專利名稱：轉(zhuǎn)移核酸通過核被膜的細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種核轉(zhuǎn)運(yùn)劑、一種含有所述核轉(zhuǎn)運(yùn)劑的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)、一種使用所述核轉(zhuǎn)運(yùn)劑將DNA轉(zhuǎn)運(yùn)到真核細(xì)胞核中的方法以及所述核轉(zhuǎn)運(yùn)劑在治療癌癥、病毒感染、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、移植排斥和單基因或多基因遺傳疾病的基因療法中的用途。
向核中的主動轉(zhuǎn)運(yùn)是將遺傳材料轉(zhuǎn)移到在打算表達(dá)遺傳材料之前的時間內(nèi)不分裂的所有細(xì)胞中必不可少的。由于核酸的核轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)有利于有效地將DNA轉(zhuǎn)移到很少分裂或根本不分裂的這些細(xì)胞中，因此核酸的核轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)非常重要(Dowty等人，1995，Wilke等人，1996)。大多數(shù)初級細(xì)胞屬于這一類。初級細(xì)胞在科學(xué)上最感興趣有兩個原因。首先，剛從生物體中分離的所述細(xì)胞反映的細(xì)胞類型的功能狀態(tài)比由此獲得的細(xì)胞系的好得多。其次，它們是基因療法的靶細(xì)胞。此外，核轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)通過使這些細(xì)胞也能表達(dá)轉(zhuǎn)移的遺傳材料增加了DNA向建立的細(xì)胞系轉(zhuǎn)移的效率，它們在轉(zhuǎn)移開始和分析之間的時間內(nèi)尚未分裂。
遺傳材料在細(xì)胞核中有活性。其中的轉(zhuǎn)運(yùn)或者可以在核被膜在有絲分裂過程中臨時分裂時在細(xì)胞分裂期間同時進(jìn)行或者它必須主動地進(jìn)行。
1)通過核定位信號將核蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)到該細(xì)胞核中。
包封該核的雙層膜具有孔。小分子可以經(jīng)擴(kuò)散通過這些孔。為了能夠進(jìn)入核，大于約50kDa的蛋白質(zhì)需要一核定位信號(NLS)，該信號必須通過轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)器識別。典型地，足夠的信號由4-8個氨基酸組成，富含正氨基酸精氨酸和賴氨酸并含有脯氨酸。它在進(jìn)化中強(qiáng)烈地保守，這樣哺乳動物NLS也在酵母中起作用。異源NLS還可以用作將靶分子轉(zhuǎn)運(yùn)到核中的工具。為此，NLS可以相對隨機(jī)的位置加入到胞質(zhì)蛋白質(zhì)的序列中，或者可以化學(xué)偶聯(lián)到蛋白質(zhì)或者甚至金顆粒上(參見Grlich，1998)。
2)許多病毒使用其細(xì)胞的核蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)將其DNA轉(zhuǎn)運(yùn)到其核中。
能夠感染靜息細(xì)胞的HIV和其它慢病毒使用病毒蛋白和細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)器將其DNA轉(zhuǎn)運(yùn)到其核中。Vpr中的NLS和HIV預(yù)整合復(fù)合物中的基質(zhì)蛋白(Gallay等人，1996)是感染不分裂的細(xì)胞所必需的(Naldini等人，1996)。盡管幾乎不知道病毒是如何將其基因組轉(zhuǎn)移到其核中的，但是含有NLS的病毒結(jié)構(gòu)蛋白的幫助甚至可能是一般原理。通過以下觀察也暗示了這一點(diǎn)在HSV衣殼蛋白中的特異性突變防止了病毒DNA向其核中的轉(zhuǎn)運(yùn)(Batterson等人，1983)。腺病毒DNA與分裂衣殼的六鄰體蛋白一起轉(zhuǎn)運(yùn)到核中(Greber等人，1993)。SV40 DNA向核中的轉(zhuǎn)運(yùn)由保持與DNA結(jié)合的病毒蛋白(可能是Vp3)介導(dǎo)(Nakanishi等人，1996)。含有NLS的兩種細(xì)菌蛋白負(fù)責(zé)根癌土壤桿菌T-DNA向植物細(xì)胞核的輸入(Citovsky等人，1994)。
由于一些病毒能夠感染靜息細(xì)胞，因此將例如HIV、腺病毒和皰疹病毒的突變體變體用作開發(fā)基因療法方案的DNA轉(zhuǎn)移載體。首先，這涉及與病毒組分的免疫反應(yīng)的危險(Friedmann 1994，1996)，其次，將輔助細(xì)胞系用于這些系統(tǒng)，為此不能排除突變較少的病毒基因組的釋放。而且，這些系統(tǒng)難以操縱。
已描述了通過含有核定位信號的肽或蛋白質(zhì)推斷提高轉(zhuǎn)染效率的幾個人工系統(tǒng)。
A)蛋白質(zhì)Kaneda等人(1989)以及Dzau和Kaneda(1997，US5,631,237)描述了一種基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，它是以使用仙臺病毒、脂質(zhì)體和意思是支持DNA的核轉(zhuǎn)運(yùn)的加入的蛋白為基礎(chǔ)。為此，該組使用HMG-1(″高遷移率組1蛋白″)，一種與DNA結(jié)合的堿性非組蛋白的染色質(zhì)蛋白質(zhì)。HMG-1通過一長堿性區(qū)與DNA結(jié)合。它位于核內(nèi)，但沒有已知的NLS。在體外，HMG-1蛋白質(zhì)與載體DNA形成復(fù)合物。純化HMG-1的生產(chǎn)費(fèi)用高且為勞動密集型。
Mistry等人(1997)描述了與HMG-1-介導(dǎo)的核轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)的實(shí)驗(yàn)。由于作為復(fù)合DNA的轉(zhuǎn)染試劑的其正電荷HMG-1在這里用于使DNA通過細(xì)胞膜。Wako BioProducts公司(Richmond，VA，USA)作為介導(dǎo)核轉(zhuǎn)運(yùn)的脂轉(zhuǎn)染試劑的添加劑銷售(1997)蛋白質(zhì)HMG-1和-2。
Fritz等人(1996)用小牛胸腺組蛋白或由SV40 NLS和人組蛋白H1組成的重組蛋白進(jìn)行了一相似試驗(yàn)。這兩種蛋白都明顯地與DNA形成大的復(fù)合物，正如出版物中所示，它們適宜通過細(xì)胞膜，但不適宜核轉(zhuǎn)運(yùn)。
B)由于含有NLS序列的合成肽生產(chǎn)簡單且費(fèi)用較低，因此也使用它們。
P.Alestrm的小組(Collas等人，1996，Collas和Alestrm，1996，1997a，b)使用來自SV40的NLS肽復(fù)合DNA，并通過該細(xì)胞將其轉(zhuǎn)運(yùn)到核中。該DNA的結(jié)合僅通過對其功能必不可少的NLS的正電荷氨基酸發(fā)生。只要DNA與肽復(fù)合，這將導(dǎo)致遮蔽核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的實(shí)際信號。在由海膽精子在體外形成的分離雄性原核中，當(dāng)它們在斑馬魚受精卵的溶胞產(chǎn)物中培養(yǎng)時，能觀察到熒光標(biāo)記的DNA的NLS依賴性轉(zhuǎn)運(yùn)。在摩爾比≥100∶1(NLS肽∶載體)和載體拷貝/細(xì)胞≥1000時，在斑馬魚胚胎中，當(dāng)將載體DNA微量注射到細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中時，觀察到熒光素酶表達(dá)增加。(在100個肽/載體和1000個注射載體下與0個肽比較獲得了六倍增加。)由于其密度高，可能并非所有NLS都與該DNA完全結(jié)合，并且因此部分仍是轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)器可及的；這可能是為什么完全可以觀察到作用的原因(參見Sebastyén等人，1998)。轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)器可能能夠識別由兩個肽序列組成的信號(Boulikas，1993)。
Sebastyén等人(1998)共價地偶聯(lián)了成千上百的DNA分子的SV40 NLS肽，并在該DNA鏈的全長上對NLS進(jìn)行了掃描。由于其大量修飾，該DNA不再能被轉(zhuǎn)錄。正如該文章中所討論的，由于空間原因，當(dāng)如此之多的NLS肽結(jié)合，致使它們中間不是所有都通過與DNA的負(fù)電荷相互作用遮蔽時，DNA明顯地僅被轉(zhuǎn)運(yùn)到核中。
Gopal(US5670347)描述了一種由DNA結(jié)合堿性區(qū)、彈性鉸鏈區(qū)和NLS組成的肽。由于在這種情況下DNA結(jié)合也是由氨基酸正電荷完成的，因此試劑與DNA形成意味著同時用于穿過細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)的復(fù)合物。NLS序列為什么不應(yīng)參與DNA結(jié)合，以致只要肽偶聯(lián)其上，核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的實(shí)際信號就可能再被DNA遮蔽的原因并不清楚。而且，產(chǎn)生的復(fù)合物可以變得非常大(Emi等人，1997，Niidome等人，1997，Wadhwa等人，1997，Trubetskoy等人，1998)，這將會減少通過核孔轉(zhuǎn)運(yùn)(Lanford等人，1986，Yoneda等人，1987，1992)。還未證明起超出多陽離子肽作為轉(zhuǎn)染試劑的已知功能的作用，它支持DNA通過細(xì)胞膜(Sorgi等人，1997，參見Hawley-Nelson等人，1997)。
Gerhard等人(DE-OS 19541679)提出了用于基因轉(zhuǎn)移的NLS多賴氨酸綴合物。在這種情況下，由陽離子多賴氨酸、陽離子NLS和DNA組成的呈現(xiàn)復(fù)合物也確實(shí)遮蔽該核轉(zhuǎn)運(yùn)信號，只要其與該DNA偶聯(lián)。
Szoka(PCT1993，權(quán)利要求23-27)通過一嵌入劑將NLS肽與DNA偶聯(lián)。在預(yù)培養(yǎng)載體和肽(比例為1∶300)之后，脂轉(zhuǎn)染的效率增加4-5倍。由于其高的正電荷，所用的SV40肽能夠復(fù)合DNA。DNA與陽離子肽的復(fù)合導(dǎo)致通過提高穿過細(xì)胞膜的效率的脂轉(zhuǎn)染效率增加(Sorgi等人，1997，參見Hawley-Nelson等人，1997)。由此使核轉(zhuǎn)運(yùn)稍有減少，至少當(dāng)生成大的復(fù)合物時(參見上面)。由于所用的NLS肽因其電荷與DNA結(jié)合，因此削弱了核轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)器對轉(zhuǎn)運(yùn)信號的識別(參見上面)。使用該實(shí)施例中所述的誘變嵌入劑限制其應(yīng)用。Szoka提出，非共價且非特異性，但是，如上所述，結(jié)合的轉(zhuǎn)染用的其它分子也與DNA不能防止NLS肽本身與該DNA結(jié)合和復(fù)合。沒有討論NLS肽與DNA直接結(jié)合的問題。
Hawley-Nelson等人(US5736392)描述了一種類似系統(tǒng)。將一NLS肽與載體DNA或者直接混合或者在與DNA-結(jié)合分子共價偶聯(lián)之后混合。然后將生成的復(fù)合物用于脂轉(zhuǎn)染(或其它轉(zhuǎn)染)。在該系統(tǒng)中，加入沒有NLS的多陽離子肽增加轉(zhuǎn)染效率，甚至比加入陽離子NLS多。亞精胺與NLS肽偶聯(lián)不會使轉(zhuǎn)染效率進(jìn)一步增加。因此，同樣在這種情況下，經(jīng)陽離子肽的DNA的復(fù)合僅解釋了擴(kuò)增作用。由于NLS的存在沒有進(jìn)一步增加轉(zhuǎn)染效率，因此可以假定核轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)器的識別序列在這種情況下也被遮蔽了。
TIB Molbiol公司(傳單1998)描述了PNA寡核苷酸和C-端NLS肽一起轉(zhuǎn)運(yùn)以特異性地抑制選擇基因的表達(dá)。該NLS用于將這些PNA寡核苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)到核中，以便它們?nèi)缓罂梢耘c其靶序列雜交。
迄今，將DNA轉(zhuǎn)運(yùn)到核中的已知試劑的缺陷是效率非常低。該低效率不足以使靜息細(xì)胞成為可轉(zhuǎn)染的。
因此，本發(fā)明的問題在于提供一種核轉(zhuǎn)運(yùn)劑，它能將DNA有效轉(zhuǎn)運(yùn)到核中，從而靜息或僅非常緩慢分裂的細(xì)胞也變?yōu)榭稍谟杏贸潭壬限D(zhuǎn)染的。
該問題通過一由兩個模件A和B組成的核轉(zhuǎn)運(yùn)劑得到解決，其中模件A特異性地與DNA結(jié)合，不會導(dǎo)致通過非特異性結(jié)合形成含一個以上DNA分子的復(fù)合物，并且模件B含有不與DNA非特異性結(jié)合的核定位信號或非NLS信號。本發(fā)明的優(yōu)選核轉(zhuǎn)運(yùn)劑含有與DNA序列特異性地結(jié)合和/或與DNA端特異性結(jié)合的模件A。特別優(yōu)選的是其中模件A為一合成肽、蛋白質(zhì)或肽核酸(PNA)的核轉(zhuǎn)運(yùn)劑。
在本發(fā)明核轉(zhuǎn)運(yùn)劑的另一實(shí)施方案中，模件B含有一因其電荷不與DNA形成復(fù)合物的延長核定位信號。優(yōu)選核轉(zhuǎn)運(yùn)劑中模件B含有一具有幾乎中性凈電荷的延長核定位信號。特別優(yōu)選核轉(zhuǎn)運(yùn)劑中模件B含有一含核定位信號和側(cè)翼帶負(fù)電荷的氨基酸的延長核定位信號。NLS序列不必與天然存在的NLS序列相同，但是也可以為基于理論考慮的氨基酸序列，只要它起NLS的作用。而且，模件B可以含有肽序列或不直接屬于核定位信號或延長核定位信號的非肽組分。優(yōu)選為增加核定位信號與模件A之間距離的組分。
而且，本發(fā)明涉及一種含本發(fā)明核轉(zhuǎn)運(yùn)劑和陽離子脂質(zhì)、肽、多胺或陽離子聚合物的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)。
而且，本發(fā)明涉及一種將DNA轉(zhuǎn)運(yùn)到真核細(xì)胞，優(yōu)選初級細(xì)胞的核中的方法，其中使用待轉(zhuǎn)運(yùn)的DNA和本發(fā)明核轉(zhuǎn)運(yùn)劑通過本領(lǐng)域已知的方法轉(zhuǎn)染這些細(xì)胞。
另一實(shí)施方案涉及本發(fā)明的核定位劑在基因療法，特別是治療癌癥、病毒感染、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、移植排斥和單基因或多基因遺傳疾病中的用途。
本發(fā)明所用的詞語“核定位信號與DNA的非特異性結(jié)合”是指防止核定位信號對于核轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)器是完全可識別的結(jié)合。
本發(fā)明所用的詞語“模件A與DNA的特異性結(jié)合”，首先是指序列特異性的結(jié)合，其中DNA核苷酸的序列對這種相互作用起著決定性作用，其次是指與由DNA單或雙鏈端介導(dǎo)的DNA的共價結(jié)合。
本發(fā)明所用的詞語“延長核定位信號”是指核定位信號具有附加的側(cè)翼氨基酸。優(yōu)選延長核定位信號具有2-40，優(yōu)選4-20個附加的側(cè)翼氨基酸。
本發(fā)明所用的詞語“因其電荷不與DNA形成復(fù)合物的延長核定位信號”是指模件B含有其電荷以如下方式分布的核定位信號它與DNA非特異性地相互作用，因此對于核轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)器來說仍是完全可及的。
本發(fā)明所用的詞語“幾乎中性凈電荷”是指核定位信號的延長部分具有與實(shí)際核定位信號的正電荷平衡的帶負(fù)電荷的氨基酸，這樣在延長核定位信號的整個區(qū)域中存在不超過3個剩余正電荷。
本發(fā)明的核轉(zhuǎn)運(yùn)劑具有不引起DNA復(fù)合的優(yōu)點(diǎn)。另一優(yōu)點(diǎn)是該核定位信號可以自由靠近核轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)器。避免形成削弱核轉(zhuǎn)運(yùn)的大的DNA復(fù)合物以及當(dāng)使用本發(fā)明的核定位劑時核定位信號對核轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)器的可接近性，使得DNA向核中的轉(zhuǎn)運(yùn)明顯更有效。
根據(jù)本發(fā)明，DNA-結(jié)合部分(模件A)或核定位信號(模件B)都不會導(dǎo)致形成大的DNA復(fù)合物。模件A模件A特異性地結(jié)合DNA，并且不引起具有一個以上DNA分子的復(fù)合物的形成。模件A序列特異性地(即僅因正電荷不是非特異性地)或者共價地與DNA端結(jié)合。
模件A可以是不同長度的肽或者蛋白質(zhì)或者PNA序列(Nielson等人，1991)或者以序列特異性的方式與核酸結(jié)合的另一種物質(zhì)。而且，模件A可以是特異性地與DNA結(jié)合的重組蛋白，作為例如lac阻抑物或其高親和力突變體(Kolkhof，1992，F(xiàn)ieck等人，1992)、或者序列特異性地與DNA端(具有LTR核心序列)結(jié)合的逆轉(zhuǎn)錄病毒整合酶(Ellison和Brown，1994)。
如果線性DNA鏈端具有為“自殺底物”的序列并可經(jīng)拓?fù)洚悩?gòu)酶裂解但不驅(qū)逐的話，那么與DNA鏈端的共價結(jié)合可以例如經(jīng)痘病毒的拓?fù)洚悩?gòu)酶1生物介導(dǎo)(Shuman，1994)。模件B模件B為不與DNA非特異性結(jié)合的核定位信號或非NLS信號。
本發(fā)明的術(shù)語“非NLS信號”是指不是核定位信號，但就轉(zhuǎn)染、基因療法或DNA接種而言用于將DNA轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞中或在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)DNA的信號。
以下屬于非NLS信號細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)的配體，它能夠介導(dǎo)DNA攝取，例如受體介導(dǎo)的DNA攝??；例如為了促使內(nèi)體中的DNA過早出來而使膜去穩(wěn)定化的肽；在細(xì)胞中介導(dǎo)與轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)結(jié)合以利于向核中的胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)的信號。
核定位信號優(yōu)選為因其電荷或?qū)NA結(jié)合模件A的空間定向不與DNA形成復(fù)合物的延長核定位信號(如上所定義的)。核定位信號可以經(jīng)合成產(chǎn)生或者可以為蛋白質(zhì)的一部分。
在本發(fā)明的核轉(zhuǎn)運(yùn)劑中使用的核定位信號中，不通過其正電荷與DNA結(jié)合的信號序列-有和沒有側(cè)翼區(qū)-以如下方式使用作為大多數(shù)核定位信號的主要部分的這些電荷作為核轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)器的信號被遮蔽。
除了核定位信號或非NLS信號之外，模件B可以含有肽序列和非肽組分，它們不是核定位信號或延長核定位信號的一部分。優(yōu)選它們能較好地立體定位該核定位信號，尤其是增加與DNA分子之間的距離。
經(jīng)典的NLS的延長序列是完全適宜的，條件是肽的凈電荷幾乎能夠被側(cè)翼帶負(fù)電荷的氨基酸平衡。這些氨基酸可以天然地存在于蛋白質(zhì)的這些位置或者可能已在結(jié)構(gòu)考慮的基礎(chǔ)上引入。最初，將負(fù)電荷氨基酸定位與許多NLS核心序列相鄰(Xiao等人，1997)。可以證明SV40的NLS作為最徹底調(diào)查過的NLS，這些側(cè)翼序列可明顯提高核轉(zhuǎn)運(yùn)效率(Rihs和Peters，1989，Rihs等人，1991，Chen等人，1991，Jans等人，1991，Xiao等人，1997)。僅在將其化學(xué)地偶聯(lián)到已由相鄰序列延長的SV40 NLS之后，但是不在將其與SV40核心NLS肽偶聯(lián)之后，將大蛋白質(zhì)(IgM)轉(zhuǎn)運(yùn)到核中(Yoneda等人，1992)。
如果NLS為序列特異性地與DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)的一部分時，這些序列被DNA遮蔽的危險性相對較低。但是由于其高效率，在這種情況下也可以使用延長的NLS序列。
也可以使用非經(jīng)典的NLS，例如作為來自流感病毒核蛋白的NLS(Wang等人，1997，Neumann等人，1997)，它們沒有大量過量的正電荷或者不經(jīng)過常規(guī)轉(zhuǎn)運(yùn)途徑到達(dá)核中。
T.Boulikas(1993，1996，1997)(不完全)概述了打算用于本文的NLS。
最后，可以使用得自核轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)器本身組分的核轉(zhuǎn)運(yùn)信號，作為例如輸入素(importin)α的輸入素β結(jié)合結(jié)構(gòu)域(IBB)。經(jīng)過該結(jié)構(gòu)域，NLS結(jié)合蛋白輸入素α與核轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)器的剩余部分相連(Grlich等人，1996，Weiss等人，1996)。
在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，使非NLS信號經(jīng)PNA(作為模件A)與現(xiàn)有載體序列結(jié)合。PNA和載體之間的結(jié)合為序列特異性的。這使得這些非NLS信號可以與幾乎所有常規(guī)表達(dá)載體偶聯(lián)，而不需要對它們進(jìn)行修飾。
就PNA與DNA的序列特異性結(jié)合而言，僅使用載體的那些DNA序列，經(jīng)PNA的這種遮蔽基本上不削弱DNA的預(yù)期目的。
在表達(dá)載體的情況下，特別是使用質(zhì)粒主鏈中的序列，尤其是存在于大多數(shù)常規(guī)表達(dá)載體中的序列(例如氨芐青霉素抗性基因的啟動子)。然而，在表達(dá)區(qū)的非編碼鏈中結(jié)合也是可能的。序列特異性結(jié)合的優(yōu)點(diǎn)是PNA-肽-雜種與DNA簡單而快速的結(jié)合。實(shí)施例2證實(shí)了例如PNA-肽-雜種與雙鏈DNA的簡單而快速的結(jié)合反應(yīng)(5分鐘，65℃)。在PNA部分和實(shí)際信號之間可能有一間隔。該間隔可以增加信號與DNA之間的距離，從而例如減少位阻。該間隔還可用于引入預(yù)定斷裂點(diǎn)，從而例如使內(nèi)體環(huán)境中的配體分離，由此使DNA結(jié)合到胞吞的細(xì)胞表面受體上。
本發(fā)明首次使靜息細(xì)胞或緩慢分裂細(xì)胞可轉(zhuǎn)染至允許以后分析的百分?jǐn)?shù)。剛從動物體或人體分離的大多數(shù)細(xì)胞(初級細(xì)胞)根本不分裂，或者難得分裂，以致在DNA成功地通過細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)之后，在其到達(dá)核并能夠被表達(dá)之前它被失活。至此這使得初級細(xì)胞不能轉(zhuǎn)染，除非它們經(jīng)人工刺激培養(yǎng)增殖。這種不可避免的后果是這些細(xì)胞然后偏離其原始狀態(tài)。一種轉(zhuǎn)染初級細(xì)胞的方法允許在體細(xì)胞的最初條件下分析遺傳材料。這對于遺傳機(jī)理的調(diào)查和在體細(xì)胞內(nèi)加工的研究是至關(guān)重要的。
使初級細(xì)胞可轉(zhuǎn)染的本發(fā)明的教導(dǎo)對基因療法的完全人造的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)也是一個重要的步驟。這種基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)必需具有3個功能性組分一種使DNA通過細(xì)胞膜的組分，為此已證實(shí)陽離子脂類和其它陽離子聚合物相對適合。它必須含有將DNA轉(zhuǎn)移到靶細(xì)胞(通常是非分裂性的)的核中的另一組分，以及介導(dǎo)DNA整合到基因組中的第三組分。在本發(fā)明中，首次描述了可以用作第二組分的有效試劑?？捎糜诨虔煼ǖ耐耆嗽斓幕蜣D(zhuǎn)移載體可望比目前使用的病毒系統(tǒng)更容易地生產(chǎn)，成本更低，更易操作，并且它不易遭受這些系統(tǒng)的內(nèi)在危險。例如已提出基因治療方案用于治療癌癥、AIDS和各種遺傳疾病，并將在醫(yī)學(xué)中發(fā)揮重要作用。
在這些至今已可轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)細(xì)胞中通過使那些在DNA通過細(xì)胞膜與分析之間的時間內(nèi)不分裂的細(xì)胞可以用于攝取DNA，本發(fā)明所述的核轉(zhuǎn)運(yùn)劑也可增加轉(zhuǎn)染效率。由于甚至對許多建立的細(xì)胞系而言轉(zhuǎn)染效率的增加將會有利于分析并且因所需細(xì)胞材料的量降低而有助于降低成本，由此這是很重要的。當(dāng)然，這對于初級細(xì)胞和建立的細(xì)胞系之間的所有階段也是如此。
以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但并不打算限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1PNA-肽-雜種使用NLS PNA核轉(zhuǎn)運(yùn)劑。使用能夠侵入DNA雙鏈的PNA序列(Nielson等人，1991，Nielson，US5,539,082)。
在幾乎所有表達(dá)載體的質(zhì)粒主鏈中，完全適合與PNA高親和相連的兩個序列位于氨芐青霉素抗性基因和復(fù)制起點(diǎn)中。
作為肽組分，所用的肽含有或者1)″SV21″NH2-GKPTADDQHSTPPKKKRKVED-COOH(肽1；SEQ ID NO1)，或者2)″SV27″NH2-GKPSSDDEATADSQHSTPPKKKRKVED-COOH(肽2；SEQ IDNO2)。
以下PNA序列位于每個肽的N-端?；蛘逜)″ori″NH2-CCTTTCTCCCTTC-肽(SEQ ID NO3)，或者B)″ssp″NH2-CTCTTCCTTTTTC-肽(SEQ ID NO4)，或者C)肽-PNA雜種序列NH2-CCTTT-GGGGGGG-TTTCC-肽(SEQ ID NO5)，在平均表達(dá)載體(5kb)中它具有約30個結(jié)合位點(diǎn)(G＝氨基酸甘氨酸)。
將5μg溶于水中的載體DNA在10μl 25μM NLS-PNA中在60℃下培養(yǎng)10分鐘。然后用RPMI將該反應(yīng)混合物調(diào)整至250μl。
將60-80％鋪滿的5×106個中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞用5mM EDTA脫附，在15ml PBS中洗滌(在50×g下離心10分鐘)。將該顆粒再次懸浮在250μlRPMI中并與預(yù)培養(yǎng)的DNA混合，轉(zhuǎn)移到電穿孔杯(間隙寬0.4cm)并在室溫下培養(yǎng)10分鐘。電穿孔(210V，975μF，BioRad GenePulser)之后，將該電穿孔杯在37℃下培養(yǎng)另外10分鐘，之后將這些細(xì)胞接種于預(yù)熱培養(yǎng)基中。
為了明確地顯示在實(shí)驗(yàn)開始和分析之間還未分裂的這些細(xì)胞被轉(zhuǎn)染，按照所述方法用pMACS 4.1(人CD4的表達(dá)載體)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，并且對細(xì)胞分裂的評價如下轉(zhuǎn)染之前，通過在1μM羧基熒光素二乙酸琥珀酰亞胺酯(CFDA，SE)(Molecular Probes，Eugene，USA)中培養(yǎng)將細(xì)胞標(biāo)記上綠色熒光。通過細(xì)胞分裂使細(xì)胞亮度降低至50％。使用流式細(xì)胞器(FACSCalibur)在單細(xì)胞水平上測得，未分裂的細(xì)胞(100％綠色熒光)也表達(dá)轉(zhuǎn)染的基因(用與Cy5偶聯(lián)的抗-CD4抗體染色之后為暗紅色熒光)。
實(shí)施例2PNA-NLS與現(xiàn)有載體序列的快速結(jié)合將PNA-肽-雜種與雙鏈DNA偶聯(lián)。
現(xiàn)有載體序列可以經(jīng)PNA用NLS-肽幾乎定量地(90％)標(biāo)記5分鐘。為了實(shí)現(xiàn)經(jīng)PNA的熱不穩(wěn)定性組分的結(jié)合，在37℃下培養(yǎng)1小時就足夠標(biāo)記大多數(shù)DNA(表1)。
將100ng表達(dá)載體在TE(pH7.8)中用25μM的不同PNA-肽-雜種在65℃或者37℃下培養(yǎng)5分鐘-3小時。這里所用的PNA序列NH2-CTCTTCCTTTTTC-COOH(SEQ ID NO6)與氨芐青霉素抗性基因的啟動子結(jié)合。
在其C-端定位一21個氨基酸的肽(肽1)或一27個氨基酸的肽(肽2)或者一10AEEA-單位的間隔(Fmoc-AEEA-OH間隔，PerSeptive生物系統(tǒng)公司，F(xiàn)ramingham，USA)，之后是一27個氨基酸的肽(肽3)。接著用限制性核酸內(nèi)切酶Earl進(jìn)行結(jié)合測定。限制酶切DNA用YOYO(Molecular Probes，Inc.，Eugene，OR，USA)染色，在瓊脂糖凝膠上分離并用熒光掃描器(ImagePlate Reader FLA 2000，分析軟件L-Process，1.6版，東京富氏膠卷有限公司)定量。DNA經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶Earl的裂解在PNA結(jié)合位點(diǎn)受到抑制。其它Earl限制位點(diǎn)用作該反應(yīng)的內(nèi)部控制。
℃分鐘肽1 肽2肽35 94％96％ 91％65 10 96％97％ 95％15 96％97％ 95％60 85％90％ 74％37 12091％91％ 76％18094％94％ 90％表1以輸入DNA的百分?jǐn)?shù)顯示的肽標(biāo)記DNA的部分PNA與DNA的結(jié)合反應(yīng)簡單、強(qiáng)烈且快速。這種結(jié)合幾乎不可逆，并且因此適合細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)過程。與蛋白質(zhì)比較，肽和PNA合成的費(fèi)用不會太高并且可以容易且長時間地貯藏。
實(shí)施例3使用PNA-NLS轉(zhuǎn)染在分裂細(xì)胞系中，與未經(jīng)轉(zhuǎn)運(yùn)的DNA相比，轉(zhuǎn)染DNA的主動核轉(zhuǎn)運(yùn)誘發(fā)其較快的表達(dá)。假如該轉(zhuǎn)染DNA在細(xì)胞質(zhì)中存活時間足夠長，則轉(zhuǎn)染DNA在有和沒有核轉(zhuǎn)運(yùn)試劑的快速分裂細(xì)胞中的表達(dá)速度應(yīng)逐漸地接近。其原因是留在細(xì)胞質(zhì)中的轉(zhuǎn)染DNA在細(xì)胞分裂過程中可以到達(dá)其核中。使用阿非迪霉素可以大大降低細(xì)胞的分裂活性和轉(zhuǎn)染能力。主動核轉(zhuǎn)運(yùn)可消除這種轉(zhuǎn)染效率降低的影響。
為了電穿孔，將5μg溶于水中的線性化載體-DNA在有或者沒有25μMPNA-NLS(肽3NH2-(AEEA)10-GKPSSDDEATADSQHSTPPKKKRKVED-COOH)的最終體積10μl中在65℃下培養(yǎng)10分鐘。下面的步驟如實(shí)施例1中所述。
為了脂轉(zhuǎn)染，將3μg溶于水中的載體-DNA在有或者沒有25μM PNA-NLS(肽3)的最終體積10μl中在65℃下培養(yǎng)10分鐘。按照廠家說明用脂轉(zhuǎn)染胺試劑(Life Technologies GmbH，Karlsruhe)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。
為了基本上抑制CHO細(xì)胞的分裂，在沒有血清情況下將細(xì)胞培養(yǎng)24小時，之后用血清和20μg/ml阿非迪霉素(Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Deisenhofen)培養(yǎng)12小時。所有隨后的脂轉(zhuǎn)染步驟都是在有20μg/ml阿非迪霉素的情況下進(jìn)行的。轉(zhuǎn)染結(jié)果示于
圖1中。
雖然僅有幾個細(xì)胞分裂，但是與存在于大多數(shù)表達(dá)載體中的序列偶聯(lián)的兩個電中性NLS在轉(zhuǎn)染之后早期能夠使轉(zhuǎn)染細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)加倍。因使用阿非迪霉素細(xì)胞分裂速度降低而引起的轉(zhuǎn)染效率的降低可以以這種方式消除。
實(shí)施例4序列特異性結(jié)合NLS-融合蛋白使用大腸桿菌lac阻抑物的高親和結(jié)合突變體作為序列特異性DNA-結(jié)合蛋白。該突變體對lac操縱基因序列具有10-15M的結(jié)合常數(shù)(Kolkhof，1992)。該高親和力是通過絲氨酸61被亮氨酸替換實(shí)現(xiàn)的。
這里所用的核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白缺失最后30個C-端氨基酸(位置331-360)并且位置330的亮氨酸被絲氨酸替換。這些突變蛋白形成同型二聚體，而不是同型四聚體，因此含有單個DNA-結(jié)合位點(diǎn)，而不是兩個位點(diǎn)。但是也可以使用四聚體作為本發(fā)明的核轉(zhuǎn)運(yùn)劑。
這些二聚體變體各自在N-端延伸作為一個NLS“N1D”NLS1MPKKKRKV-MKPVTLYDVA...
“N2D”NLS2MEEDTPPKKKRKVEDL-KPVTLYDVA...
(這些NLS-序列以黑體顯示并且分別相應(yīng)于SEQ ID NO8和SEQ IDNO9。序列MKPVTLYDVA...和KPVTLYDVA...表示上述大腸桿菌lac阻抑物。)NLS1相應(yīng)于SV40病毒大T抗原的NLS。NLS2代表具有中性凈電荷且由SV40-NLS和來自多瘤病毒VP2-蛋白的NLS的N-端側(cè)翼區(qū)組成的雜種。
lac-操縱基因-序列可以在大量表達(dá)載體中發(fā)現(xiàn)并且能夠容易地與任意序列相連作為PCR引物的突出端。
實(shí)施例5含有NLS的lac-阻抑物突變體的DNA結(jié)合將以下lac-操縱基因-序列用于結(jié)合測定天然存在的操縱基因AATTGTGAGC GGATAACAATT和一完全回文操縱基因-序列AATTGTGAGC GCTCACAATT。
將0.7ng長1kb的放射性標(biāo)記DNA-片段經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶裂解成914bp和86bp長的片段，然后在室溫下分別用lac-阻抑物NLS-1-二聚體或NLS-2-二聚體培養(yǎng)30分鐘。然后在聚丙烯酰胺凝膠上將這些片段分離(圖2)。含有l(wèi)ac-操縱基因的86bp-片段因特異性結(jié)合而受到阻礙。非特異性結(jié)合導(dǎo)致缺乏lac-操縱基因的914bp-片段受到阻礙。在完全特異性結(jié)合的情況下，幾乎觀察不到任何非特異性結(jié)合。
其它實(shí)驗(yàn)證實(shí)，使用不同條件，例如在細(xì)胞培養(yǎng)基PPMI、150mM氯化鈉或由10mM Tris/HCl(pH7.2)、10mM氯化鉀和3mM乙酸鎂的緩沖液中用兩個測定的操縱基因-序列都達(dá)到了穩(wěn)定的結(jié)合。
實(shí)施例6DNA通過lac-阻抑物-NLS的核轉(zhuǎn)運(yùn)將約8μg(100pmol)lac-阻抑物-NLS-突變體用2μg(100pmol)長30bp的雙鏈DNA培養(yǎng)，在兩端用熒光染料Cy5在室溫下在總體積300μl的10mMTris/HCl(pH7.2)、10mM KCl、3mM乙酸鎂和50μg/ml BSA中標(biāo)記30分鐘。通過一Microcon-filter(Amicon)離心將未結(jié)合的DNA分離。然后將樣品緩沖液改變?yōu)榧?xì)胞注射緩沖液(76mM K2HPO4，17mM KH2PO4，14mMNaH2PO4(pH 7.2))。
將一由與lac-阻抑物-突變體結(jié)合的DNA和熒光素標(biāo)記的BSA(BSA-FITC)組成的混合物分別微量注射(帶Femtotips的EppendorfTransjektor 5246，直徑為0.5μm，注射壓力為55hPa，注射時間為0.5秒)到50個NIH3T3-細(xì)胞中。注射10-15分鐘之后，經(jīng)熒光顯微鏡檢查分析細(xì)胞(圖3)。在成功注射到細(xì)胞質(zhì)中之后，僅BSA-FITC留在細(xì)胞質(zhì)中(1a、2a和3a)。與lac-阻抑物-NLS-突變體結(jié)合導(dǎo)致可以分析的幾乎所有細(xì)胞，在少于15分鐘(NLS1-二聚體，2b)和少于10分鐘(NLS2-二聚體，3b)內(nèi)分別將DNA轉(zhuǎn)運(yùn)到核中時，幾乎沒有DNA留在細(xì)胞質(zhì)中。對照證實(shí)，沒有結(jié)合蛋白質(zhì)的標(biāo)記DNA留在細(xì)胞質(zhì)中(1b)。
實(shí)施例7用lac-阻抑物-NLS轉(zhuǎn)染將1μg長1.1kb且含有一完全表達(dá)基因盒和后接一完全回文lac-操縱基因-序列的多腺苷酸序列的線性DNA在50μl等滲0.5×RPMI(用于脂轉(zhuǎn)染)或150mM NaCl(用于使用聚乙烯亞胺的轉(zhuǎn)染)中與不同濃度的lac-阻抑物-蛋白質(zhì)(分別為約2.5μg、0.3μg和0.15μg二聚體，以及5μg、0.6μg或0.3μg四聚體)一起在室溫下培養(yǎng)30分鐘。按照廠家說明將樣品與脂轉(zhuǎn)染胺試劑(Life Technologies)或聚乙烯亞胺(PEI、ExGen 500、Fermentas)復(fù)合并添加到融合NIH3T3-細(xì)胞中。結(jié)果示于圖4。
轉(zhuǎn)染后4小時測定的轉(zhuǎn)染效率可以由lac-阻抑物-NLS增加3-4倍。在本文所述的實(shí)施例中，轉(zhuǎn)染前，培養(yǎng)粘著NIH3T3細(xì)胞至融合，使得細(xì)胞分裂大大受到抑制。轉(zhuǎn)染后4小時，僅有幾個細(xì)胞分裂。另外，由于以下事實(shí)使在本實(shí)施例中無論如何受到限制的分裂速度對轉(zhuǎn)染有關(guān)的時間減少經(jīng)胞吞作用攝取的轉(zhuǎn)染DNA不得不留在胞內(nèi)體和隨后與陽離子轉(zhuǎn)染試劑的復(fù)合物中，之后它可被轉(zhuǎn)運(yùn)到待表達(dá)的核中。脂轉(zhuǎn)染胺試劑-DNA-復(fù)合物的存留時間可能要比與聚乙烯亞胺的DNA-復(fù)合物的存留時間明顯長，這使得使用脂轉(zhuǎn)染胺試劑的lac-阻抑物-NLS的作用不太清楚。24小時后大多數(shù)細(xì)胞分裂一次，此后有和沒有核轉(zhuǎn)運(yùn)試劑的轉(zhuǎn)染DNA的表達(dá)速度漸漸接近。
參考文獻(xiàn)Batterson，W.、Furlong，D.和Roizman，B.(1983)“單純皰疹病毒的分子遺傳學(xué)。VIII.在釋放病毒DNA和病毒再生循環(huán)的其它階段有缺陷的溫度敏感性突變體的進(jìn)一步表征。”《病毒學(xué)雜志》45397Boulikas，T.(1993)“核定位信號(NLS)?！盋rit.Rev.Euk.GeneExpr.3193Boulikas，T.(1996)“蛋白激酶和細(xì)胞周期蛋白的核輸入。”《細(xì)胞生物化學(xué)雜志》6061Boulikas，T.(1997)“DNA修復(fù)蛋白的核輸入?！薄犊拱┭芯俊?7843Chen，Y.-R.、Lees-Miller，S.P.、Tegtmeyer，P.和Anderson，C.W.(1991)“在氨基和羧基末端位置人DNA激活的蛋白激酶磷酸化猿猴病毒40T抗原。”《病毒學(xué)雜志》655131Citovsky，V.、Warnick，D.和Zambryski，P.(1994)“土壤桿菌VirD2和VirE2蛋白在玉米和煙草中的核輸入?！薄睹绹鴩铱茖W(xué)院院報》913210Collas，P.、Husebye，H.和Alestrm，P.(1996)“SV40 T抗原的核定位序列促進(jìn)轉(zhuǎn)基因攝取以及在斑馬魚胚胎核中的表達(dá)?！薄锻蛔冄芯俊?451Collas，P.和Alestrm，P.(1996)“SV40 T抗原的核定位信號在體外指導(dǎo)質(zhì)粒DNA輸入到海膽雄性原核中?！盡ol.Repr.Dev.45431Collas，P.和Alestrm，P.(1997a)“通過SV40 T抗原的核定位信號將質(zhì)粒DNA快速導(dǎo)向斑馬魚胚胎核中。”Mol.Mar.Biol.Biotech.648Collas，P.和Alestrm，P.(1997b)“核定位信號在斑馬魚中核轉(zhuǎn)運(yùn)質(zhì)粒DNA的驅(qū)動力。”Biochem.Cell.Biol.75633Dowty，M.E.、Williams，P.、Zhang，G.、Hagstrom，J.E.和Wolff，J.A.(1995)“質(zhì)粒進(jìn)入原始大鼠肌管的分裂期后核中?！薄睹绹鴩铱茖W(xué)院院報》924572Ellison，V.和Brown，P.O.(1994)“在整合酶和病毒DNA端之間的一穩(wěn)定復(fù)合物在體外介導(dǎo)人免疫缺陷病毒整合?！薄睹绹鴩铱茖W(xué)院院報》917316Emi，N.、Kidoaki，S.、Yoshikawa，K.、Saito，H.(1997)“經(jīng)多精氨酸介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移需要形成DNA聚集體的大載體-復(fù)合物。”Biochem.Biophys.Res.Commun.231421-424Fieck，A.、Wyborski，D.L.和Short，J.M.(1992)“用于在真核細(xì)胞中表達(dá)的大腸桿菌Lac阻抑物的修飾核信號序列對蛋白質(zhì)活性和核累積的影響?！薄逗怂嵫芯俊?01785Friedmann，T.(1994)“神經(jīng)病癥的基因療法?！薄哆z傳學(xué)趨勢》10210Friedmann，T.(1996)“人基因療法-一種未成熟基因，但是一定不在瓶中?！薄短烊凰幬铩?144Fritz，J.D.、Herweijer，H.、Zhang，G.和Wolff，J.A.(1996)“使用組蛋白凝聚的質(zhì)粒DNA將基因轉(zhuǎn)移到哺乳動物細(xì)胞中?！薄度嘶虔煼ā?1395Gallay，P.、Stitt，V.、Mundy，C.、Oettinger，M.和Trono，D.(1996)“karyopherin途徑在I型人免疫缺陷病毒核輸入中的作用。”《病毒學(xué)雜志》701027Greber，U.F.、Willetts，M.、Webster，P.和Helenius，A.(1993)“腺病毒2在進(jìn)入細(xì)胞過程中逐步分解?！薄都?xì)胞》75477Grlich，D.、Henklein，P.、Laskey，R.A.和Hartmann，E.(1996)“輸入素-a中的一41個氨基酸基元能與輸入素-b結(jié)合，由此轉(zhuǎn)運(yùn)到核中?！薄禘MBO雜志》151810Grlich D.(1998)“向細(xì)胞核中轉(zhuǎn)運(yùn)和從細(xì)胞核中運(yùn)出?！薄禘MBO雜志》172721Jans，D.A.、Ackerfmann，M.J.、Bischoff，J.R.、Beach，D.H.和Peters，R.(1991)“在T124的p43cdc2-介導(dǎo)的磷酸化抑制了SV-40 T抗原蛋白的核輸入。”《細(xì)胞生物學(xué)雜志》1151203Kaneda，Y.、Iwai，K.和Uchida，T.(1989)“在成年大鼠肝臟中與核蛋白共引入的DNA的增量表達(dá)。”《科學(xué)》243375Kolkhof，P.(1992)“3個牢固結(jié)合的Lac阻抑物的特異性。”《核酸研究》205035Lanford，R.E.、Kanda，P.、Kennedy，R.C.(1986)“用與SV40 T抗原轉(zhuǎn)運(yùn)信號同源的合成肽誘導(dǎo)核轉(zhuǎn)運(yùn)?！薄都?xì)胞》46575-582Mistry，A.R.、Falciola，L.、Monaco，L.、Tagliabue，R.、Acerbis，G.、Knight，A.、Harbottle，R.P.、Soria，M.、Bianchi，M.E.、Coutelle，C.和Hart，S.L.(1997)“在巴斯德畢赤氏酵母中產(chǎn)生的重組HMG1蛋白一種非病毒基因轉(zhuǎn)運(yùn)劑?！薄渡锛夹g(shù)》22718Nakanishi，A.、Clever，J.、Yamada，M.、Li，P.P.和Kasamatsu，H.(1996)“與衣殼蛋白結(jié)合啟動猿猴病毒40 DNA核導(dǎo)向?！薄睹绹鴩铱茖W(xué)院院報》9396Naldini，L.、Blmer，U.、Gallay，P.、Ory，D.、Mulligan，R.、Gage，F(xiàn).H.、Verma，I.M.、Trono，D.(1996)“通過慢病毒載體在體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)基因和穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)非分裂性細(xì)胞。”《科學(xué)》272263Neumann，G.、Castrucci，M.R.和Kawaoka，Y.(1997)“流感病毒核蛋白的核輸入和輸出?！薄恫《緦W(xué)雜志》719690Nielson，P.、Egholm，M.、Berg，R.H.和Buchardt，O.(1991)“通過用一胸腺嘧啶取代的聚酰胺的鏈替換序列選擇性地識別DNA?！薄犊茖W(xué)》2541497Niidome，T.、Ohmori，N.、Ichinose，A.、Wada，A.；Mihara，H.、Hirayama，T.；Aoyagi，H.(1997)“陽離子α-螺旋肽與質(zhì)粒DNA的結(jié)合及其向細(xì)胞中的基因轉(zhuǎn)移能力。”《生物化學(xué)雜志》27215307-15312Rihs，H.-P.和Peters，R.(1989)“核轉(zhuǎn)運(yùn)動力學(xué)取決于含磷酸化位點(diǎn)且側(cè)翼有猿猴病毒40 T抗原的親核序列?！薄禘MBO雜志》81479Rihs，H.-P.、Jans，D.A.、Fan，H.和Peters，R.(1991)“通過側(cè)翼有SV40 T-抗原的核定位序列的酪蛋白激酶II位點(diǎn)測定核細(xì)胞質(zhì)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)的速度?！薄禘MBO雜志》10633Shuman，S.(1994)“使用牛痘DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶分子克隆和多核苷酸合成的新方案。”《生物化學(xué)雜志》26932678Sebastyén，M.G.、Ludtke，J.J.、Bassik，M.C.、Zhang，G.、Budker，V.、Lukhtanov，E.A.、Hagstrom，J.E.和Wolff，J.A.(1998)“DNA載體化學(xué)信號肽與質(zhì)粒DNA的共價結(jié)合?！薄短烊簧锛夹g(shù)》1680Sorgi，F(xiàn).L.、Bhattacharya，S.、Huang，L.(1997)“硫酸魚精蛋白促進(jìn)脂類介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移。”《基因療法》4961-968Trubetskoy，V.S.、Budker，V.G.、Hanson，L.J.、Slattum，P.M.、Wolff，J.A.、Hagstrom，J.E.(1998)“利用模板聚合作用自裝配DNA-聚合物復(fù)合物。”《核酸研究》264178-4185Wadhwa，M.S.、Collard，W.T.、Adami，R.C.、McKenzie，D.L.、Rice，K.G.(1997)“肽介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)運(yùn)肽結(jié)構(gòu)對基因表達(dá)的影響”《生物綴合化學(xué)》881-88Wang，P.、Palese，P.和O’Neill，R.E.(1997)“在A型流感病毒核蛋白上的NPI-1/NPI-3(Karyopherin a)結(jié)合位點(diǎn)為一非常規(guī)核定位信號。”《病毒學(xué)雜志》711850Weiss，K.、Ryder，U.和Lamond，A.I.(1997)“hSRPla的保守氨基端結(jié)構(gòu)域?qū)说鞍纵斎胧潜夭豢缮俚??！薄禘MBO雜志》151818Wilke，M.、Fortunati，E.、van den Broek，M.、Hoogeveen，A.T.和Scholte，B.J.(1996)“肽基轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的功效取決于有絲分裂活性?！薄痘虔煼ā?11133-1142Xiao，C.-Y.、Hübner，S.和Jans，D.A.(1997)“通過側(cè)翼有核定位序列的雙鏈DNA-依賴性蛋白激酶位點(diǎn)(絲氨酸120)調(diào)節(jié)SV40大腫瘤抗原核輸入?！薄渡锘瘜W(xué)雜志》27222191Yoneda，Y.、Arioka，T.、Imamoto-Sonobe，N.、Sugawa，H.、Shimonishi，Y.、Uchida，T.(1987)“在核定位中所涉及的含SV40大T-抗原區(qū)的合成肽指導(dǎo)蛋白質(zhì)向核中轉(zhuǎn)運(yùn)?！薄都?xì)胞研究實(shí)驗(yàn)》170439-452Yoneda，Y.、Semba，T.、Kaneda.Y.、Noble，R.L.、Matsuoka，Y.、Kurihara，T.、Okada，Y.和Imamoto，N.(1992)“含有核定位信號及其SV40 T-抗原的側(cè)翼序列的長合成肽有效地指導(dǎo)IgM向核中轉(zhuǎn)運(yùn)。”《細(xì)胞研究實(shí)驗(yàn)》201313引證的專利Dzau，V.J.和Kaneda，Y.(1997)“通過脂質(zhì)體在體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)治療劑的方法?！盢 no.5631237Gerhard，F(xiàn).、Kuhn C-S.、Mittenbühler，K和AppelK.(Offenlegungsschrift vom 1997年5月15日)DE19541679A1Gopal，T.V.(1997)“肽介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移”US5670347Hawley-Nelson，P.、Lan，J.、Shih，P.J.、Jessee，J.A.和Schifferli，K.P.(1998)“肽強(qiáng)化的陽離子脂轉(zhuǎn)染”US5736392Nielson，P.E.、Buchardt，O.、Egholm，M.和Berg，R.H.(1996)“肽核酸”US5539082Szoka，F(xiàn).C.Jr.“自裝配的多核苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)”(PCT，1993年10月14日)WO93/19768，其中的權(quán)利要求23-27
序列表<110>AMAXA GmbH<120>轉(zhuǎn)運(yùn)核酸通過核被膜的細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的用途<130>201-1(1)<140><141><150>DE 199 00 513.3<151>1999-01-08<150>DE 199 33 939.2<151>1999-07-20<160>9<210>1<211>21<212>PRT<213>人工序列<220><223><400>1Gly Lys Pro Thr Ala Asp Asp Gln His Ser Thr Pro Pro Lys Lys Lys15 10 15Arg Lys Val Glu Asp20<210>2<211>27<212>PRT<213>人工序列<220><223><400>2Gly Lys Pro Ser Ser Asp Asp Glu Ala Thr Ala Asp Ser Gln His Ser15 10 15Thr Pro Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Glu Asp20 25<210>3<211>13<212>DNA<213>人工序列<220><223>DNA為PNA(肽核酸)<400>3cctttctccc ttc 13<210>4<211>13<212>DNA<213>人工序列<220><223>DNA為PNA(肽核酸)<400>4ctcttccttt ttc13<210>5<211>17<212>DNA/PRT<213>人工序列<220><223>DNA為PNA；混合肽/PNA序列<400>5ccttt Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly tttcc 17<210>6<211>13<212>DNA<213>人工序列<220><223>DNA為PNA<400>6ctcttccttt ttc13<210>7<211>27<212>PRT<213>人工序列<220><223><400>7Gly Lys Pro Ser Ser Asp Asp Glu Ala Thr Ala Asp Ser Gln His Ser15 10 15Thr Pro Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Glu Asp20 25<210>8<211>8<212>PRT<213>人工序列<220><223>序列相應(yīng)于SV40病毒大T抗原的NLS<400>8Met Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val15<210>9<211>16<212>PRT<213>人工序列<220><223>序列相應(yīng)于由SV40 NLS和來自多瘤病毒VP2蛋白的NLS的N-端側(cè)翼區(qū)組成的中性雜種<400>9Met Glu Glu Asp Thr Pro Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Glu Asp Leu15 10 1權(quán)利要求
1.一種核轉(zhuǎn)運(yùn)劑，由兩個模件A和B組成，其中模件A與DNA特異性結(jié)合，并且不導(dǎo)致形成含一個以上DNA分子的復(fù)合物，并且其中模件B含有不介導(dǎo)該核轉(zhuǎn)運(yùn)劑與該DNA非特異性結(jié)合的核定位信號。
2.如權(quán)利要求1的核轉(zhuǎn)運(yùn)劑，其中模件A序列特異性地與DNA結(jié)合。
3.如權(quán)利要求1的核轉(zhuǎn)運(yùn)劑，其中模件A特異性地與DNA端結(jié)合。
4.如權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的核轉(zhuǎn)運(yùn)劑，其中模件A為肽、蛋白質(zhì)或PNA(肽核酸)。
5.如權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的核轉(zhuǎn)運(yùn)劑，其中模件B含有一因其電荷不與DNA形成復(fù)合物的延長核定位信號。
6.如權(quán)利要求5的核轉(zhuǎn)運(yùn)劑，其中模件B含有一具有幾乎中性凈電荷的延長核定位信號。
7.如權(quán)利要求6的核轉(zhuǎn)運(yùn)劑，其中模件B含有一延長核定位信號，它含有核定位信號和側(cè)翼帶負(fù)電荷的氨基酸。
8.如權(quán)利要求5-7任一項(xiàng)的核轉(zhuǎn)運(yùn)劑，其中模件B除了含有核定位信號或延長核定位信號之外，還含有不直接屬于核定位信號的肽序列或非肽組分。
9.如權(quán)利要求1的核轉(zhuǎn)運(yùn)劑，其中模件A為PNA，模件B含有代替NLS信號或除NLS信號之外的非NLS信號。
10.如權(quán)利要求1的核轉(zhuǎn)運(yùn)劑，其中模件A為一以序列特異性方式與DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)，模件B含有代替NLS信號或除NLS信號之外的非NLS信號。
11.如權(quán)利要求9的核轉(zhuǎn)運(yùn)劑，其中非NLS信號選自能夠介導(dǎo)DNA攝取的細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)的配體、使膜去穩(wěn)定化的肽和在細(xì)胞中介導(dǎo)與轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)結(jié)合的信號，以及引起保留在核中的信號。
12.一種基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，含有權(quán)利要求1-11任一項(xiàng)的核轉(zhuǎn)運(yùn)劑和一陽離子脂質(zhì)、肽、多胺或陽離子聚合物。
13.一種將DNA轉(zhuǎn)運(yùn)到真核細(xì)胞的核中的方法，其中所述細(xì)胞用待轉(zhuǎn)運(yùn)的DNA和權(quán)利要求1-1 1任一項(xiàng)的核轉(zhuǎn)運(yùn)劑轉(zhuǎn)染。
14.如權(quán)利要求13的方法，其中所述真核細(xì)胞為初級細(xì)胞。
15.一種含有權(quán)利要求1-11任一項(xiàng)的核轉(zhuǎn)運(yùn)劑的藥用組合物。
16.權(quán)利要求1-11任一項(xiàng)的核轉(zhuǎn)運(yùn)劑在基因療法中的用途。
17.權(quán)利要求1-11任一項(xiàng)的核轉(zhuǎn)運(yùn)劑在治療癌癥、病毒感染、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、移植排斥和單基因或多基因遺傳疾病的基因療法中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種核轉(zhuǎn)運(yùn)劑、一種含有所述核轉(zhuǎn)運(yùn)劑的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)、一種使用所述核轉(zhuǎn)運(yùn)劑將DNA轉(zhuǎn)運(yùn)到真核細(xì)胞核中的方法以及所述核轉(zhuǎn)運(yùn)劑在治療癌癥、病毒感染、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、移植排斥和單基因或多基因遺傳疾病的基因療法中的用途。
文檔編號A61P35/00GK1339068SQ00803447
公開日2002年3月6日 申請日期2000年1月3日 優(yōu)先權(quán)日1999年1月8日
發(fā)明者G·希本科頓, R·克里斯汀 申請人:阿馬克薩有限公司