專利名稱：血清β的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及血清β2-糖蛋白I作為促溶栓活性物質(zhì)的應(yīng)用及其功能肽段。
心血管病被稱為是威脅人類健康與生命的第二殺手，血栓的產(chǎn)生與發(fā)展既是心血管疾病發(fā)生的重要環(huán)節(jié)，又是造成中風(fēng)，心肌梗塞的直接原因。溶栓藥物的開發(fā)研究一直在心血管疾病防治的研究中處于重中之重的位置，而且在相當(dāng)長時期內(nèi)都將是生物工程研究與產(chǎn)品開發(fā)的重點(diǎn)。
機(jī)體存在著凝血與纖溶(使凝血塊溶解)兩個對立與統(tǒng)一的系統(tǒng)，維持和調(diào)節(jié)兩者間的平衡，保證血液循環(huán)的暢通?；跈C(jī)體具有的這種凝血與纖溶機(jī)制，人們研究與開發(fā)防止血栓形成和溶(血)栓方法和藥物。目前國內(nèi)外最廣泛使用的有效的溶栓生物制品有組織纖維蛋白溶酶原激活劑(tPA)，尿激酶(uPA)，鏈激酶等，它們都是基于這樣的機(jī)制血液中不具活性的血纖維蛋白溶酶原(plasminogen)在其激活因子(tPA，uPA)的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂谢钚缘难w維蛋白酶(plasmin)，后者能夠溶解由血纖維蛋白形成的凝血塊[1.Machovich，R.，Litwiller，R.D.and Owen，W.G.(1992)Biochemistry.31，11558-11561；2.Hoylaerts，M.，Rijken，D.C.，Lijnen，HR.and Collen，D.(1982)J.Biol.Chem.257，2912-2919.]。但是，現(xiàn)有上述溶栓藥物普遍存在藥效持續(xù)時間短，給藥量小時療效不佳，而大劑量使用又會損傷機(jī)體凝血機(jī)制的缺點(diǎn)。
事實(shí)上，在體外實(shí)驗(yàn)中，如果沒有某些輔助因素(cofactors)存在，血纖維蛋白溶酶原-tPA/uPA纖溶體系(plasminogen-tPA/uPA fibrinolysis system)的纖溶活性很低。因此，在機(jī)體內(nèi)應(yīng)該存在有促進(jìn)或激活纖溶體系的活性物質(zhì)。目前發(fā)現(xiàn)的相關(guān)輔助因素或因子有三類形成血凝塊的纖維蛋白本身(fibrin)，某些細(xì)胞膜表面受體聚合體(如annexin II complex)，某些高溫等激烈處理產(chǎn)生的不可逆變性蛋白[1.Machovich，R.and Owen，W.G.(1997)Arch.Biochem.Biophy.344，343-349；2.Ellis，V.(1997)TCM，7(7)，227-234.]。然而，它們都不是天然的可溶性血清活性因子，與人體的親和和相容性均存在著問題，顯然不宜開發(fā)為臨床應(yīng)用的促溶(血)栓活性物質(zhì)藥物。
本發(fā)明的目的是提供血清β2-糖蛋白I作為促溶栓活性物質(zhì)的應(yīng)用。
本發(fā)明的另一個目的是提供上述血清β2-糖蛋白I作為促溶栓活性物質(zhì)的功能肽段。
血清β2-糖蛋白I可以作為促溶栓活性物質(zhì)而得到廣泛應(yīng)用，特別是應(yīng)用于制造各類的溶栓藥物。
血清β2-糖蛋白I與磷脂的復(fù)合物或載有血清β2-糖蛋白I的脂質(zhì)體、與組織纖維蛋白溶酶原激活劑或尿激酶結(jié)合的復(fù)合物以及該復(fù)合物進(jìn)一步與磷脂結(jié)合的復(fù)合物，均具有溶栓的作用，可以利用其作為活性成分，生產(chǎn)具有溶栓功能的藥物。
血清β2-糖蛋白I作為促溶栓活性物質(zhì)的功能肽段為Gly1-Pro62，其主要作用肽段為Ser38-Arg-Gly-Gly-Met-Arg-Lys44和Cys47-Pro-Leu-Thr-Gly-Leu-Typ-Pro-Ilu-Asn-Thr-Leu-Lys-Cys60。利用該肽段可以生產(chǎn)具有溶栓功能的藥物。
血清β2-糖蛋白I作為促溶栓活性物質(zhì)的結(jié)構(gòu)域V的功能肽段為Cys270-Ala320，其主要作用肽段為Cys281-Lys-Asn-Lys-Glu-Lys-Lys-Cys288和Lys305-Cys-Phe-Lys-Glu-His-Ser-Ser-Leu-Ala-Phe-Trp-Lys-Thr-Asp-Ala320。利用該肽段也可以生產(chǎn)具有溶栓功能的藥物。
本發(fā)明的促溶(血)栓活性物質(zhì)(promoting fibrinolysis activators，血清β2-糖蛋白I)是由血清提取純化和基因工程生產(chǎn)的β2-糖蛋白I(β2-GlycoprotainI)，也稱載脂蛋白H(apolipoprotein H，簡稱ApoH)。該分子為一種單鏈蛋白分子，具有326個氨基酸，分子量為43-50KD。其氨基酸序列及提純、制備方法見Lozier，J.，Takahashi，N.and Putnam，F(xiàn).W.(1984)Proc.Natl.Sci.USA，81，3640-3644.
研究表明，ApoH的相關(guān)肽段Gly1-Pro62(CCP1)[Schwarzenbacher，R.，Zeth，K.，Diederichs，K.，Gries，A.，Kostner，G.M.，Laggner，P.And Prassl R.(1999)EMBO J.，18，6228-6239.]的主要作用肽段為Ser38-Arg-Gly-Gly-Met-Arg-Lys44(CCP1-1)，和Cys47-Pro-Leu-Thr-Gly-Leu-Typ-Pro-Ilu-Asn-Thr-Leu-Lys-Cys60(CCP1-2)。ApoH的結(jié)構(gòu)域V(domain V，Ser244-Cys326，D.V)[Schwarzenbacher，R.，Zeth，K.，Diederichs，K.，Gries，A.，Kostner，G.M.，Laggner，P.And Prassl R.(1999)EMBO J.，18，6228-6239.]，尤其Cys270-Ala320(D.V-1)，其主要作用肽段為Cys281-Lys-Asn-Lys-Glu-Lys-Lys-Cys288(D.V-2)和Lys305-Cys-Phe-Lys-Glu-His-Ser-Ser-Leu-Ala-Phe-Trp-Lys-Thr-Asp-Ala320(D.V-3)。上述肽段在β2-糖蛋白I的功能上起重要作用。
實(shí)驗(yàn)證明，在沒有其它輔助因素(cofactors)存在的情況下，加入本發(fā)明的血清β2-糖蛋白I或其功能肽段，顯著促進(jìn)tPA活化血纖維蛋白溶酶原為血纖維蛋白溶酶，進(jìn)而激活和顯著提高血纖維蛋白溶酶原-tPA/uPA纖溶體系(plasminogen-tPA/uPA fibrinolysis system)的纖溶活性。
與不加血清β2-糖蛋白I的對照組相比較，在加入血清β2-糖蛋白I時，tPA促纖溶活性和血纖維蛋白溶酶原-tPA/uPA纖溶體系的纖溶活性均可大大提高，可高達(dá)20多倍，其活性的提高與加入的β2-糖蛋白I或其活性片斷存在效應(yīng)劑量關(guān)系。
本發(fā)明的血清β2-糖蛋白I或其活性片斷有雙向調(diào)節(jié)作用，不僅能夠提高血纖維蛋白溶酶原-tPA/uPA纖溶體系的纖溶活性，而且在一定劑量下，能夠降低由某些輔助因子(如annexinII)對血纖維蛋白溶酶原-tPA/uPA纖溶體系的纖溶活性的增強(qiáng)作用。
下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的具體實(shí)施例作進(jìn)一步說明。
圖1為實(shí)施例1的對比曲線圖2為實(shí)施例1當(dāng)加入不同濃度的ApoH時的促纖溶活力曲線圖3為實(shí)施例2的對比曲線圖4為實(shí)施例2當(dāng)加入不同濃度的ApoH時的促纖溶活力曲線圖5為顯示ApoH各活性片段促溶纖活性的直方圖在下面的所有實(shí)施例中，以熒光強(qiáng)度表示促纖溶活力，用I360/465nm表示，其中360nm是激發(fā)光，465nm是發(fā)射光，也可以用促纖溶活力的絕對速度K(I/Min2)表示，即強(qiáng)度與時間平方的比值。
實(shí)施例1ApoH對tPA-依賴的血纖維蛋白溶酶纖溶活性的影響實(shí)驗(yàn)反應(yīng)體系為250nM(100-500nM均可)血纖維蛋白溶酶原(plasminogen)25nM(10-50nM均可)tPA600nM(200-1000nM均可)血纖維蛋白酶的反應(yīng)底物(H-D-Val-Leu-Lys-AMC)實(shí)驗(yàn)組加入1μM ApoH(0.25-5μM均可)反應(yīng)溫度恒溫30℃(25℃-37℃均可)熒光光度測量激發(fā)光360nm/發(fā)射光465nm在反應(yīng)0-60分鐘期間內(nèi)，每隔5分鐘，測量一次反應(yīng)體系的熒光強(qiáng)度。
如圖1所示(曲線1為對照組，曲線2為實(shí)驗(yàn)組，橫坐標(biāo)是反應(yīng)時間的平方，縱坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度I360/465nm)，較之于不加ApoH的對照組，在加入了ApoH時，反應(yīng)產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度所表示的血纖維蛋白溶酶原-tPA/uPA纖溶體系的纖溶活性可大大提高，最高可達(dá)20多倍。當(dāng)用上述操作方法，實(shí)驗(yàn)組中加入0.2-10.0μM不同濃度的ApoH時，如圖2所示(橫坐標(biāo)為ApoH的濃度，縱坐標(biāo)為促纖溶活力K(I/Min2)，圖中的各點(diǎn)表示實(shí)際測得的不同ApoH濃度下促纖溶活力K(I/Min2)的數(shù)字)，表明纖溶活性的提高與加入的β2-糖蛋白I存在效應(yīng)劑量關(guān)系，但當(dāng)β2-糖蛋白I的濃度達(dá)到一定時，反應(yīng)速度不再增加，保持穩(wěn)定，與上述的β2-糖蛋白I促纖溶的作用原理相吻合。
實(shí)施例2、ApoH對tPA促纖溶活性的影響實(shí)驗(yàn)反應(yīng)體系為30nM tPA(10-50nM均可)700nM(200-1000nM均可)的tPA反應(yīng)底物(Glutaryl-Gly-Arg-AMC)實(shí)驗(yàn)組加入0.5μM ApoH(0.25-5μM)反應(yīng)溫度恒溫32℃(25℃-37℃均可)熒光光度測量激發(fā)光360nm/發(fā)射光465nm在反應(yīng)0-60分鐘期間內(nèi)，每隔5分鐘，測量一次反應(yīng)體系的熒光強(qiáng)度。
如圖3所示(曲線3為對照組，曲線4為實(shí)驗(yàn)組，橫坐標(biāo)是反應(yīng)時間的平方，縱坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度I360/465nm)，較之于不加ApoH的對照組，在加入了ApoH時，反應(yīng)產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度所表示的tPA促纖溶活性可大大提高，最高可達(dá)20多倍。當(dāng)用上述操作方法，實(shí)驗(yàn)組中加入0.2-5.0μM不同濃度的ApoH時，如圖2所示(橫坐標(biāo)為ApoH的濃度，縱坐標(biāo)為促纖溶活力K，圖中的各點(diǎn)表示促纖溶活力K(I/Min2))，表明纖溶活性的提高與加入的β2-糖蛋白I存在效應(yīng)劑量關(guān)系。
實(shí)施例3ApoH各活性片段的促溶纖活性400nM(100-500nM均可)血纖維蛋白溶酶原(plasminogen)40nM(10-50nM均可)tPA 200-1000nM血纖維蛋白酶的反應(yīng)底物(H-D-Val-Leu-Lys-AMC)實(shí)驗(yàn)組分別加入1μM ApoH的相關(guān)片段CCP1，CCP1-1，CCP1-2和D.V，D.V-1，D.V-2，D.V-3。
反應(yīng)溫度恒溫30℃(25℃-37℃均可)熒光光度測量，激發(fā)光360nm/發(fā)射光465nm在反應(yīng)0-60分鐘期間內(nèi)，每隔5分鐘，測量一次反應(yīng)體系的熒光強(qiáng)度。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，較之于不加ApoH的對照組，在加入上述ApoH活性片段時，反應(yīng)產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度所表示的血纖維蛋白溶酶原-tPA/uPA纖溶體系的纖溶活性可有不同程度的提高。如圖5所示，為ApoH各活性片段在反應(yīng)體系中反應(yīng)60分鐘時的直方圖，橫坐標(biāo)依次為對照、CCP1、CCP1-1、CCP1-2、D.V、D.V-1、D.V-2和D.V-3，縱坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度I360/465 nm，可以看出，雖然各活性片段之間的纖溶活性有差別，但較對照組均有較大的提高。
權(quán)利要求
1.血清β2-糖蛋白I作為促溶栓活性物質(zhì)的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的血清β2-糖蛋白I的應(yīng)用，其特征在于所述血清β2-糖蛋白I應(yīng)用于制造溶栓類的藥物。
3.以血清β2-糖蛋白I作為活性成分的溶栓藥物。
4.血清β2-糖蛋白I與磷脂的復(fù)合物或載有血清β2-糖蛋白I的脂質(zhì)體。
5.以權(quán)利要求4所述的脂質(zhì)體為活性成分的溶栓藥物。
6.血清β2-糖蛋白I與組織纖維蛋白溶酶原激活劑或尿激酶的復(fù)合物。
7.權(quán)利要求6所述的復(fù)合物與磷脂形成的復(fù)合物。
8.以權(quán)利要求6所述的復(fù)合物為活性成分的溶栓藥物。
9.血清β2-糖蛋白I作為促溶栓活性物質(zhì)的功能肽段Gly1-Pro62，其主要作用肽段為Ser38-Arg-Gly-Gly-Met-Arg-Lys44，和Cys47-Pro-Leu-Thr-Gly-Leu-Typ-Pro-Ilu-Asn-Thr-Leu-Lys-Cys60。
10.以血清β2-糖蛋白I的促溶栓功能肽段Gly1-Pro62或其主要作用肽段Ser38-Arg-Gly-Gly-Met-Arg-Lys44，和Cys47-Pro-Leu-Thr-Gly-Leu-Typ-Pro-Ilu-Asn-Thr-Leu-Lys-Cys60作為活性成分的溶栓藥物。
11.血清β2-糖蛋白I作為促溶栓活性物質(zhì)的結(jié)構(gòu)域V的功能肽段Cys270-Ala320，其主要作用肽段為Cys281-Lys-Asn-Lys-Glu-Lys-Lys-Cys288和Lys305-Cys-Phe-Lys-Glu-His-Ser-Ser-Leu-Ala-Phe-Trp-Lys-Thr-Asp-Ala320。
12.以血清β2-糖蛋白I的結(jié)構(gòu)域V的功能肽段Cys270-Ala320或其主要作用肽段Cys281-Lys-Asn-Lys-Glu-Lys-Lys-Cys288和Lys305-Cys-Phe-Lys-Glu-His-Ser-Ser-Leu-Ala-Phe-Trp-Lys-Thr-Asp-Ala320作為活性成分的溶栓藥物。
全文摘要
本發(fā)明公開了血清β
文檔編號A61K38/14GK1359729SQ00135779
公開日2002年7月24日 申請日期2000年12月20日 優(yōu)先權(quán)日2000年12月20日
發(fā)明者蔡國平 申請人:清華大學(xué)