，(Academic Press，1985)；b)《藥物設計及發展教材》，Krogsgaard-Larsen和H.Bundgaard編，第5章“前藥設計及應用”，H.Bundgaard著，113-191頁(1991)；c)H.Bundgaard，高級藥物轉運回顧，8，1-38，(1992)；d)H.Bundgaard等，制藥科學學報，77,285(1988)；e)N.Kakeya等，制藥化學公報，32,692(1984)。
所述前藥的例子是在體內可裂解的本發明化合物的酯類。含有羧基的在體內可裂解的本發明化合物的酯類是，例如，在人或動物體內裂解形成母酸的藥用允許的酯類。產生羧基適用的藥用允許的酯包括C1-6烷基酯，例如甲酯或乙酯；C1-6烷氧甲基酯，例如甲氧基甲酯；C1-6烷酰氧基甲基酯，例如新戊酰氧基甲酯；2-苯并[c]呋喃酮基酯；C3-8環烷氧基羰基氧C1-6烷基酯，例如環己基羰基氧乙酯；1，3-二氧戊環-2-基甲基酯，例如5-甲基-1，3-二氧戊環-2-基甲酯；C1-6烷氧基羰基氧乙基酯，例如甲氧基羰基氧乙基酯；氨羰基甲基酯和其單、雙-N-(C1-6烷基)酯類，例如N，N-二甲基氨羰基甲基酯和N-乙基氨羰基甲基酯；并可以在本發明化合物中任何羧基上形成酯。含有羥基的在體內可裂解的本發明化合物的酯類是，例如，在人或動物體內裂解形成母羥基的酯。產生羥基適用的藥用允許的酯包括C1-6烷酰基酯，例如乙酰基酯；以及苯甲酰基酯，其中苯基可被氨甲基或N-取代的單-或二-C1-6烷基氨甲基取代，例如4-氨基甲基苯甲酰基酯和4-N，N-二甲基氨甲基苯甲酰基酯。
所述前藥的另一例子是在體內可裂解的本發明化合物的酰胺類。此類在體內可裂解的酰胺的例子包括N-C1-6烷基酰胺和N，N-二(C1-6烷基)酰胺，如N-甲基、N-乙基、N-丙基、N，N-二甲基、N-乙基-N-甲基或N，N-二乙酰胺。
本發明的另一方面提供制備式(I)化合物或其藥用允許的鹽或前藥的方法，該方法(其中除非特別說明，R1、R2、R3、T和環A如式(I)定義)包括a)將式(II)化合物 其中Ra是R3或被保護的R3，Rb是氫原子或適宜的羥基保護基團，與式(III)化合物反應 其中L是可置換基團；然后，如果需要i)將一種式(I)化合物轉化為另式(I)化合物；ii)除去所有保護基團；iii)形成藥用允許的鹽或前藥；L適用的基團為例如，鹵代或磺酰氧基團，例如氯、溴、甲磺酰氧基或甲苯-4-磺酰氧基團。
上述反應的特殊反應條件如下a)式(II)、(III)化合物可在惰性溶劑和堿中一起反應，如N，N-二甲基甲酰胺/氫化鈉或二氯甲烷/氫氧化鈉或乙腈/碳酸鉀，或者在相轉移催化劑如硫酸氫四正丁銨存在下進行。反應適宜進行1-6小時，優選1-3小時；溫度15-30℃，優選20-25℃，以獲得式(I)化合物。
式(II)化合物可由市場購得；或用公知制備方法由市場購得的式(II)化合物進行修飾制得；或由下述方法制備方法i)將式(IV)化合物 其中Rb的定義如上，與式(V)化合物反應 其中Rc是C1-4烷基。
式(IV)和(V)化合物在Reissert反應條件下進行，如在惰性溶劑(如四氫呋喃)中；在堿(如乙醇鉀)存在下；溫度在15-30℃范圍內，優選20-25℃；反應10-20小時，優選15-17小時。分離所得化合物，溶解于醇如乙醇和有機酸(如乙酸)中，加入過渡金屬催化劑(如10％Pd/C)和環己烯。混合物在60-120℃優選70-90℃下加熱15-25小時優選16-20小時，得到式(II)化合物，其中Ra是-CO2C1-4烷基。方法ii)將式(VI)化合物 其中Rb的定義如上，與式(VII)化合物反應 其中Rd是C1-4烷基。
式(VI)和(VII)化合物在Fischer反應條件下進行，例如同有機酸(如乙酸)一起，在醇(如乙醇)中；溫度60-90℃，優選75-85℃；反應1-5小時，優選1-3小時。所得化合物與強酸(如多磷酸)混合并在90-150℃優選100-120℃下加熱0.5-4小時優選0.5-2小時，得到式(II)化合物，其中R2是氫原子。然后，如果需要，可以用下述在本技術領域中公知的方法將R2任意選擇地轉化為式(I)中定義的其它類型的R2。方法iii)式(VII)化合物的環化 其中R1、Ra、Rb和R2的定義如上。
化合物在有機溶劑如二甲苯中的回流可產生環化反應。制備式(VIII)化合物適宜將式(IX)化合物 其中R1、R2和Rb的定義如上，與式(X)化合物反應 其中Ra的定義如上。反應適宜在有機溶劑如醇，特別是甲醇中，在堿如堿金屬醇鹽，特別是甲醇鈉存在下實現。應采用適當的溫度，-30-20℃。方法iv)在進一步的修飾中，將式(XI)化合物環化可制備式(II)化合物 其中R1和Rb的定義如上；R7為烷基，如甲基；以及R8為羧基保護基團，如烷基，特別是甲基。
環化反應適宜在Klingemann反應條件下實現，通過在有機溶劑如甲苯和適當的酸如對甲苯磺酸中加熱所述化合物的溶液。
制備式(XI)化合物適宜將式(XII)化合物 其中，R1、Rb、R5和R6的定義如上，與式(XIII)化合物反應 其中R7和R8的定義如式(XI)。在亞硝酸鹽如亞硝酸鈉存在下，在適當低溫-30-0℃，優選-5℃下，將式(XII)化合物溶解在稀酸如1.5N HCl中。
然后，在堿溶液如堿金屬氫氧化物，例如氫氧化鈉水溶液存在下，該溶液與式(XIII)化合物混合于有機溶劑如乙醇中。
式(III)、(IV)、(V)、(VI)、(VII)、(VIII)、(X)、(XII)和(XIII)化合物是公知的或可由市場購買或用本技術領域中公知的方法對市場購買的或公知的材料進行標準操作來制備。
Rc和Rd是C1-4烷基，優選Rc和Rd是甲基或乙基。
這里所述的某些反應中，有必要/希望保護化合物的所有敏感基團，這是可以理解的。在哪里必須或希望進行基團保護以及適用的保護方法的例子是該技術領域中的技術人員所公知的。因此，這里所述的某些反應中，如果反應物包括如羧基或羥基等基團，可能就希望保護這些基團。
適宜的羥基保護基團為，例如，酰基，例如烷酰基如乙酰基；芳酰基，例如苯甲酰基，或者芳甲基，例如芐基。根據所選保護基團不同，上述保護基團的脫保護方法必然不同。因此，例如，酰基如烷酰基或芳酰基可以例如通過，用適宜的堿如堿金屬氫氧化物，比如氫氧化鈉或氫氧化鋰水解脫去。或者芳甲基如芐基可以通過，例如，用催化劑如鈀碳氫化脫去。
適宜的羧基保護基團為，例如酯化基團，比如甲基或乙基，它可通過例如用堿如氫氧化鈉水解脫去；或者例如叔丁基，它可通過例如用酸處理脫去，比如有機酸如三氟乙酸；或者例如芐基，它可通過例如用催化劑如鈀碳氫化脫去。
用化學技術領域公知技術可在合成的任意適宜階段將保護基團脫去。
這里所述的某些中間體可能是新型的，例如式(II)的中間體，因此它們給本發明提供了新的特征。
當需要式(I)化合物的藥用允許的鹽時，可以通過例如將所述化合物與適當的酸(它提供生理學允許的陰離子)，或與適當的堿(它提供生理學允許的陽離子)反應，或通過任何適宜的成鹽步驟得到。
另一方面，本發明提供了一種藥用組合物，它含有如前所定義的式(I)化合物或其藥用允許的鹽或前藥，以及藥用允許的賦形劑或載體。
本發明的組合物的形式可以適于口服(例如作片劑、錠劑、硬或軟膠囊、水或油懸浮液、乳液、可分散粉末或顆粒、糖漿或酏劑)；用于局部涂敷(例如霜、膏、膠、或水或油的溶液或懸浮液)；用于吸入給藥(例如作分得很細的粉末或液體的噴霧劑)；用于吹入給藥(例如作分得很細的粉末)或非腸道給藥(例如作靜脈、皮下、肌內用的無菌水或油溶液、肌內用藥或作栓劑用于直腸用藥)。
本發明的組合物可通過采用普通的制藥賦形劑應用傳統步驟獲得，這在本技術領域中是公知的。因此，用于口服的組合物可含有，例如，一種或多種著色劑、甜味劑、矯味劑和/或防腐劑。
用于片劑的適宜的藥用允許的賦形劑包括，例如惰性稀釋劑如乳糖、碳酸鈉、磷酸鈣或碳酸鈣；成粒劑和崩解劑如玉米淀粉或藻酸；粘合劑如淀粉；潤滑劑如硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石粉；防腐劑如對-羥基苯甲酸乙酯或丙酯和抗氧化劑如抗壞血酸。片劑可以有包衣也可不包衣以調節其崩解及隨后活性成分在腸道內的吸收，或提高其穩定性和/或外觀，在各種情況下，可選用在本技術領域中公知的普通包衣劑和步驟。
口服組合物可以作成硬明膠膠囊形式，其活性組分是與惰性固體稀釋劑混合，例如碳酸鈣、磷酸鈣或高嶺土；也可以作成軟明膠膠囊形式，其活性組分與水或油如花生油、液體石蠟或橄欖油混合。
水懸浮液通常含有分得很細的活性成分，以及一種或多種助懸劑，例如羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、藻酸鈉、聚乙烯基吡咯烷酮、黃蓍樹膠和阿拉伯樹膠。分散劑或潤濕劑如卵磷脂或環氧烷與脂肪酸的縮合產物(例如聚氧乙烯基硬脂酸酯)；或環氧丙烷與長鏈脂肪醇的縮合產物，比如十七乙烯氧基十六醇；或環氧丙烷與由脂肪酸和己糖醇形成的部分酯的縮合產物，如聚氧乙烯基山梨醇單油酸酯；或環氧丙烷與長鏈脂肪醇的縮合產物，比如十七乙烯氧基十六醇；或環氧丙烷與由脂肪酸和己糖醇形成的部分酯的縮合產物，如聚氧乙烯基山梨醇單油酸酯；或環氧丙烷與由脂肪酸和脫水己糖醇形成的部分酯的縮合產物，如聚氧乙烯基脫水山梨醇單油酸酯。水懸浮液可能還含有一種或多種防腐劑(如對-羥基苯甲酸乙酯或丙酯，抗氧化劑(如抗壞血酸)，著色劑、矯味劑和/或甜味劑(如蔗糖、糖精或天冬甜素)。
油懸浮液可以將活性組分懸浮于植物油(如花生油、橄欖油、芝麻油或椰子油)或礦物油(如液體石蠟)中制得。油懸浮液可能含增稠劑，如蜂蠟、固體石蠟或十六烷醇。甜味劑用上述那些，還可加入矯味劑以提供可口的口服成藥。這些組合物可通過加入抗氧化劑如抗壞血酸進行保存。
通過加水來制備水懸浮液的可分散粉末與顆粒通常含有活性組分以及分散和潤濕劑、助懸劑和一種或多種防腐劑。適宜的分散或潤濕劑和助懸劑在上述說明中已有例證。也可能含有附加賦形劑如甜味劑、矯味劑和著色劑。
本發明的藥用組合物也可能是水包油乳液形式。油相可是植物油，如橄欖油或花生油；或者礦物油，例如液體石蠟；或者它們的混合物。適宜的乳化劑可以是，例如，天然樹膠如阿拉伯樹膠或黃蓍樹膠，天然磷脂如大豆、卵磷脂、脂肪酸和脫水己糖醇形成的酯或部分酯(如脫水山梨醇單油酸酯)和所述部分酯產物與環氧丙烷的縮合產物如聚氧乙烯基脫水山梨醇單油酸酯。乳液可能還含有甜味劑、矯味劑和防腐劑。
糖漿和酏劑由甜味劑如甘油、丙二醇、山梨醇、天冬甜素或蔗糖制得，可能還含有刺激緩和劑、防腐劑、矯味劑和/或著色劑。
所述藥用組合物也可能是注射用無菌水或油懸浮液形式，它是根據已知方法用上述的一種或多種適宜的分散劑或潤濕劑和助懸劑制得。注射用無菌制劑是在注射用藥所允許的無毒稀釋劑或溶劑中的注射用無菌溶液或懸浮液，例如1，3-丁二醇溶液。
栓劑配方可以將活性組分與無刺激賦形劑混合制成，該賦形劑在常溫下為固態，而在直腸溫度下為液態因此融化在直腸中釋放出藥物。適宜的賦形劑是，例如可可脂和聚乙二醇。
局部涂敷配方，例如霜、膏、膠、或水或油的溶液或懸浮液，通常將活性組分與普通的局部涂敷允許的賦形劑或稀釋劑，用本技術領域中公知的方法配制而得。
吹入給藥的組合物可以是分得很細的粉末的形式，該粉末含平均粒徑例如30μ或更小的微粒，粉末本身含有活性組分或者用一種或多種生理學允許的載體如乳糖稀釋的活性組分。然后，吹入粉末儲存在膠囊中，含有例如1-50mg活性組分以便同壓力吸入器裝置，如用于吹入已知藥劑色甘酸鈉的裝置一起使用。
吸入給藥的組合物可以是普通加壓噴霧劑的形式，它可將活性組分分散成含有分得很細的固體的氣溶膠或小液滴。可應用常用的噴霧劑拋射劑如揮發氟化烴或烴，噴霧裝置常被安排成可以分散一定計量的活性組分。
關于配方的進一步信息，讀者可參考《綜合醫藥化學》卷5，第25.2章(Corwin Hansch；Chairman of Editorial Board)，PergamonPress1990。
活性組分與一種或多種賦形劑組合形成單獨劑量形式，根據所治宿主和特殊給藥方法的不同，活性組分的量必然不同。例如，用于人類口服給藥的配方通常含有，例如0.5mg-2g的活性組分，以及適宜的和適量的賦形劑，它可以在總組合物重量的約5％至約98％間變化。單位劑量形式通常含有約1mg至約500mg的活性組分。關于給藥方法和劑量狀況的進一步信息，讀者可參考《綜合醫藥化學》卷5，第25.2章(Corwin Hansch；Chairman of Editorial Board)，PergamonPress 1990。
根據公知的醫藥原理，根據病癥的性質和嚴重程度、動物或病人的年齡和性別以及給藥途徑的情況，用于治療或預防用途的式(I)化合物劑量的大小必然有變化。如上所述，式(I)化合物在處理全部或部分由于老鼠的法呢基化產生的疾病或醫療情況時是有用的。
在將式(I)化合物用于治療或預防用途時，它通常被給藥成日劑量在每公斤體重接受0.5mg至75mg范圍內，如果需要可按分開的劑量給藥。應用注射方法時通常給藥較低的劑量。因此，例如靜脈注射時，通常選用每公斤體重例如0.5mg至30mg的劑量范圍。類似的，吸入給藥時選用每公斤體重例如0.5mg至25mg的劑量范圍。但是更優選口服給藥。
另一方面，本發明提供式(I)化合物及其藥用允許的鹽或前藥，如前所定義，應用于人體或動物的治療方法。如上所述，本發明順便提供一種將式(I)化合物及其藥用允許的鹽或前藥給藥用于治療炎癥的方法。
本發明的另一個特征是式(I)化合物及其藥用允許的鹽或前藥作為藥物的用途。
這是式(I)化合物及其藥用允許的鹽或前藥作為醫藥的用途，用于溫血動物如人抵抗MCP-1介導的作用。
因此，本發明的另一個方面是提供式(I)化合物及其藥用允許的鹽或前藥的應用，用于生產為溫血動物如人抵抗由MCP-1介導作用的藥物。
因此，本發明的另一個方面是提供用于溫血動物如人抵抗由MCP-1介導的作用的方法，該治療方法包括給所述動物使用有效量的如前所述的式(I)化合物及其藥用允許的鹽或前藥。生物測試隨后的生物測試方法、數據和例子用于說明本發明。縮寫ATCC 美國模式培養物保藏所，Rockville，USABCA Bicinchroninic acid(與硫酸銅一起用于分析蛋白質)BSA 牛血清白蛋白DMEM 達爾伯克氏改良伊格爾培養基EGTA 乙基雙(氧亞乙基次氮基)四乙酸FCS 胎牛血清HEPESN-(2-羥乙基)哌嗪-N’-(2-乙磺酸)HBSS 漢克氏平衡鹽溶液hMCP-1 人單核細胞化學吸引劑蛋白-1PBS 磷酸緩沖生理鹽水PCR 聚合酶鏈反應AMPLITAQTM，從Perkin-Elmer Cetus獲得，用作熱穩定DNA聚合酶的來源。
結合緩沖劑(Binding Buffer)為50mM HEPES、1Mm CaCl2、5MmMgCl2、0.5％胎牛血清，用1M NaOH調到pH7.2。
非必需氨基酸(100×濃縮物)為L-丙氨酸，890mg/l；L-天冬酰胺，1320mg/l；L-天冬氨酸，1330mg/l；L-谷氨酸，1470mg/l；甘氨酸，750mg/l；L-脯氨酸，1150mg/l和L-絲氨酸，1050mg/l。
次黃嘌呤和胸苷補體(50×濃縮物)為次黃嘌呤，680mg/l和胸苷，194mg/l。
青霉素-鏈霉素青霉素G(鈉鹽)，5000單位/毫升；硫酸鏈霉素，5000μg/ml。
人體單核細胞系THP-1細胞從ATCC獲得，批號ATCC TIB-202。
漢克氏平衡鹽溶液(HBSS)從Gibco獲得；見Proc.Sco.Exp.Biol.Med.，1949，71，196。
合成細胞培養基，RPMI 1640從Gibco獲得，它含有無機鹽[Ca(NO3)2·4H2O，100mg/l；KCl，400mg/l；MgSO4·7H2O，100mg/l；NaCl，6000mg/l；NaHCO3，2000mg/l和Na2HPO4(無水)，800mg/l]；D-葡萄糖，2000mg/l；還原谷光甘肽1mg/l；氨基酸和維生素。
FURA-2/AM為1-[2-(5-羧基噁唑-2-基)-6-氨基苯并呋喃-5-氧基]-2-(2’-氨基-5’-甲基苯氧基)-乙烷-N，N，N’，N’-四乙酸五乙酰氧基甲酯，從Molecular Probes，Eugene，Oregon，USA得到。
血液緩沖液含有8.5g/lNaCl和10g/l羥乙基纖維素。
細胞溶解緩沖溶液為0.15M NH4Cl，10mM KHCO3，1mM EDTA。
全細胞結合緩沖液為50mM HEPES，1mM CaCl2，5mM MgCl2，0.5％BSA，0.01％NaN3，用1M NaOH調到pH7.2。
清洗緩沖液為50mM HEPES，1mM CaCl2，5mM MgCl2，0.5％加熱滅活的FCS，0.5MNaCl，用1M NaOH調到pH7.2。
普通分子生物操作可按照《分子克隆-實驗手冊)》第二版，Sambrook，Fritsch and Maniatis(Cold Spring HarborLaboratory，1989)所述的任何方法進行。i)hMCP-1受體的克隆與表達以公布的MCP-1受體序列(Charo等人，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，91，2752)為基礎，采用適宜的低聚合苷酸引物用PCR從THP-1細胞RNA復制出MCP-1受體B(CCR2B)cDNA。產生的PCR產物復制到載體PCR-IITM上(InVitrogen，San Diego，CA.)。無誤的CCR2B cDNA作為Hind III-Not I片段復制到真核生物表達載體pCDNA3(In Vitrogen)上，分別產生pCDNA3/CC-CKR2A和pCDNA3/CCR2B。
用磷酸鈣沉淀物將線形pCDNA3/CCR2B轉染入CHO-K1細胞(Wigler等人，1979，細胞，16，777)。細胞轉染24小時后，加入遺傳霉素硫酸鹽(G418，Gibco BRL)1mg/ml選出已轉染的細胞。如上述進行RNA的制備和Northern印跡(Needham等人，1995，Prot.Exprss.Purific.，6，134)。CHO-K1克隆7(CHO-CCR2B)確定為最佳的MCP-1受體B的表達劑。ii)膜碎片的制備CHO-CCR2B細胞在DMEM中生長，并補加10％胎牛血清，2mM谷酰胺，1倍非必須氨基酸，1倍次黃嘌呤和胸苷補體和青霉素-鏈霉素(50μg/ml硫酸鏈霉素，Gibco BRL)。用如上所述的細胞溶解/差速離心法制備膜碎片(Siciliano等人，1990，J.Biol.Chem.，265，19658)。根據操作指南，用BCA蛋白質分析儀估計蛋白質濃度(Pierce，Rockford，Illinois)。iii)分析聯和應用Bolton和Hunter制備碘125MCP-1(Bolton等人，1973，Biochem.J.，133，529；Amersham International plc.)。用Ernst等人，1994，J.Immunol.，152，3541的方法進行平衡結合分析。簡言之，在100μl結合緩沖液中，不同量的125碘標記的MCP-1加入7μg純CHO-CCR2B細胞膜。在室溫下培養1小時后，過濾結合反應混合物，通過滴定盤清洗器(Brandel MLR-96T Cell Harvester)用冰冷的結合緩沖冰液清洗5遍。濾墊(Brandel GF/B)在使用前在0.3％聚乙烯亞胺中預先浸漬60分鐘。過濾后各濾器分別放在3.5ml試管內(Sastedt No.55484)，測出結合的125碘標記的MCP-1(LKB1277Gammaaster)。如上所述，將100pM125碘標記的MCP-1放入不同濃度的未標記的MCP-1進行冷競爭研究。在反應中用過量200倍的未標記MCP-1夾雜物來確定非特異性結合。
與由CHO-CCR2B細胞制備的膜碎片一起的配體結合研究，顯示CCR2B受體存在濃度0.2pmoles/mg膜蛋白質，并且與MCP-1選擇結合，具有高的親和力(IC50＝110pM，Kd＝120pM)。與膜的結合是完全可逆的，在室溫下45分鐘后達到平衡，當MCP-1用量在100pM至500pM之間時，MCP-1的結合與CHO-CCR2B之間存在線性關系。
用八點劑量響應曲線檢測溶解于DMSO(5μl)的被檢化合物，該化合物在濃度范圍(0.01-50μM)內與100pM標記的MCP-1發生競爭，實驗一式兩份，并計算IC50濃度。
這里所述的hMCP-1受體結合分析中，本發明檢測的化合物IC50值為50μM或小一些。b)MCP-1在THP-1細胞中傳遞鈣流人體單核細胞系THP-1培養在合成細胞培養基RPMI1640中，并補充10％胎牛血清，6mM谷酰胺和青霉素-鏈霉素(50μg/ml硫酸鏈霉素，Gibco BRL)。THP-1細胞在HBSS(缺乏Ca2+和Mg2+)+1mg/mlBSA中清洗，并再次懸浮于同樣的緩沖液中，密度為3×106細胞/ml。在37℃，然后使這些細胞負荷1mM FURA-2/AM 30分鐘，在HBSS中清洗兩次，再次懸浮到1×106細胞/ml。將THP-1細胞懸浮液加入5ml一次性比色杯中，其中有磁力攪拌棒和2.1ml預熱(37℃)的含1mg/mlBSA、1mM MgCl2和2mM CaCl2的HBSS。比色杯在37℃攪拌預培養4分鐘，放入熒光分光光度計中(Perkin Elmer，Norwalk，CT)。記錄70秒內的熒光，10秒鐘后向比色杯加入hMCP-1刺激這些細胞。在340nm或380nm激發，隨后在510nm測量發射熒光強度，測得[Ca2+]i。計算在340nm和380nm激發的發射熒光強度比值，R，根據方程式給出和估計細胞質的[Ca2+]。
i=Kd(R-Rmin)(Sf2/Sb2)(Rmax-R)其中，37℃時FURA-2 Ca2+配合物的Kd在224nm獲得。Rmax是加入10mM離子霉素后測得的最大熒光比，Rmin是隨后加入含有5mM EGTA的去Ca2+溶液后測得的最小熒光比，Sf2/Sb2為380nm激發分別在Rmax和Rmin測得的熒光值的比。
用hMCP-1刺激THP-1細胞導致在特效和劑量依賴方式上[Ca2+]i快速而短暫的上升。劑量反應曲線顯示2nm的EC50近似值。被檢化合物溶解于DMSO(10μl)，它用于抑制鈣的釋放的，分析時要在加入配體10秒鐘前將它加入細胞懸浮液，并測量[Ca2+]i的瞬間上升中的減少量。檢測發現被檢化合物替代hMCP-1時缺少刺激活性。c)hMCP-1和RANTES介導的趨化性進行體外趨化性分析是利用人體單核細胞系THP-1。移過聚碳酸酯膜的細胞可以直接用Coulter計數器計算獲得，或間接用比色耐久性分析測量線粒體呼吸作用鏈分解的四唑鎓鹽(Scudiero D.A.等人，1988，Cancer Res.，48，4827-4833)。
化學吸引劑加入96井微量滴定盤，滴定盤形成趨化性室的低井，其中按操作手冊裝有5μm孔徑的無PVP聚碳酸酯膠粘劑，該膠粘劑用濾膜(NeuroProbe MB Series，Cabin John，MD20818，USA)框住。化學吸引劑在合成細胞培養基，RPMI1640(Gibco)中適當稀釋，補充2mM谷酰胺和0.5％BSA，也可選擇補充含有Ca2+和Mg2+不含酚紅(Gibco)的HBSS加0.1％BSA。各稀釋液真空脫氣30分鐘并放(400μl)在該室的低井中，在上室的各井中培養THP-1細胞(在100μlRPMI 1640+0.5％BSA中有5×105)。為抑制趨化性，化學吸引劑維持恒定事先確定的較大濃度(1nM MCP-1)，將其與溶解在DMSO(DMSO最終濃度＜0.05％V/V)的不同濃度的被檢化合物一起加入低井。37℃該室在5％CO2中培養2小時。從上井中除去培養基，然后在打開該室前用200μl生理鹽水清洗上井，擦干膜表面，以600g離心96滴定盤5分鐘收獲細胞。吸出上清液(150μl)，向井中加入10μl細胞增殖劑，WST-1，4-[3-(4-碘苯基)-2-(4-硝基苯基)-2H-5-四唑]-1，3-苯基二磺酸酯以及電子偶合試劑(Boehringer Mannheim，Cat.No.1644807)。滴定盤在37℃培養3小時，所吸收的可溶甲產物從微量滴定盤的讀數器上在450nm讀取。數據輸入擴展表，糾正沒有化學吸引劑時的所有隨機偏離，算出平均吸收值、均值標準誤差和有效測試值。hMCP-1導致濃度對細胞轉移有依賴，其特點是雙相響應，最大為0.5-1.0nm。
上述分析的備選方式中，可用熒光標記的細胞以有助于終點的確定。這種情況下，在5mM Calcein AM(甘氨酸，N，N’-[[3’，6’-二(乙酰氧基)-3-氧代螺[異苯并呋喃-1(3H)，9’-[9H] 咕噸]-2’，7’-二基]二(亞甲基)二[N-[2-[(乙酰氧基)甲氧基]-2-氧代乙基]]-二(乙酰氧基)甲基]酯，Molecular Probes)存在下，在黑暗中培養45分鐘將THP-1細胞用熒光標記。離心收獲這些細胞并再懸浮于含Ca2+和Mg2+(不含酚紅)的HBSS和0.1％BSA。同上，將50μl(2×105細胞)細胞懸浮液放在各井的濾器上，在37℃下、5％CO2中培養2小時。培養結束時，用磷酸緩沖生理鹽水將細胞從濾器上表面洗下，從滴定盤移走濾器，粘在濾器下部或低井的細胞數可讀取485nm處激發、538nm發射波長(fmax，Molecular Devices)的熒光進行估計。數據輸入擴展表，糾正沒有化學吸引劑時的所有隨機偏離，算出平均熒光值、均值標準誤差、抑制百分數和被檢化合物的IC50值和顯著測試值。除了MCP-1誘導的趨化性，該分析備選方案也可用于測定對RANTES誘導的趨化性的抑制。d)與人體外周血單核細胞(PBMCs)結合i)制備人PBMCs從志愿捐獻者獲取新鮮人血(200ml)，收集到檸檬酸鈉抗凝劑中，使其最終濃度為0.38％。血液與沉淀緩沖劑混合，在37℃下培養20分鐘。收集上清液并以1700rpm離心5分鐘(Sorvall RT6000D)。所得顆粒再懸浮于20mlRPMI/BSA(1mg/ml)，在15ml離心管中將4×5ml細胞仔細布于4×5ml Lympoprep(Nycomed)。離心管以1700rpm轉30分鐘(Sorvall RT6000D)，移走生成物層并轉到50ml Falcon管中。在細胞溶解緩沖液中清洗細胞兩次除去所有殘余血紅細胞，然后在RPMI/BSA中清洗兩次。細胞再懸浮于5ml的結合緩沖液。用Coulter計數器測定細胞數，加入額外的結合緩沖液使最終濃度為1.25×107PBMCs/ml。ii)檢測聯和應用Bolton和Hunter制備[碘125]MCP-1(Bolton等人，1973，Biochem.J.，133，529；Amersham International plc.)。用Ernst等人，1994，J.Immunol.，152，3541的方法進行平衡結合分析。簡言之，在96井滴定盤中，將50μl125碘標記的MCP-1(最終濃度100pM)加入40μl(5×105細胞)細胞懸浮液中。化合物用全細胞結合緩沖液稀釋，緩沖液取自DMSO中的10mM貯存液，加入化合物最終體積5μl，維持分析中DMSO濃度5％。總結合量在無化合物時測定。加入5μl冷MCP-1使最終分析濃度為100nM來確定非特異性結合。用全細胞結合緩沖液將分析井的最終體積調至100μl，密封滴定盤。在37℃下培養60分鐘后，過濾反應混合物，通過滴定盤清洗器(Brandel MLR-96T Cell Harvester)用清洗緩沖冰液清洗10秒鐘。濾墊(Brandel GF/B)在使用前在0.3％聚乙烯亞胺加0.2％BSA中預先浸漬60分鐘。過濾后各濾器分別放在3.5ml試管內(SastedtNo.55484)，測出結合的125碘標記的MCP-1(LKB1277 Gammaaster)。
通過一式兩份實驗，用六位劑量響應曲線測定被檢化合物效用及IC50濃度。
本發明檢測的化合物在有效濃度未發現生理學不允許的毒性。
本發明用下列實施例進一步說明，但發明不受這些實施例的限制，其中除非特別說明，將采用下列總方法。i)N，N-二甲基甲酰胺(DMF)用4埃分子篩干燥。無水四氫呋喃(THF)從Aldrich SURESEALTM獲得。除非特別說明，所用其它市場購買的試劑和溶劑不必進一步提純。有機溶劑萃取液用MgSO4干燥。ii)除非特別說明，1H、13C和19F NMR記錄在Bruker WM200、WM250、WM300或WM400上，用DMSO-d6與Me4Si或CCl3F作內標物較適當。化學位移記作d(ppm)，以及多重峰標明如下s，單峰；d，雙峰；dd，雙重雙峰；t，三重峰；dt，雙重三峰；q，四重峰；m，多重峰；br，寬峰。iii)記錄質譜用四極VG12-12，VG70-250SE，VG ZAB2-SE或VG改進的AEI/Kratos分光計。iv)作TLC分析，使用Merck預涂布TLC色譜板(硅膠60 F254，d＝0.25mm)。v)用氧化硅進行快速色譜分析(Merck KieselgelArt.9385)。
NMR；δ5.77(s，2H)，6.81(dd，1H)，6.89(dd，1H)，6.95(d，1H)，7.13(s，1H)，7.26(d，1H)，7.34(d，1H)，7.52(d，1H)，9.01(s，1H)，12.85(s，1H)；m/z334(M-H+).
采用適當的吲哚-2-羧酸乙酯起始物，重復上述實施例步驟，則獲得的化合物闡述如下。
用類似方式但從3-氟-4-氯苯甲醛開始，制備3-氟-4-氯芐基溴產率74％。NMRδ4.5(s，2H)，7.1(t，1H)，7.25(m，1H)，7.45(dd，1H).方法B
0℃下，將硼烷-四氫呋喃配合物(1M溶液在四氫呋喃中，52ml)在20分鐘內加入攪拌著的5，6-二氯煙酸(2g)四氫呋喃(60ml)溶液中。混合物可在90分鐘內加熱至室溫，然后冷卻至0℃并用水(100ml)淬冷。溶液用固體食鹽飽和并用乙酸乙酯萃取，干燥萃取液并真空濃縮。殘渣同二氯甲烷-50％乙酸乙酯一起研制，過濾除去固體副產物。真空濃縮濾液，并通過用異己烷/乙酸乙酯(1∶1v/v)作洗脫劑的柱色譜提純，獲得白色固體產物(820mg，45％)。
NMRδ4.55(d，2H)，5.5(t，1H)，8.0(m，1H)，8.3(m，1H)；m/z178.1(M+H+).方法C2，3-二氯-5-(溴甲基)吡啶將2，3-二氯-5-(羥甲基)吡啶(275mg)溶于二氯甲烷(10ml)，在三苯膦(444mg)和四溴甲烷(641mg)存在下攪拌過夜。真空濃縮溶液，殘渣通過用異己烷2.5％乙酸乙酯作洗脫劑的柱色譜提純，獲得白色固體產物(270mg，73％)。
NMRδ4.75(s，2H)，8.25(m，1H)，8.5(m，1H)；m/z242(M+H+).方法D5-乙酰氧基-N-(3，4-二氯芐基)吲哚-2-羧酸乙酯i)5-羥基吲哚-2-羧酸乙酯在氬氣氛圍中，在-78℃將三溴化硼(64.58g)滴加入攪拌著的5-甲氧基吲哚-2-羧酸乙酯(20g)的二氯甲烷(1000ml)溶液。反應物加熱至室溫并再攪拌2小時。反應液倒入攪拌著的冰/飽和碳酸氫鈉溶液，并用乙酸乙酯萃取。合并的有機萃取液用飽和碳酸氫鈉水溶液、水、飽和食鹽水溶液清洗并干燥。真空濃縮溶液，殘渣通過用0-60％乙醚異己烷作洗脫劑的柱色譜提純，獲得白色固體產物(9.02g，48％)。
NMRδ1.31(t，3H)，4.29(q，2H)，6.79(dd，1H)，6.90(dd、1H)，7.22(d，1H)，8.84(s，1H)，11.52(brs，1H)；m/z206(M+H+).ii)5-乙酰氧基吲哚-2-羧酸乙酯在乙酐(80ml)中攪拌的5-羥基吲哚-2-羧酸乙酯(7.79g)與4-二甲氨基吡啶(20mg)的溶液，在80℃下加熱4小時。真空濃縮反應物，殘渣溶解于乙酸乙酯。合并的有機萃取液用鹽酸(2M)、飽和碳酸氫鈉水溶液、水、飽和食鹽水溶液清洗并干燥。真空濃縮溶液獲得黃色固體產物(9.39g，100％)。
NMRδ1.20(t，3H)，2.10(s，3H)，4.19(q，2H)，6.86(dd，1H)，6.97(d，1H)，7.20(s，1H)，7.29(d，1H)；m/z248(M+H+).iii)5-乙酰氧基-N-(3，4-二氯芐基)吲哚-2-羧酸乙酯在氬氣氛圍中，將3，4-二氯芐基溴(5.96g)加入攪拌著的5-乙酰氧基吲哚-2-羧酸乙酯(5.4g)和碳酸鉀(6.94g)的乙腈(500ml)溶液。反應物在80℃下加熱16小時后進行真空濃縮，殘渣在乙酸乙酯和水之間分配。合并的有機萃取液用水、飽和食鹽水溶液清洗并干燥。真空除去溶劑，殘渣同異己烷一起研制獲得霜狀固體產物(5.55g，63％)。
NMRδ1.27(t，3H)，2.27(s，3H)，4.28(q，2H)，5.82(s，2H)，6.90(d，1H)，7.09(dd，1H)，7.33-7.40(m，2H)，7.46(d，1H)7.52(d，1H)，7.60(d，1H).
采用適宜的芐基鹵化物，或用方法F和G制備的烷基吲哚-2-羧酸酯和適宜的芐基鹵化物，重復方法Di)-iii)所述的步驟。則獲得的化合物闡述如下。方法D15-乙酰氧基-N-[(2，3-二氯吡啶-5基)甲基]吲哚-2-羧酸乙酯產率90％。NMRδ1.27(t，3H)，2.26(s，3H)，4.28(q，2H)，5.85(s，2H)，7.12(dd，1H)，7.38(s，1H)，7.47(d，1H)，7.68(d，1H)，7.78(d，1H)，8.10(d，1H)；m/z409(M+H+)，407.方法D25-乙酰氧基-N-(3-氯-4-氟芐基)吲哚-2-羧酸乙酯產率57％。NMR(CDCl3)δ1.37(t，3H)，2.33(s，3H)，4.35(q，2H)，5.74(s，2H)，6.90(m，1H)，7.00(d，1H)，7.05(dd，1H)，7.13(dd，1H)，7.26(d，1H)，7.36(s，1H)，7.22(d，1H).5-乙酰氧基-N-(4-氯-3-氟芐基)吲哚-2-羧酸乙酯產率73％。m/z390(MH+).5-乙酰氧基-N-(3-氯芐基)吲哚-2-羧酸乙酯產率93％。m/z372(MH+).5-乙酰氧基-N-(3-三氟甲基芐基)吲哚-2-羧酸乙酯產率91％。m/z406(MH+).5-乙酰氧基-N-(4-氯芐基)吲哚-2-羧酸乙酯產率70％。m/z372(MH+).5-乙酰氧基-3-溴-N-(3，4-二氯芐基)吲哚-2-羧酸乙酯產率86％。m/z486(MH+).5-乙酰氧基-4-溴-N-(3，4-二氯芐基)吲哚-2-羧酸乙酯產率62％。NMR δ1.40(t，3H)，2.39(s，3H)，4.38(q，2H)，5.77(s，2H)，6.82(dd，1H)，7.08(d，1H)，7.18(s，1H)，7.22(d，1H)，7.32(d，1H)，7.42(s，1H)；m/z486(MH+).5-乙酰氧基-N-(3，4-二氯芐基)-3-甲基吲哚-2-羧酸乙酯產率79％。NMRδ1.40(t，3H)，2.36(s，3H)，2.40(s，3H)，4.35(q，2H)，5.76(s，2H)，6.83(dd，1H)，7.00(d，1H)，7.10(d，1H)，7.19(s，1H)，7.30(d，1H)，7.40(s，1H)；m/z421(M+H+).5-乙酰氧基-N-(3，4-二氯芐基)-3-氯吲哚-2-羧酸乙酯產率83％。NMRδ1.25(t，3H)，2.25(s，3H)，4.3(q，2H)，5.8(s，2H)，6.9(d，1H)，7.2(m，1H)，7.4(m，2H)，7.5(d，1H)，7.7(d，1H)；m/z441.8(M+H+)方法EN-(3，4-二氯芐基)-5-羥基吲哚-2-羧酸乙酯在氬氣氛圍中，將乙醇鈉(1.86g)加入攪拌著的5-乙酰氧基-N-(3，4-二氯芐基)吲哚-2-羧酸乙酯(5.55g)乙醇(50ml)溶液。反應在室溫下攪拌2小時，然后進行真空濃縮，殘渣用鹽酸水溶液(2M)酸化并用二氯甲烷萃取。合并的有機萃取液用水、飽和食鹽水溶液清洗并干燥。真空除去溶劑，殘渣同異己烷/乙酸乙酯一起研制獲得白色固體產物(3.17g，92％)。
NMRδ1.26(t，3H)，4.25(q，2H)，5.75(s，2H)，6.81-6.91(m，2H)，6.98(d，1H)，7.19(s，1H)，7.29(d，1H)，7.38(d，1H)7.50(d，1H)，9.06(s，1H)；m/z 364(M+H+).方法F5-乙酰氧基-3-溴吲哚-2-羧酸乙酯將N-溴丁二酰亞胺(0.14g)加入攪拌著的5-乙酰氧基吲哚-2-羧酸乙酯(0.2g)的DMF(3.0ml)溶液。反應攪拌4小時，然后倒入水中。過濾生成的沉淀并真空干燥，產生白色粉末的標題化合物(0.23g，87％)。
NMRδ1.38(t，3H)，2.23(s，3H)，4.38(q，2H)，7.10(dd，1H)，7.23(d，1H)，7.50(d，1H)，12.28(bs，1H)；m/z326(M+).方法F15-乙酰氧基-3-氯吲哚-2-羧酸乙酯在N-氯丁二酰亞胺(297mg)和碳酸鉀(279mg)存在下，將5-乙酰氧基吲哚-2-羧酸乙酯(500mg)的二氯甲烷(10ml)溶液攪拌過夜。過濾收集生成的沉淀，用冷二氯甲烷清洗后再用水洗，真空干燥過夜產生所要的白色粉末產物(425mg，75％)。
NMRδ1.35(t，3H)，2.25(s，3H)，4.4(q，2H)，7.1(d，1H)，7.3(s，1H)，7.5(d，1H)，12.2(s，1H)；m/z281.9(M+H+).方法G5-乙酰氧基-3-甲基吲哚-2-羧酸乙酯(i)5-甲氧基-3-甲基吲哚-2-羧酸乙酯將濃硫酸(1ml)加入4-甲氧基苯基肼鹽酸鹽(11.2g)和2-氧代丁酸(8.72g)的乙醇(250ml)溶液，并將溶液加熱回流16小時。反應物冷卻、真空濃縮，殘渣與乙醇一起研制，得到白色固體的標題化合物(8.8g，59％)。
NMRδ1.36(t，3H)，3.76(s.3H)，4.30(q，2H)，6.88(dd，1H)，7.03(d，1H)，7.28(d，1H)，11.28(bs，1H)；m/z232(M-H+).(ii)5-乙酰氧基-3-甲基吲哚-2-羧酸乙酯在氬氣氛圍中，在-78℃下將三溴化硼(25g)滴加入攪拌著的5-甲氧基-3-甲基吲哚-2-羧酸乙酯(2.0g)的干二氯甲烷(250ml)溶液。反應物加熱到室溫，再攪拌2小時。反應液倒入攪拌著的冰/飽和碳酸氫鈉水溶液并用乙酸乙酯萃取。合并的有機萃取液用飽和碳酸氫鈉水溶液、水、飽和食鹽水溶液清洗并干燥(MgS04)。真空濃縮該溶液并將殘渣溶于乙酸乙酯。加入DMAP(20mg)和乙酐(0.5ml)，溶液加熱回流5分鐘。將反應液冷卻、真空濃縮，并將殘渣同乙醚一起研制，獲得白色粉末的標題化合物(0.4g，18％)。
NMRδ1.37(t，3H)，2.25(s，3H)，2.50(s，3H)，4.34(q，2H)，7.00(dd，1H)，7.37(d，1H)，7.40(d，1H)，11.52(bs，1H)；m/z260(M-H+).同樣的方式，但用4-溴-5-甲氧基吲哚-2-羧酸乙酯為起始物，制備5-乙酰氧基-4-溴吲哚-2-羧酸乙酯NMRδ1.42(t，3H)，2.39(s，3H)，4.42(q，2H)，7.02(d，1H)，7.23(s，1H)，7.35(d，1H)，9.22(bs，1H)m/z324，326(M-H+).方法HN-(3，4-二氯芐基)-4-氟-5-羥基吲哚-2-羧酸甲酯(i)2-氟-3-芐氧基苯甲醛在氬氣氛圍中，將2-氟-3-羥基苯甲醛(16.49g)溶于二甲基甲酰胺(200ml)并攪拌。加入氫化鈉(在礦物油中60％，5.18g)并將混合物攪拌30分鐘。加入芐基溴(16.8ml)并將混合物攪拌過夜。將反應混合物真空濃縮，所得殘渣在乙醚(200ml)和水(200ml)之間分配。合并的有機提取物用水(400ml)清洗，干燥(MgSO4)并進行真空濃縮。殘渣通過快速柱色譜提純，用梯度0-10％的乙酸乙酯/異己烷作洗脫劑，得到黃色固體產物(18.41g)。
1H NMR(DMSO-d6)δ5.20(s，2H)，7.2-7.6(m，8H)，10.21(s，1H)(ii)2-疊氮基-3-(2-氟-3-芐氧基苯基)丙烯酸甲酯在氬氣流下，在-25℃，將疊氮乙酸甲酯(36.64g)和2-氟-3-芐氧基苯甲醛(18.32g)的甲醇(250ml)混合物在1小時內滴加到甲醇鈉(17.20g)和甲醇(100ml)的混合液中。混合液攪拌20分鐘，升溫至5℃并攪拌過夜。
過濾生成的沉淀，隨后用冷甲醇、乙酸的水稀釋液和水順序清洗。生成的固體在真空下干燥，獲得淺棕色固體產物(16.70g)，該產物不必提純。(iii)4-氟-芐氧基吲哚-2-羧酸甲酯將甲基-2-疊氮基-3-(2-氟-3-芐氧基苯基)丙烯酸酯(16.7)的二甲苯(600ml)溶液在1小時內滴加到攪拌回流著的二甲苯(2.4L)后再攪拌20分鐘。反應混合物進行真空濃縮，通過快速柱色譜提純，用梯度0-10％的乙酸乙酯/異己烷作洗脫劑，得到黃色固體產物(12.93g)1H NMR(DMSO-d6)δ3.85(s，3H)，5.15(s，2H)，7.05-7.45(m，8H)，12.06(s，1H)；M/z(+)300.4(MH+)(i)N-(3，4-二氯芐基)-4-氟-芐氧基吲哚-2-羧酸甲酯將氫化鈉(在礦物油中60％，589mg)加入4-氟-芐氧基吲哚-2-羧酸甲酯(4g)的二甲基甲酰胺(100ml)溶液，混合物在氬氣氛圍中攪拌30分鐘。加入3，4-二氯芐基氯(2.22ml)并將混合物攪拌過夜。將反應混合物真空濃縮，所得殘渣在乙醚(100ml)和水(100ml)之間分配。有機提取物用水(100ml)清洗，干燥(MgSO4)，真空濃縮并通過快速柱色譜提純，先用異己烷再用5％乙酸乙酯/異己烷作洗脫劑，得到黃色晶體產物(4.61g)。
1H NMR(DMSO-d6)δ3.80(s，3H)，5.15(s，2H)，5.80(s，2H)，6.85(m、1H)，7.25-7.52(m，10H)；M/z(+)458.2(MH+)(v)N-(3，4-二氯芐基)-4-氟-羥基吲哚-2-羧酸甲酯在氫氣氛圍中，將N-(3，4-二氯芐基)-4-氟-芐氧基吲哚-2-羧酸甲酯(8.22g)和5％Pd/C(200mg)在乙酸乙酯(250ml)中攪拌過夜，用硅藻土過濾，進行真空濃縮并通過快速柱色譜提純，用0-50％乙酸乙酯/異己烷作洗脫劑，得到棕色固體產物(6.18g)。
1H NMR(DMSO-d6)δ3.80(s，3H)，5.75(s，2H)，6.85(m，1H)，7.00(t，1H)，7.22(m，2H)，7.30(m，1H)，7.50(m，1H)，9.33(s，1H)；M/z(-)366.2(MH+)方法IN-(3，4-二氯芐基)-3-甲氧基-5-羥基吲哚-2-羧酸乙酯(i)5-芐氧基疊氮吲哚-2-羧酸乙酯將亞硝酸鈉(6g)分批加入5-芐氧基吲哚-2-羧酸乙酯的乙酸乙酯(40ml)和乙酸(20ml)溶液。混合液攪拌18小時后在乙酸乙酯和水之間進行分配。有機提取液用水、飽和碳酸氫鈉水溶液清洗并干燥。在真空下除去溶劑，將生成的膠與乙醚一起研制，得到橙色粉末產品(1.8g)。
NMRδ1.45(t，3H)，4.5(q，2H)，5.1(s，2H)，7.05(m，2H)，7.3(m，5H)，7.9(d，1H)；m/z322(M+H+)(ii)3-甲氧基-5-芐氧基吲哚-2-羧酸乙酯將辛酸銠(300mg)加入攪拌著的5-芐氧基重氮吲哚-2-羧酸乙酯(2.0g)的甲苯(100ml)和甲醇(10ml)溶液。混合液在惰性氣氛圍下回流2.5小時。將溶液真空濃縮，用30-50％乙醚/異己烷作洗脫劑，通過柱色譜提純殘渣，得到橙色固體(1.41g)。
NMRδ1.4(t，3H)，4.05(s，3H)，4.4(q，2H)，5.1(s，2H)，7.1(dd，1H)，7.2-7.5(m，8H)；m/z326(MH+)(iii)N-(3，4-二氯芐基)-3-甲氧基-5-芐氧基吲哚-2-羧酸乙酯在惰性氣氛圍下，將3，4-二氯芐基氯(0.72ml)加入攪拌著的3-甲氧基-5-芐氧基吲哚-2-羧酸乙酯(1.40g)、碳酸鉀(0.90g)和碘化鉀(0.1g)的DMF(50ml)溶液。反應混合物在50℃加熱6小時，然后在乙酸乙酯和水之間進行分配。合并的有機提取物用水清洗，再用飽和食鹽水溶液洗三次并干燥。在真空下除去溶劑，通過用10-30％乙酸乙酯/異己烷的柱色譜提純殘渣，產生黃色的油(0.9g)。
NMRδ1.4(t，3H)，4.0(s，3H)，4.4(q，2H)，5.1(s，2H)，5.6(s，2H)，6.9(dd，1H)，7.0-7.5(m，9H)；m/z484(MH+)(iv)N-(3，4-二氯芐基)-3-甲氧基-5-羥基吲哚-2-羧酸乙酯將5％Pd/C(100mg)加入入攪拌著的N-(3，4-二氯芐基)-3-甲氧基-5-芐氧基吲哚-2-羧酸乙酯(0.9g)的乙酸乙酯(50ml)溶液，混合物氫化12小時。濾掉催化劑并蒸發濾液得到棕色的油(0.61g)，它不必進行進一步提純。
NMRδ1.4(t，3H)，4.0(s，3H)，4.4(q，2H)，5.6(s，2H)，6.8(dd，1H)，6.9(dd，1H)，7.1(m，3H)，7.3(d，1H)；m/z394(MH+)方法JN-(3，4-二氯芐基)-4-氯-5-甲氧基吲哚-2-羧酸乙酯(i)2-疊氮-3-(2-氯-3-甲氧基苯基)丙烯酸乙酯0℃下，將疊氮乙酸乙酯(9.9g)和2-氯-3-甲氧基苯甲醛(3g)的乙醇(20ml)溶液滴加到乙醇鈉(4.7g)的乙醇(10ml)溶液中。反應在18小時內加熱到室溫，然后在2N HCl(50ml)和二氯甲烷(250ml)之間進行分配。干燥有機相(MgSO4)并在真空下濃縮，用異己烷-12％乙酸乙酯/異己烷作洗脫劑，通過柱色譜提純殘渣，得到淺黃色固體(2.2g，44％)，使用時可不經進一步提純。(ii)4-氯-5-甲氧基吲哚-2-羧酸乙酯將2-疊氮-3-(2-氯-3-甲氧基苯基)丙烯酸乙酯(2.22g)的二甲苯(100ml)溶液加熱回流30分鐘，并進行真空濃縮，用異己烷-50％乙酸乙酯/異己烷作洗脫劑，通過柱色譜提純殘渣，得到淺黃色固體(1.34g，67％)
NMRδ(CDCl3)1.31(t，3H)，3.84(s，3H)，4.32(q，2H)，7.0(d，1H)，7.22(d，1H)，7.39(d，1H)，12.2(bs，1H)；(iii)N-(3，4-二氯芐基)-4-氯-5-羥基吲哚-2-羧酸乙酯在惰性氣氛圍下，將氫化鈉(60mg)在室溫下加入4-氯-5-甲氧基吲哚-2-羧酸乙酯(250mg)、3，4-二氯芐基氯(0.21ml)和碘化四丁基銨(3mg)的DMF溶液。反應在室溫下攪拌18小時，然后在乙酸乙酯(30ml)和水(30ml)之間進行分配。干燥有機相(MgSO4)并在真空下濃縮，用異己烷-15％乙酸乙酯作洗脫劑，通過柱色譜提純殘渣，得到白色固體產物(196mg，48％)。
NMRδ(CDCl3)1.39(t，3H)，3.93(s，3H)，4.32(q，2H)，5.73(s，2H)，6.84(dd，iH)，7.06-7.16(m，3H)，7.31(d，1H)，7.42(s，1H)(iv)N-(3，4-二氯芐基)-4-氯-5-甲氧基吲哚-2-羧酸乙酯將三甲基碘硅烷(0.6ml)加入N-(3，4-二氯芐基)-4-氯-5-羥基吲哚-2-羧酸乙酯(190mg)的氯仿(20ml)溶液。混合物在50℃加熱18小時，然后倒入甲醇(50ml)中并在真空下濃縮。用異己烷-20％乙酸乙酯/異己烷作洗脫劑，通過柱色譜提純殘渣，得到黃色固體(100mg，71％)。
NMRδ(CDCl3)1.39(t，3H)，4.35(q，2H)，5.72(s，2H)，6.84(dd，1H).7.05-7.13(m，3H)7.3(d，1H)7.35(s，1H)；m/z396.2/398.2(M-H+)
上述的起始物制備如下(i)N-(3，4-二氯芐基)-5-乙酰氧基吲哚-2-羧酸將二甲氨基吡啶(100mg)和乙酐(1.12ml)加入N-(3，4-二氯芐基)-5-羥基吲哚-2-羧酸的乙酸乙酯(50ml)溶液，并在室溫下攪拌1小時。加入乙醇(10ml)，反應攪拌30分鐘。蒸發部分溶劑并加入異己烷以產生沉淀，將沉淀濾出并干燥，產生白色固體產物(1.12g)。NMRδ2.25(s，3H)，5.85(s，2H)，6.9(dd，1H)，7.3-7.6(m，5H)；m/z376，378(M-H+)(ii)N-(3，4-二氯芐基)-2-三氟甲基磺酰氨基-5-乙酰氧基吲哚在惰性氣氛圍下，向攪拌著的N-(3，4-二氯芐基)-5-乙酰氧基吲哚-2-羧酸的DMF(5ml)溶液中加入HATU(0.27g)、DIPEA(0.12ml)和三氟甲基磺酰氨(97mg)。反應在室溫下攪拌18小時。混合液倒入飽和的碳酸氫鈉溶液，濾出生成的沉淀并干燥，生成產物(90mg)。
NMRδ2.25(s，3H)，5.9(s，2H)，6.9(dd，1H)，7.0(dd，1H).7.1(s，1H)，7.35(m，1H)；m/z506，508(M-H-)
NMRδ2.25(s，3H)，5.6(s，2H)，7.0(dd，1H)，7.45-7.65(m，4H)，7.7(d，1H)
NMRδ6.9(m，2H)，7.25(s，1H)，7.85(d，1H)，7.9(m，2H)，8.15(s，1H)，9.5(s，1H)；m/z385.8(M-H-).起始物制備如下(i)N-(3，4-二氯苯基磺酰基)-5-芐氧基吲哚-2-羧酸甲酯將氫化鈉(60％分散液，444mg)在室溫下加入攪拌著的5-芐氧基吲哚-2-羧酸甲酯(2.08g)的DMF(50ml)溶液。1小時后，加入3，4-二氯苯基磺酰基氯(2.72g)。攪拌繼續2小時，然后反應混合物在水和乙酸乙酯之間進行分配。合并的有機提取物進行干燥和真空濃縮，用異己烷-20％乙酸乙酯作洗脫劑，通過柱色譜提純殘渣，生成所需白色固體狀產物(2.02g，56％)。
NMRδ3.85(s，3H)，5.1(s，2H)，7.2(m，1H)，7.4(m，7H)，7.9(s，2H)，8.0(d，1H)，8.2(s，1H)；m/z489.8(MH+).(ii)N-(3，4-二氯苯基磺酰基)-5-羥基吲哚-2-羧酸甲酯在氫氣氛圍壓力下，將5％鈀碳的乙酸乙酯(450ml)懸浮液和N-(3，4-二氯苯基磺酰基)-5-芐氧基吲哚-2-羧酸甲酯(2.01g)在60℃攪拌48小時。過濾除去催化劑并將濾液進行真空濃縮。用20％乙酸乙酯/異己烷作洗脫劑，通過柱色譜提純殘渣，生成所需的膠狀產物(270mg，16％)。
NMRδ3.85(s，3H)，7.0(m，2H)，7.35(s，1H)，7.9(m，3H)，8.1(s，1H)，9.6(s，1H)；m/z401.9(MH+).
1H NMR(DMSO-d6)δ2.25(s，3H)，5.85(s，2H)，6.9(dd，1H)，7.05(dd，1H)，7.3-7.6(m，5H)；m/z378，380(MH+).實施例19藥用組合物該實施例舉例而非限制說明本發明的典型用藥劑型(活性組分用“化合物X”表示)，它用于人體治療和預防用途。
(d)

(e)

(f)

(g)

(h)

(i)

(j)

(k)

(I)

注上述制劑中的化合物X可包括如例1至3中的化合物。
通過制藥工藝所公知的普通步驟可獲得上述制劑。用常規方法可將片劑(a)-(c)進行腸溶包衣，例如提供鄰苯二甲酸乙酸纖維素包衣。噴霧劑制劑(h)-(k)可與標準的、計量的噴霧劑分配器結合使用，助懸劑脫水山梨醇三油酸酯和大豆卵磷脂可用其它助懸劑代替，如脫水山梨醇單油酸酯、脫水山梨醇倍半油酸酯、多乙氧基醚-80、聚甘油油酸酯或油酸。
權利要求
1.一種式(I)化合物 其中R1是氫原子、鹵素或甲氧基；R2是氫原子、鹵素、甲基、乙基或甲氧基；R3是羧基、四唑基或-CONHSO2R4，其中R4是甲基、乙基、苯基、2，5-二甲基異噁唑基或三氟甲基；T是-CH2-或-SO2-；和環A是3-氯苯基、4-氯苯基、3-三氟甲基苯基、3，4-二氯苯基、3，4-二氟苯基、3-氟-4-氯苯基、3-氯-4-氟苯基或2，3-二氯吡啶-5-基，或其藥用鹽或前藥。
2.權利要求1的化合物，其中環A是3-氯苯基、4-氯苯基、3-三氟甲基苯基、3，4-二氯苯基、3，4-二氟苯基、3-氟-4-氯苯基或3-氯-4-氟苯基。
3.權利要求2的化合物，其中環A是3，4-二氯苯基、3-氟-4-氯苯基或3-氯-4-氟苯基。
4.依照權利要求1的化合物，其中環A是3，4-二氯苯基、2，3-二氯吡啶-5-基或3-氯-4-氟苯基。
5.上述任一權利要求的化合物，其中T是-CH2-。
6.上述任一權利要求的化合物，其中R3是羧基。
7.權利要求1的化合物，其中式(I)化合物中，R1是氫原子；R2是氫原子；R3是羧基；T是-CH2-；和環A是3，4-二氯苯基或3-氯-4-氟苯基，或其藥用鹽或前藥。
8.一種制備權利要求1的化合物的方法，該方法包括a)將式(II)化合物 其中Ra是如權利要求1定義的R3或R3的被保護形式，Rb是氫原子或羥基保護基團，R1和R2如權利要求1定義，與式(III)化合物反應 其中T和環A如權利要求1定義，L是可置換基團；然后，如果需要i)將一種式(I)化合物轉化為另式(I)化合物；ii)除去所有保護基團；或iii)形成藥用允許的鹽或其前藥。
9.一種藥用組合物，含有與藥用允許的載體結合的權利要求1-7中任意一項的化合物。
10.一種權利要求1-7中任意一項的化合物用于制備治療由單核細胞化學吸引劑蛋白-1或RANTES(活化后調節的，正常T細胞表達和分泌的因子)介導的疾病如炎癥的藥物中的用途。
全文摘要
本發明涉及一種式(I)化合物,其中R
文檔編號A61P29/00GK1339025SQ0080346
公開日2002年3月6日 申請日期2000年1月31日 優先權日1999年2月5日
發明者A·W·福爾, J·G·凱特勒 申請人:阿斯特拉曾尼卡有限公司