專利名稱：Eia－特定藥用化合物作為制備抗頭頸部腫瘤藥物的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基因與特定化學(xué)治療藥物聯(lián)合應(yīng)用以提高對(duì)頭頸部腫瘤細(xì)胞殺傷能力的新方法。
大量臨床研究資料已經(jīng)證明，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和局部復(fù)發(fā)是影響頭頸腫瘤患者預(yù)后最關(guān)鍵的因素。這是由于頭頸部位重要器官密集，可切除范圍有限，手術(shù)切緣中難免殘存有癌細(xì)胞，且頭頸部腫瘤易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移所至。以局部治療為主的手術(shù)和放射治療措施對(duì)這些殘存和轉(zhuǎn)移的癌細(xì)胞療效較差，加上頭頸部腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物又不敏感，導(dǎo)致約50％的患者終因復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移而死亡。長(zhǎng)期以來(lái)，如何提高頭頸腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，盡可能多地殺傷體內(nèi)殘存的腫瘤細(xì)胞，以提高療效，一直是頭頸腫瘤治療中的難題。
腺病毒5型EIA基因(早期表達(dá)1區(qū)A基因)位于腺病毒基因組5′端，是一個(gè)具有抗癌作用的基因，長(zhǎng)約1．71Kb。以往曾報(bào)導(dǎo)該基因具有抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用(Oncogene，1992，71255-1258)。另有報(bào)導(dǎo)EIA基因能提高骨肉瘤、乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞對(duì)順鉑和鬼臼乙叉甙(vp16)兩種化療藥物的敏感性(Cancer Res，1995，555551-5555)。近年還有報(bào)導(dǎo)稱EIA基因能提高HER-2／neu癌基因過(guò)度表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞對(duì)化療藥紫杉醇的敏感性(Oncogene，1997，15953-960)。但到目前為止，經(jīng)檢索，尚未見(jiàn)有EIA與相關(guān)化療藥物聯(lián)合應(yīng)用治療頭頸腫瘤的報(bào)導(dǎo)。
本發(fā)明之目的是針對(duì)目前頭頸腫瘤治療所面臨的世界性難題，尋找常規(guī)手術(shù)和放射治療之外新的有效方法，以期較大幅度提高頭頸腫瘤的治療效果。本發(fā)明的內(nèi)容與要點(diǎn)一真核高效表達(dá)EIA載體的構(gòu)建及鑒定1、pCMV-EIA載體的構(gòu)建帶有EIA全長(zhǎng)基因的pUC119質(zhì)粒和pBluescript M13質(zhì)粒經(jīng)EcoRI和BamHI酶切、電泳后，分別回收1．77kb全長(zhǎng)EIA基因和2．96kb的pBluescript載體片段。T4連接酶12℃連接反應(yīng)過(guò)夜，將產(chǎn)物轉(zhuǎn)化JM109受體菌，用藍(lán)白斑法篩選并鑒定出有E1A基因的陽(yáng)性克隆，擴(kuò)增并大量制備重組質(zhì)粒。將此質(zhì)粒和pcDNA3．1質(zhì)粒用HindⅢ和Bam-HI酶切，電泳后回收1．77kb全長(zhǎng)E1A和5．4kb的載體片段。用T4連接酶，12℃過(guò)夜，轉(zhuǎn)化HB101受體菌，在含氨芐青霉素培養(yǎng)基的平皿上篩選出陽(yáng)性克隆，并用HindⅢ和BamHI酶切鑒定。該表達(dá)載體除含有EIA本身的啟動(dòng)子外，還增加了較強(qiáng)的CMV啟動(dòng)子。所以表達(dá)水平較高，效果亦較好。
2、pCMV-E1A載體的鑒定由于再克隆步驟較多，為了確保在整個(gè)過(guò)程中DNA不發(fā)生重排及其他可能的變化，本發(fā)明對(duì)所構(gòu)建的質(zhì)粒進(jìn)行了內(nèi)切酶圖譜的鑒定和序列分析。
(1)內(nèi)切酶圖譜鑒定用AvaⅠ酶切，獲得5kb，1．35kb，0．75kb 3個(gè)片段。用XbaI酶切，獲得6．6kb，0．5kb 2個(gè)片段。用SaeⅠ酶切，獲得5．2kb，1．9kb 2個(gè)片段。用HindⅢ和BamHI酶切，獲得5．4kb，1．7kb 2個(gè)片段。均與預(yù)計(jì)相符。
(2)用ABI Prism 377測(cè)序儀測(cè)定EIA DNA序列，結(jié)果表明核苷酸序列與文獻(xiàn)報(bào)道一致。二、細(xì)胞培養(yǎng)，基因轉(zhuǎn)染及表達(dá)鑒定1、細(xì)胞株為來(lái)源于人頭頸鱗癌頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶的癌細(xì)胞株LN686，用含10％新生牛血清的DMEM／F-12培養(yǎng)基，于5％CO2，37℃孵箱培養(yǎng)。取生長(zhǎng)至70％融合態(tài)的細(xì)胞，換為無(wú)血清培養(yǎng)基。將pCMV-E1A重組質(zhì)粒或相應(yīng)的空載體DNA與脂質(zhì)體(LipofectAMINETm，Gibco-BRL)按1∶3(w／w)比例混合后，室溫靜置20分鐘，均勻加入到無(wú)血清培養(yǎng)的上述細(xì)胞中，無(wú)血清條件下培養(yǎng)10小時(shí)后，加入含20％血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)，加G418(800ug／ml)篩選抗性克隆，挑選單克隆化的細(xì)胞繼續(xù)在含有400ug／mlG418的培養(yǎng)基中培養(yǎng)擴(kuò)增。
2、轉(zhuǎn)染后陽(yáng)性克隆的鑒定(1)轉(zhuǎn)染后陽(yáng)性克隆中基因的整合由于所用載體含neo基因，首先用細(xì)胞基因組DNA為模板，檢查了neo基因在細(xì)胞基因組DNA中整合的情況。所用引物為15′-CAAGATGGATTGCACGCAGG-3′；引物25′-CCGCTGAGAAGAACTCGTC-3′，產(chǎn)物為790bp。反應(yīng)條件為95℃變性1分鐘，60℃退火1分鐘，72℃延伸2分鐘，32個(gè)循環(huán)后72℃延伸10分鐘。然后用1．0％瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物。結(jié)果證明所轉(zhuǎn)染DNA質(zhì)粒已整合到受體細(xì)胞(六個(gè)克隆化細(xì)胞)的基因組中。
(2)RT-PCR分析E1A基因的表達(dá)用Trizol試劑盒提取總RNA。逆轉(zhuǎn)錄按Gibco-BRL公司的試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。然后以cDNA為模板，以E1A基因引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，引物15′-CGGAGGTGTTATTACCGAAG-3′；引物25′-TCGTCACTGGGTGGAAAGCC-3′，產(chǎn)物為383bp。反應(yīng)條件為95℃變性1分鐘，59℃退火1分鐘，72℃延伸2分鐘，30個(gè)循環(huán)后，72℃延伸5分鐘。用1．5％瓊脂糖凝膠電泳分析反應(yīng)產(chǎn)物，結(jié)果證明在上述六個(gè)經(jīng)PCR證明陽(yáng)性的克隆細(xì)胞中有5株表達(dá)E1A mRNA。
(3)陽(yáng)性克隆中E1A蛋白的表達(dá)；采用免疫細(xì)胞化學(xué)方法，用EIA抗體(m58，Pharmingen)，以S-P方法對(duì)RT-PCR分析陽(yáng)性的轉(zhuǎn)染細(xì)胞中E1A蛋白表達(dá)情況進(jìn)行了分析。證明在轉(zhuǎn)染pCMV-E1A的LN686細(xì)胞核中均有該蛋白的表達(dá)，而在空載體轉(zhuǎn)染的LN686細(xì)胞核中無(wú)表達(dá)(
圖1)。三、E1A-特定藥用化合物對(duì)頭頸鱗癌及頭頸鱗癌頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞的殺傷作用1、由于頭頸腫瘤易發(fā)生頸部淋巴轉(zhuǎn)移是影響患者預(yù)后的關(guān)鍵因素，所以首先觀察了E1A基因與化療藥物聯(lián)合應(yīng)用對(duì)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞株LN686的殺傷作用。
當(dāng)用不同濃度的博萊霉素(每毫升含0ug，0．1ug，0．5ug，1ug，5ug，10ug，50ug，100ug，)處理對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的癌細(xì)胞LN686親本細(xì)胞、LN686-Veet(空載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞)、LN686-E1A(含E1A基因的細(xì)胞)。每個(gè)濃度均設(shè)3個(gè)平皿。用MTT法測(cè)定細(xì)胞的存活率。36小時(shí)后測(cè)定細(xì)胞存活率。在5ug／ml時(shí)，LN686-E1A細(xì)胞存活率為50％，而在100ug／ml時(shí)，LN686和LN686-Vect細(xì)胞的存活率仍為70％-75％。說(shuō)明E1A與博萊霉素聯(lián)合應(yīng)用對(duì)LN686細(xì)胞的殺傷能力提高了二十多倍(以IC50值相比)(圖2)。
2、用同樣的實(shí)驗(yàn)方案，還觀察了E1A與博萊霉素聯(lián)合應(yīng)用對(duì)頭頸鱗癌(來(lái)源于舌癌)細(xì)胞株Tu-138的殺傷作用(圖3)。兩者聯(lián)合應(yīng)用對(duì)該細(xì)胞的殺傷作用至少提高了十倍左右，因在25ug／ml時(shí)，表達(dá)E1A的兩株細(xì)胞Tul38-P1和Tul38-P2存活率均為50％，而對(duì)照細(xì)胞在250ug／ml時(shí)仍存活70-80％。
3、E1A與其它化療藥物，如順鉑(圖4)、泰素(圖5)及射線(圖6)聯(lián)合應(yīng)用也能明顯提高對(duì)上述癌細(xì)胞的殺傷作用，提高幅度在3-10倍左右(順鉑及泰素)，對(duì)射線則提高1至1．5倍左右。
綜上，本發(fā)明E1A-特定藥用化合物聯(lián)合應(yīng)用能顯著提高對(duì)頭頸腫瘤及頭頸腫瘤頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞的殺傷能力，為克服頭頸腫瘤治療中常見(jiàn)的對(duì)化療藥物耐藥性的難題提供了新的措施。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)及效果是聯(lián)合應(yīng)用EIA與特定藥用化合物如博萊霉素或其它化療藥物能顯著提高對(duì)頭頸腫瘤癌細(xì)胞，特別是頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞的殺傷能力，比單獨(dú)使用其中任何一種效果都強(qiáng)，對(duì)于提高頭頸腫瘤的治療效果，防止轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)無(wú)疑具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。
圖2，E1A與博萊霉素聯(lián)合應(yīng)用對(duì)LN686、LN686-vect及LN686-E1A細(xì)胞殺傷作用的劑量效應(yīng)曲線。
其中-◆-LN686-○-LN686-vect-▲-LN686 EIA圖3，E1A與博萊霉素聯(lián)合應(yīng)用對(duì)舌癌細(xì)胞株Tul38、Tul38-vect及兩株Tul38-ElAp1和p2殺傷作用的劑量效應(yīng)曲線。
其中-◆-TUl38-■-TUl38-vect-▲-Tul38-ElAp1-■-Tul38-ElAp2圖4，ElA與順鉑聯(lián)合應(yīng)用對(duì)LN686、LN686-vect及LN686-E1A細(xì)胞(A)和對(duì)Tul38、Tul38-vect及兩株Tul38-ElAp1和p2(B)殺傷作用的劑量效應(yīng)曲線其中A、-◆-LN686-○-LN686-vect-▲-LN686-EIAB、-◆-Tul38-■-Tul38-vect-▲-Tul38-E1Ap1-■-Tul38-E1Ap2圖5，E1A與泰素聯(lián)合應(yīng)用對(duì)LN686、LN686-vect及LN686-E1A細(xì)胞(A)和對(duì)Tul38、Tul38-vect及兩株Tul38-ElAp1和p2(B)殺傷作用的劑量效應(yīng)曲線。
其中A、-◆-LN686-○-LN686-vect-▲-LN686-EIAB、-◆-Tul38-■-Tul38-vect-▲-Tul38-ElAp1-■-Tul38-ElAp2圖6，E1A與射線聯(lián)合應(yīng)用對(duì)LN686、LN686-vect及LN686-E1A細(xì)胞(A)和對(duì)Tul38、Tul38-vect及兩株Tul38-ElAp1和p2(B)殺傷作用的劑量效應(yīng)曲線。
其中A、-◆-LN686-○-LN686-vect-▲-LN686-EIAB、-◆-Tul38-■-Tul38-vect-▲-Tul38-ElAp1-■-Tul38-ElAp權(quán)利要求
1.EIA-特定藥用化合物作為制備抗頭頸部腫瘤藥物的應(yīng)用，其中包括A、EIA-博萊霉素B、EIA-順鉑C、EIA-泰素
2.EIA-特定射線作為制備抗頭頸部腫瘤藥物的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種基因與特定治療藥物或射線聯(lián)合應(yīng)用以提高對(duì)頭頸部腫瘤細(xì)胞殺傷能力的新方法,其方案是先進(jìn)行真核高效表達(dá)EIA載體的構(gòu)建,細(xì)胞培養(yǎng),基因轉(zhuǎn)染及表達(dá),再用制備好的表達(dá)EIA的癌細(xì)胞聯(lián)合不同濃度的博萊霉素、順鉑、泰素,或用射線處理上述癌細(xì)胞,觀察對(duì)癌細(xì)胞的殺傷作用,結(jié)果表明,EIA－特定化療藥物或EIA－射線聯(lián)合治療方案,與單獨(dú)使用其中任何一種手段相比,頭頸部腫瘤細(xì)胞殺傷幅度可提高1—20倍,對(duì)提高臨床療效,防止轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)將具有重要的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)A61K48/00GK1281699SQ00121340
公開(kāi)日2001年1月31日 申請(qǐng)日期2000年7月21日 優(yōu)先權(quán)日2000年7月21日
發(fā)明者趙清正 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所